Curso:
Marcadores Moleculares aplicados
a organismos de interesse epidemiológico
SUCEN – Superintendência de Controle de Endemias
São Paulo 17 a 22 de agosto de 2009
LABORATÓRIO DE VIROLOGIA - LIM 52
Aula : PCR EM TEMPO REAL
José Eduardo Levi
Instituto de Medicina Tropical - USP
LABORATÓRIO DE VIROLOGIA - LIM 52
POR QUE USAMOS PCR PARA DIAGN
ÓSTICO?
DIAGNÓSTICO?
• SENSIBILIDADE ANALÍTICA
• PODE DETECTAR ORGANISMOS QUE NÃO PODEM SER ISOLADOS
• RAPIDEZ
• VERSATILIDADE DE AMOSTRAS
DESVANTAGENS DA PCR
••
••
CONTAMINAÇÃO
CONTAMINAÇÃO
REPRODUTIBILIDADE
REPRODUTIBILIDADE
•• EM
EM ALGUNS
ALGUNS CASOS
CASOS POUCA
POUCA CORRELAÇÃO
CORRELAÇÃO CLÍNICA
CLÍNICA
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POR QUE O PCR CONVENCIONAL NÃO É UMA
TÉCNICA QUANTITATIVA?
PCR SEMI-QUANTITATIVO - DILUIÇÃO SERIADA
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POR QUE O PCR CONVENCIONAL NÃO É UMA
TÉCNICA QUANTITATIVA?
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O crescimento linear do número de cópias ocorre até um determinado
número de ciclos. A saturação ocorre quando a concentração de
produto amplificado atinge ~ 10-8 M ou ~ 1012 moléculas por 100 l.
As causas do platô são várias:
- Perda da atividade da enzima
- Todas as enzimas disponíveis estão ocupadas com a síntese de DNA
- Acúmulo de produtos amplificados que tendem a parear entre si, em
detrimento do pareamento com os “primers”. Aumenta possibilidade
de amplificação de produtos inespecíficos.
- Gasto dos reagentes, especialmente inativação da DNA polimerase
- Acúmulo de pirofosfato (PiPi)
- Competição com outros produtos que vinham sendo amplificados
com eficiência menor mas também foram se acumulando
etc
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COMO SE PROCUROU VENCER
ESTA LIMITAÇÃO?
DILUIÇÃO SERIADA (“END-POINT” DILUTION)
PADRÃO EXTERNO
CONTROLE INTERNO
CONTROLE INTERNO COMPETITIVO
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OS AVANÇOS :
NA QUÍMICA DE FLUORESCÊNCIA
NAS TÉCNICAS DE MARCAÇÃO DE OLIGOS
NOS LEITORES DE FLUORESCÊNCIA
NA TECNOLOGIA DE TERMOCICLADORES
REAL-TIME PCR
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1. INTERCALANTES
EX. BROMETO DE ETÍDIO, SYBR GREEN, ETC.
VANTAGES: SIMPLES E BARATOS
DESVANTAGENS: REQUER PADRONIZAÇÃO POIS
PRIMER-DIMERS TAMBÉM FLUORESCEM
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CURVA DE MELTING TEMPERATURE C/ SYBR GREEN
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MÉTODOS DE DETECÇÃO
2. SONDAS DE HIDRÓLISE (TAQMAN)
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O sistema TaqMan também é utilizado para fazer
discriminação e quantificação alélica
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MÉTODOS DE DETECÇÃO
3. SONDAS FRET
FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)
using adjacent hybridization probes
FITC
Red 640
P
Excitation
FRET
Phosphate
Emission
P
Amplicon
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MÉTODOS DE DETECÇÃO
4. MOLECULAR BEACONS
A
Excitation
B
C
Reporter
FRET
Non-fluorescent
Quencher
ANNEALING
Amplicon
Aplicações
• Detecção de agentes infecciosos
• Caracterização do agente (tipagem)
• Determinação da carga viral
(quantificação)
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CURVA DE CALIBRAÇÃO
(STANDARD)
40
Threshold Cycle = 35
Load = 103.8 copies/ml
30
20
10
0
1
2
3
4
Concentration
5
6
log 10
2.5
Test Sample
F2 /F1
Threshold Cycle
50
Threshold
1.5
Threshold Cycle
0.5
0
10
20
30
40
Cycles
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50
60
70
Determinação da Carga
2.5
NEG
F2 / F1
Threshold
Cycle
10
100
1.5
1000
10000
100000
1000000
0.5
0
10
20
30
40
50
60
Cycles
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70
RELAÇÃO ENTRE CARGA VIRAL E DOENÇA
HIV
“Mellors JW Quantitation of HIV-RNA in plasma predicts outcome
after seroconversion. Ann Intern Med, 122:573-579, 1995.
“ VIRAL COUNTS COUNT ON HIV INFECTION”
DAVID HO, SCIENCE
DEMONSTRAÇÃO EMPÍRICA QUE A CARGA VIRAL
DE HIV TEM CORRELAÇÃO COM O PROGNÓSTICO
DO PACIENTE
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CARGA VIRAL E HISTÓRIA NATURAL DA DOENÇA
HIV
8 PROGRESSORES RÁPIDOS= 20%
10
8
10
6
10
NÃO-PROGRESSORES = 5%
2
10
PROGRESSORES TARDIOS E INTERM. = 75%
6
10
2
10
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Incidência cumulativa de cirrose após 11 anos de
seguimento de acordo com HBV-DNA basal
HBV
40
R.E.V.E.A.L. study - Iloeje UH, et al. Gastroenterology 2006
36,2%
35
30
23,5%
25
20
15
10
9,8%
4,5%
5,9%
5
0
<300
300-10.000
10.000100.000
100.0001.000.000
HBV-DNA basal (cópias/mL)
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>1.000.000
Incidência cumulativa de HCC após 11 anos de
seguimento de acordo com HBV-DNA basal
HBV
20
R.E.V.E.A.L. study - Iloeje UH, et al. Gastroenterology 2006
15
14,9%
12,2%
10
3,4%
5
1,3%
1,4%
<300
300-10.000
0
10.000100.000
100.0001.000.000
HBV-DNA basal (cópias/mL)
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>1.000.000
Dengue
Quais as diferenças que levam a apresentações clínicas tão distintas
como a Febre da Dengue (DF) e a Febre Hemorrágica da Dengue (DHF)
e a Síndrome do Choque da Dengue (DSS) ?
As hipóteses abordam características do hospedeiro (HLA, Nutrição
estado imune) e fatores virais (sorotipo/genótipo, CARGA VIRAL)
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Dengue
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Dengue
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Carga viral em Dengue
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Carga viral em Dengue
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Carga viral em Dengue
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Carga viral em Dengue
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Carga viral em Dengue
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Carga viral em Dengue
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Carga viral em Dengue
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Carga viral em Dengue
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Carga viral em Dengue
DEN-2
DEN-1
DEN-3
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HGV X HIV
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HGV X HIV
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HGV X HIV
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HGV X HIV
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HGV X HIV
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ADRIANA FUMIE TATENO
ADRIANA FREIRE MACHADO
CÉLIA RODRIGUES
SYNARA DE ARAÚJO
JOSÉ EDUARDO LEVI ( DUDI)
E-MAIL : [email protected]
DR. CLÁUDIO SÉRGIO PANNUTI
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