UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
ROSEANE LEANDRA DA ROSA
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL GASTROPROTETOR E ANTIÚLCERA
DAS SEMENTES DA Eugenia involucrata DC. (cereja do mato) E
Artocarpus heterophyllus Lam. (jaca) EM ROEDORES
Itajaí
2013
UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
PROGRAMA DE PÓS GARDUAÇÃO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E
SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS
ROSEANE LEANDRA DA ROSA
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL GASTROPROTETOR E ANTIÚLCERA
DAS SEMENTES DA Eugenia involucrata DC. (cereja do mato) E
Artocarpus heterophyllus Lam. (jaca) EM ROEDORES
Dissertação submetida ao Programa de Mestrado
Acadêmico em Ciências Farmacêuticas, da
Universidade do Vale do Itajaí, como parte dos
requisitos para obtenção do grau de Mestre em
Ciências Farmacêuticas
Orientador: Prof. Dr. Sérgio Faloni de Andrade
Itajaí, Dezembro de 2013
FICHA CATALOGRÁFICA
R71a
Rosa, Roseane Leandra da , 1988Avaliação do potencial gastroprotetor e antiúlcera das sementes da
Eugenia involucrata DC. (cereja do mato) e Artocarpus heterophyllus Lam.
(jaca) em roedores / Roseane Leandra da Rosa, 2013.
95 f. ; il., tab. ; fig.
Cópia de computador (Printout(s)).
Dissertação (Mestrado) Universidade do Vale do Itajaí,
Mestrado em Ciências Farmacêuticas.
“Orientadora : Prof . Dr. Sérgio Faloni de Andrade”
Bibliografia : p. 79 - 95
1.Úlcera péptica. 2. Gastrite. 3. Artocarpus heterophyllus Lam.
4. Eugenia involucrata DC. 5. Produtos naturais. 6. Fitoterapia.
7. Química farmacêutica. I. Título.
CDU: 615.32
Josete de Almeida Burg – CRB 14.ª 293
FOLHA DE APROVAÇÃO
Dedico este trabalho, a minha família
pelo apoio e compreensão em todos os
momentos, dando forças para continuar,
sempre. Em especial para Marcelo
Antunes de Mattos, companheiro fiel
de estudos e viagens.
AGRADECIMENTOS
Agradeço a todos, que de uma maneira ou outra se fizeram presentes contribuindo e
auxiliando na realização deste trabalho, especialmente:
A Deus, pois sem ele, nada disso seria possível;
Ao Prof. Dr. Sérgio Faloni de Andrade, pela orientação, pelas conversas, pelos
ensinamentos sábios, pela dedicação ao estudo. Por ser um profissional de respeito
que por esses dois anos, acompanhou e incentivou meu crescimento profissional;
Ao Prof. Dr. Valdir Cechinel Filho e mestranda Camila Leandra Bueno de Almeida
pelo fornecimento dos extratos, pela troca de informações, conhecimentos e pelo
apoio para plena realização deste trabalho;
Ao Prof. Dr. Alexandre Bella Cruz pelas contribuições dadas ao longo da elaboração
deste trabalho;
A Prof. Dr. Marcia Maria de Souza pela preocupação pelas minhas viagens, pelo
apoio e dicas dados nas aulas e no laboratório;
A amiga sempre presente Luciane Ângela Nottar Nesello, pela amizade, pelo carinho
e dedicação, pela companhia nas horas intermináveis de testes no laboratório, pelas
conversas sem fim, pelas dicas e correções na construção da dissertação, pelos
conselhos, pelas risadas, enfim, por ter feito a diferença em mais essa etapa da
minha caminhada;
As colegas de mestrado e doutorado Ana Baumgart e Adriana Gasparetto Soletti,
pelas conversas, pelas risadas, pelos conselhos, ensinamentos e principalmente
pela companhia, nos momentos em que estava longe de minha família, vocês, com
certeza fizeram a diferença;
A técnica do laboratório de farmacologia, Érika Pessiquelli, pelo apoio, pelas dicas e
dedicação, sempre pronta a ajudar;
A colega de mestrado Danyela Benvenutti pelo auxílio e pela companhia na
realização dos testes no laboratório de farmacologia, sempre com muito bom humor,
amenizava as dificuldades e obstáculos;
Aos colaboradores e à coordenação do Programa de Mestrado em Ciências
Farmacêuticas da UNIVALI, Prof. Dr. Tania Mari Bellé Bresolin, Juliano dos Santos e
Helenize Heyse Moreira;
A minha família, ao meu pai Alcediles e minha mãe Terezinha, a minha irmã
Rosangela, pelo carinho, suporte e apoio, por compreenderem a minha ausência;
Ao Marcelo Antunes de Mattos, por fazer parte da minha vida, me apoiando sempre
com seu jeito alegre, compartilhando comigo as horas intermináveis de leitura, pela
paciência e compreensão na minha ausência, por estar comigo em mais uma etapa;
Muito obrigada!
“Embora ninguém possa voltar atrás e
fazer um novo começo, qualquer um
pode começar agora e fazer um novo fim”
(Chico Xavier)
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL GASTROPROTETOR E ANTIÚLCERA
DAS SEMENTES DA Eugenia involucrata DC.(cereja do mato) E
Artocarpus heterophyllus Lam. (jaca) EM ROEDORES
Roseane Leandra da Rosa
Dezembro/2013
Orientador: Prof. Sérgio Faloni de Andrade, Doutor.
Área de concentração: Produtos Naturais e Substâncias Sintéticas Bioativas
Número de Páginas: 95.
Resumo:Nos últimos 20 anos tem se registrado um relevante aumento na incidência
de gastrites e úlceras. Essas desordens gástricas desencadeiam danos ao trato
digestório, podendo resultar em carcinomas, representando um importante problema
de saúde pública. Na maioria dos casos são consequência da ação da bactéria
Helicobacter pylori, do uso abusivo de álcool e medicamentos anti-inflamatórios não
esteroidais, tabagismo e de uma alimentação desequilibrada. Atualmente, muitas
pesquisas destacam os benefícios, não apenas nutricionais, mas, também
funcionais de frutas, hortaliças e de plantas “medicinais”, pois tem se verificado na
composição destas, fitoconstituintes responsáveis pela proteção e tratamento de
diversas patologias. A presente pesquisa buscou investigar o potencial
gastroprotetor e antiulcera do extrato metanólico das sementes da Eugenia
involucrata, da Artocarpus heterophyllus, e da fração e subfração metanólica em
roedores. Para isso, foram utilizados métodos de indução de úlcera aguda com
etanol e AINE, e de úlcera crônica induzida por ácido acético, além da avaliação dos
possíveis mecanismos de ação envolvidos, através dos métodos de alteração dos
parâmetros do suco gástrico, determinação de muco e avaliação dos papéis do
óxido nítrico e compostos sulfidrilas in vivo. O extrato bruto metanólico das sementes
da Artocarpus heterophyllus e da Eugenia involucrata demonstararm possuir
potencial gastroprotetor significativo, observado em ambos os modelos de indução
de úlcera aguda (etanol e AINE). Também, apresentaram atividade antiúlcera
relevante no modelo de indução de úlcera cronica (ácido acético), demonstrando
possuir além da ação de proteção da cavidade gástrica, capacidade de estímulo da
cicratização do tecido. O mecanismo de ação pelo qual os extratos podem ter agido
na atividade gastropotetora e antiúlcera foi relacionado a citoproteção, pois, os
resultados apresentaram valores significativamente diferentes do controle negativo,
demonstrando aumento na produção de muco. As vias pelas quais o extrato
metanólico das sementes podem ter exercido sua ação foram relacionadas a
participação do óxido nítrico e grupamentos sulfidrilas, visto que na administração
dos inibidores dessas substâncias os extratos perderam parte de sua ação, sendo
essas vias participantes do aumento de fluxo sanguineo e da atividade antioxidante.
A fração e subfração metanólica do extrato bruto metanólico das sementes da
Artocarpus heterophyllus também demonstraram potencial gastroprotetor em ambos
os modelos de indução de úlcera aguda, de maneira semelhante ao extrato bruto.
Palavras-chave: Antiúlcera. Artocarpus heterophyllus Lam. Eugenia involucrata DC.
Gastroproteção. Sementes.
EVALUATION OF THE GASTROPROTECTIVE AND ANTIULCER
POTENTIAL OF SEEDS OF Eugenia involucrata DC. (cherry bush)
AND Artocarpus heterophyllus Lam. (jackfruit) IN RODENT
Roseane Leandra da Rosa
December/2013
Supervisor: Sérgio Faloni de Andrade, PhD.
Concentration area: Natural products and bioactive substances.
Number of pages: 95.
Abstract: In the last twenty years, there has been a significant increase in the
incidence of gastritis and ulcers. These gastric disorders trigger damage to the
digestive tract and may result in carcinomas, representing a major public health
problem. In the majority of cases, they are the result of the action of the bacterium
Helicobacter pylori, alcohol abuse, non-steroidal anti-inflammatory drugs, smoking,
and an unbalanceddiet. Many recent studies highlight the benefits, not only nutritional
but also functional, of fruit, vegetables and "medicinal" plants, as phytochemicals
have been found in their composition that offer protection and treatment of various
ailments.This research investigates the gastroprotective and antiulcerogenic
potentialof methanol extract of seeds of Eugenia involucrata, and Artocarpus
heterophyllus, and methanol fraction and subfraction in rodents. Acute ulcers were
induced by ethanol and NSAIDs, and chronic ulcers were induced by acetic acid. The
possible mechanisms involved were assessedby alterations in gastric juice
parameters, mucus determination, and evaluation of the roles of of nitric oxide and
sulfhydryl compounds in vivo. Crude methanol extract of the seeds ofArtocarpus
heterophyllus and Eugenia involucrata demonstrated significant gastroprotective
potential, observed in both acute ulcer-induction models (ethanol and NSAIDs). They
also demonstrated significant antiulcer activity in the chronic ulcer induction model
(acetic acid) model, showing that in addition to its protective action in the gastric
cavity, it is also capable of stimulating tissue healing. A possible mechanism of action
of the extract in gastroprotective and antiulcer activity is related to cytoprotection, as
the results were significantly different from those of the negative control,
demonstrating an increase in mucus production. The pathways by which the
methanol extract of the seeds may have exerted its action were related to the role of
nitric oxide and sulfhydryl groups, as in the administration of inhibitors of these
substances, the extracts lost part of their action, and these pathways are involved in
increased blood flow and antioxidant activity. The methanol fraction and subfraction
of the methanol crude extract of the seeds of Artocarpus heterophyllus also showed
gastroprotective potential in both models of acute ulcer induction, similar to the crude
extract.
Keywords: Antiulcer. Artocarpus heterophyllus Lam. Eugenia involucrata DC.
Gastroprotection. Seeds.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1.
Esquema representativo da secreção de ácido clorídrico pela
célula parietal e da produção de muco pela célula epitelial
superficial..................................................................................
24
Figura 2.
Foto da Artocarpus heterophyllus Lam.....................................
38
Figura 3.
Foto da Eugenia involucrata DC...............................................
40
Figura 4.
Semente da A. heterophyllus inteira antes de ser partida em
pedaços menores para maceração em metanol por 7
dias............................................................................................
Figura 5.
41
Semente da E. involucrata inteira antes de ser partida em
pedaços menores para maceração em metanol por 7
dias............................................................................................
Figura 6.
Sobreposição dos cromatogramas das amostras original pelo
CG-MS no tempo de 16 minutos...............................................
Figura 7.
41
50
Imagens de estômagos após indução de úlcera por etanol. Acontrole negativo; B- controle positivo (cimetidina 100 mg/kg);
C – EBM da semente de A. heterophyllus 50 mg/kg; D – EBM
da semente de A. heterophyllus 125 mg/kg; E - EBM da
semente de A. heterophyllus 250 mg/kg; F – EBM da
semente de E. involucrata 50 mg/kg; G - EBM da semente de
E. involucrata 125 mg/kg; H - EBM da semente de E.
involucrata 250 mg/kg...............................................................
Figura 8.
52
Índice de cura obtido pelo efeito da administração oral de
cimetidina (100 mg/kg) e das diferentes doses do extrato
metanólico da semente de A. heterophyllus (nas doses de 50,
125 e 250 mg/kg) em úlceras gástricas agudas induzidas por
etanol/HCl em camundongos....................................................
Figura 9.
53
Índice de cura obtido pelo efeito da administração oral de
cimetidina (100 mg/kg) e das diferentes doses do extrato
metanólico da semente de E. involucrata (nas doses de 50,
53
125 e 250 mg/kg) em úlceras gástricas agudas induzidas por
etanol/HCl em camundongos....................................................
Figura 10.
Imagens de estômagos após indução de úlcera por etanol. Acontrole negativo; B- controle positivo (cimetidina 100 mg/kg);
C – Fração metanólica do EBM da semente de A.
heterophyllus 50 mg/kg; D – Subfração metanólica do EBM
da semente de A. heterophyllus................................................
Figura 11.
57
Índice de cura obtido pelo efeito da administração oral de
cimetidina (100 mg/kg) e da fração e subfração metanólica
(50 mg/kg) do extrato da semente da A. heterophyllus em
úlceras gástricas agudas induzidas por etanol/HCl em
camundongos............................................................................
Figura 12.
57
Índice de cura obtido pelo efeito da administração oral de
cimetidina (100 mg/kg) do extrato metanólico da semente da
A. heterophyllus nas diferentes doses (50, 125 e 250 mg/kg)
e de sua fração e subfração metanólica (50 mg/kg) em
úlceras gástricas agudas induzidas por etanol/HCl em
camundongos............................................................................
Figura 13.
58
Imagens de estômagos após indução de úlcera com
indometacina. A- controle negativo; B- controle positivo
(cimetidina 100 mg/kg); C – EBM da semente de A.
heterophyllus 50 mg/kg; D – EBM da semente de A.
heterophyllus 125 mg/kg; E - EBM da semente de A.
heterophyllus 250 mg/kg; F – EBM da semente de E.
involucrata 50 mg/kg; G - EBM da semente de E. involucrata
125 mg/kg; H - EBM da semente de E. involucrata 250
mg/kg........................................................................................
Figura 14.
60
Índice de cura obtido pelo efeito da administração oral de
cimetidina (100 mg/kg) e das diferentes doses do extrato
metanólico da semente da A. heterophyllus (nas doses de 50,
125 e 250 mg/kg) em úlceras gástricas agudas induzidas por
indometacina em camundongos...............................................
60
Figura 15.
Índice de cura obtido pelo efeito da administração oral de
cimetidina (100 mg/kg) e das diferentes doses do extrato
metanólico da semente da E. involucrata (nas doses de 50,
125 e 250 mg/kg) em úlceras gástricas agudas induzidas por
indometacina em camundongos...............................................
Figura 16.
61
Imagens de estômagos após indução de úlcera por AINE. Acontrole negativo; B- controle positivo (cimetidina 100 mg/kg);
C – Subfração do EBM da semente de A. heterophyllus 50
mg/kg........................................................................................
Figura 17.
61
Índice de cura obtido pelo efeito da administração oral de
cimetidina (100 mg/kg) e da dose da subfração metanólica da
semente da A. heterophyllus (50 mg/kg) em úlceras gástricas
agudas
induzidas
por
indometacina
em
camundongos............................................................................
Figura 18.
62
Índice de cura obtido pelo efeito da administração oral de
cimetidina (100 mg/kg) e do EBM da semente da A.
heterophyllus (250 mg/kg) e do EBM da semente da E.
involucrata (250 mg/kg) em úlceras gástricas agudas
induzidas
por
ácido
acético
(30%)
em
camundongos............................................................................
Figura 19.
Porcentagem
de
área
lesada
obtida
pelo
efeito
65
da
administração oral do extrato metanólico da semente da A.
heterophyllus (250 mg/kg) em úlceras gástricas agudas
induzidas
por etanol
em
camundongos,
associado
a
administração de L-NAME (70 mg/kg, i.p.) e salina (0,1 mL/10
g de peso de animal).................................................................
Figura 20.
Porcentagem
de
área
lesada
obtida
pelo
efeito
71
da
administração oral do extrato metanólico da semente da E.
involucrata (250 mg/kg) em úlcera gástrica aguda induzida
por etanol em camundongos, associado a administração de
L-NAME (70 mg/kg, i.p.) e salina (0,1 mL/10 g de peso de
animal)......................................................................................
72
Figura 21.
Porcentagem
de
área
lesada
obtida
pelo
efeito
da
administração oral do extrato metanólico da semente da A.
heterophyllus (250 mg/kg) em úlceras gástricas agudas
induzidas
por etanol
em
camundongos,
associado
a
administração de NEM (10 mg/kg, i.p.) e salina (0,1 mL/10 g
de peso de animal)....................................................................
Figura 22.
Porcentagem
de
área
lesada
obtida
pelo
efeito
74
da
administração oral do extrato metanólico da semente da E.
involucrata (250 mg/kg) em úlceras gástricas agudas
induzidas
por etanol
em
camundongos,
associado
a
administração de NEM (10 mg/kg, i.p.) e salina (0,1 mL/10 g
de peso de animal)....................................................................
75
LISTA DE TABELAS
Tabela 1.
Efeitos da administração oral de cimetidina (100 mg/kg) e das
diferentes doses do extrato metanólico da semente da A.
heterophyllus e E. involucrata (50, 125 e 250 mg/kg) em úlcera
gástrica aguda induzida por etanol em camundongos....................... 52
Tabela 2.
Efeitos da administração oral de cimetidina (100 mg/kg) da fração e
subfração metanólica da semente da A. heterophyllus (50 mg/kg)
em
úlceras
gástricas
agudas
induzidas
por
etanol
em
camundongos..................................................................................... 57
Tabela 3.
Efeitos da administração oral de cimetidina (100 mg/kg) e das
diferentes doses do extrato bruto metanólico da semente da A.
heterophyllus e E. involucrata (50, 125 e 250 mg/kg) em úlcera
gástrica aguda induzida por indometacina em camundongos...........
Tabela 4.
59
Efeitos da administração oral de cimetidina (100 mg/kg) e da
subfração metanólica da semente da A. heterophyllus (50 mg/kg)
em
úlcera
gástrica
aguda
induzida
por
indometacina
em
camundongos..................................................................................... 62
Tabela 5.
Efeito da administração oral de cimetidina (100 mg/kg) e do EBM
da semente da A. heterophyllus e da E. involucrata (250 mg/kg) em
úlceras gástricas agudas induzidas por ácido acético (30%) em
camundongos..................................................................................... 64
Tabela 6.
Efeitos da administração intraduodenal de cimetidina (100 mg/kg) e
das diferentes doses do extrato metanólico da semente da A.
heterophyllus e E. involucrata (50, 125 e 250 mg/kg) nos
parâmetros
bioquímicos
da
secreção
gástrica
ácida
de
camundongos submetidos à ligadura de piloro.................................. 67
Tabela 7.
Efeitos da administração intraduodenal de carbenoxolona (200
mg/kg) e das diferentes doses do extrato metanólico das sementes
da A. heterophyllus e E. involucrata (50, 125 e 250 mg/kg) nos
parâmetros bioquímicos da produção de muco de camundongos
submetidos à ligadura de piloro.........................................................
68
Tabela 8.
Efeito da administração oral de carbenoxolona (200 mg/kg) e do
extrato metanólico das semente de A. heterophyllus (250 mg/kg)
em úlceras gástricas induzidas por etanol associado a inibição da
NO-sintase em camundongos............................................................ 70
Tabela 9.
Efeito da administração oral de carbenoxolona (200 mg/kg) e do
extrato metanólico das semente de E. involucrata (250 mg/kg) em
úlceras gástricas induzidas por etanol associado a inibição da NOsintase em camundongos..................................................................
70
Tabela 10. Efeito da administração oral de carbenoxolona (200 mg/kg) e do
extrato metanólico da semente de A. heterophyllus (250 mg/kg) em
úlceras gástricas induzidas por etanol associado a alquilação de
grupamentos sulfidrilas em camundongos......................................... 73
Tabela 11. Efeito da administração oral de carbenoxolona (200 mg/kg) e do
extrato metanólico da semente de E. involucrata (250 mg/kg) em
úlceras gástricas induzidas por etanol associado a alquilação de
grupamentos sulfidrilas em camundongos......................................... 74
LISTA DE ABREVIATURAS
AINE – anti-inflamatório não-esteroidal
NIQFAR – Núcleo de Investigações Químico-Farmacêuticas
NO – Óxido nítrico
GSH – Glutationa
PGE2 – Prostaglandinas E2
CCD – cromatografia de camada delgada
HCL – Ácido clorídrico
EBM – Extrato bruto metanólico
CLAE – Cromatografia líquida de alta eficiência
RMN – Ressonância magnética nuclear
EARP – Software de análise de imagens
IC – Índice de cura
v.o – Via oral
L-NAME – N-nitro-L-arginina metil éster
NOs – Óxido nítrico sintase
NEM – N-etilmaleimida
CG-EM – Cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa
FM – Fração metanólica
SFM – Subfração metanólica
H2 – Ras – receptores antagonistas de histamina 2
EROs - Espécies reativas de oxigênio
SOD – Superóxido dismutase
GPx – Glutationa peroxidase
GSSG – Glutationa oxidase
GR – Glutationa redutase
PGs – Prostaglandinas
COX – Ciclooxigenase
ATP – Adenosina trifosfato
GMPc - Guanosina-3’,5’-monofosfato cíclico
NOSc - Óxido nítrico sintase constitutiva
NOSe - óxido nítrico sintase endotelial
SH – Compostos sulfidrilas
EPM – erro padrão da média
H2 – receptor de histamina tipo 2
i.p. – via intraperitonial
mEq – miliequivalente-grama
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 19
2 OBJETIVOS ........................................................................................................... 21
2.1
OBJETIVO GERAL........................................................................................ 21
2.2
OBJETIVOS ESPECÍFICOS ......................................................................... 21
3 REVISÃO DA LITERATURA ................................................................................. 22
3.1
FISIOLOGIA DO ESTÔMAGO ...................................................................... 22
3.2
FISIOPATOLOGIA DA GASTRITE E DA ÚLCERA PÉPTICA ...................... 24
3.2.1 Mecanismos de proteção do estômago ....................................................... 26
3.2.2 Diagnóstico e tratamento da gastrite e úlcera péptica ............................... 27
3.3
UTILIZAÇÃO DA FITOTERAPIA NO TRATAMENTO DE PATOLOGIAS ..... 28
3.4
ESPÉCIES VEGETAIS COM ATIVIDADE GASTROPROTETORA .............. 30
3.4.1 Frutos e atividade gastroprotetora ............................................................... 32
3.5
Artocarpus heterophyllus Lam. ...................................................................... 36
3.6
Eugenia involucrata DC. ................................................................................ 39
4 MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................... 41
4.1
PREPARO DO MATERIAL VEGETAL .......................................................... 41
4.2
ANÁLISE FITOQUÍMICA ............................................................................... 41
4.3
ANIMAIS E ENSAIOS FARMACOLÓGICOS ................................................ 42
4.3.1 Animais ........................................................................................................... 42
4.4
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE GASTROPROTETORA .................................. 43
4.4.1 Modelo de úlcera aguda induzida por etanol ............................................... 43
4.4.2 Modelo de úlcera aguda induzida por anti-inflamatório não-esteroidal .... 44
4.4.3 Modelo de úlcera crônica induzida por ácido acético (ensaio curativo) ... 44
4.5
MECANISMOS DE AÇÃO ............................................................................. 45
4.5.1 Modelo de avaliação da secreção gástrica (ligadura de piloro) ................. 45
18
4.5.2 Modelo de avaliação da secreção de muco em mucosa gástrica .............. 46
4.5.3 Avaliação do papel do óxido nítrico (NO) in vivo ........................................ 47
4.5.4 Avaliação do papel dos grupos sulfidrílicos (SH) in vivo ........................... 47
5 RESULTADOS E DISCUSSÕES .......................................................................... 49
5.1 ANÁLISE FITOQUÍMICA ..................................................................................... 51
5.2 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE GASTROPROTETORA ........................................ 50
5.2.1 Efeito do extrato metanólico da semente da E. involucrata, da A.
heterophyllus e de sua respectiva fração e subfração em úlcera aguda induzida
por etanol. ................................................................................................................ 51
5.2.2 Efeito do extrato metanólico da semente de E. involucrata, da A.
heterophyllus
e
sua
subfração
em
úlcera
aguda
induzida
por
AINE/parassimpaticomimético ............................................................................... 59
5.2.3 Efeito do extrato metanólico da semente de A. heterophyllus e E.
involucrata no modelo de úlcera crônica induzida por ácido acético (ensaio
curativo) ................................................................................................................... 64
5.3 MECANISMOS DE AÇÃO ................................................................................... 66
5.3.1 Efeito do extrato metanólico da semente da A. heterophyllus e da E.
involucrata sobre a secreção gástrica (ligadura de piloro) ................................. 66
5.3.2 Efeito do extrato metanólico da semente da A. heterophyllus e E.
involucrata sobre a secreção de muco na mucosa gástrica ............................... 68
5.3.3 Papel do óxido nítrico e do extrato metanólico da semente da A.
heterophyllus e da E. involucrata em úlcera aguda induzida por etanol ........... 69
5.3.4 Papel dos compostos sulfidrilas e do extrato metanólico da semente da
A. heterophyllus e da E. involucrata em úlceras agudas induzidas por etanol. 73
6 CONCLUSÃO ........................................................................................................ 78
REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 79
19
1 INTRODUÇÃO
O padrão alimentar e consequentemente a qualidade de vida do ser humano
passou por drásticas mudanças nos últimos anos e infelizmente estas alterações
tem resultado em um número cada vez maior de pessoas acometidas por patologias
no trato digestório, dentre as quais se destacam as gastrites, úlceras e carcinomas
(BRZOZOWSKI, 2003; OLIVEIRA, 2010; LEMOS et al., 2011).
O desenvolvimento da gastrite, úlcera e demais desordens gástricas ainda
não está bem esclarecido. Acredita-se que quando o sistema de defesa do trato
gastrintestinal entra em desequilíbrio a mucosa e o epitélio ficam expostos aos
agentes agressores, o que pode gerar lesões que irão desencadear as patologias
em discussão (BRZOZOWSKI, 2003).
A gastrite é caracterizada por um processo inflamatório no estômago, dividida
em três principais classificações: atrófica (aguda), não-atrófica (crônica) e formas
especiais, sendo que a crônica é a mais frequente. A úlcera, de acordo com o
National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (2004), representa
uma ferida que acomete o revestimento do estômago ou duodeno, podendo se
estender da camada da mucosa até a túnica serosa. Na maioria dos casos estas
doenças são consequência da bactéria Helicobacter pylori, do uso abusivo de álcool,
medicamentos anti-inflamatórios não esteroidais (AINEs), tabagismo e de uma
alimentação desequilibrada (REIS, 2003; PORTH, 2004).
Acredita-se que aproximadamente 10% da população mundial apresente ou
venha a apresentar sintomas referentes à úlcera péptica, em algum momento de sua
vida. Entre os sintomas mais comuns estão dispepsia, dor epigástrica, desconforto
abdominal, vômitos e refluxo. A úlcera péptica pode desencadear condições mais
complicadas, como hemorragia e perfuração, ambas associadas com alta
mortalidade e morbidade (BARKUN; LEONTIADIS, 2010).
Diante do grande número de pessoas acometidas pela gastrite e a
possibilidade da evolução do quadro clínico para úlcera, a procura por novos
tratamentos alternativos com efeitos colaterais menos deletérios se fazem
necessários, assim como, a procura de alimentos ou plantas que possam auxiliar
neste tratamento e/ou na gastroproteção (OLIVEIRA, 2010; LEMOS et al., 2011).
As espécies vegetais utilizadas tradicionalmente pela população na forma de
infusões, decocções e outras maneiras de preparo para tratamento de patologias
20
constituem fontes potenciais de substâncias com atividades biológicas. Assim como,
as dietas compostas em sua maioria por grãos, frutas e hortaliças, pois exitem
evidencias de um risco menor no desenvolvimento de inúmeras patologias em
indivíduos que possuem esse padrão alimentar (HAVSTEEN, 2002; MELO;
GUERRA, 2002; INCA, 2007).
Várias espécies de frutos contêm substâncias fitoquímicas, como os
flavonoides,
fundamentais
para
estabelecer
a
homeostase
no
organismo,
responsáveis por preservar tecidos celulares e consequentemente prevenindo
inúmeras patologias, tanto aquelas relacionadas com a má nutrição, como às
ocasionadas por infecções, inflamações e estresse oxidativo. A esta classe de
substâncias são atribuídas ações anti-inflamatória, antioxidante, antibacteriana,
hormonal, anti-hemorrágica, antialérgica e anticâncer (INCA, 2007).
O Núcleo de Investigações Químico-Farmacêuticas (NIQFAR) vem avaliando
ao longo dos anos diversas espécies silvestres, dentre estas, duas demonstraram
efeito gastroprotetor potente na triagem com o modelo de indução por etanol, em
camundongos. Estas são: Artocarpus heterophyllus Lam. (A. heterophyllus) e
Eugenia involucrata DC. (E. involucrata).
As espécies, supracitadas, já são utilizadas na cultura popular para
tratamento de doenças. Os frutos da E. involucrata são conhecidos por possuírem
atividade antidiarréica e digestiva (LORENZI, 2000; SILVA et al., 2003; SANTOS,
2006). Estudos científicos mostram que a A. heterophyllus possui atividade
hipoglicêmica e hipolipemiante, além de possuir atividade antibacteriana (TIMYAN,
1996; CHACKREWARTHY et al., 2010; OMAR et al., 2011).
A A. heterophyllus e a E. involucrata são espécies frutíferas, ricas em açúcar
e fontes de vitaminas, minerais, fibras dietéticas e diferentes fitoquímicos, como
flavonoides, polifenois, carotenóides e terpenos que representam compostos
bioativos de potente atividade antioxidante, demonstrando a viabilidade na
continuidade das pesquisas no efeito gastroprotetor e aprofundamento para
verificação de uma possível ação antiúlcera, sugerindo a utilização destas espécies
tanto na prevenção, quanto no tratamento das desordens gástricas, considerando
que tais patologias tem sido relacionadas com estresse oxidativo (NAGASHIMA,
1989; OGATA et al., 2000).
21
2 OBJETIVOS
2.1
OBJETIVO GERAL
Avaliar o potencial gastroprotetor e antiúlcera do extrato metanólico das
sementes da Eugenia involucrata e da Artocarpus heterophyllus em modelos de
úlcera experimental in vivo.
2.2
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
- Avaliar a atividade gastroprotetora do extrato metanólico das sementes da A.
heterophyllus e da E. involucrata através do modelo de indução de úlcera aguda por
etanol e anti-inflamatórios não esteroidais (AINEs) em roedores;
- Verificar o potencial antiúlcera do extrato metanólico das sementes da A.
heterophyllus e da E. involucrata através do modelo de indução de úlcera crônica
(ensaio curativo) com ácido acético, em roedores.
- Avaliar o potencial gastroprotetor da fração e subfração metanólica do
extrato metanólico das sementes da A. heterophyllus através do modelo de indução
de úlcera aguda por etanol e da subfração através do modelo de indução de úlcera
aguda por AINEs em roedores;
- Analisar o efeito do extrato metanólico das sementes da A. heterophyllus e
da E. involucrata sobre a secreção gástrica ácida e sobre a produção de muco;
- Verificar se a ação gastroprotetora do extrato metanólico das sementes da
A. heterophyllus e da E. involucrata é dependente da via óxido nítrico e dos
compostos sulfidrilas;
- Comparar o potencial gastroprotetor dos extratos metanólicos, da fração e
subfração metanólica com a cimetidina, fármaco utilizado no tratamento de gastrites
e úlceras.
22
3 REVISÃO DA LITERATURA
3.1
FISIOLOGIA DO ESTÔMAGO
Ao consumirmos um alimento ele passa por diversos processos digestivos, os
quais se iniciam na boca com a mastigação e passam pelo esôfago para chegar ao
estômago, onde a decomposição física do alimento tem continuidade, neste órgão o
alimento é envolvido pelo suco gástrico que contém ácido clorídrico e enzimas
responsáveis por “quebrar” os alimentos em substâncias mais simples passíveis de
absorção na mucosa intestinal (GUYTON, 1988; FLOCH, 2007; LEMOS et al., 2011)
Considerado um reservatório, o estômago possui formas e volumes variáveis
que dependem da particularidade da anatomia de cada indivíduo, sendo o mais
comum possuir a forma de “J”. É composto por uma túnica mucosa de cor cinzentoavermelhado, com uma única camada de células epiteliais superficiais. Possui três
divisões, o fundo, a porção superior do órgão, o cólon e o antro que termina no
piloro. Também, contém duas curvaturas, dois esfíncteres (cárdia e piloro), o vaso
principal e as artérias para irrigação do trato gastrintestinal, tendo capacidade
aproximada de 1200 mililitros (REIS, 2003; FLOCH, 2007).
O estômago é constituído por quatro camadas, a mucosa, a submucosa, a
muscular e a serosa. Na mucosa estão presentes diversas células responsáveis pela
produção do suco gástrico, as quais se diferem de acordo com o tipo secreção,
sendo, a secreção parietal composta por ácido clorídrico e fator intrínseco e a
secreção não parietal, também denominada secreção péptica, composta por muco,
bicarbonato, sódio, potássio e pepsinogênio (HAUBRICH; SCHAFFNER; BERK,
1995; REIS, 2003; GUYTON; HALL, 2011).
A movimentação para digestão no trato gastrintestinal ocorre de acordo com
diversos estímulos que resultam no controle do esvaziamento gástrico. Quando
repleto o estômago diminui o tamanho do fundo dando origem às contrações
sistólicas do antro terminal que influenciaram no esvaziamento gástrico, que
dependerá da distensão do duodeno ou jejuno, da ação da gastrina no estímulo da
motilidade antral, da pressão do esfíncter esofagiano, da diminuição da motilidade
gástrica e do relaxamento do piloro, que promoverão estímulos irritantes, assim
como a liberação da enterogastrona que promoverá a acidificação do duodeno
(HAUBRICH; SCHAFFNER; BERK, 1995; REIS, 2003).
23
Além dos fatores endógenos citados, para o esvaziamento gástrico há
também a influência dos fatores emocionais, como estresse e tensão na hora da
alimentação. Assim, considerando a quantidade de alimento consumido, o qual
determinará o volume alimentar gástrico e consequentemente a velocidade de
esvaziamento, atenta-se para a alteração da distensão da parede o que causará a
excitação da bomba pilórica e inibição do piloro. A gastrina, então, aumentará a
atividade desta bomba produzindo mais secreção de suco gástrico altamente ácido.
Fatores estes relevantes na relação da fisiologia com as patologias gástricas
(HAUBRICH; SCHAFFNER; BERK, 1995; REIS, 2003).
Como mencionado acima, a secreção gástrica é constituída de água, ácido
gástrico, mucina, ânions, cátions, enzimas, hormônios e fator intrínseco. É
responsável pelo início do processo de digestão da proteína e é produzida em
grande quantidade durante o dia, cerca de 2,5 litros, sendo regulada pela via
humoral, nervosa e hormonal, ocasionando um grande gasto energético (JONHSON;
JONHSON, 1997; GUYTON; HALL, 2011).
Dentre os hormônios que estimulam a secreção das glândulas gástricas, há a
acetilcolina, que estimula a produção de ácido clorídrico através da ativação de
diferentes células secretoras, que liberam no lúmen o pepsinogênio, ácido clorídrico,
muco, gastrina e histamina. A gastrina aumentará a secreção de ácido clorídrico
estimulando a atividade reflexa entérica que produzirá mais ácido gástrico
(JONHSON; JONHSON, 1997; GUYTON; HALL, 2011). Assim como a histamina,
que é um cofator para a secreção de ácidos pelas células parietais (Figura 1).
Algumas substâncias como os aminoácidos circulantes, cafeína e álcool, também
estimulam a secreção ácida (JOHNSON; JOHNSON, 1997; ENCICLOPÉDIA, 2000;
GUYTON; HALL, 2011).
24
Figura 1- Esquema representativo da secreção de ácido clorídrico pela célula
parietal e da produção de muco pela célula epitelial superficial
Fonte: http://www.sistemanervoso.com/pagina.php?secao=8&materia_id=133&materiaver=1
Levando em consideração que a secreção do suco gástrico tem como função
a digestão das proteínas e que a parede do estômago é formada por músculo liso,
que tem em sua estrutura proteínas é relevante destacar os sistemas de proteção
deste órgão, sendo os mais importantes, o muco (uma superfície protetora de
mucosa), fluxo sanguíneo, o estado secretor, a alcalinização, regulação do pH,
impermeabilidade da mucosa aos íons H+ e a agilidade de reconstituição epitelial
(REIS, 2003; GUYTON; HALL, 2011).
3.2
FISIOPATOLOGIA DA GASTRITE E DA ÚLCERA PÉPTICA
Envolvida por uma incerteza na área clínica médica, a gastrite e a úlcera
péptica não tem uma etiologia bem compreendida, acredita-se que o sistema de
proteção do estômago se torna ineficiente e o suco gástrico passa a agredir a
mucosa e o epitélio gerando lesões, inflamações e necroses na área atingida
(BRZOZOWSKI, 2003; FLOCH, 2007).
A gastrite vem sendo encarada pelos médicos como uma inflamação na
túnica da mucosa do estômago (BRZOZOWSKI, 2003; REIS, 2003; FLOCH, 2007).
A úlcera péptica é definida pelo National Institute of Diabetes and Digestive and
25
Kidney Diseases (2004) como sendo uma ferida no revestimento do estômago ou
duodeno, geralmente crônica e isolada.
Ambas, úlcera péptica e gastrite podem estar associadas a fatores internos
como a genética, patologias infecciosas e/ou patologias granulomatosas associadas
a doenças crônicas e a fatores externos como qualidade de vida, estresse, consumo
de álcool, cafeína, drogas e medicamentos como aspirina e anti-inflamatórios não
esteroidais e/ou a infecção pela bactéria Helicobacter pilory (WOLFE; SANCHS,
2000; REIS, 2003; BRUTON; LAZO; PARKER, 2006).
Assim, para melhor classificar a gastrite recentemente foi realizado um
consenso médico que a classificou em não-atrófica, atrófica e formas especiais,
sendo que a mais comum, causada pela bactéria Helicobacter pylori, se enquadra
em não-atrófica, sendo esta a mais frequente, podendo resultar em atrofia gástrica,
metaplasia intestinal e úlcera péptica (PORTH, 2004; FLOCH, 2007).
Helicobacter pylori é uma bactéria gram-negativa que tem como habitat
específico a mucosa gástrica, possibilitando sua relação com a destruição das
células neste local (SIQUEIRA et al., 2007; FALCÃO et al., 2008). Considera-se
esta bactéria o principal agente etiológico da úlcera péptica em humanos, apresenta
uma prevalência de 40% em países desenvolvidos, chegando a 80% em países em
desenvolvimento (SOUZA et al., 2009).
A úlcera péptica, não diferentemente da gastrite, como citado acima, pode ser
provocada por diversos fatores, um deles o etanol, constituinte das bebidas
alcoólicas e que é considerado um dos agentes agressores da mucosa gástrica mais
intenso. Promove distúrbios como, isquemia, aparecimento de radicais livres,
degranulação de mastócitos, inibição da produção de prostaglandinas e diminuição
na produção do muco gástrico. Úlceras gástricas também são frequentemente
causadas pelo excesso no consumo de AINEs, um dos maiores indutores de lesões
ulcerativas
na
mucosa,
pois
inibem
a
produção
de
prostaglandinas
e
consequentemente aumentam a liberação de ácido gástrico e diminuem a produção
do muco citoprotetor (HIRUMA-LIMA et al., 2000).
Além das causas citadas acima, acredita-se que produtos do metabolismo do
ácido araquidônico, espécies reativas de oxigênio relacionadas aos eventos de
oxidação e formação de peróxido e elementos celulares, sejam os responsáveis pelo
desencadeamento das inflamações, depleções nas reservas energéticas das
26
mitocôndrias e danos no DNA das células do sistema digestório (BECKMAN;
KOPPENOL, 1996; REPETTO; LLESUY, 2002).
Os sintomas mais comuns da gastrite são dor abdominal, náusea e anorexia,
é comum também o relato de pacientes com distensão abdominal e sensação de
queimação epigástrica. Em casos mais graves podem ocorrer vômitos e
intolerâncias alimentares, assim como a perda de peso. As manifestações clínicas
da úlcera péptica são relacionadas à gastrite devido à interação entre as patologias,
em casos de não complicação concentra-se na dor do tipo queimação ou cólica e
desconforto (PORTH, 2004; FLOCH, 2007).
3.2.1 Mecanismos de proteção do estômago
Como mencionado anteriormente, as lesões na parede do estômago e
duodeno são geradas por um desequilíbrio entres os mecanismos de defesa e os
fatores lesivos, principalmente a secreção de ácido e de pepsina. Os mecanismos de
defesa podem ser classificados separadamente de acordo com suas funções, sendo
que todos envolvem o epitélio gástrico, responsável pela renovação das células
progenitoras da mucosa. O epitélio é reconstituído a cada 2-4 dias, sendo esta uma
característica importante para a integridade da mucosa e, portanto, proteção da
mesma, acarretando em maior resistência (TULASSAY; HERSZENYI, 2010).
Entre os mecanismos de defesa estão os fatores luminais, que se encontram
na porção luminal do epitélio gástrico e compreendem o suco gástrico que apresenta
em sua composição o ácido clorídrico, imunoglobulinas e lactoferrina que reduzem a
colonização
bacteriana
mediante a formação
de
um
ambiente
de difícil
desenvolvimento das bactérias (TULASSAY; HERSZENYI, 2010).
Além do mecanismo do suco gástrico, há a barreira de muco e bicarbonato,
considerada a primeira linha de defesa da mucosa. É a única barreira entre o epitélio
e a luz, composta por um gel de muco, bicarbonato e fosfolipídios surfactantes, de
característica viscosa, maleável e aderente. O muco possui uma importante função
estrutural na camada que retém o bicarbonato secretado pelas células epiteliais,
resultando em pH próximo a neutralidade, atuando contra a ação da pepsina e do
ácido clorídrico (ALQASOUMI et al., 2009).
Também, no epitélio, além da secreção das células de superfície
responsáveis pela secreção do muco e bicarbonato, ocorre a secreção de proteínas
27
de choque térmico, as quais têm como função a manutenção da homeostase celular
mediante o estresse oxidativo e aumento da temperatura evitando a desnaturação
das proteínas de proteção (TULASSAY; HERSZENYI, 2010).
Uma perfusão adequada de sangue no trato gastrintestinal também evita
danos epiteliais nas camadas mais profundas da mucosa. Nesse caso, o fluxo
sanguíneo é um mecanismo de defesa que age no abastecimento da
microcirculação da mucosa, mantendo as células nutridas e com oxigênio. Assim,
quando a mucosa é agredida por agentes irritantes as células endoteliais produzem
vasodilatadores, como o óxido nítrico e prostaciclina I2, que agem protegendo a
mucosa contra agentes vasoconstritores, como os leucotrienos, tromboxanos e a
endotelina (WALLACE; MILLER, 2000).
Outro fator relevante na proteção da mucosa contra as lesões que podem
ocasionar a úlcera são as prostaglandinas, um agente facilitador e estimulante da
maioria dos outros mecanismos gastroprotetores, descritos acima. É responsável
pela geração contínua de PGI2 e PGE2, indispensáveis para manutenção da
integridade gástrica. Além disso, inibe a liberação de ácido gástrico, aumenta o fluxo
sanguíneo, estimula a produção de muco e bicarbonato e acelera o processo de
cicatrização (BROZOZWSKI, 2003; TULASSAY; HERSZENYI, 2010; MADALOSSO,
2011).
3.2.2 Diagnóstico e tratamento da gastrite e úlcera péptica
Para diagnóstico da gastrite e úlcera péptica pode ser realizado uma
investigação, obtenção da história da patologia, avaliação-padrão que inclui a
endoscopia do trato gastrintestinal superior com biópsia e exames de imagem por
radiologia. Em casos de atrofia é realizado o teste de anticorpos de células parietais
(PORTH, 2004; FLOCH, 2007).
Para estabelecer a presença da bactéria Helicobacter pylori são utilizados o
teste respiratório para uréia C, o teste de antígeno em fezes, biópsia e exames de
sangue para obter os valores sorológicos da bactéria (PORTH, 2004; FLOCH, 2007).
O tratamento para a gastrite e úlcera péptica, por muito tempo foi baseado na
supressão da secreção ácida, todavia, pesquisas tem direcionado seus estudos para
drogas com mecanismos reguladores e cicatrizantes, envolvidos no quadro
28
ulcerativo (DAJANI; KLAMUT, 2000; WALLACE, 2005). Os fármacos utilizados
atualmente no tratamento de gastrites e úlceras pépticas envolvem:
- Fármacos de terapia antissecretória, que inibem ou neutralizam a secreção
de ácido gástrico, como a cimetidina e ranitidina que antagonizam receptores de H2
da histamina;
- Inibidores da bomba de prótons (H+-K+)-ATPase, que agem na fase final de
secreção, sendo deste grupo o omeprazol, fármaco utilizado por grande parte da
população com sintomas gástricos;
- Antiácidos neutralizadores do ácido gástrico, como o hidróxido de magnésio
e bicarbonato de sódio;
Além dessas três linhas de fármacos, exitem os protetores da mucosa, como
o quelato de bismuto e sucralfato (RANG; DALE; RITTER, 2001; BRUTON; LAZZO;
PARKER, 2006).
Associada ao uso de medicamentos, a alimentação se torna um fator
relevante no tratamento das desordens gástricas, pois, quando adequada às
necessidades e sintomas de cada indivíduo pode auxiliar na recuperação e
manutenção do estado nutricional deste, atuando na redução da secreção gástrica,
na promoção do esvaziamento gástrico adequado e na diminuição de efeitos
colaterais dos medicamentos e da interação entre eles, além de manter a hidratação
corporal estável (REIS, 2003; FLOCH, 2007).
Mediante a importância das patologias descritas, a gastrite e a úlcera péptica,
a busca por terapias mais eficazes e com menos efeitos colaterais se torna relevante
para o meio científico e médico, sendo necessários mais estudos da fisiopatologia do
trato gastrintestinal, assim como sua relação com os produtos bioativos das espécies
vegetais, as quais nos últimos anos vem se demonstrando capazes de produzirem
efeitos idênticos ou até melhores que dos medicamentos sintéticos no tratamento da
úlcera péptica (SCHMEDA-HIRSCHMANN; YESILADA, 2005; LEMOS et al., 2011).
3.3
UTILIZAÇÃO DA FITOTERAPIA NO TRATAMENTO DE PATOLOGIAS
O termo “fitoterapia” resultou da junção das palavras gregas “Phython”
(planta) e “Therapeia” (terapia), ou seja, terapia com as plantas, visando o estudo
das espécies tidas como medicinais e as suas aplicações no tratamento de
patologias (CARVALHO, 2004; TESKE; TRENTINI, 2001). As plantas fazem parte da
29
vida do ser humano desde o início das civilizações, como fonte de alimentos, de
materiais para o vestuário, habitação, utilidades domésticas, defesa e como meio de
restaurar a saúde (SIMÕES et al., 2004; NOLLA; SEVERO; MIGOTT, 2005).
São utilizadas como medicamentos a muito tempo, na China, há registros de
cultivo de plantas medicinais desde de 3000 a.C., com elas eram produzidos
vermífugos, purgantes, cosméticos, diuréticos e gomas que serviam para
embalsamar múmias. Hipócrates (460-377 a.C.), em sua obra Corpus Hipocraticum,
escreveu sobre doenças e os respectivos remédios elaborados com plantas,
ressaltando o interesse pelas espécies vegetais desde a antiguidade (SIMÕES et al.,
2004; NOLLA; SEVERO; MIGOTT, 2005).
No Brasil, os primeiros europeus que chegaram se depararam com uma
grande quantidade de plantas medicinais, essas usadas pelas inúmeras tribos
indígenas que aqui viviam. Por intermédio dos Pajés os conhecimentos das ervas
foram transmitidos e aprimorados de geração em geração, mas, infelizmente, com o
início da industrialização e subsequente urbanização do país, o conhecimento das
plantas passou para segundo plano, o acesso a medicamentos sintéticos e a não
preocupação em comprovar as propriedades terapêuticas das plantas tornou o
conhecimento da flora medicinal um atraso. O estudo das plantas medicinais
mostrou uma resistência inicial a acompanhar as grandes revoluções científicas do
período, mas com o tempo e reconhecimento por parte dos cientistas voltou a
ganhar força (LORENZI; MATTOS, 2002; PINTO, 2008).
De acordo com a Organização Mundial de Saúde, 65 a 80% da população de
países em desenvolvimento utilizavam como primeira opção de tratamento as
plantas medicinais, e essa alternativa, têm ajudado no tratamento de diversas
patologias, considerando o vasto conhecimento popular (NOLLA; SEVERO;
MIGOTT, 2005; LIMA, 2006).
As novas tendências globais de uma preocupação com a biodiversidade e as
idéias de desenvolvimento sustentável trouxeram novas áreas de estudos das
espécies vegetais, que acabaram despertando novos interesses na fitoterapia, os
quais criaram novas linhas de pesquisa em Universidades brasileiras, que buscam
validar a utilização das plantas. Considera-se validada a espécie que responder
positivamente à aplicação do conjunto de ensaios capazes de comprovar a
existência que lhe é atribuída, bem como sua toxicidade (CORREA; BATISTA;
QUINTAS, 2001; LORENZI; MATTOS, 2002; PINTO, 2008).
30
Após várias discussões e grupos de trabalhos, o Ministério da Saúde publicou
em 2006 a Portaria nº 971, contendo a Política Nacional que recomendou a adoção
pelas secretarias de saúde dos estados e dos municípios, a introdução das ações e
serviços relativos a práticas integrativas e complementares para tratamento das
patologias nos serviços de saúde (BRASIL, 2006).
Ainda, em 2006 o então presidente Luís Inácio Lula da Silva assinou o
Decreto nº 5.813, que aprovou a Política Nacional de Plantas Medicinais e
Fitoterápicos e instituiu o grupo de trabalho interministerial, para elaborar o
Programa direcionado à esta Política, o qual buscou e busca nortear a ampliação
das opções terapêuticas aos usuários do SUS, a valorização e preservação do
conhecimento tradicional unido ao desenvolvimento científico e tecnológico (LOPES;
COUTINHO, 2008). Levando em consideração que os medicamentos fitoterápicos,
de acordo com a Agência Nacional de Vigilância Sanitária, em sua resolução número
14 de 2010 são “os obtidos com emprego exclusivo de matérias-primas ativas
vegetais, cuja eficácia e segurança são validadas por meio de levantamentos
etnofarmacológicos, de utilização, documentações tecnocientíficas ou evidências
clínicas”.
Mediante a relevância da fitoterapia e os efeitos adversos causados pela
gama de medicamentos sintéticos utilizados no tratamento da gastrite e
principalmente das úlceras pépticas, ressalta-se a importância de mais pesquisas
voltadas ao desenvolvimento de novos medicamentos e de terapias alternativas que
minimizem os efeitos colaterais dos medicamentos utilizados tradicionalmente
(KLEIN-JÚNIOR et al., 2010; SANTIN et al., 2010).
A atividade gastroprotetora das plantas pode estar vinculada a diversos
compostos químicos isolados, como flavonoides, esteroides, terpenoides e as
saponinas (SOUCCAR; LIMA-LANDMAN; LAPA, 2002).
3.4
ESPÉCIES VEGETAIS COM ATIVIDADE GASTROPROTETORA
Os efeitos colaterais dos medicamentos sintéticos utilizados no tratamento
das úlceras pépticas têm estimulado pesquisas que visam o estudo de terapias
alternativas que possam ser mais eficazes ou que gerem menos efeitos indesejados,
e nesse contexto, as plantas medicinais vêm ganhando destaque, principalmente
quando considerado os compostos químicos de muitas espécies vegetais, como os
31
flavonoides, terpenoides, saponinas e esteroides, os quais são exemplos de
substâncias de interessante efeito gastroprotetor (ALKOFAHI; ATTA, 1999;
GONZALES et al., 2000; SOUCCAR; LIMA-LANDMAN; LAPA, 2002).
Entre as plantas com relato de efeito gastroprotetor mediante pesquisas
científicas, há a espécie Maytenus truncata Reiss uma planta nativa da Bahia,
conhecida como “espinheira santa”, usada popularmente na forma de infusão das
folhas para tratamento de úlcera gástrica, sendo que experimentalmente sua
administração de extratos brutos reduziu a severidade de úlcera gástrica induzida
pelo estresse ao frio em ratos (SILVA et al., 2005).
Segundo Markman, Bacchi e Kato (2004), a Campomasia xanthocarpa,
conhecida no Brasil por “gabiroba” e usada no tratamento preventivo de patologias
no trato gastrintestinal, demonstrou efeito preventivo da úlcera gástrica mediante a
administração oral do extrato hidroalcoólico das folhas (400 mg/kg) em ratos, não
produzindo efeito tóxico em doses superiores a 5 g/kg.
Além dessas, resultados experimentais de extrato clorofórmico de Tanacetum
larvatum administrado em ratos na dose de 50 mg/kg, mostraram ter um efeito
promissor no tratamento de doenças inflamatórias e efeito gastroprotetor
(PETROVIC et al., 2003).
A Byrsonimacrassa niedenzu (Malpigheaceae), planta utilizada na medicina
popular para tratar doenças relacionadas ao aparelho digestivo, teve seu efeito
gastrotroprotetor comprovado em modelo experimental de úlcera induzida pela
associação de ácido clorídrico e etanol com extratos hidrometanólicos, metanólicos e
clorofórmicos de suas folhas. Essa planta contém compostos fenólicos como
quercetina e catequina que podem explicar o efeito protetor na mucosa
(SANNOMIYA et al., 2005).
Também, de acordo com Lemos et al. (2011), o extrato hidroalcoólico das
folhas da Brassica oleracea L. var. acephala DC. (couve), um alimento funcional já
utilizado
em
desordens
gástricas
pela
população
apresentou
atividade
gastroprotetora promissora em roedores induzidos a úlcera por diferentes
metodologias. A gastroproteção foi relacionada ao seu perfil fitoquímico, composto
por flavonoides glicosilados, glicosinolatos e compostos fenólicos. De acordo com os
resultados observados pelos pesquisadores, esses componentes bioativos podem
exercer seu efeito farmacológico por sinergismo, sendo que os mecanismos de ação
podem estar relacionados com fatores antioxidantes (participação do NO e GSH),
32
fatores anti-inflamatórios (participação da PGE2) e/ou a inibição da secreção ácida
(bloqueio da (H+-K+)-ATPase).
A Achyrocline satureoides (Lam.) D.C. popularmente conhecida como marcela
e muito utilizada no sul do Brasil no tratamento de desordens gástricas, inclusive
para gastrite, também foi avaliada por Santin et al. (2010), que através de modelos
animais induzidos a úlcera péptica, puderam confirmar o que já dizia a medicina
tradicional, já que o extrato hidroalcoólico da Achyrocline satureoides e suas frações
hexânica e metanólica apresentaram ação gastroprotetora, estando provavelmente
relacionada com o aumento da produção de muco. No ensaio de úlcera crônica
induzida por ácido acético, o extrato e as frações apresentaram também, atividade
curativa das lesões ulcerativas. Segundo Klein-Júnior et al. (2012) e Santin et al.
(2010) as atividades de proteção podem estar relacionadas aos seus compostos
fitoquímicos: flavonoides, terpenos e esteroides.
Assim, diante dos dados supracitados, podemos observar que as plantas
medicinais podem ser incluídas no tratamento de patologias do trato gastrintestinal,
como no caso das úlceras pépticas, mas que necessitam de maiores pesquisas para
poderem se tornar uma terapia eficaz e com menores riscos de efeitos colaterais,
levando em consideração que muitas já têm demonstrado atividade gastroprotetora,
mas o mecanismo gastroprotetor envolvido continua, na maioria das espécies
estudadas, uma incógnita.
3.4.1 Frutos e atividade gastroprotetora
Os radicais livres são compostos instáveis e altamente reativos que contém
elétrons desemparelhados. Para sua estabilização reagem com moléculas estáveis,
buscando capturar elétrons e acabam gerando novos radicais livres (KAUR; KAPOO,
2001). Podem ser gerados de maneira endógena, no citoplasma, nas mitocôndrias
ou na membrana (ANDERSON, 1996; YU; ANDERSON, 1997). E, também, por
estímulos exógenos, como a exposição a radiações gama e ultravioleta, uma dieta
com alta ingestão de gorduras totais e gorduras saturadas, colesterol, açúcar e sódio
refinado, associado com a baixa ingestão de gordura insaturada, grãos integrais,
legumes, frutas e verduras, além do tabagismo, estresse, ingestão de álcool e uso
abusivo de fármacos (HASLER, 2002).
33
A presença desses radicais livres é critica para a homeostase das funções
fisiológicas e, portanto, para a manutenção da saúde humana (POMPELLA, 1997). A
sua produção contínua durante os processos metabólicos estimula mecanismos de
defesa antioxidante, que a limitam, diminuindo seus níveis intracelulares impedindo a
indução de danos. Porém, quando há o desequilíbrio entre a formação e inativação
desses radicais livres, ocorre o estresse oxidativo, o qual está associado direta e
indiretamente ao desenvolvimento de diversas patologias, inclusive as desordens no
trato gastrintestinal (AMES; SHIGENAGA; HAGEN, 1993; SIES, 1993).
Os antioxidantes que são agentes responsáveis pela inibição e redução das
lesões causadas pelos radicais livres nas células apresentam papel importante no
sistema de defesa do organismo (SHAHIDI; NACZK, 1995; GUTTERIDGE;
HALLIWELL, 2000).
Estudos demonstraram a presença de diversos flavonoides, substâncias
antioxidantes, nos produtos de origem natural, principalmente em frutos, estando
localizados em abundância nas angiospermas (MELO; GUERRA, 2002). Os
flavonoides além de atuar como antioxidantes também agem como quelantes de
metais. As flavonas e os flavonóis são as duas principais classes de flavonoides
encontrados na natureza (HARBORNE; WILLIAMS, 2000). Tais compostos podem
inibir o crescimento ou matar muitas cepas bacterianas, inibir importantes enzimas
virais como transcriptase reversa e proteases, bem como destruir alguns
protozoários patogênicos. Sendo que todas essas atividades são exercidas com
baixa toxicidade em células animais (HAVSTEEN, 2002).
Pesquisas têm levado em consideração o desenvolvimento de métodos de
cultivo, armazenamento e conservação desses frutos, como também as técnicas de
isolamento de substâncias específicas para fins nutricionais e formulação de
métodos que conservem os compostos bioativos ou substâncias que atuem
diretamente no funcionamento do organismo. Essas substâncias que apresentam
propriedades fitoterápicas presentes nos vegetais podem certamente após
comprovação científica serem utilizadas no tratamento das enfermidades mais
comuns da sociedade. Visto que foi comprovado que os polifenóis presentes na
maioria das espécies vegetais combatem com agilidade os radicais livres (INCA,
2007).
A úlcera gastroduodenal é uma desordem comum do trato gastrintestinal.
Pode se desenvolver quando há um desequilíbrio entre os fatores defensivos e
34
agressivos sobre a mucosa, resultantes da potencialização dos fatores agressivos
ou
da
diminuição
da
proteção
da
mucosa
(TASMAN-JONES,
1986;
RAMAKRISHNAN; SALINAS, 2007; LAINE; TAKEUCHI; TARNAWSKI, 2008). Após
vários estudos, tem se aceitado que a úlcera gástrica é causada principalmente pelo
estresse oxidativo (KOUNTOURAS; CHATZOPOULOS; ZAVOS, 2001; DEMIR et al.,
2003).
Dessa maneira, levando em consideração o excesso na produção de radicais
livres nas desordens gastrintestinais e os estudos com frutos que tem identificado
diversos antioxidantes, torna-se viável explorar os benefícios dessas espécies
vegetais e de seus fitoconstituintes em doenças como a gastrite e a úlcera péptica.
Dentre alguns dos estudos já realizados nesta área, está a pesquisa com o
Aegle marmelos, vulgarmente conhecido como Bael, uma árvore espinhosa
pertencente à família Rutaceae. Esta espécie possui o eugenol (C10H12O2), presente
no extrato da folha e que possui potente propriedade antioxidante, além de inibição
da peroxidação lipídica (NAGASHIMA, 1989; OGATA et al., 2000; JAGETIA;
VENKATESH; BALIGA, 2003).
O fruto da Aegle marmelos também foi pesquisado. O extrato aquoso da
polpa demonstrou possuir atividade antioxidante, rendendo a mucosa gástrica, maior
resistência aos ferimentos gerados pelas agressões da aspirina (WALLACE, 2001).
A dose utilizada foi de 400 mg/kg de peso corpóreo. Foi utilizado como controle
positivo o omeprazol (fármaco padrão). Os resultados mais salientes desse estudo
sugeriram que os compostos fenólicos do extrato aquoso da fruta possuem uma boa
fonte
de
antioxidantes,
que
exerceram
efeitos
protetores
contra
úlcera
gastroduodenal induzida por aspirina em ratos albinos (DAS; ROY, 2012).
Apesar de as propriedades medicinais das espécies vegetais serem
atribuídas principalmente a presença de flavonoides, elas também podem ser
influenciadas por outros compostos orgânicos e inorgânicos, tais como cumarinas,
alcaloides, terpenos, taninos, ácidos fenólicos e micronutrientes antioxidantes, por
exemplo, cobre, zinco, manganês (CZINNER et al., 2001), como é o caso do fruto
Musa sapientum (banana) que foi relatado na prevenção de várias doenças,
inclusive nas lesões da mucosa gástrica.
O estudo com a Musa sapientum foi desenhado para avaliar a eficácia do pó
no tratamento da úlcera péptica induzida por indometacina em ratos. Foi verificado
que o tratamento com Musa sapientum e omeprazol aumentou significativamente
35
(34,96%, 24,06%), o óxido nítrico na mucosa do tecido do trato gastrointestinal,
ressaltando que os componentes ativos, tais como a leucocianidina foram relatados
como os responsáveis por proteger a mucosa através da estimulação da proliferação
de células, promoção da secreção de muco, e inibição da secreção de HCl (ácido
clorídrico) (BEST; LEWIS, 1984; DUNIJIC et al., 1993; PRABHA et al., 2011).
Além dos frutos, as sementes dos frutos também têm sido estudadas.
Brzozowski et al. (2005) realizaram uma pesquisa com extrato da semente da
toranja (Citrus grandis) e observaram que exerce uma potente atividade
gastroprotetora contra lesões induzidas por etanol e estresse através do aumento na
produção de prostaglandinas endógenas, supressão de peroxidação lipídica e
hiperemia, possivelmente, mediada por óxido nítrico. Além disso, associaram essas
ações
gastroprotetoras
a
atividade
antioxidante
de
flavonoides
como
a
naringenina. Também, verificaram que o suco da toranja apresenta potente atividade
in vitro contra Helicobacter pylori (BAE; HAN; KIM, 1999; TIRILLINI, 2000).
Em estudos anteriores já havia sido demonstrado que a Citrus grandis possui
outro flavonoide, o meciadanol, um flavonoide que inibe a histidina descarboxilase,
diminuindo com isso o teor de histamina no estômago, atenuando as lesões
gástricas produzidas pelo etanol e ácido (KONTUREK et al., 1986).
Também
as
sementes
da
Trigonella
foenum-graecum,
conhecida
popularmente como feno-grego, usada como condimento em lares indianos, na
cultura popular são relatadas como estimulantes dos processos digestivos. Foram
utilizadas para tratar doenças gastrintestinais no sistema de medicina indiano (PURI,
1998).
O estudo de Pandian, Anuradha e Viswanathan (2002) mostraram que as
frações das sementes da Trigonella foenum-graecum agem na proteção gástrica, de
maneira dose-dependente contra os efeitos do etanol, um agente necrotizante. As
sementes demonstraram ser tão potentes quanto o omeprazol, sendo que a fração,
foi significativamente mais eficaz do que o extrato aquoso. A via de ação para
gastroproteção das sementes da Trigonella foenum-graecum, envolve o mecanismo
de aumento na produção de muco, sugerindo uma ação citoprotetora, e no
mecanismo antissecretor, também importante para proteção da cavidade gástrica.
Além disso, parecem influenciar a formação de radicais livres, pois, o índice de
peroxidação (TBARS) foi baixo, o que é associado com atividades aumentadas de
enzimas antioxidantes.
36
3.5
Artocarpus heterophyllus Lam.
A Artocarpus heterophyllus Lam. é uma espécie vegetal de origem
subespontânea, não endêmica do Brasil, originária da Índia. No Brasil está
distribuída em várias regiões: no norte, no nordeste, no centro-oeste e no sudeste.
Possui como nomes vernaculares jaca, brasil e português (ROMANIUC NETO et al.,
2012). Pertence à família Moraceae. É uma árvore de porte médio perene,
geralmente atinge de 8 a 25 m de altura, produz frutos grandes, que podem chegar a
35 kg (SAMMADAR, 1985).
Na Índia a A. heterophyllus é um alimento popular e ocupa a terceira posição
na produção anual após manga e banana (SAMMADAR, 1985; ALAGIAPILLAI et al.,
1996; HAQ, 2006). É o fruto nacional de Bangladesh e considerado extremamente o
mais importante para os nativos. Também referido como alimento dos pobres, barato
e de fácil acesso (BOSE, 1985; BALIGA et al., 2011).
O uso medicinal da A. heterophyllus utiliza de todas as partes para
preparação de medicamentos mediante princípios da medicina Ayurveda e Yunani
local da Índia. Sendo recomendada para aumento da virilidade, melhora na digestão,
como antidiarreica, para doenças de pele, na cicatrização, sistema respiratório
(asma),
como
antidiabética,
anticariogênica,
antifúngica
e
antineoplásica
(MUKHERJEE, 1993; BALIGA et al., 2011).
A. heterophyllus possui frutos carnudos, fibrosos e ricos em açúcares. São
fontes de minerais, ácidos carboxílicos, fibras dietéticas e vitaminas como ácido
ascórbico (RAHMAN et al., 1999). Estudos têm mostrado que a A. heterophyllus
contém variadas classes de compostos fitoquímicos, como os carotenoides,
flavonoides, ácidos voláteis, esteróis e taninos, os quais podem atuar como
protetores da mucosa gástrica (WONG; LIM; WONG, 1992; LIN; LU; HUANG, 2000;
CHANDRIKA; JANSZ; WARNASURIYA, 2004; ARUNG; SHIMIZU; KONDO, 2007;
BALIGA et al., 2011).
No mercado, alguns produtos com A. heterophyllus estão disponíveis,
misturado com mel e enlatados. Na sua forma desidratada vem sendo usada em
sopas instantâneas, produtos de panificação, bebidas, laticínios, doces, sorvetes,
alimentos para bebês, massas, entre outros (PUA et al., 2007). Suas sementes são
fontes nutritivas e importantes na dieta dos indianos, são cozidas ou assadas e
37
consumidas
como
castanhas,
utilizadas
também
em
pratos
locais.
São
comercializadas enlatadas, como grãos cozidos, em salmoura e em molho de
tomate. O extrato da semente é conhecido popularmente como útil para digestão
(SAMMADAR, 1985; BALIGA et al., 2011).
O estudo de Omar et al. (2011) cita os efeitos antidiabético e antioxidante do
extrato etanólico do fruto A. heterophyllus, que podem ser atribuídos ao seu alto teor
de proantocianidinas e flavonoides (FERNANDO; WICKRAMASINGHE; THABREW,
1991; CHANDRIKA et al., 2002; CHANDRIKA et al., 2006) através da inibição da
formação de peróxido lipídico e através da alfa-amilase, indicando que poderia atuar
como um bloqueador de amido, diminuindo o nível de glicose pós-prandial. Além
disso, em outros estudos foi relatado que o extrato deste fruto possui atividade antiinflamatória e antibacteriana (KHAN; OMOLOSO; KIHARA, 2003; KOTOWAROO et
al., 2006; SHIZUO; YOSHIAKI, 2006).
Também, Chackrewarthy et al. (2010) investigou o extrato das folhas
“maduras” de A. heterophyllus. Buscou verificar o efeito hipoglicemiante e
hipolipemiante de uma fração de acetato em um modelo de rato diabético. Em ratos
normoglicêmicos, a administração de uma dose única (20 mg/kg) da fração resultou
na redução da concentração de glicose sanguínea em jejum e uma melhora
significativa na tolerância à glicose, em comparação com os controles. Em ratos
diabéticos a administração crônica da fração de acetato de etila, durante 5 semanas,
resultou numa redução significativa da glicose no soro, do colesterol e dos
triglicerídeos.
A capacidade antioxidante total e conteúdo fenólico da semente da A.
heterophyllus foram verificados e apresentaram maior atividade antioxidante e
conteúdo fenólico do que a porção comestível, a polpa (SOONG; BARLOW, 2004;
JAGTAP; PANASKAR; BAPAT, 2010). O flavonoide prenilada, 5,7,40-tri-hidroxi-6, 8diprenilisoflavona, isolado na semente da espécies em discussão demonstrou forte
efeito inibitório sobre a peroxidação lipídica por interação da hemoglobina e do
peróxido de hidrogênio (TODA; SHIRATAKI, 2006). Além desse flavonoide, nas
sementes da A. heterophyllus foi encontrado a jacalina, uma proteína que representa
50% do conteúdo proteico do extrato bruto que apresenta atividade biológica
(JAGTAP; BAPAT, 2013). Essa lectina pode ser usada para o isolamento do IgA1
humano, auxiliando em pesquisas sobre a AIDS (KABIR, 1998).
38
Fang, Hsu e Yen (2008) investigaram possíveis efeitos anti-inflamatórios de
compostos fenólicos isolados a partir do extrato de acetato de etila dos frutos da A.
heterophyllus in vitro. Caracterizaram três compostos fenólicos a artocarpesina
[5,7,2', 4'- tetra-hidroxi- 6-(3-metilbut- 3-enil) flavona] a norartocarpetina (5,7,2’, 4'tetrahydroxyflavone) e o oxyresveratrol [trans -2, 4,3', 5'- tetra-] por meio de métodos
espectroscópicos e através da comparação com dados da literatura. Estes três
compostos
apresentaram
atividade
anti-inflamatória
potente.
Os
resultados
indicaram que artocarpesina suprimiu a produção de óxido nítrico e prostaglandina
E2, através da regulação negativa de óxido nítrico sintase induzida (iNOS ) e da
expressão da ciclo-oxigenase 2 (COX -2), demonstrando possuir atividade
terapêutica potencial para desordens associadas a inflamação.
De acordo com Baliga et al. (2011) que realizaram uma revisão sobre a
espécie A. heterophyllus, pesquisas experimentais sugerem que a planta possui
diversas indicações terapêuticas, com efeito antioxidante , anti-inflamatório,
antimicrobiano,
anticariogênico,
antifúngico,
anti-neoplásico
Também atuando na inibição da biossíntese de melanina e
e
hipoglicêmico.
na cicatrização de
feridas. Essas propriedades farmacológicas observadas foram atribuídas à presença
de vários fitoquímicos, principalmente compostos fenólicos. Além disso, quando
comparada com outras frutas tropicais, como laranja, banana, manga, abacaxi e
mamão, a polpa e as sementes da A. heterophyllus quantitativamente contém mais
proteínas, cálcio, ferro e constituintes fitoquímicos.
Figura 2. Foto da Artocarpus heterophyllus Lam.
Fonte: http://www.prota4u.info/protav8.asp?g=psk&p=Artocarpus+heterophyllus+Lam.
39
3.6
Eugenia involucrata DC.
Entre as espécies vegetais frutíferas, silvestres do Brasil, a família Myrtaceae
é uma das mais conhecidas. Possui cerca de 140 gêneros e mais de 3000 espécies,
as quais se localizam principalmente na América e na Austrália (LORENZI, 2000;
SILVA et al., 2003; SANTOS, 2006) . Algumas são exploradas comercialmente,
como a Psidium guajava (goiabeira), a Myrciaria cauliflora (jabuticabeira) e a
Eugenia uniflora L. (pitangueira) (GRESSLER; PIZO; MORELLATO, 2006).
Além disso, inúmeras mirtáceas nativas do Brasil, apresentam importância
medicinal com atividades biológicas, que incluem: efeito antioxidante (Eugenia
caryophyllata,
Eugenia
involucrata,
Campomanesia
xanthocarpa,
Psidium
cattleyanum) (MARIN et al., 2008; MADALOSSO, 2011), antimicrobiano (Eugenia
jambolana, Syzygium aromaticum) (JASMINE et al., 2010; MACHADO et al., 2010),
hipoglicemiante (Campomanesia xanthocarpa, Eugenia jambolana) (BIAVATTI et al.,
2004; HARI et al., 2010), anti-inflamatório e antinociceptivo (Eugenia discifera,
Eugenia candolleana) (MARIDASS, 2008; GUIMARÃES et al., 2009)
O gênero Eugenia representa um terço da família Myrtaceae possui um perfil
fitoquímico formado por 42% de flavonoides, 18% de triterpenos, 17% de taninos,
16% de derivados flaroglucinóis, 4% de cromenos, 2% de estilbenoides e 1% de
outros compostos (CRUZ; KAPLAN, 2004), sendo que muitas dessas espécies são
ricas em óleos essenciais e por isso bastante estudadas para verificação de
atividades biológicas (ROMAGNOLO; SOUSA, 2006; LIMA, 2012).
Na medicina popular as folhas da E. involucrata são empregadas em forma
de infusão no tratamento da diarreia, má digestão, hemorragia e infecções. Os frutos
são consumidos in natura, na forma de doces, geleias e licores (LORENZI, 2000;
SILVA et al., 2003; SANTOS, 2006).
É popularmente conhecida por vários nomes: cereja-do-mato, pitanga-preta,
cereja, cerejeira, cerejeira-da-terra, araçazeiro e cerejeira-do-rio-grande. É uma
planta que pode atingir de 5 a 15 m de altura. Ocorre desde São Paulo até o Rio
Grande do Sul, nas formações florestais do complexo atlântico e nas florestas e
cerrados da bacia do Paraná. Ocorre ainda no Mato Grosso do Sul, Minas Gerais e
Goiás (LORENZI, 2002). No sul do Brasil são encontradas no estado silvestre e
cultivado (MENDONÇA et al., 2009).
40
Os frutos da E. involucrata são bagas piriformes, lisas, de coloração vermelha
quando maduro, medindo de 1,3 cm a 2,3 cm de comprimento. Pesam em média 5
g, sendo que no seu interior são encontradas de 1 a 5 sementes. As sementes
possuem coloração amarelada medindo de 5 mm a 10 mm, são em sua maioria
estudadas com o objetivo de caracterizar a época de colheita do fruto, maturação
fisiológica e composição nutricional (GOLLE et al., 2012).
Os eventos da frutificação concentraram-se em setembro e outubro, no início
do período das chuvas, e os frutos maduros ocorrem entre setembro e janeiro
(CARVALHO, 2008). A frutificação em exemplares cultivados em solo fértil aparece
do sexto ao sétimo ano. Uma cerejeira pode produzir acima de mil frutos por safra,
por até 200 anos. São consumidos na forma in natura, na forma de doces, geleias e
licores (LORENZI, 2000; SILVA et al., 2003; SANTOS, 2006).
Sua cor intensa indica a presença de fitoquímicos (carotenoides e
antocianinas) que contribuem para manutenção da saúde (FRANCIS, 2000).
Figura 3. Foto da Eugenia involucrata DC
Fonte: http://www.plantasonya.com.br/category/frutiferas
41
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1
PREPARO DO MATERIAL VEGETAL
A E. involucrata foi coletada em janeiro de 2012, na cidade de Rio Negro-SC,
e a A. heterophyllus foi obtida em Itajaí-SC, em maio de 2012.
O extrato bruto metanólico das sementes dos frutos A. heterophyllus (Figura
2) e E. involucrata (Figura 3) foram preparados pelo Prof. Dr. Valdir Cechinel Filho e
mestranda Camila Leandra Bueno de Almeida no Laboratório de Fitoquímica da
Universidade do Vale do Itajaí. As sementes foram submetidos à maceração em
metanol por 7 dias. Após esse período o macerado foi filtrado e submetido à
evaporação do solvente em rota-evaporador (HW100, Fisatom®) à pressão reduzida
(50 ºC) e/ou evaporação em capela com auxílio de ar quente até secura, e
posteriormente foi determinado o seu rendimento.
Figura 4 – Semente da A.
heterophyllus inteira antes de ser
partida em pedaços menores para
maceração em metanol por 7 dias.
Figura 5 – Semente da E.
involucrata inteira antes de ser
partida em pedaços menores para
maceração em metanol por 7 dias.
Fonte: http://www.fotosearch.com.br/fotos-
imagens/jaca.html
Fonte: http://www.fotosearch.com.br/fotos-imagens
4.2
Fonte: http://www.apremavi.org.br/media/galerias
ANÁLISE FITOQUÍMICA
A avaliação dos constituintes químicos presentes nas amostras do EBM da A.
heterophyllus e E. involucrata também foi realizada pelo Prof. Dr. Valdir Cechinel
Filho e pela mestranda Camila Leandra Bueno de Almeida, através de cromatografia
em camada delgada (CCD) por cromatoplaca com fase estacionária de sílica gel 60
F254 (Merck) e eluentes em diferentes proporções: hexano:acetato de etila e
clorofórmio:metanol. As cromatoplacas foram reveladas em câmara de ultravioleta
42
com comprimento de onda de 254 e 365 nm e com reveladores seletivos como
anisaldeído sulfúrico (terpenoides e esteroides), cloreto férrico (flavonoides e
fenólicos) e reativos de Dragendorff (alcaloides). Para o EBM da A. heterophyllus
foram utilizados os padrões sitosterol, ácido betulínico e ácido ursólico para efeito de
comparação, já que estes compostos foram descritos na literatura anteriormente
isolados das raízes da A. heterophyllus (BALIGA et al., 2011).
Do EBM da semente da A. heterophyllus foi preparada a fração acetona,
fração acetato de etila e fração metanólica, onde foi solubilizado 1 g do EBM em 10
ml de solvente, por três vezes. O solvente foi evaporado em capela com auxílio de ar
quente para obtenção das frações. Além disso, 1.090 mg do EBM foi submetido a
cromatografia em coluna aberta, sendo utilizada como fase estacionaria sílica gel 60
(0,040 – 0,063 mm) Merck empacotada com o extrato no formato de “pastilha” e
eluida com hexano 100% e metanol:acetato de etila (50:50).
As frações foram coletadas, totalizando 75 frascos. O solvente foi evaporado
a temperatura ambiente e realizou-se a CCD para reunião das frações conforme
semelhança do fator de retenção (Rf) revelado na cromatoplaca. Ficando reunidas
as frações 9-14 (2 mg), frações 15-16 (4 mg) e frações 19-21 (7,5 mg), que foram
analisadas através de cromatografia gasosa acoplada ao espectro de massa (CGEM).
4.3
ANIMAIS E ENSAIOS FARMACOLÓGICOS
As
doses
utilizadas
nos
experimentos
de
avaliação
da
atividade
gastroprotetora foram baseadas em estudos preliminares realizados no Laboratório
de Fitoquímica da Universidade do Vale do Itajaí. No estudo farmacológico de
plantas utilizam-se normalmente concentrações crescentes, correlacionadas para
possível observação da relação dose-resposta. Neste estudo, avaliou-se efeito dos
extratos utilizando as concentrações de 50 mg/kg, 125 mg/kg e 250 mg/kg.
4.3.1 Animais
Os animais foram mantidos segundo as normas e cuidados com animais de
laboratório, bem estar e biossegurança na experimentação, conforme descritas na
Lei n. 11.794, de 8 de outubro de 2008, e de acordo com as diretrizes da Sociedade
Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório. Os experimentos foram submetidos
43
ao Comitê de Ética na Utilização de Animais da Universidade do Vale do Itajaí,
sendo aprovado sob o protocolo n° 019/13.
Nos ensaios biológicos foram utilizados camundongos machos e fêmeas
Swiss, pesando entre 25–50 g, provenientes do Biotério Central da Universidade do
Vale do Itajaí – UNIVALI. Os animais foram mantidos em caixas de polipropileno, em
sala com temperatura (25 ºC) e ciclo controlados (claro/escuro 12 horas cada), tendo
ração e água ad libitum. Nas doze horas anteriores aos experimentos, os animais
foram mantidos em jejum e com livre acesso à água, sendo adicionada a caixa uma
grade para inibir a coprofagia.
4.4
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE GASTROPROTETORA
Na avaliação da atividade gastroprotetora, foram utilizados experimentos que
procuraram mimetizar os distúrbios gástricos em humanos, baseados em fatores
etiológicos da doença no homem, como por exemplo, o aumento do suco gástrico,
uso de drogas anti-inflamatórias não esteroidais e uso abusivo de bebidas
alcoólicas. Cada experimento contou com seus respectivos controles positivo
(cimetidina ou carbenoxolona) e negativo (veículo ou indometacina), dependendo da
necessidade de cada modelo. Para avaliar a atividade gastroprotetora foram
utilizados diferentes modelos experimentais, conforme descritos a seguir.
4.4.1 Modelo de úlcera aguda induzida por etanol
A metodologia utilizada neste experimento foi a descrita por Mizui e Doteuchi
(1983), com algumas modificações. Os camundongos foram submetidos a jejum de
doze horas e após esse período, divididos em diferentes grupos (n=6), pré-tratados
por via oral com cimetidina (controle positivo – 100 mg/kg), veículo (controle negativo
– água destilada), os extratos metanólicos nas doses de 50, 125 e 250 mg/kg e a
fração e subfração da A. heterophyllus na dose de 50 mg/kg.
Após uma hora do tratamento, foram administrados por via oral nos animais,
0,1 mL/10 g (peso animal) de etanol (agente lesivo). Uma hora após a administração
do agente lesivo, os animais foram sacrificados por deslocamento cervical, e em
seguida, os estômagos foram retirados e abertos ao longo da curvatura maior e
esticados em placas de parafina. As imagens foram digitalizadas e analisadas por
44
programa de computador de análise de imagens EARP, a fim de determinar o
número de lesões e o seu tamanho.
Posteriormente, foi determinado a área total de lesão (mm2), área relativa
lesada (%) e o índice de cura (IC). Sendo que o IC foi calculo mediante a equação
abaixo:
Onde:
ATLTratado: Área total de lesão no grupo tratado
ATLControle: Área total de lesão no grupo controle
Os resultados foram expressos em quantidade total de área lesada (mm2),
quantidade relativa de área lesada (%), e índice de cura (IC – %).
4.4.2 Modelo de úlcera aguda induzida por anti-inflamatório não-esteroidal
A metodologia utilizada foi descrita por Rainsford (1980), com algumas
modificações. Após doze horas de jejum os camundongos foram divididos em
diferentes grupos (n=6) e pré-tratados por via oral com cimetidina (controle positivo –
100 mg/kg), veículo (controle negativo – água destilada), os extratos metanólicos
nas doses de 50, 125 e 250 mg/kg, e a subfração metanólica de A. heterophyllus na
dose de 50 mg/kg.
Após uma hora e meia da administração do tratamento, os animais receberam
100 mg/kg de indometacina via oral (v.o). Passadas doze horas os animais foram o
sacrificados por deslocamento cervical e os estômagos retirados e abertos ao longo
da grande curvatura e esticados. As imagens foram digitalizadas e analisadas por
software de análise de imagens EARP, a fim de determinar o número de lesões e o
tamanho destas.
Posteriormente, foi realizado a determinação da quantidade total de área
lesada (mm2), quantidade relativa de área lesada (%), e índice de cura (IC - %),
conforme descrito no item 4.4.1.
4.4.3 Modelo de úlcera crônica induzida por ácido acético (ensaio curativo)
45
A metodologia utilizada foi descrita por Takagi, Okabe e Saziki (1969), com
algumas modificações. Os animais foram mantidos em jejum de doze horas com
livre acesso à água. Posteriormente, foram anestesiados com uma mistura
anestésica a base de xilazina (5 mg/mL) e cetamina (2 mg/mL) na proporção 1:1 (0,1
mL/10g de peso de animal), e submetidos a uma incisão longitudinal abaixo ao
processo apófise xifóide. Após a exposição do estômago, foi injetado na camada
subserosa da parede externa do estômago 40 µL de solução de ácido acético 30%.
O local é pressionado por 30 segundos para evitar o extravasamento do líquido
injetado e lavado delicadamente com salina. A parede abdominal foi posteriormente
suturada. Após dois dias de recuperação dos animais, iniciou-se o tratamento. Os
animais operados com a administração do ácido ácético foram divididos em
diferentes grupos (n=6), classificados de acordo com o seu tratamento: veículo
(controle negativo – água destilada), cimetidina (controle positivo – 100 mg/kg), e
extratos (250 mg/kg).
Diariamente, os animais foram pesados para a determinação da dose
administrada via oral. No oitavo dia, ao final do período de tratamento, os animais
foram sacrificados, e os estômagos retirados e abertos ao longo da grande curvatura
e esticados. Através de escaneamento, as imagens foram captadas e analisadas por
software de análise de imagens EARP, a fim de determinar se houve regressão da
lesão nos tratamentos quando comparados com o controle, sendo realizada a
determinação da quantidade total de área lesada (mm2), quantidade relativa de área
lesada (%), e índice de cura (IC – %).
4.5
MECANISMOS DE AÇÃO
4.5.1 Modelo de avaliação da secreção gástrica (ligadura de piloro)
Este experimento foi realizado de acordo com o método descrito por Shay et
al. (1945), com algumas modificações. Os animais foram submetidos a jejum por
doze horas com livre acesso a água e divididos em diferentes grupos (n=6). Em
seguida foram anestesiados com uma mistura anestésica a base de xilazina (5
mg/mL) e cetamina (2 mg/mL) (0,1 mL/10 g de peso de animal) e submetidos a uma
incisão longitudinal abaixo ao processo apófise xifóide, para amarração do piloro e a
administração por via intraduodenal dos diferentes tratamentos: cimetidina (controle
46
positivo – 100 mg/kg), veículo (controle negativo – água destilada) e extratos (50,
125 e 250 mg/kg).
Depois dos tratamentos, as incisões foram suturadas, sendo que quatro horas
após a cirurgia, os animais foram sacrificados por deslocamento cervical. As incisões
foram reabertas e após o pinçamento da válvula cárdia (para evitar a perda do
conteúdo gástrico), o estômago foi retirado para determinação do conteúdo
estomacal, pH e concentração de íons hidrogênio.
Após a determinação do volume, foi adicionado 5 mL de água destilada à
amostra, que foi centrifugada por 10 min a 3000 rpm, com o sobrenadante foi
determinado o pH e titulado com solução de hidróxido de sódio a 0,01 N, utilizandose fenolftaleína como indicador.
Os resultados foram expressos em g (volume), pH e mEq/L/4h (concentração
de íons hidrogênio).
4.5.2 Modelo de avaliação da secreção de muco em mucosa gástrica
O modelo utilizado neste experimento foi descrito por Sun, Matsumoto e
Yamada (1991), com algumas modificações. Os animais foram submetidos a jejum
por doze horas com livre acesso a água e divididos em diferentes grupos (n=6). Em
seguida foram anestesiados com uma mistura anestésica a base de xilazina (5
mg/mL) e cetamina (2 mg/mL) (0,1 mL/10 g de peso de animal) e submetidos a uma
incisão longitudinal abaixo ao processo apófise xifóide, para amarração do piloro e
administração intraduodenal dos diferentes tratamentos: carbenoxolona (controle
positivo – 200 mg/kg), indometacina (controle negativo – 100 mg/kg) e extratos (50,
125 e 250 mg/kg).
Depois dos tratamentos, as incisões foram suturadas, sendo que quatro horas
após a cirurgia os animais foram sacrificados por deslocamento cervical. As incisões
foram reabertas e após o pinçamento da válvula cárdia (para evitar a perda do
conteúdo gástrico) o estômago foi retirado, cuidadosamente lavado em salina,
pesado em balança analítica e acondicionado em 10 mL de solução de Alcian Blue,
um corante específico para mucinas ácidas (Alcian Blue 0,02%, sacarose 0,16 M,
acetato de sódio 0,05 M; pH 5,8 a 20 ºC) por 24 horas.
Após este período, o tecido estomacal foi retirado, e o líquido submetido a
centrifugação a 3000 rpm por 10 minutos. A leitura do sobrenadante foi realizada
47
através de leitor de microplaca Asys Expert Plus UV (no comprimento de onda a 620
nm), em triplicata. As leituras foram interpoladas em equação da curva padrão de
solução de Alcian Blue (1, 2, 4, 8, 16, 32, 64 e 128 mg/mL), sendo os resultados
calculados sobre a média das leituras. Os resultados foram expressos em
quantidade de corante aderido ao muco (mg) por grama de tecido (g).
4.5.3 Avaliação do papel do óxido nítrico (NO) in vivo
O método utilizado foi descrito primeiramente por Arrieta et al. (2003), com
algumas modificações. O L-NAME (N-nitro-L-arginina metil éster) é uma substância
que tem a capacidade de bloquear a enzima óxido nítrico sintase (NOs), responsável
pela produção de NO (óxido nítrico), que pode estar relacionado com os processos
gastroprotetores.
Após doze horas de jejum, os camundongos foram divididos nos seguintes
grupos: veículo (água destilada) com L-NAME, veículo com água destilada,
carbenoxolona (200 mg/kg) com L-NAME, carbenoxolona (200 mg/kg) com água
destilada, extrato (250 mg/kg) com L-NAME, e extrato (250 mg/kg) com água
destilada.
Os animais foram tratados com L-NAME na dose de 70 mg/kg, via
intraperitonial. Após trinta minutos dos tratamentos foram administrados nos
diferentes grupos os seus respectivos tratamentos por via oral. Passadas uma hora
e meia após a administração dos tratamentos foi dado aos animais, 0,1 mL/10 g
(peso animal) de etanol (agente lesivo). Sendo que após uma hora e meia da
administração do agente lesivo, os animais foram sacrificados e os estômagos
retirados e abertos ao longo da grande curvatura e esticados.
Através de escaneamento, as imagens foram captadas e analisadas por
software de análise de imagens EARP, a fim de determinar o número de lesões e o
tamanho destas, conforme descrito anteriormente no item 4.4.1, estabelecendo
comparação com os tratamentos de L-NAME e salina através de teste t.
4.5.4 Avaliação do papel dos grupos sulfidrílicos (SH) in vivo
Para a avaliação dos grupamentos sulfidrilas na gastroproteção foi adotado o
modelo de Matsuda, Li e Yoshikawa (1999). O NEM (N-metil-maleimida), é uma
substância que tem a capacidade de quelar os compostos sulfidrilas, os quais
48
participam dos mecanismos antioxidantes relacionados com a proteção do trato
gastrintestinal.
Da mesma maneira, após doze horas de jejum, os ratos foram separados nos
seguintes grupos: veículo (água destilada) com NEM, veículo com água destilada,
carbenoxolona (200 mg/kg) com NEM, carbenoxolona (200 mg/kg) com água
destilada, extratos (250 mg/kg) com NEM e extratos (250 mg/kg) com água
destilada. Foram tratados com NEM na dose de 10 mg/kg, via intraperitonial. Após
trinta minutos, houve a administração dos tratamentos respectivos aos diferentes
grupos, via oral.
Passando uma hora e meia da administração dos tratamentos foi dado aos
animais, 0,1 mL/10 g (peso animal) de etanol (agente lesivo). Sendo que após uma
hora e meia da administração do agente lesivo, os animais foram sacrificados, e os
estômagos retirados e abertos ao longo da grande curvatura e esticados. Através de
escaneamento, as imagens foram captadas e analisadas por software de análise de
imagens EARP, a fim de determinar o número de lesões e o tamanho destas,
conforme descrito anteriormente no item 4.4.1, porém também se comparando aos
tratamentos entre o NEM e salina através de teste t.
49
5 RESULTADOS E DISCUSSÕES
5.1 ANÁLISE FITOQUÍMICA
O rendimento do EBM da semente da E. involucrata foi de 3,64%, e da A.
heterophyllus 2,60%. Através da CCD o EBM da E. involucrata apresentou três
classes de diferentes compostos fitoquímicos, eluídos com clorofórmio:metanol (8:2),
os esteroides e terpenos revelados com anisaldeído sulfúrico e compostos fenólicos
revelados com cloreto férrico (Comunicação pessoal do professor Doutor Valdir
Cechinel Filho).
As frações de acetato de etila, acetona e metanol do EBM da semente de A.
heterophyllus foram avaliadas inicialmente através de CCD, sendo que a fração de
acetona e acetato de etila apresentaram baixo rendimento, com indícios de
esteroides/terpenos e ácidos graxos.
A fração metanólica foi eluída com clorofórmio:metanol (8:2) e revelada com
cloreto férrico, apresentando 1 mancha de coloração verde, caracterizada como um
flavonoide. Em uma segunda análise, com esta mesma fração, foram adicionados 3
padrões, o sitosterol, ácido betulínico e ácido ursólico, compostos estes já
verificados nas raízes da A. heterophyllus em outras pesquisas, que possibilitou a
identificação de uma substância com o mesmo Rf do sitosterol e 2 manchas
possíveis de terpenos após revelação com anisaldeido sulfúrico.
Posteriormente, com o EBM foi realizada uma cromatografia em coluna
aberta. As frações coletadas foram analisadas por CCD e agrupadas de acordo com
as similaridades, frações de 15 a 16, 9 a 14 e 19 a 21, sendo que para comprovação
da semelhança no perfil cromatográfico dessas frações, estas foram avaliadas em
Cromatografia Gasosa acoplada ao Espectrômetro de Massas (CG-EM), conforme
demonstrado na figura 6.
50
Figura 6 - Sobreposição dos cromatogramas das amostras original pelo CGMS no tempo de 16 minutos.
(x1,000,000)
4.0
3.0
2.0
1.0
0.0
5.0
7.5
10.0
12.5
15.0
17.5
Legenda: Linha rosa- Fração 15-16. Linha preta – Fração 9-14. Linha azul – Fração 19-21.
Foram observados inúmeros picos na análise por CG-EM, identificando-se
principalmente os seguintes compostos: 2- ácido láurico, metil ester; 3- ácido láurico;
5- ácido ftálico, diisobutil ester; 6- ácido palmítico, metil ester; 8- ácido palmítico; 9ácido linoleico, metil ester; 10,11,12- gliceróis substituídos; 17,18- gliceróis
substituídos; 19- Linolein, 1-mono-; 20- Gliceril 1-oleate, diacetato; 21, 22- gliceróis
substituídos; 23- Ergost-5-en-3.beta.-ol; 24- beta-Stigmasterol; 25- Lanosterol; 27gamma-Sitosterol (Camila Almeida e Valdir Cechinel Filho, comunicação pessoal).
Uma subfração metanólica foi obtida a partir da solubilização da fração
metanólica em metanol (15 ml por 3 vezes) na tentativa de verificar o potencial
gastroprotetor de uma substância mais pura.
Os resultados obtidos com a análise fitoquímica do EBM da A. heterophyllus e
E. involucrata estão de acordo com os dados de outros estudos que documentaram
a composição fitoquímica dessas sementes (WONG; LIM; WONG, 1992;
HARBORNE; WILLIAMS, 2000; LIN; LU; HUANG, 2000; CHANDRIKA; JANSZ;
WARNASURIYA, 2004; CRUZ; KAPLAN, 2004; ROMAGNOLLO; SOUSA, 2006;
ARUNG; SHIMIZU; KONDO, 2007; BALIGA et al., 2011; LIMA, 2012).
51
5.2 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE GASTROPROTETORA
5.2.1 Efeito do extrato metanólico da semente da E. involucrata, da A.
heterophyllus e de sua respectiva fração e subfração em úlcera aguda induzida
por etanol.
Levando em consideração os indícios de compostos fitoquímicos promissores
(flavonoides, terpenos e esteroides) as sementes da A. heterophyllus e da E.
involucrata foram avaliadas experimentalmente para gastroproteção. Sendo que a
quantificação de lesões gástricas em ratos e camundongos é um método
amplamente utilizado e confiável para se avaliar atividade gastroprotetora
(CHANDRANATH; BASTAKI; SINGH, 2002; ALQASOUMI et al., 2009).
Na presente pesquisa, o potencial gastroprotetor do EBM das sementes da A.
heterophyllus e E. involucrata foi inicialmente evidenciado pela redução significativa
de áreas lesadas dos estômagos de camundongos induzidos a úlcera por etanol, um
agente necrozante (MADALOSSO, 2011).
Apesar de não representar fielmente a patologia humana, esse modelo,
supracitado, é comum na triagem de estudos de fármacos com atividades
gastroprotetoras, fornecendo indicativos relevantes de mecanismos de ação dos
extratos, que podem estar associados a fatores antioxidantes e/ou fatores antiinflamatórios, na redução da secreção ácida e produção de muco (RAIHA et al.,
1998; SCHMASSMANN, 1998; LEMOS et al., 2011).
O extrato bruto metanólico (EBM) das sementes da A. heterophyllus e E.
involucrata apresentaram capacidade de defesa da mucosa gástrica frente ao
agente agressor etanol, reduzindo a área total lesada e a área relativa de lesão para
os tratamentos com as doses de 50, 125 e 250 mg/kg de maneira significativa
quando comparados com o controle negativo, assim como a cimetidina que
comprovou seu efeito gastroprotetor (Tabelas 1).
52
Tabela 1. Efeito da administração oral de cimetidina (100 mg/kg) e das diferentes
doses do extrato das sementes da A. heterophyllus e E. involucrata (50, 125 e 250
mg/kg) em úlcera gástrica aguda induzida por etanol em camundongos (n=6).
Tratamento
Controle
EBM da semente
A. heterophyllus
2
Dose (mg/kg)
Veículo
50
125
Área total de lesão (mm )
77,08 ± 3,72
26,52 ± 4,99**
29,19 ± 2,13 **
Área relativa de lesão (%)
12,54 ± 0,65
4,08 ± 0,53**
3,48 ± 0,65 **
250
50
125
250
100
28,92 ± 4,20 **
28,92 ± 6,34**
5,04 ± 1,60**
9,45 ± 2,28**
25,35 ± 6,40**
3,93 ± 0,76**
3,54 ± 1,09**
0,88 ± 0,28**
1,12 ± 0,31**
7,43 ± 1,21**
EBM da semente da
E. involucrata
Cimetidina
Diferença significativa em relação ao grupo controle (**p<0,01), ANOVA, expressos como média ± EPM, teste a
posteriori de Dunnett.
Figura 7. Imagens de estômagos após indução de úlcera por etanol.
A
B
C
D
E
F
G
H
Legenda: A- controle negativo; B- controle positivo (cimetidina 100 mg/kg); C – EBM da semente de
A. heterophyllus 50 mg/kg; D – EBM da semente de A. heterophyllus 125 mg/kg; E - EBM da semente
de A. heterophyllus 250 mg/kg; F – EBM da semente de E. involucrata 50 mg/kg; G - EBM da
semente de E. involucrata 125 mg/kg; H - EBM da semente de E. involucrata 250 mg/kg.
O EBM da semente da A. heterophyllus apresentou um índice de cura (IC) de
69% para a dose de 50 mg/kg, 62% para a dose de 125 mg/kg e 65% para a dose
de 250 mg/kg, apresentando um efeito semelhante ao do fármaco de escolha, a
cimetidina, que obteve um IC de 73% (Figura 8).
53
Figura 8. Índice de cura obtido pelo efeito da administração oral de cimetidina
(100 mg/kg) e das diferentes doses do extrato metanólico da semente de A.
heterophyllus (nas doses de 50, 125 e 250 mg/kg) em úlcera gástrica aguda induzida
por etanol em camundongos.
Cimetidina
Semente da A.
heterophyllus 50 mg/kg
Semente da A.
heterophyllus 125 mg/kg
Semente da A.
heterophyllus 250 mg/kg
Por sua vez, o EBM da semente da E. involucrata apresentou um IC de 66%
para a dose de 50 mg/kg, 93% para a dose de 125 mg/kg e 88% para a dose de 250
mg/kg, sendo que a dosagem de 125 mg/kg apresentou maior efetividade do que o
fármaco de escolha, a cimetidina, que apresentou um IC de 73% (Figura 9).
Figura 9. Índice de cura obtido pelo efeito da administração oral de cimetidina
(100 mg/kg) e das diferentes doses do extrato metanólico das sementes da E.
involucrata (nas doses de 50, 125 e 250 mg/kg) em úlcera gástrica aguda induzida
por etanol em camundongos.
*
Cimetidina
Semente da E. involucrata
50 mg/kg
Semente da E. involucrata
125 mg/kg
Semente da E. involucrata
250 mg/kg
Diferença significativa em relação ao grupo cimetidina (*p<0,05), expressos como média ± EPM, ANOVA, teste a
posteriori de Dunnett.
54
Como pode ser visualizado na figura 7, no modelo de lesão gástrica induzida
por etanol, são verificadas extensas áreas hemorrágicas e de necrose na mucosa
gástrica do grupo controle negativo, comprovando a gastrotoxicidade desse agente,
que promove alteração da homeostase celular desencadeando danos teciduais
resultantes de sua ação na mucosa e aumento na geração de espécies reativas de
oxigênio (EROs) (REPETTO; LLESUY, 2002; MADALOSSO, 2011; ROZZA et al.,
2011).
As espécies reativas de oxigênio (EROs) são produzidas em animais e
humanos sob condições fisiológicas e patológicas, através do processo de
metabolismo do oxigênio. As EROs atacam as insaturações dos ácidos graxos poliinsaturados, gerando radicais lipídicos peroxil e alcoxil (ROO• e RO•), que atuam na
captação de O2 e rearranjo de duplas ligações, resultando na alteração da
integridade e fluidez das membranas, ocorrendo lipoperoxidação lipídica, mantida
pela formação de hidroperóxidos e aldeídos, lesionando as células (BUEGE; AUST,
1978; HALLIWELL; GUTTERIDGE, 1984; ANDREOLI, 2000; FANG; YANG; WU,
2002; CHATTOPADHYAY et al., 2006; RODRIGUES et al., 2008; LEMOS et al.,
2011).
E é nesse mecanismo, de excesso na geração de espécies reativas de
oxigênio que os estudos experimentais têm demonstrado aumento nas lesões
gástricas causadas pelo etanol, que atua mediando à injúria no tecido, provocando
danos na membrana celular através da peroxidação dos lipídios, decorrendo na
coagulação de proteínas, lipídios e ácidos nucleicos, ocasionando lesões
histopatológicas como congestão, edema, hemorragia, erosão e necrose (LOLIGER,
1991; CHEN et al., 1996; JAYATILLEKE; SHAW, 1998; HOGG; KALYANARAMAN,
1999; AL-SHABANAH et al., 2000; LA CASA et al., 2000; WENG; WANG, 2000).
Como as EROs são geradas em processos fisiológicos, os seres aeróbicos
desenvolveram mecanismos de defesa, conhecidos como antioxidantes, que podem
ser compostos químicos e enzimáticos. No caso das enzimas, o organismo sintetiza
proteínas (enzimas) antioxidantes como as superóxido dismutase, catalase e
glutationa peroxidase, além da glutationa reduzida (GSH) que diminuem a ação
tóxica
das
espécies
reativas
de
oxigênio
(EROs)
produzidas
intra
e
extracelularmente (YU, 1994; EL-HABIT et al., 2000; KWIECIÉN; BRZOZOWISK;
KONTUREK, 2002; RODRIGUES et al., 2008).
55
Já as defesas antioxidantes de fonte exógena, podendo ser provenientes da
alimentação (compostos químicos) compreendem várias moléculas, como o αtocoferol (vitamina E), β-caroteno, selênio, ácido ascórbico (vitamina C), flavonoides
e outros compostos que podem promover equilíbrio na mucosa gástrica, juntamente
com o sistema enzimático, evento de extrema importância para manutenção das
funções vitais do organismo (LOLIGER, 1991; CHEN et al., 1996; JAYATILLEKE;
SHAW, 1998; HOGG; KALYANARAMAN, 1999; HARBORNE; WILLIAMS, 2000;
WENG; WANG, 2000; RODRIGUES et al., 2008).
Neste contexto, tem se verificado que flavonoides, terpenos e esteroides,
provenientes de espécies vegetais fazem parte dos fitoquímicos mais estudados na
gastroproteção com ação antioxidante, metabólitos secundários esses, observados
nas sementes em estudo (YARIWAKE et al., 2005; SOUSA et al., 2007; LEMOS et
al., 2011; KLEIN-JÚNIOR et al., 2012).
As chalconas são uma das classes de flavonoides que mais tem sido
pesquisado ao longo dos anos na verificação do potencial gastroprotetor, os
resultados obtidos até o momento são promissores, sendo que demonstraram
possuir efeito protetor significativo frente à lesão causada por etanol (KYOGOKU et
al., 1979; SAZIKI et al., 1984; WANG et al., 2010; KLEIN-JÚNIOR et al., 2012).
Também, a quercetina, que é um dos flavonoides mais abundantes entre
produtos vegetais (FORMICA; REGELSON, 1995; MOJZIS et al., 2001) foi avaliada
no modelo de indução de úlcera com etanol, sendo que o potencial gastroprotetor
evidenciado foi relacionada à sua propriedade antioxidante (MOTA et al., 2009).
Vários terpenoides também foram estudados para verificação do potencial
gastroprotetor, um exemplo, é o eucaliptol, presente em muitos óleos essenciais de
plantas, sendo capaz de atenuar as lesões gástricas induzidas por etanol nas doses
de 50 e 200 mg/kg de maneira efetiva, semelhante ao controle positivo (SANTOS;
RAO, 2001).
Os esteroides também foram avaliados na gastroproteção. Navarrete, Trejo
Miranda e Reyes Trejo (2002) relataram atividade gastroprotetora pelo composto bsitosterol, demonstrando que a dose de 100 mg/kg, via oral, inibiu significativamente
a lesão gástrica induzida por etanol.
No modelo de indução com etanol, o extrato hidroetanólico da folha de
Syzygium jambos, da mesma família que a E. involucrata, apresentou atividade
gastroprotetora, sendo que a dose de 400 mg/kg apresentou em relação ao grupo
56
controle resultados extremamente significativos, demonstrando mais eficácia que o
fármaco empregado como referência (lansoprazol), sugerindo que a presença de
flavonoides e taninos, verificados na triagem fitoquímica da droga, pode ter sido
responsável pela ação antiúlcera do extrato (DONATINI et al., 2009). Considerando
que os taninos possuem a propriedade de formar complexos com macromoléculas,
como proteínas e polissacarídeos e com isso levar à formação de uma camada
protetora na mucosa do estômago, possibilitando mais resistência a agressões
químicas e/ou mecânicas (MELLO; SANTOS, 2004).
Dessa maneira, levando em consideração a presença dos compostos
químicos supracitados nas espécies Eugenia e Artocarpus e as atividades biológicas
documentadas, sugere-se que os compostos fenólicos (flavonoides, taninos),
terpenos
e
esteroides
podem
ser
responsáveis
por
parte
da
atividade
gastroprotetora do EBM das sementes da A. heterophyllus e E. involucrata na úlcera
aguda induzida por etanol, pois apresentam alta capacidade antioxidante, seja por
inibir diretamente o radical, ou por induzir a expressão de enzimas metabolizadoras,
quanto por outros possíveis mecanismos como aumento do NO, produção de muco,
diminuição da acidez, entre outros (ZHANG et al., 2003; FRANCISCO et al., 2009).
Mediante o exposto acima e buscando identificar com mais precisão os
compostos responsáveis pela atividade de gastroproteção da semente da A.
heterophyllus, a qual é mais disponível e de fácil acesso a população quando
comparada a semente da E. involucrata, foram realizados fracionamentos do EBM,
conforme mencionado na análise fitoquímica, item 5.1, resultando na obtenção de
uma fração metanólica (FM) e subfração metanólica (SFM), que foram avaliadas no
modelo de úlcera aguda induzida por etanol na dose de 50 mg/kg, afim de se
determinar se a ação de proteger a mucosa estaria em maior evidência nesses
compostos mais puros.
Ambas, a FM e a SFM demonstraram atividade gastroprotetora frente o
agressor deste modelo, reduzindo a área total lesada e a área relativa lesada
quando comparados com o grupo controle negativo (Tabela 2).
57
Tabela 2. Efeito da administração oral de cimetidina (100 mg/kg) da fração e
subfração metanólica da semente da A. heterophyllus (50 mg/kg) em úlcera gástrica
aguda induzida por etanol em camundongos (n=6).
Tratamento
Controle
FM A.heterophyllus
SFM A.heterophyllus
Cimetidina
Dose (mg/kg)
Veículo
50
50
100
2
Área total de lesão (mm )
77,08 ± 3,72
28,46 ± 4,15**
26,21 ± 6,11 **
25,35 ± 6,40 **
Área relativa de lesão (%)
12,54 ± 0,65
4,64 ± 0,92**
3,86 ± 0,76 **
7,43 ± 1,21 **
Diferença significativa em relação ao grupo controle (**p<0,01), ANOVA, expressos como média ± EPM, teste a
posteriori de Dunnett.
Figura 10. Imagens de estômagos após indução de úlcera por etanol. Acontrole negativo; B- controle positivo (cimetidina 100 mg/kg); C – Fração metanólica
do EBM da semente de A. heterophyllus 50 mg/kg; D – Subfração metanólica do
EBM da semente de A. heterophyllus 50 mg/kg.
A
B
C
D
Com isso, o índice de cura calculado foi de 67% para a FM; 71% para a SFM,
valores próximos ao controle positivo (cimetidina) 73% (Figura 11).
Figura 11. Índice de cura obtido pelo efeito da administração oral de
cimetidina (100 mg/kg) e da fração e subfração metanólica (50 mg/kg) do extrato da
semente da A. heterophyllus em úlcera gástrica aguda induzida por etanol em
camundongos.
Cimetidina
SFM metanólica da A.
heterophyllus 50 mg/kg
FM metanólica da A.
heterophyllus 50 mg/kg
58
De acordo com os parâmetros avaliados, percebe-se que a SFM, a FM (50
mg/kg) e as diferentes dosagens do EBM das sementes da A. heterophyllus (50,
125 e 250 mg/kg), possuem atividade gastroprotetora com efetividade semelhante
entre si e em relação ao controle positivo (Figura 12).
Figura 12. Índice de cura obtido pelo efeito da administração oral de
cimetidina (100 mg/kg) do extrato metanólico da semente da A. heterophyllus nas
diferentes doses (50, 125 e 250 mg/kg) e de sua fração e subfração metanólica (50
mg/kg) em úlcera gástrica aguda induzida por etanol em camundongos.
Cimetidina
Semente da A.
heterophyllus 50 mg/kg
Semente da A.
heterophyllus 125 mg/kg
Semente da A.
heterophyllus 250 mg/kg
SFM da A. heterophyllus
50 mg/kg
FM da A. heterophyllus 50
mg/kg
Como a fração e subfração (flavonoides) apresentaram atividade de
gastroproteção significativa, mas, não de maneira relevante quando comparado com
os resultados do extrato bruto, sugere-se um efeito somático ou sinérgico entre as
substâncias presentes no extrato, ou seja, estes efeitos podem ser associados a
compostos
fenólicos,
terpenos
e
esteroides
(FRANCISCO
et
al.,
2009;
MADALOSSO, 2011).
O termo sinergia corresponde a mistura de duas ou mais substâncias que
possuem efeito biológico maior que a soma dos efeitos individuais ministrados na
mesma dose, o que ocorre possivelmente devido a associação química entre as
substâncias, facilitando o transporte celular e biodisponibilidade, auxiliando na ação
farmacológica. Algumas pesquisas evidenciam que extratos totais ou parciais
provenientes de espécies vegetais, por vezes apresentam atividade farmacológica
superior à dose similar de uma substância isolada (WAGNER et al., 2010).
Lemos et al. (2011), em sua pesquisa com o extrato bruto hidroalcoólico da
Brassica oleracea L. var. acephala DC, obteve frações e subfrações na tentativa de
59
elucidar os possíveis metabólitos responsáveis pela atividade gastroprotetora já
observada. À medida que o extrato foi sendo fracionado apresentou uma diminuição
na capacidade de inibir as úlceras, mas, mantendo a capacidade gastroprotetora.
5.2.2 Efeito do extrato metanólico da semente de E. involucrata, da A.
heterophyllus e sua subfração em úlcera aguda induzida por AINE.
Como mencionado no modelo de indução de úlcera aguda com etanol, a
quantificação de lesões gástricas em ratos e camundongos é um método
amplamente utilizado para avaliar atividade gastroprotetora (CHANDRANATH;
BASTAKI; SINGH, 2002; ALQASOUMI et al., 2009). Nesse modelo que também é
utilizado como triagem nos estudos de fármacos com atividade gastroprotetora, a
indução de úlcera aguda, ocorre por indometacina, um AINE que inibe a proteção
normal do estômago, atuando na inibição da COX e consequentemente na
diminuição da síntese de prostaglandinas constitutivas (RAIHA et al., 1998;
SCHMASSMANN, 1998; LEMOS et al., 2011; MADALOSSO, 2011).
O experimento baseado no modelo de úlcera aguda induzida por AINE
(indometacina) possibilitou a verificação da atividade gastroprotetora de ambos os
extratos, que reduziram a área total lesada e a área relativa de lesão nas doses de
50, 125 e 250 mg/kg, assim como a cimetidina (100 mg/kg), com valores
significativamente diferentes quando comparados com o controle negativo (Tabela
3).
Tabela 3. Efeito da administração oral de cimetidina (100 mg/kg) e das diferentes
doses do extrato bruto metanólico da semente da A. heterophyllus e E. involucrata
(50, 125 e 250 mg/kg) em úlcera gástrica aguda induzida por indometacina em
camundongos (n=6).
Tratamento
Controle
EBM da semente
A. heterophyllus
EBM da semente da
E. involucrata
Cimetidina
2
Dose (mg/kg)
Veículo
50
125
Área total de lesão (mm )
10,81 ± 1,10
6,04 ± 1,00**
2,42 ± 0,75**
Área relativa de lesão (%)
2,15 ± 0,17
1,24 ± 0,08**
0,63 ± 0,21**
250
50
125
250
100
1,14 ± 0,60 **
1,81 ± 0,27**
1,33 ± 0,26 **
0,89 ± 0,14 **
2,39 ± -0,61 **
0,30 ± 0,17**
0,32 ± 0,05**
0,26 ± 0,06 **
0,26 ± 0,06 **
0,51 ± 0,12**
Diferença significativa em relação ao grupo controle (**p<0,01), ANOVA, expressos como média ± EPM, teste a
posteriori de Dunnett.
60
Figura 13. Imagens de estômagos após indução de úlcera com indometacina
A
B
C
D
E
F
G
H
Legenda: A- controle negativo; B- controle positivo (cimetidina 100 mg/kg); C – EBM da semente de
A. heterophyllus 50 mg/kg; D – EBM da semente de A. heterophyllus 125 mg/kg; E - EBM da semente
de A. heterophyllus 250 mg/kg; F – EBM da semente de E. involucrata 50 mg/kg; G - EBM da
semente de E. involucrata 125 mg/kg; H - EBM da semente de E. involucrata 250 mg/kg.
O IC obtido do EBM da semente da A. heterophyllus foi de 53% para a dose
de 50 mg/kg, 81% para a dose de 125 mg/kg e 91% para a dose de 250 mg/kg,
demonstrando ação gastroprotetora relevante, sendo 85% o IC para o tratamento
com cimetidina na dose de 100 mg/kg (Figura 14).
Figura 14. Índice de cura obtido pelo efeito da administração oral de
cimetidina (100 mg/kg) e das diferentes doses do extrato metanólico da semente da
A. heterophyllus (nas doses de 50, 125 e 250 mg/kg) em úlcera gástrica aguda
induzida por indometacina em camundongos.
Cimetidina
**
Semente da A.
heterophyllus 50 mg/kg
Semente da A.
heterophyllus 125 mg/kg
Semente da A.
heterophyllus 250 mg/kg
Diferença significativa em relação ao grupo controle, cimetidina (**p<0,01), ANOVA, expressos como media ±
EPM, teste a posteriori de Dunnett.
61
O EBM da semente da E. involucrata, também apresentou um IC
representativo em todas as dosagens, 84% para a dose de 50 mg/kg, 90% para a
dose de 125 mg/kg e 93% para a dose de 250 mg/kg, sendo 85% o IC do tratamento
com cimetidina na dose de 100 mg/kg (Figura 15). Possibilitando a verificação do
potencial na atividade de proteção da mucosa gástrica.
Figura 15. Índice de cura obtido pelo efeito da administração oral de
cimetidina (100 mg/kg) e das diferentes doses do extrato metanólico da semente da
E. involucrata (nas doses de 50, 125 e 250 mg/kg) em úlcera gástrica aguda
induzida por indometacina em camundongos.
Cimetidina
Semente da E. involucrata
50 mg/kg
Semente da E. involucrata
125 mg/kg
Semente da E. involucrata
250 mg/kg
Com o fracionamento do extrato e após verificar que a SFM da A.
heterophyllus obteve um resultado satisfatório no modelo de úlcera aguda induzida
por etanol, realizou-se o experimento de úlcera aguda induzida por AINE com esta
subfração, na dose de 50 mg/kg. Neste modelo a SFM apresentou resultados
significativos na atividade gastroprotetora (Tabela 4), reduzindo a área total lesada e
a área relativa lesada de maneira relevante quando comparado ao controle negativo,
assim como o EBM.
Figura 16. Imagens de estômagos após indução de úlcera por indometacina.
A
B
C
Legenda: A- controle negativo; B- controle positivo (cimetidina 100 mg/kg); C – Subfração metanólica
do EBM da semente de A. heterophyllus 50 mg/kg.
62
Tabela 4. Efeito da administração oral de cimetidina (100 mg/kg) e da subfração
metanólica das sementes da A. heterophyllus (50 mg/kg) em úlcera gástrica aguda
induzida por indometacina em camundongos (n=6).
Tratamento
Controle
SFM A.heterophyllus
Cimetidina
Dose (mg/kg)
Veículo
50
100
2
Área total de lesão (mm )
10,81 ± 1,10
2,97 ± 0,41**
2,39 ± -0,61**
Área relativa de lesão (%)
2,15 ± 0,17
0,58 ± 0,06**
0,51 ± 0,12**
Diferença significativa em relação ao grupo controle (**p<0,01), ANOVA, expressos como média ± EPM, teste a
posteriori de Dunnett.
O IC calculado para a SFM (50 mg/kg) foi de 76%, sendo 85% o IC do
tratamento com cimetidina na dose de 100 mg/kg (Figura 17). Demonstrando possuir
ação gastroprotetora próxima ao do tratamento convencional.
Figura 17. Índice de cura obtido pelo efeito da administração oral de
cimetidina (100 mg/kg) e da dose da subfração metanólica da semente da A.
heterophyllus (50 mg/kg) em úlcera gástrica aguda induzida por indometacina em
camundongos.
Cimetidina
**
Semente da A.
heterophyllus 50 mg/kg
Semente da A.
heterophyllus 125 mg/kg
Semente da A.
heterophyllus 250 mg/kg
SFM da A. heterophyllus
50 mg/kg
Diferença significativa em relação ao grupo controle, cimetidina (**p<0,01), ANOVA, expressos como média ±
EPM, teste a posteriori de Dunnett.
No presente modelo de indução de úlcera gástrica por AINEs, a indometacina
é o AINE de primeira escolha devido ao seu alto potencial ulcerogênico quando
comparado a outros medicamentos da mesma linha. Embora seu mecanismo de
ação não esteja totalmente esclarecido, acredita-se que a indometacina induz o
dano gástrico principalmente devido aos seus efeitos sistêmicos, ou seja, ao inibir as
enzimas COX-1 e COX-2, reduzindo assim as concentrações locais de PGs
(SULEYMAN et al., 2010; MADALOSSO, 2011).
63
As PGs estão envolvidas com praticamente todos os mecanismos de defesa
da mucosa, participam da inibição da secreção de ácido, estimulam secreção de
muco, bicarbonato e fosfolípideos, melhoram a circulação sanguínea e com isso a
restituição do epitélio. Além de atuarem na inibição da ativação de mastócitos e
aderência de leucócitos e plaquetas ao epitélio vascular (LAINE; TAKEUCHI;
TARNAWSKI, 2008; WALLACE, 2008). Na sua falta o sistema de defesa da mucosa
gástrica fica suprimido, deixando os fatores agressores agirem com maior facilidade
(HAWKEY; RAMPTON, 1985; DEY; LEJEUNE; CHADEE, 2006).
O papel das EROs também é descrito para a lesão induzida pela
indometacina. Segundo Hassan, Martin e Puidg-Parellada (1998) duas horas após a
administração oral de indometacina ocorreu aumento agudo na produção de
superóxido e peróxido de hidrogênio na mucosa gástrica.
Neste ínterim, os flavonoides também tiveram sua atividade gastroprotetora
avaliada no modelo de indução com indometacina, demonstrando diminuir as lesões
gástricas causadas por esse AINE (KLEIN-JÚNIOR et al., 2012). Isobe et al. (1985)
e Konturek et al. (1986) já documentavam que as chalconas agiam aumentando o
teor de prostaglandinas na mucosa, mantendo a primeira barreira de proteção da
mucosa em equilíbrio.
Além das chalconas, a quercetina também foi pesquisada utilizando-se deste
modelo em discussão, e resultou em uma atividade gastroprotetora potente na dose
de 50 mg/kg, atuando na diminuição no volume gástrico ácido e da acidez, diferente
da ação dos extratos em estudo, que não tiveram alterações nesse mecanismo
(FORMICA; REGELSON, 1995; MOJZIS et al., 2001).
Resultados obtidos por Barros et al. (2008) indicam que os compostos
fenólicos presentes nas folhas da A. heterophyllus são responsáveis pelo efeito
gastroprotetor mediante a atividade citoprotetora, reduzindo as lesões causadas pelo
agente agressor em discussão.
O mecanismo para a ação gastroprotetora dos flavonoides tem se
enquadrado na reversão dos efeitos oxidativos, o aumento da expressão das
isoformas de COX e na síntese de prostaglandinas (ADHIKARY et al., de 2011).
Klein-Júnior et al. (2012) e Santin et al. (2010) verificaram potencial
gastroprotetor de flavonoides, terpenos e esteroides, compostos observados nos
extratos em estudo, neste modelo em discussão.
64
Com isso, supõe-se que além de poder estar atuando no mecanismo de
produção ou manutenção do muco, na citoproteção, o EBM das sementes da A.
heterophyllus e E. involucrata, também podem estar contribuindo com o mecanismo
antioxidante na resposta de gastroproteção frente ao dano induzido por este AINE.
Outros mecanismos são descritos na literatura para fármacos que reduzem as
lesões gástricas induzidas por este medicamento, os quais incluem aumento de NO,
inibição de granulócito elastase, abertura de canais de potássio ATP dependentes,
redução das concentrações de adrenalina e proteínas de choque térmico (VANE;
BAKHLE; BOTTING, 1998; MUSUMBA; PRITCHARD; PIRMOHAMED, 2009).
5.2.3 Efeito do extrato metanólico das sementes da A. heterophyllus e E.
involucrata no modelo de úlcera crônica induzida por ácido acético
A indução de úlceras crônicas por ácido acético é o modelo de experimento
com animais que mais se assemelha com a patologia em humanos. Foi descrito por
Takagi, Okabe e Saziki (1969), quando observaram que o ácido acético foi capaz de
produzir uma lesão bem definida envolvendo a camada muscular de cicatrização
demorada, semelhante à úlcera péptica humana. Baseado nisso, este modelo foi
utilizado para a avaliação da atividade curativa do EBM das sementes da A.
heterophyllus e da E. involucrata sobre úlceras crônicas produzidas por ácido
acético, sendo que a possível ação curativa na cavidade gástrica mediada por esses
extratos na dose de 250 mg/kg, foi avaliada após 9 dias da indução da lesão.
Os resultados obtidos demonstraram que ambos os extratos foram capazes
de diminuir o tamanho da úlcera em comparação ao grupo controle negativo,
inclusive de maneira mais efetiva que o controle positivo, cimetidina (100 mg/kg) na
cicatrização das lesões gástricas (Tabela 5).
Tabela 5. Efeito da administração oral de cimetidina (100 mg/kg) e do EBM das
sementes da A. heterophyllus e da E. involucrata (250 mg/kg) em úlcera gástrica
induzidas por ácido acético (30%) em camundongos (n=6).
Tratamento
Controle
EBM da semente da
A. heterophyllus
EBM da semente da
E. involucrata
Cimetidina
2
Dose (mg/kg)
Veículo
Área total de lesão (mm )
6,67 ± 1,05
Área relativa de lesão (%)
1,84 ± 0,59
250
1,45 ± 0,39**
0,24 ± 0,12**
250
1,07 ± 0,37**
0,21 ± 0,07**
100
2,38 ± 0,24**
0,22 ± 0,08**
Diferença significativa em relação ao grupo controle (**p<0,01), ANOVA, expressos como média ± EPM, teste a
posteriori de Dunnett.
65
Com a determinação da área total lesada, foi calculado o IC, onde o
tratamento com EBM da semente da A. heterophyllus (250 mg/kg) apresentou 92%
de cura e o EBM da semente da E. involucrata 95%, ambos demonstrando maior
potencial gastroprotetor que o tratamento com cimetidina (100 mg/kg), que
apresentou um IC de 64% (Figura 18).
Figura 18. Índice de cura obtido pelo efeito da administração oral de
cimetidina (100 mg/kg) e do EBM da semente da A. heterophyllus (250 mg/kg) e do
EBM da semente da E. involucrata (250 mg/kg) em úlcera gástrica aguda induzida
por ácido acético (30%) em camundongos.
**
**
Cimetidina
Semente da A.
heterophyllus 250 mg/kg
Semente da E.
Involucrata 250 mg/kg
Diferença significativa em relação ao grupo controle, cimetidina (**p<0,01), ANOVA, expressos como média ±
EPM, teste a posteriori de Dunnett.
A úlcera gástrica decorre de um processo necrótico e isquêmico, onde o
tecido em necrose não recebe nutrientes, liberando mediadores que causam
quimiotaxia de leucócitos e macrófagos, os quais fagocitam os restos celulares
liberando citocinas pró-inflamatórias, TNFα, a IL-1α e a IL-1β, que aumentam as
lesões (TARNAWSKI, 2000; TSUJI et al., 2002; POONAM; VINAY; GAUTAN, 2005;
SCHMASSMAN et al., 2005; WALLACE, 2005).
A defesa da mucosa e o processo de cicatrização do tecido envolvem a
enzima COX-2, que quando expressa parece controlar os mecanismos de reepitelização, angiogênese, citoproteção e proliferação celular epitelial. Da mesma
maneira, as PGs exercem atividade de extrema importância para a renovação do
epitélio gástrico, através da manutenção dos fatores defensivos da mucosa gástrica
(TSUJI et al., 2002; POONAM; VINAY; GAUTAN, 2005; SCHMASSMAN et al., 2005;
TARNAWSKI, 2005; WALLACE, 2005).
66
Os resultados obtidos com esse modelo demonstram que o EBM das
sementes da A. heterophyllus e E. involucrata, apresentaram além da atividade
gastroprotetora nos modelos agudos, capacidade de promover a cicatrização de
úlceras no modelo crônico, permitindo sugerir que os compostos fitoquímicos
presentes nos extratos favorecem os mecanismos anti-inflamatórios e antioxidantes,
possivelmente induzindo a síntese de PGE2 e liberação de NO, favorecendo os
mecanismos de reparo e cicatrização da lesão ulcerativa (LEMOS et al., 2011).
Outros estudos de avaliação do mecanismo antiúlcera, apresentaram
cicatrização de lesões gástricas provocadas por ácido acético, relacionando esta
atividade com os compostos fitoquímicos, flavonoides e terpenos, sendo que o
mecanismo de ação envolvido, observado nas pesquisas, é o aumento na produção
de prostaglandina e inibição da peroxidação lipídica, corroborando com os dados da
presente pesquisa (KONTUREK et al., 1987; SUZUKI et al., 1998; SANTIN et al.,
2010; LEMOS et al., 2011; KLEIN-JÚNIOR et al., 2012).
5.3 MECANISMOS DE AÇÃO
5.3.1 Efeito do extrato metanólico da semente da A. heterophyllus e da E.
involucrata sobre a secreção gástrica (ligadura de piloro)
Frente aos efetivos resultados de gastroproteção verificados nos dois
modelos clássicos de indução de úlcera aguda (etanol e indometacina) e também no
modelo de úlcera crônica (ácido acético) pelo EBM das sementes da A.
heterophyllus e E. involucrata, buscou-se investigar mais detalhadamente os
mecanismos pelos quais podem estar desenvolvendo suas atividades biológicas.
O modelo de ligadura de piloro investiga a secreção de ácido gástrico, uma
das mais importantes funções do estômago. Em situações de estresse ou que
acarretem alterações nos mecanismos homeostáticos essa secreção é prejudicada e
o volume e a acidez podem aumentar desordenadamente, podendo atingir as
defesas da mucosa e levar a formação de lesões gástricas (LAPA et al., 2008;
LEMOS et al., 2011). Os experimentos permitem verificar a ação do extrato por via
sistêmica, sendo a administração do extrato via intraduodenal, permitindo anular a
interação do contato direto com a mucosa (LEMOS et al., 2011).
67
A administração do EBM das sementes da A. heterophyllus promoveu a
diminuição do volume na secreção gástrica de maneira significativa quando
comparado ao controle negativo. Todavia, os resultados obtidos na alteração do pH
nas três dosagens testadas (50, 125 e 250 mg/kg) não apresentaram significância
quando comparados ao grupo controle negativo, assim como os valores obtidos na
concentração de íons da secreção gástrica, que não caracterizam relevância na
diminuição da acidez.
Em relação ao EBM das sementes da E. involucrata, os resultados também
demonstraram a promoção da diminuição no volume da secreção gástrica e
aumento de pH, sendo que apenas na dose de 250 mg/kg os valores foram
significativos quando comparados ao controle negativo. As doses de 50 e 125 mg/kg
não causaram alterações relevantes em nenhuma das variantes analisadas (Tabela
6).
Tabela 6. Efeitos da administração intraduodenal de cimetidina (100 mg/kg) e das
diferentes doses do extrato metanólico da semente da A. heterophyllus e E.
involucrata (50, 125 e 250 mg/kg) nos parâmetros bioquímicos da secreção gástrica
ácida de camundongos submetidos à ligadura de piloro (n=6).
Tratamento
Dose
(mg/kg)
pH
Volume de
secreção (g)
[H+]
-1
(mEq.g /L)
Controle
Veículo
50
125
2,92 ± 0,15
3,21 ± 0,16
3,32 ± 0,12
0,275 ± 0,02
0,162 ± 0,02*
0,102 ± 0,06**
86,36 ± 4,38
104,47 ± 5,63
91,44 ± 3,06
250
50
125
250
100
3,36 ± 0,18
3,51 ± 0,35
3,77 ± 0,18
4,24 ± 0,48**
4,97±0,51**
0,137 ± 0,02**
0,185 ± 0,02
0,259 ± 0,03
0,154 ± 0,02**
0,350 ± 0,02*
62,68 ± 5,93
62,87 ± 9,97
65,90 ± 9,30
112,56 ± 5,14
34,00±4,30**
EBM da semente da
A.heterophyllus
EBM da semente da
E. involucrata
Cimetidina
Diferença significativa em relação ao grupo controle (*p<0,05 e **p<0,01), ANOVA, expressos como média ±
EPM, teste a posteriori de Dunnet
O EBM das sementes em estudo causaram alterações no pH, no volume
gástrico e na concentração de íons de hidrogênio, todavia, em sua maioria os
resultados não foram significativamente diferentes do controle negativo, sugerindo
que os extratos não possuem atividade antissecretora, atuando na gastroproteção
por outra via (Tabela 6).
O fato de algumas espécies vegetais não agirem inibindo ou reduzindo a
secreção de ácido gástrico pode ser interessante farmacologicamente para o
68
tratamento de desordens no trato gastrintestinal, uma vez que, previne o
crescimento microbiano e a hipogastrinemia (LAMBERTS et al., 1993).
Também, no estudo de Giordano et al., (1990) e Pongipiriyadacha et al.
(2003) foi verificado atividade gastroprotetora de diferentes terpenoides nos dois
modelos de indução de úlcera aguda, etanol e indometacina , sendo que o
mecanismo de ação, verificado pelo pesquisador, não envolveu a diminuição na
produção de ácido clorídrico, estando relacionado a outras vias, conforme observado
nos dados em discussão.
5.3.2 Efeito do extrato metanólico da semente da A. heterophyllus e E.
involucrata sobre a produção de muco na mucosa gástrica
O não envolvimento do extrato com a secreção ácida levou a presente
pesquisa a investigação de outros mecanismos protetores da mucosa gástrica,
trabalhando desta forma com a investigação na produção de muco.
O EBM das sementes da A. heterophyllus e da E. involucrata foram capazes
de aumentar a quantidade de muco presente na mucosa gástrica. Os resultados
apresentados na Tabela 7 demonstram que a administração nas doses de 125 e 250
mg/kg foram significativas no aumento da quantidade de muco presente na mucosa
gástrica quando comparados com o grupo controle negativo. A carbenoxolona (200
mg/kg) mostrou-se efetiva como controle positivo, pois promoveu o aumento de
muco. A indometacina (100 mg/kg) também mostrou-se efetiva como controle
negativo, reduzindo a quantidade de muco da mucosa.
Tabela 7. Efeito da administração intraduodenal de carbenoxolona (200 mg/kg) e
das diferentes doses do extrato metanólico das sementes da A. heterophyllus e E.
involucrata (50, 125 e 250 mg/kg) nos parâmetros bioquímicos da produção de muco
de camundongos submetidos à ligadura de piloro (n=6).
Tratamento
Controle
EBM da semente da
A. heterophyllus
EBM da semente da
E. involucrata
Carbenoxolona
Dose (mg/kg)
Veículo
50
125
Quantidade de Alcian Blue ligado (mg/g tecido)
5,00 ± 0,66
5,96 ± 0,26
7,08 ± 0,21**
250
50
125
250
200
7,15 ± 0,18**
5,78 ± 0,17
6,21 ± 0,22*
6,64 ± 0,27**
7,04 ± 0,53**
Diferença significativa em relação ao grupo controle (**p<0,01), ANOVA, expressos como média ± EPM, teste a
posteriori de Dunnett
69
O muco é um componente importante envolvido na gastroproteção, formado
por glicoproteinas e água. Possui uma consistência viscosa, elástica e aderente.
Para exercer sua ação depende além de suas características estruturais, também da
sua espessura (LAINE; TAKEUCHI; TARNAWSKI, 2008).
O aumento do muco, fator protetor, consequentemente, diminui o dano
causado às células epiteliais quando em contato com o ácido clorídrico. O muco tem
a capacidade de sequestrar radicais livres, devido a sua composição glicoprotéica
(MOJZIS; HEGEDUSOVA; MIROSSAY, 2000; NAM et al., 2005; WALLACE, 2007).
A proteção criada pelo muco ligado ao tecido pode ser observada pela
formação de mucopolissacarídeos solúveis, os quais são quantificados de acordo
com sua ligação ao Alcian Blue, um corante específico para mucinas ácidas (LAPA
et al., 2008). Ambos os EBMs das sementes demonstraram que sua atividade
gastroprotetora pode ser mediada em parte por este mecanismo. Possivelmente
atuando na influência da PGE2 e NO, que podem modular a defesa da mucosa
mediante o estímulo da secreção de muco e bicarbonato, aumento no fluxo
sanguíneo e estímulo da citoproteção, favorecendo os mecanismos de reparo
tecidual, podendo também estar relacionado com o aumento do potencial
antioxidante do muco (HAMAISHI; KOJIMA; ITO, 2006; LEMOS et al., 2011).
Beil, Birkholz e Sewing (1995) e Gracioso et al. (2002) também propuseram
que a ação gastroprotetora dos flavonoides, de maneira mais ampla, pode ser
mediada através da estimulação da secreção de muco e bicarbonato e/ou por um
efeito inibitório direto na bomba de prótons das células parietais.
Corroborando com os dados da pesente pesquisa, diversos estudos que
procuraram verificar o potencial gastroprotetor de compostos fitoquimicos de
espécies vegetais, verificaram ação gastroprotetora mediante aumento significativo
na quantidade de muco,
atividade esta relacionada ao efeito dos flavonoides,
terpenos e esteroides (KANNAPPAN et al., 2010; SANTIN et al., 2010; LEMOS et
al., 2011; KLEIN-JÚNIOR et al., 2012). Sendo que este aumento na produção de
muco pode ser proveniente do aumento nos níveis de prostaglandinas, atividade do
NO e SH (GIORDANO et al., 1990; PONGIPIRIYADACHA et al., 2003)
5.3.3 Papel do óxido nítrico e do extrato metanólico da semente da A.
heterophyllus e da E. involucrata em úlcera aguda induzida por etanol
70
Visto que os extratos apresentaram ação gastroprotetora, provavelmente por
atuar viabilizando os mecanismos antioxidantes e no aumento na estimulação e/ou
produção de muco, verificou-se a necessidade de explorar a ação do óxido nítrico no
modelo de úlcera aguda induzida por etanol, em conjunto com a administração do
EBM das sementes, na tentativa de melhor elucidar o mecanismo de ação desses
tratamentos.
O L-NAME é uma substância capaz de inibir a enzima NOs (óxido nítrico
sintase). Em modelos de avaliação da atividade gastroprotetora ligada a fatores
antioxidantes verifica-se a participação do NO (óxido nítrico) através da préadministração de L-NAME.
Neste modelo, a administração do L-NAME nos animais antes dos
tratamentos com EBM (250 mg/kg), permitiram verificar que uma das vias prováveis
de ação gastroprotetora é a do NO, visto que a atividade de proteção antes
observada, com administração apenas do EBM, foi perdida com a pré-administração
do L-NAME (Tabela 8 e 9).
Tabela 8. Efeito da administração oral de carbenoxolona (200 mg/kg) e do extrato
metanólico das semente de A. heterophyllus (250 mg/kg) em úlcera gástrica induzida
por etanol associado a inibição da NO-sintase em camundongos (n=6).
Tratamento
L-NAME
(70mg/kg)
Dose (mg/kg)
Área total de
2
lesão (mm )
Controle
+
+
+
Veículo
Veículo
250 mg
250 mg
200 mg
200 mg
62,61 ± 4,08
79,74 ± 10,00
###
26,00 ± 4,50*
0
62,01 ± 10,23
###+++
6,31 ± 1,93***
##C
39,91 ± 5,94
A. heterophyllus
Carbenoxolona
Índice de cura
(%) –
L-NAME
20,83±5,24
67,66±5,67
36±9,00
+++
88,33 ± 1,17***
43,63 ± 2,72*
###
Diferença significativa em relação ao grupo controle (*p<0,05, ***p<0,001), controle L-NAME ( p<0,001), em
0
relação ao grupo A. heterophyllus 250mg sem L-NAME ( <p0,05), em relação ao grupo A. heterophyllus 250mg
+++
C
com L-NAME ( p<0,001) e em relação ao grupo carbenoxolona ( p<0,05) ANOVA, expressos como média ±
EPM, teste a posteriori de Dunnett.
Tabela 9. Efeito da administração oral de carbenoxolona (200 mg/kg) e do extrato
metanólico das semente de E. involucrata (250 mg/kg) em úlcera gástrica induzida
por etanol associado a inibição da NO-sintase em camundongos (n=6).
Tratamento
L-NAME (70mg/kg)
Controle
+
+
+
E. involucrata
Carbenoxolona
Dose
(mg/kg)
Veículo
Veículo
250 mg
250 mg
200 mg
200 mg
Área total de lesão
2
(mm )
53,31 ± 7,38
79,74 ± 10,00*
###
5,51 ± 1,14***
###
13,55 ± 0,72**
###
6,31 ± 1,93***
###000+cc
39,91 ± 5,94
Índice de cura (%)
20,83±5,24
94±1,26
82±0,54
88,33 ± 1,17***
000+++
43,63 ± 2,72*
Diferença significativa em relação ao grupo controle (*p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001), controle L-NAME
###
000
( p<0,001), em relação ao grupo E. involucrata 250mg sem L-NAME ( <p0,001), em relação ao grupo E.
71
+
+++
cc
involucrata 250mg com L-NAME ( p<0,05 e
<p0,001) e em relação ao grupo carbenoxolona ( p<0,01)
ANOVA, expressos como média ± EPM, teste a posteriori de Dunnett.
O tratamento com EBM das sementes da A. heterophyllus (250 mg/kg),
demonstrou promover gastroproteção, apresentando área relativa lesada de 4%
contra o dano produzido pelo etanol, sendo que a atividade gastroprotetora foi
parcialmente perdida quando pré-administrado L-NAME nos animais (11%). No
grupo controle negativo, não foi observado alterações significativas entre o grupo
tratado com salina (11%) e o grupo tratado com L-NAME (15%) (Figura 19). A
carbenoxolona (200 mg/kg) apresentou-se efetiva como controle positivo diante do
dano gástrico produzido pelo etanol, perdendo sua atividade com associação ao LNAME.
Figura 19. Porcentagem de área lesada obtida pelo efeito da administração
oral do extrato metanólico das sementes da A. heterophyllus (250 mg/kg) em úlcera
gástrica aguda induzida por etanol em camundongos, associado a administração de
L-NAME (70 mg/kg, i.p.) e água destilada (0,1 mL/10 g de peso de animal).
Controle negativo
Controle negativo + LNAME 70 mg/kg
Semente da A.
heterophyllus 250 mg/kg
##
*
Semente da A.
heterophyllus 250 mg/kg +
L-NAME 70 mg/kg
Diferença significativa em relação ao grupo controle negativo (*p<0,05), controle L-NAME (##p<0,01) e grupo
0
semente da A. heterophyllus 250 mg/kg ( p<0,05). ANOVA, expressos como média ± EPM, teste a posteriori de
Dunnett.
Também, o tratamento com EBM das sementes da E. involucrata (250 mg/kg)
demonstrou promover gastroproteção, apresentando área relativa lesada de 1,2%
contra o dano produzido pelo etanol, sendo que esta foi perdida quando préadministrado L-NAME nos animais (4,03%). No grupo controle negativo, foi
observado alterações significativas entre o grupo tratado com salina (9,9%) e o
grupo tratado com L-NAME (16,9%) (Figura 20).
72
Figura 20. Porcentagem de área lesada obtida pelo efeito da administração
oral do extrato metanólico da semente da E. involucrata (250 mg/kg) em úlcera
gástrica aguda induzida por etanol em camundongos, associado a administração de
L-NAME (70 mg/kg, i.p.) e água destilada (0,1 mL/10 g de peso de animal).
*
Controle negativo
Controle negativo + LNAME 70 mg/kg
Semente da E.involucrata
250 mg/kg
###
*
###
**
Semente da E.involucrata
250 mg/kg + L-NAME 70
mg/kg
Diferença significativa em relação ao grupo controle negativo (*p<0,05 e **p<0,01), controle L-NAME
###
( p<0,001), ANOVA, expressos como média ± EPM, teste a posteriori de Dunnett.
O NO participa da modulação da defesa da mucosa gástrica mediante a
regulação na secreção de muco, como vasodilatador produzindo aumento de fluxo
sanguíneo local e inibindo a agregação dos neutrófilos, auxiliando no processo de
cicatrização da úlcera gástrica (LAPA et al., 2008; LEMOS et al., 2011).
O NO atua sobre a guanilato ciclase, na via da guanosina-3’,5’-monofosfato
cíclico (GMPc) e diretamente sobre os canais de potássio dependentes de cálcio,
gerando hiperpolarização nas células endoteliais dos vasos, causando seu efeito de
vasodilatação. Na cavidade do trato gastrointestinal, o NO é produzido pela enzima
óxido nítrico sintase, mantendo a integridade da mucosa (ODABASOGLU et al.,
2006; LAPA et al., 2008).
No experimento com pré-administração de L-NAME ocorre o bloqueio da
síntese de NO através da inibição da enzima NOs, o que causa possivelmente
aumento no estresse oxidativo, ativando mastócitos que se encontram em grande
quantidade no trato digestório, além de poder prejudicar a microcirculação do local.
Ambos os EBMs das sementes da A. heterophyllus e E. involucrata obtiveram sua
atividade gastroprotetora revertida com o pré-tratamento com L-NAME, sugerindo
que o mecanismo de ação seja dependente de NO (LAPA et al., 2008; LEMOS et al.,
2011).
73
Semelhante ao presente estudo, Brzozowski et al., (2005) em sua pesquisa
verificou o potencial gastroprotetor de flavonoides, frente a danos induzidos por
etanol. O pesquisador observou aumento na produção de prostaglandinas e
vasodilatação, relacionando com a atividade do óxido nítrico, possivelmente
estimulado pelo composto fitoquímico em discussão, que também exerce atividade
antibacteriana e antioxidante.
CosKun et al. (2004) em sua pesquisa afirmou que a atividade gastroprotetora
exercida pela quercetina, um tipo de flavonoide, decorreu da diminuição da
peroxidação lipídica e normalização dos níveis de NO e de algumas enzimas
antioxidantes. Assim como Giordano et al. (1990) e Pongipiriyadacha et al. (2003)
que observaram efeito gastroprotetor mediado por terpenos via aumento do NO.
5.3.4 Papel dos compostos sulfidrilas e do extrato metanólico da semente da
A. heterophyllus e da E. involucrata em úlcera aguda induzida por etanol
Na tentativa de melhor elucidar o mecanismo de ação do EBM das sementes
da A. heterophyllus e E. involucrata, além de explorar a atividade do NO, é
necessário investigar os compostos sulfidrilas, visto que também podem atuar
viabilizando os mecanismos antioxidantes e o aumento na estimulação e/ou
produção de muco.
O NEM (N-etilmaleimida) é uma substância capaz de quelar os grupamentos
sulfidrilas presente na mucosa gástrica, que participam dos processos antioxidantes
ligados a gastroproteção. Neste modelo de avaliação do potencial gastroprotetor,
pode-se verificar outra possível via de ação do EBM das sementes, sendo que
ambos perderam a atividade protetora da mucosa, já observada, quando préadministrado o NEM (Tabela 10 e 11).
Tabela 10. Efeito da administração oral de carbenoxolona (200 mg/kg) e do extrato
metanólico da semente de A. heterophyllus (250 mg/kg) em úlcera gástrica induzida
por etanol associado a alquilação de grupamentos sulfidrilas em camundongos.
Tratamento
Controle
A. heterophyllus
Carbenoxolona
NEM
(70mg/kg)
+
+
+
Dose
(mg/kg)
Veículo
Veículo
250 mg
250 mg
200 mg
200 mg
Área total de lesão
2
(mm )
46,80 ± 8,87
55,64 ± 5,00
##
22,05 ± 3,85*
37,61 ± 4,44
###++
6,90 ± 3,10***
###000++ccc
105,11 ± 9,14***
Índice de cura (%) NEM
12,8±5,59
67±5,80
36±9,00
+++
87,33 ± 4,31***
000++ccc
0
74
###
Diferença significativa em relação ao grupo controle (*p<0,05, ***p<0,001), controle NEM ( p<0,001), em
000
relação ao grupo A. heterophyllus 250mg sem NEM ( <p0,001), em relação ao grupo A. heterophyllus 250mg
++
+++
CCC
com NEM ( p<0,01 e p<0,001) e em relação ao grupo carbenoxolona ( p<0,001) ANOVA, expressos como
média ± EPM, teste a posteriori de Dunnett.
Tabela 11. Efeito da administração oral de carbenoxolona (200 mg/kg) e do extrato
metanólico da semente de E. involucrata (250 mg/kg) em úlceras gástricas induzidas
por etanol associado a alquilação de grupamentos sulfidrilas em camundongos.
Tratamento
Controle
E. involucrata
Carbenoxolona
NEM
(10mg/kg)
+
+
+
Dose
(mg/kg)
Veículo
Veículo
250 mg
250 mg
200 mg
200 mg
Área total de lesão
2
(mm )
53,31 ± 7,38
60,07 ± 2,92
###
4,97 ± 1,25***
##0
29,56 ± 5,91*
###+
6,90 ± 3,10***
###000+++c
105,11 ± 9,14***
Índice de cura
(%)
12,8±5,59
92,6±1,91
46,6±7,82
++
88,00 ± 3,86***
000+++ccc
0
##
Diferença significativa em relação ao grupo controle (*p<0,05 e ***p<0,001), controle NEM ( p<0,01 e
###
0
000
p<0,001), em relação ao grupo E. involucrata 250 mg sem NEM ( p<0,05 e <p0,001), em relação ao grupo
+
+++
c
E. involucrata 250 mg com NEM ( p<0,05 e
<p0,001) e em relação ao grupo carbenoxolona ( p<0,05 e
ccc
p<0,001) ANOVA, expressos como média ± EPM, teste a posteriori de Dunnett.
O EBM das sementes da A. heterophyllus demonstrou através da área
relativa lesada promover gastroproteção (4%) contra o dano produzido pelo etanol,
gastroproteção essa perdida quando pré-administrado NEM (10%). No grupo
controle negativo, foi possível observar alterações entre o grupo tratado com salina
(11%) e o grupo tratado com NEM (14%), sugerindo que o dano produzido por
etanol foi maior quando associado com a pré-administração de NEM. Estes
resultados podem ser observados na Figura 21.
Figura 21. Porcentagem de área lesada obtida pelo efeito da administração
oral do extrato metanólico das sementes da A. heterophyllus (250 mg/kg) em úlceras
gástricas agudas induzidas por etanol em camundongos, associado a administração
de NEM (10 mg/kg, i.p.) e água destilada (0,1 mL/10 g de peso de animal).
Controle negativo
##
00
Controle negativo + NEM
10 mg/kg
###
***
Semente da A.
heterophyllus 250 mg/kg
Semente da A.
heterophyllus 250 mg/kg +
NEM 10 mg/kg
75
##
###
Diferença significativa em relação ao grupo controle (***p<0,001), controle NEM ( p<0,01 e
p<0,001) e em
00
relação ao grupo A. heterophyllus 250mg sem NEM ( <p0,01) ANOVA, expressos com média ± EPM, teste a
posteriori de Dunnett.
Os resultados representados na Figura 22 possibilitam a verificação, através
da área relativa lesada que o EBM das sementes da E. involucrata promoveu
gastroproteção (1%) contra o dano produzido pelo etanol, a qual foi perdida quando
pré-administrado NEM (9%) de maneira significativa. No grupo controle negativo, foi
possível observar alterações entre o grupo tratado com salina (10%) e o grupo
tratado com NEM (15%), sugerindo que o dano produzido por etanol foi maior
quando associado com NEM.
Figura 22. Porcentagem de área lesada obtida pelo efeito da administração
oral do extrato metanólico da semente da E. involucrata (250 mg/kg) em úlceras
gástricas agudas induzidas por etanol em camundongos, associado a administração
de NEM (10 mg/kg, i.p.) e salina (0,1 mL/10 g de peso de animal).
*
Controle negativo
##
000
Controle negativo + NEM
10 mg/kg
Semente da E.involucrata
250 mg/kg
Semente da E.involucrata
250 mg/kg + NEM 10
mg/kg
###
***
##
Diferença significativa em relação ao grupo controle (*p<0,05 e ***p<0,001), controle NEM ( p<0,01 e
###
000
p<0,001) e em relação ao grupo E. involucrata 250 mg sem NEM ( <p0,001) ANOVA, expressos como
média ± EPM, teste a posteriori de Dunnett.
Assim como o NO, os grupamentos sulfidrílicos são compostos que auxiliam
na defesa e manutenção da mucosa. Estes com a função principal de redução na
formação de EROs, direcionada á citoproteção, são compostos com capacidade de
redução
na
lesão
tecidual
mediante
a
manutenção
do
fluxo
sanguíneo
(CHATTOPADHYAY et al., 2006; LAPA et al., 2008).
Também, na mesma linha de estudo que o NO, a redução dos níveis normais
de grupos sulfidrílicos permite que a mucosa gástrica fique mais susceptível ao
76
ataque dos agentes agressores supracitados. A N-etilmaleimida (NEM), é uma droga
que possui a propriedade de quelar as pontes de dissulfeto que são responsáveis
pela conformação da barreira da mucosa, promovido pelos compostos sulfidrílicos.
Quando administrado diminui a concentração de SH nessa área, podendo
potencializar os danos induzidos pelo etanol na cavidade gástrica (LAPA et al.,
2008).
Geralmente os danos são relacionados à diminuição significativa nos níveis
de grupos sulfidrílicos, especialmente do GSH. Tal redução pode ser devida à
oxidação da glutationa, em resposta a geração de metabólitos tóxicos e/ou devido à
ligação da glutationa ao acetaldeído gerado através da oxidação de agentes
necrotizantes pela atividade gástrica da enzima álcool desidrogenase (DEVI et al.,
2007; LAPA et al., 2008).
Os resultados deste modelo, supracitado, permitem a associação da atividade
gastroprotetora de ambos os EBMs das sementes com os compostos sulfidrilas,
sendo que tanto a A. heterophyllus quanto a E. involucrata demonstraram ser
dependentes destes compostos, pois, após seu bloqueio, tiveram sua ação protetora
diminuída de maneira significativa (Figura 21 e 22).
Com a verificação dos compostos fitoquímicos (flavonoides, terpenos e
esteroides) presentes nas sementes em estudo, possibilita-se em parte, justificar o
potencial gastroprotetor verificado, pois, de acordo com Barbastefano (2007)
diversos terpenoides possuem atividade antiulcerogênica. Sendo, que em seu
estudo buscou investigar um extrato metanólico rico em flavonoides e outro extrato
clorofórmico rico em terpenoides, verificando que exerceram sua ação de proteção
da cavidade gástrica, via aumento na produção de muco aderido à mucosa gástrica
dependente em parte da presença de NO e radicais sulfidrila (SHs), corroborando
com os dados da presente pesquisa.
Segundo Mota et al. (2009) e Klein-Júnior et al. (2012) o mecanismo de maior
relevância pelo qual os flavonoides exercem sua atividade de proteção da mucosa
gástrica está relacionado à sua capacidade antioxidante, eliminação de EROs,
inibição de enzimas da via oxidativa, aumento de antioxidantes protéicos e não
protéicos e redução da peroxidação lipídica.
Nesse ínterim, supõe-se que as substâncias presentes no EBM das sementes
da A. heterophyllus e da E. involucrata em estudo exercem atividade gastroprotetora
semelhante
a
carbenoxolona, atuando de
maneira
mais significativa
nos
77
mecanismos citoprotetores, aumentando a secreção de muco. Ressaltando que a
atividade
antioxidante,
gastroprotetores in vivo.
pode
ter sido, também,
responsável pelos
efeitos
78
6 CONCLUSÕES
Após a realização de todos os experimentos para análise do potencial
gastroprotetor do EBM das sementes da E. involucrata e da A. heterophyllus e de
sua fração e subfração metanólica, pode-se concluir que:
1.
O EBM das sementes da A. heterophyllus e da E. involucrata
apresentaram atividade gastroprotetora frente aos dois agressores estudados, etanol
e indometacina.
2.
No modelo de úlcera induzida por etanol, a fração e subfração
metanólica do EBM das sementes da A. heterophyllus apresentaram atividade
gastroprotetora equivalente a atividade do EBM.
3.
A subfração metanólica do EBM das sementes da A. heterophyllus no
modelo de úlcera induzido por AINEs, demonstrou possuir atividade gastroprotetora,
também de maneira efetiva proporcional ao EBM.
4.
A análise fitoquímica permitiu verificar a presença de compostos
fenólicos (flavonoides), terpenos e esteroides no EBM de ambas as sementes em
estudo.
5.
O estudo crônico permitiu observar o efeito de cicatrização exercido
pelo EBM das sementes da A. heterophyllus e E. involucrata, demonstrando a
capacidade de ambos em regenerar o dano produzido pelo ácido acético.
6.
A atividade gastroprotetora verificada no EBM das sementes estudadas
ocorre em parte, devido ao aumento da produção/secreção de muco, não tendo
relação com a atividade antissecretora.
7.
A reversão da atividade gastroprotetora do EBM das sementes
mediante a administração de L-NAME e NEM sugere que a ação de proteção da
mucosa esteja ligada a fatores antioxidantes (NO e SH).
Sugerem-se estudos posteriores para a determinação das enzimas envolvidas
nos processos antioxidantes relacionados com a gastroproteção.
79
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