XIII JORNADA DE ENSINO, PESQUISA E EXTENSÃO – JEPEX 2013 – UFRPE: Recife, 09 a 13 de dezembro.
CARACTERIZAÇÃO GENOTÍPICA DE BOVINOS LEITEIROS
GIROLANDO PARA O GENE DA ALFA-LACTOALBUMINA NO
ESTADO DE PERNAMBUCO
Ricardson Carlos Barboza da Silva1, Severino Benone Paes Barbosa2, Soraya Farias de Andrade Freitas 3, Catarina
Xavier da Silva4, Maria do Carmo da Silva5, Manoel Adrião Gomes Filho6, Ângela Maria Vieira Batista7

Introdução
De acordo com Silva et al. (2012), os primeiros cruzamentos da raça Holandesa com a raça Gir no Brasil surgiram
na década de 1940. Deste cruzamento surgiu a raça Girolando que alia a alta capacidade de produção de leite do gado
Holandês com a excelente rusticidade do Gir ocorrendo, assim, complementaridade das duas raças em um único tipo de
animal, fenotipicamente superior aos demais mestiços leiteiros. Esses animais se destacam pela excelente produtividade,
em ambientes tropicais e subtropicais, fertilidade e vigor (Freitas, 2003; Freitas et al., 2009).
A alfa-lactoalbumina (α-La) é uma proteína cálcica de estrutura globular, composta por uma sequência de 123
aminoácidos, bastante conservada entre as espécies de ruminantes domésticos. Constitui em torno de 18% das proteínas
do soro e 3,5% da proteína total do leite bovino (Bleck & Bremel, 1993; Balcan et al., 2008; Dayal et al., 2009).
A importância biológica da α-La se encontra em sua contribuição na biossíntese da lactose, já que é componente da
enzima lactose sintase, responsável pela ligação β 1,4 da Glicose + Uridina difosfato galactose, na etapa final da síntese
deste carboidrato (Volker et al., 1999; Martín et al., 2002). A lactose, por sua vez, possui importante papel regulador da
osmolaridade na glândula mamária e sua síntese está associada com a entrada de água no lúmen mamário, provocando,
desta forma, maior produção de leite, processo relacionado com a síntese de α-La (Uffo & Martinez, 2002).
Material e métodos
A. Origem e colheita das Amostras.
Foram coletadas 360 amostras de sangue de bovinos da raça Girolando (machos e fêmeas), provenientes do Instituto
Agronômico de Pernambuco (IPA), com sedes em Arcoverde e Itambé, no Estado de Pernambuco, para realização da
tipagem do gene da α-La. As análises foram realizadas no Laboratório de Fisiologia Animal Molecular Aplicada
(FAMA).
B. Processamento das amostras de sangue, extração do DNA e verificação da sua integridade.
A extração do DNA das células sanguíneas foi realizada de acordo com o protocolo de Osta (1994) e, em seguida, os
pellets de DNA foram ressuspendidos em 30μl de água ultra pura e armazenados em freezer a - 20ºC. As reações de
amplificação (PCR) foram realizadas em um termociclador (Biocycler) com uma concentração de DNA de 100ng/ l.
Foram utilizadas sequências de primers descritas por Osta (1994): LAA(33)5’TTCCTggATgTAAggCTTgA e
LAA(34)3’ggTATgAAACgCggTACAgA, que amplificam uma sequência de 583pb localizada na região 5’ não
traduzida (UTR) e a região do éxon I do gene da α-La. Cada reação de amplificação consistiu 2,5μl de tampão para PCR
1X (KCl 500 mM, Tris-Cl pH 8.3 100 mM), 0,75μl de cada primer, 1,0μl de dNTP 0,125 mM, 1,0μl Taq DNA
Polimerase, 0,75μl MgCl2, 2,0μl de DNA e água ultra pura para completar o volume final de 25μl.
As condições de ciclagem foram: desnaturação inicial a 94°C por 5 minutos, seguida por 30 ciclos de 94°C por 30
segundos, 62°C por 30 segundos e 72°C por 30 segundos com extensão final a 72°C por 5 minutos. Os produtos das
amplificações foram submetidos à eletroforese em gel de agarose a 2,0%, durante uma hora, e para coloração das bandas
foi utilizado o intercalante de DNA, Syber Blue Green. O tamanho dos fragmentos amplificados foi estimado utilizandose marcador de pares de base (100pb DNA ladder), sendo os amplicons visualizados em transluminador com luz
1
Graduando em Medicina Veterinária Bolsista de Iniciação Científica do CNPq, Universidade Federal Rural de Pernambuco, R. Dom Manoel de
Medeiros, S/N, Recife, PE, CEP 52171-900. E-mail: [email protected]
2
Professor Associado do Departamento de Zootecnia, Universidade Federal Rural de Pernambuco, R. Dom Manoel de Medeiros, S/N, Recife, PE,
CEP 52171-900.
3
Professora Assistente , Universidade Federal do Amazonas, (ICSEZ/UFAM). Campus Universitário ‘‘Dorval Varela Moura’’, 2186. Bairro
Palmares, AM Parintins.
4
Graduando em Zootecnia, Universidade Federal Rural de Pernambuco, R. Dom Manoel de Medeiros, S/N, Recife, PE, CEP 52171-900.
5
Graduando em Zootecnia, Universidade Federal Rural de Pernambuco, R. Dom Manoel de Medeiros, S/N, Recife, PE, CEP 52171-900.
6
Professor Adjunto do Departamento de Morfologia e Fisiologia Animal , Universidade Federal Rural de Pernambuco, R. Dom Manoel de
Medeiros, S/N, Recife, PE, CEP 52171-900.
7
Professora Associado do Departamento de Zootecnia, Universidade Federal Rural de Pernambuco, R. Dom Manoel de Medeiros, S/N, Recife,
PE, CEP 52171-900.
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ultravioleta e, em seguida, foto documentados. O produto da amplificação, foi submetido à digestão pela MspI durante
12 horas de acordo com o seguinte protocolo, para cada reação: 1,5μl Tampão, 0,5μl MspI, 10,0μl do produto da PCR,
acrescentado um volume de água para um produto final de 15μl, em estufa a 37°C. Em seguida, procedeu-se a
eletroforese em gel de agarose a 4,0% por uma hora. Após a digestão foram verificados os fragmentos gerados e,
posteriormente, identificados os genótipos e, em seguida, os alelos foram quantificados por meio de contagem direta.
As frequências genotípicas (χii) e alélicas (χi) da amostra populacional em estudo foram verificadas pelas equações:
χii = nii/n e χi = 2nii + Σnij/2n, em que nii e nij corresponderam ao número de homozigotos e heterozigotos observados
no gene i, respectivamente; n corresponde ao número total de indivíduos. As frequências alélicas foram submetidas ao
teste de equilíbrio de Hardy- Weinberg.
Resultados e Discussão
Na Figura 1, observa-se o padrão eletroforético da digestão do produto da PCR do gene da α-La, que gerou
fragmentos de peso molecular de 583pb para o genótipo AA; 583, 393 e 190pb, para o genótipo AB, e 393 e 190pb para
o genótipo BB.
Na tabela 1, com base no teste de qui-quadrado (χ2), considerando as frequências genotípicas observadas e
esperadas da α-La, verificou-se que estas diferiram significativamente (P < 0,05), o que indica que a amostra
populacional a partir deste loco gênico não se encontra em equilíbrio genético, pelo Teorema de Hardy-Weinberg.
O resultado da análise da estrutura genética da população de bovinos Girolando do Estado de Pernambuco relata
maior proporção genotípica para o heterozigoto AB (56,00%) e frequência superior para o polimorfismo A (0,61)
quando comparado ao alelo B (0,39).
Em raças submetidas a isolamento geográfico e com pequena população, a deriva genética e o efeito Wahlund
(subdivisão populacional) parecem mais prováveis para explicar a baixa variabilidade e a ocorrência de desequilíbrio
populacional (Martin-Burriel et al., 1999; Maudet et al., 2002).
Agradecimentos
Agradeço a todos dos Laboratórios de Fisiologia Animal Molecular Aplicada – FAMA e Programa de
Gerenciamento de Rebanhos Leiteiros do Nordeste - PROGENE, a Universidade Federal Rural de Pernambuco e ao
CNPq pela concessão da bolsa.
Referências
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BALCAN, V.R.A.; GEORGESCU, S.E.; MANEA, M.A. et al. Alpha-lactalbumin genotypes identification in Romanian Black
Spotted cattle breed. Zootehnie si Biotehnologii, v.41, n. 1, p. 169-173, 2008.
DAYAL, S.; BHATTACHARYA, T.K.; VOHRA, V. et al. Effect of alpha-lactalbumin gene polymorphism on milk production traits
in water buffalo. Asian Australasian Journal of Animal Sciences, v.19, n.3, p. 305-308, 2006.
FREITAS, M. S. Utilização de modelos de regressão aleatória na avaliação genética de animais da raça Girolando. 2003. 89f. Tese
(Doutorado – Zootecnia) – Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, Minas Gerais, 2003.
FREITAS, A. F.; COSTA, C. N.; MENEZES, C. R. A. et al. Programa de Melhoramento Genético da Raça Girolando: Sumário de
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UFFO, O.; MARTÍNEZ, S. Amplificación por PCR de los genes que codifican para la alfa-lactoalbumina, la beta-lactoglobulina y
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Revista de Salud Animal, v.24, n. 1, p. 22-26, 2002.
VOELKER JR. G.R., BLECK G.T., WHEELER M. B. Identification of Variations in the α-Lactalbumin Gene in Cattle and Potential
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XIII JORNADA DE ENSINO, PESQUISA E EXTENSÃO – JEPEX 2013 – UFRPE: Recife, 09 a 13 de dezembro.
Distribuição das proporções genotípicas e frequências alélicas da alfa-Lactoalbumina na
população Girolando.
Tabela 1.
Genótipo
Frequência
Genotípica
N° observado
N° esperado
AA
0,33
120
134
AB
0,56
200
171
BB
0,11
40
55
Total
χ2
Frequência
Alélica
(±σ)
A
0,61 ± 0,010
12,01*
B
0,39 ± 0,010
360
 (P < 0,05)
Figura 1. Gel de agarose 4,0%, padrão eletroforético obtido pela digestão da endonuclease MspI. Região do fragmento gênico da αLactoalbumina bovina, localizado na região 5’ (UTR) e éxon I. Linha 1: Marcador de peso molecular (DNA-Ladder100pb); Linha 6:
AA; Linhas 2 e 4: AB; Linhas 3,5,7 e 8: BB.