SILVIA LETICIA BISPO DOS SANTOS
Variabilidade genética em populações de Agave sisalana Perrine
(Agavaceae) detectada pela técnica Inter Simple Sequence Repeats
(ISSR)
FEIRA DE SANTANA - BAHIA
2011
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE FEIRA DE SANTANA
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM RECURSOS
GENÉTICOS VEGETAIS
Variabilidade genética em populações de Agave sisalana Perrine
(Agavaceae) detectada pela técnica Inter Simple Sequence Repeats
(ISSR)
SILVIA LETICIA BISPO DOS SANTOS
Dissertação apresentada ao programa de PósGraduação em Recursos Genéticos Vegetais,
da Universidade Estadual de Feira de Santana,
como requisito parcial para obtenção do título
de Mestre em Recursos Genéticos Vegetais.
Orientadora: Profa. Dra. Sandra Regina de
Oliveira Domingos Queiroz
Co-orientador: Prof. Dr. Cássio van den Berg
FEIRA DE SANTANA - BAHIA
2011
Ficha Catalográfica - Biblioteca Central Julieta Carteado - UEFS
Santos, Silvia Letícia Bispo dos
S238v
Variabilidade genética em populações de Agave sisalana Perrine
(Agavaceae) detectada pela técnica Inter Simple Sequence Repeats
(ISSR)./ Silvia Letícia Bispo dos Santos. – Feira de Santana, 2011.
85 f : il.
Orientadora: Sandra Regina de Oliveira Domingos Queiroz
Co-orientador: Cássio van den Berg
Dissertação (mestrado) – Programa de Pós-Graduação em
Recursos Genéticos Vegetais. Universidade Estadual de Feira de
Santana, 2011.
1.Sisal – Diversidade genética. 2.Agavaceae. 3.Clonalidade.
4.ISSR. I.Queiroz, Sandra Regina Oliveira Domingos. II.Berg,,
Cássio van der. III.Universidade Estadual de Feira de Santana. IV.
BANCA EXAMINADORA
_________________________________________________________
Professora Doutora Rejane Patrícia de Oliveira
Universidade Estadual de Feira de Santana - UEFS
_________________________________________________________
Professor Doutor Eddy José Francisco de Oliveira
Universidade Estadual de Feira de Santana - UEFS
_________________________________________________________
Professor Doutor Cássio van den Berg – Co-orientador
Universidade Estadual de Feira de Santana - UEFS.
FEIRA DE SANTANA – BA
2011
A todos que acreditaram em minha vitória,
mesmo diante dos obstáculos e dificuldades.
i
AGRADECIMENTOS
Durante o desenvolvimento desse trabalho, várias pessoas estiveram ao
meu lado as quais foram importantes para o meu êxito. Algumas já eram
companheiras de longas datas, outras se somaram a essas. Esforçar-me-ei para não
esquecer ninguém, e, independente da ordem em que aparecerão aqui, a todas só
tenho a agradecer.
À Deus por estar ao meu lado em cada instante e por ter me amparado e
me dado forças em todos os momentos.
À minha avó Perolina (in memorian), pessoa ímpar em minha vida, que me
acolheu em seus braços e me ensinou tudo o que hoje sou.
À minha tia Zelinha por ter me acompanhado nos primeiros passos rumo a
essa conquista.
A meus primos Giselle e Maurício, pela contribuição sempre no que foi
possível.
À minha orientadora Sandra Regina, por ter me apresentado o sisal.
Ao meu co-orientador Cássio van den Berg, por ter me proporcionado
todas as condições ideais no LAMOL para a realização de meus experimentos me
orientando, de forma decisiva à conclusão deste trabalho.
A Eneida Cerqueira, minha professora, amiga que sempre acreditou em
mim apostando em meu sucesso, a quem admiro como pessoa e profissional.
À minha grande amiga Joceli, que esteve sempre ao meu lado nos
melhores e piores momentos, sempre me dando apoio e força e acreditando em
minha vitória.
Às minhas colegas de trabalho do 13° Centro de Saúde, Elijane, Maria e
Janete que me entenderam e me ajudaram cada uma do seu jeitinho.
Às minhas amigas Viviane, Jecineide e Ana Cristina que me acolheram em
seus lares com muito carinho, me proporcionando momentos de descanso físico.
A Paty Luz, que pacientemente me ajudou a resolver as mais diversas
dificuldades encontradas durante o desenvolvimento de meus experimentos.
ii
A Tarciso Maia, pela paciência e disposição em me ajudar sempre.
A todos os colegas do LAMOL; em especial ao funcionário Ricardo, pela
presteza, até mesmo aos finais de semana.
A Fernando Carneiro, amigo e companheiro de expedição pelo semiárido
baiano. Não consigo imaginar como teria feito minhas coletas sem sua ajuda.
A Sabrina Lambert, que muito me ajudou na conclusão do meu trabalho.
A todos os donos de campos de sisal, por terem permitido a coleta dos
bulbilhos em suas propriedades.
Aos vigilantes do LABIO, pelo cuidado e atenção.
A UEFS, que me recebeu com toda infra-estrutura necessária ao
desenvolvimento do meu trabalho.
Agradeço ao programa RGV, pelo apoio sempre e pela oportunidade.
Ao secretário do RGV, Alberto Vicente, pela paciência e por estar sempre
atento às necessidades dos alunos do programa.
Ao IDR-Sisal por ter financiado o meu projeto, apoio imprescindível.
Agradeço à banca examinadora pelas preciosas contribuições e correções.
Espero não ter esquecido ninguém, mas se por acaso minha memória tenha
falhado, peço desculpas, na certeza de que não foi por falta de consideração.
Agora é hora de comemorar e nada mais justo do que repartir a minha
felicidade com vocês.
Obrigada, obrigada, muito obrigada a todos vocês!
iii
“ Na sobrevivência dos indivíduos e raças
favorecidas, durante a luta constante e
recorrente pela existência, vemos uma forma
poderosa e incessante de seleção.”
Charles Darwin.
iv
RESUMO
O sisal (Agave sisalana Perrine) pertence à família Agavaceae e é uma planta
cultivada resistente à seca cuja principal utilização é a extração das fibras contidas
em suas folhas, contribuindo com mais da metade da produção comercial desse
produto no mundo. Dada a sua importância econômica ao Estado da Bahia,
despertou-se o interesse em conhecer melhor o comportamento genético da
espécie, avaliando a variabilidade genética entre e dentro de populações de Agave
sisalana. Para isso, foram analisados 140 genótipos de sisal coletados em seis
municípios baianos: Campo Formoso, Jacobina, Ourolândia, Santaluz, São
Domingos e Valente. Após a extração do DNA foi escolhido o marcador
molecular dominante ISSR (inter simple sequence repeats) para amplificação.
Dos nove Primers utilizados, obtiveram-se 143 lócos polimórficos. A análise de
agrupamento foi feita utilizando a distância genética. O percentual médio de
polimorfismo nas populações de Agave sisalana foi de 64%. A média de
heterozigosidade (He) e do índice de Shannon-Wiener (I) foram de 0, 180 e 0, 279
respectivamente. Os dados de AMOVA mostraram que 73% da variância
molecular pode ser atribuída às diferenças intrapopulacionais. Verificou-se que as
populações foram divididas em dois grupos, mostrando uma tendência de se
agruparem de acordo com sua localização geográfica, evidenciando uma
estruturação da variabilidade genética no espaço. O GST de 0,235, suficiente para
evitar que exista uma forte diferenciação populacional. A estruturação genética do
sisal pode ser explorada para a criação de bancos de germoplasma visando à
conservação in situ e ex situ para a obtenção de indivíduos de boa qualidade
comercial.
PALAVRAS-CHAVE: Agavaceae; Clonalidade; Diversidade genética; ISSR;
Sisal.
v
ABSTRACT
Sisal (Agave sisalana Perrine) belongs to Agavaceae, and is a drought resistant
crop plant whose main use is the extraction of the fibers contained in the leaves,
contributing more than 50% to the commercial production of this product in the
world. Given its economic importance to in the Bahia State, there is the interest in
learning more about the genetic behavior of the species, and assessing the genetic
variation between and within populations of Agave sisalana. For this, we analyzed
140 genotypes collected in six municipalities of Bahia: Campo Formoso,
Jacobina, Ourolândia, Santaluz, São Domingos and Valente. After DNA
extraction we chose dominant molecular markers of ISSR (inter simple sequence
repeats) for amplification. Of the nine Primers, we obtained 143 polymorphic
loci. Cluster analysis was performed using the Nei genetic distance. The mean
percentage of polymorphism in populations of Agave sisalana was 64%. The
average heterozygosity (He) and Shannon-Wiener index (I) were 0.180 and 0.279
respectively. An AMOVA showed that 73% of molecular variance can be
attributed to intrapopulation differences. We verified that the populations are
divided into two groups, showing a tendency to group together according to their
geographical location, showing genetic variation a structured of in space. GST was
0.235, in agreement with the strong genetical structuring found. Genetic
structuring the sisal can be exploited for creating germplasm banks aiming the in
situ and ex situ conservation to obtain individuals of good commercial quality.
KEYWORDS: Agavaceae; Clonality; Genetic diversity; ISSR; Sisal.
vi
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 - Mapa do Território de Identidade Sisal SEAGRI 2011 ........................................................................................... 5
FIGURA 2 - Mapa de Identidade sisal. Piemonte da Diamantina SEAGRI
(2011) ......................................................................................................................6
FIGURA 3 - Produção de sisal por hectare nas localidades de coleta das seis
populações amostral IBGE (2009) .......................................................................7
FIGURA 4 - Produção de sisal na região nordeste do Brasil – IBGE (2009) ..8
FIGURA 5A - Altura da planta de Agave sisalana Perrine.............................. 11
FIGURA 5B - Disposição em roseta das folhas .................................................11
FIGURA 5C - Poste ou pendão de Agave ........................................................... 11
FIGURA 5D - Ramificações tricotômicas com inflorescência .........................11
FIGURA 5E - Flores de Agave sisalana Perr .....................................................11
FIGURA 6A – Bulbilhos de sisal ........................................................................13
FIGURA 6B – Rebentos de sisal .........................................................................13
FIGURA 6C - Corte das folhas de sisal no campo ............................................13
FIGURA 6D - Folhas de sisal coletadas ............................................................. 13
FIGURA 7 - Regiões escolhidas para coleta dos genótipos de sisal – Adaptada
de SEI (2011).........................................................................................................29
FIGURA 8 (A e B) - Demarcação do espaço amostral em uma das áreas de
coleta ......................................................................................................................32
FIGURA 8C – Coleta de bulbilhos .....................................................................32
FIGURA 8D - Marcação de uma planta fornecedora de genótipos ................32
FIGURA 9 - Dendrograma mostrando as relações fenéticas entre as
populações de Agave sisalana de seis localidades: JAC, CF, VAL, SD, STL e
OUR, com base em UPGMA. ..............................................................................42
vii
FIGURA 10 - Análise de coordenadas principais (PCoA) de 6 populações de
Agave sisalana. Eixo 1 ˟ 2 correspondendo a 22,69% .......................................43
FIGURA 11 - Análise de coordenadas principais (PCoA) de 6 populações de
Agave sisalana. Eixo 1 ˟ 3, correspondendo a 20,61% ......................................44
FIGURA 12 - Gráfico de estruturação genética a partir da analise dos dados
de marcadores dominantes de ISSR com o software STRUCTURE nas seis
populações de sisal cultivadas na Bahia ............................................................. 45
viii
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 - Coordenadas geográficas e altitudes dos l ocais de
coleta das seis populações de sisal ( Agave sisalana ) cultivadas no
semiárido da Bahia .................................................................. 30
TABELA 2 - Distância em Km, entre os municípios de coleta das populações
de Agave sisalana ..................................................................................................31
TABELA 3 - Relação dos Primers de ISSR amplificados e suas respectivas
sequências iniciadoras..........................................................................................35
TABELA 4 - Primers utilizados sequências e número de bandas amplificadas .
................................................................................................................................ 39
TABELA 5 - Diversidade genética de seis populações de Agave sisalana do
semiárido baiano com base em nove iniciadores de ISSR ................................ 41
TABELA 6 - Resumo da análise de variância molecular (AMOVA) .............46
TABELA 7 - Valores de GST, Nm, Ht e Hs para as seis populações estudadas e
para os dois grupos de população .......................................................................46
TABELA 8 - Variabilidade genética em grupos de Agavaceae e média
utilizando marcadores moleculares ....................................................................50
TABELA 9 - Estimativas de variações dentro das populações e / ou variações
entre as populações, obtidas com marcadores moleculares diferentes ...........52
ix
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO
1
2. REVISÃO DE LITERATURA
4
2.1 Considerações gerais sobre o semiárido e a região sisaleira da
Bahia
4
2.2 Produção de sisal no estado da Bahia
6
2.3 O Agave sisalana Perr. (sisal)
8
2.4 Diversidade genética em populações naturais
13
2.5 Marcadores moleculares
15
2.6 Estudos com Marcadores Moleculares em Agave
17
2.6.1 RAPD
17
2.6.2 AFLP
19
2.6.3 ISSR
20
2.6.4 Análise da diversidade e estrutura genética a partir de
marcadores moleculares dominantes (ISSRs)
3. OBJETIVOS
22
26
3.1 Objetivo geral
26
3.2 Objetivos específicos
26
4. HIPÓTESES
27
5. MATERIAL E MÉTODOS
28
5.1 Área de estudo e amostragem
28
5.2 Coleta de campo – Material vegetal
31
5.3 Extração de DNA genômico
33
5.4 Verificação da integridade do DNA
33
5.5 Condições de amplificação
34
x
5.5.1 Seleção de Primers
34
5.6 Estudo de variabilidade
36
6. RESULTADOS
40
7. DISCUSSÃO
47
8. IMPLICAÇÕES PARA A CONSERVAÇÃO DA ESPÉCIE
54
9. CONCLUSÕES
56
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
57
ANEXOS
69
1
1. INTRODUÇÃO
Agave, o maior gênero da família Agavaceae, é endêmico nas Américas,
sua freqüência vai desde o sul dos Estados Unidos, Colômbia e Venezuela.
(GARCIA-MENDOZA & GALVAN, 1995). Propõe-se que este gênero possua
em média 166 espécies das quais 125 estão no México (GARCIA-MENDOZA
2002).
Agave sisalana Perrine, também conhecida como sisal, é um vegetal
eminentemente tropical, que engloba um grupo bem definido de plantas de
consistência herbácea e escapo floral saliente, podendo atingir doze ou mais
metros de altura (SILVA & BELTRÃO, 1999).
É considerada uma espécie altamente produtora de fibras e extremamente
resistente à seca (DAS, 1992).
O sisal, originário da península de Yucatán (México), foi introduzido no
Brasil primeiramente na Bahia no início do Século XX. No entanto, só se
configurou como possibilidade econômica a partir de 1939 se firmando como a
principal fonte comercial de fibras, substituindo a indústria de fios de caroá a
Neoglaziovia variegata (Arruda) Mez (CAR, 1994).
O cultivo do sisal no Brasil ocorre principalmente na região semiárida que
se caracteriza por apresentar precipitação pluvial entre 300 mm3 e 800 mm3,
concentrada em poucos meses do ano, gerando períodos de chuva e estiagem. Esta
região costumeiramente conta com temperaturas altas, acima de 26°C, com
poucas variações. Assim, a evaporação é intensa, causando a precipitação de sais
no solo (AB’SABER, 1996).
O Brasil é o maior produtor de sisal no mundo, sendo a Bahia e Paraíba os
estados com produção mais expressiva. Na Paraíba o sisal se constitui no principal
produto da pauta de exportação e, na Bahia, em 2007 destacou-se no ranking
nacional (SEAGRI, 2009).
A fibra do sisal, beneficiada ou industrializada, rende divisas internas,
além de gerar mais de meio milhão de empregos diretos e indiretos por meio de
sua cadeia produtiva, sendo o cultivo dessa planta um dos principais motivos de
2
fixação do homem à região semiárida nordestina (SUINAGA et al. 2006a). O sisal
tem utilização muito vasta, sua fibra é empregada para confecção de cordas,
barbantes, papel, papelão, sacos e diversos outros artefatos como tapetes e bolsas.
Gera ainda como produtos secundários graxa, cera, glucosídeos, álcool e ácidos
(APAEB, 2010). Mais recentemente passou a ser utilizado na indústria
automobilística, substituindo a fibra de vidro.
A agricultura do semiárido tem o sisal como importante cultivar. Diante
disso, é importante que se conheça melhor sua estrutura genética. Estudar o sisal
através da genética de populações pode facilitar a classificação correta dos
acessos, favorecendo a seleção de amostras representativas que capturem a
diversidade genética detectando padrões de diferenciação.
A genética de populações tem sido utilizada como uma ferramenta
importante no estudo da diversidade genética, descrevendo variabilidade em
populações e estudando os mecanismos de manutenção desta variabilidade (NEI,
1987).
O estudo de genética de populações engloba os processos e mecanismos
pelos quais a evolução ocorre em populações naturais, determinando a variação
genética existente nas mesmas, qual é a origem, manutenção e distribuição de tal
variação, bem como a sua importância evolutiva (HARTL & CLARK, 1989). Os
objetos desse estudo são as frequências alélicas, a deriva gênica e adaptação de
genótipos de populações naturais. Enquanto as freqüências alélicas são
relativamente fáceis de medir, suas mudanças não são, porque a escala de tempo
da mudança na maioria das variantes genéticas é muito grande, milhões de anos
(GILLESPIE, 1998).
Para o estudo da variabilidade genética em uma população, o uso de
técnicas de genética molecular é de fundamental importância. Dentre os
marcadores mais utilizados estão as Isoenzimas, os RAPDs (Random Amplified
polymorphic DNA, WILLIAMS et al. 1990), AFLPs (Amplified polimorfismo
fagment, VOS et al. 1995), Microssatélites (HAMADA & KAKUNAGA, 1982) e
ISSRs (Inter Simple Sequence Repeats) (GUPTA et al. 1994; ZIETKIEWICZ et
al. 1994).
3
Vários estudos sobre o nível de variabilidade genética das Agaves têm
utilizado diferentes marcadores moleculares, incluindo: isoenzimas em Agave
fourcroydes Lem.. (COLUNGA-GARCÍAMARÍN et al. 1999), Agave victoriaereginae (MARTÍNEZ-PALACIOS et al. 1999) e Agave lechuguilla Torr.
(SILVA-MONTELLANO & EGUIARTE, 2003); microssatélites em Agave
cupreata e Agave potatorum (EGUIARTE et al. 2003); RAPD em Agave
tequilana Weber (GIL-VEGA et al. 2001, 2006) e em Agave deserti (NAVARRO
et al. 2003); AFLP em Agave fourcroydes Lem. (GONZÁLEZ et al. 2003);
DEMEY et al. (2004) e Agave angustifolia Haw. (BARRAZA-MORALES et al.
2006); (SÁNCHEZ-TEYER et al. 2009) e ISSR em Agave angustifolia e Agave
tequilana (VARGAS-PONCE et al. 2009).
Considerando a importância econômica do sisal para a região do semiárido
baiano e levando em conta que a principal forma de reprodução da cultivar na
região é vegetativa, além do fato de que não há estudos utilizando marcadores
moleculares para identificação da variabilidade genética em Agave sisalana, o
objetivo desse estudo foi investigar a variabilidade genética desta espécie a partir
de plantas coletadas em seis municípios da região sisaleira do estado da Bahia,
com o uso do marcador Inter Simple Sequence Repeats (ISSR).
4
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 – Considerações gerais sobre o semiárido e a região sisaleira da Bahia
De acordo com AB´SABER (1999), o sertão nordestino é uma das
regiões semiáridas mais povoadas do mundo. De acordo com o IBGE, 27 milhões
de pessoas vivem atualmente no polígono das secas (IBGE, 2010).
Apesar das características gerais reconhecidas, como a irregularidade de
distribuição das chuvas, temperatura elevada e limitações hídricas, o semiárido
brasileiro é uma realidade complexa, tanto no que se refere aos aspectos
geofísicos, quanto à ocupação humana e à exploração dos recursos naturais.
Sendo sempre limitada às condições topoclimáticas e edáficas, sua
vegetação característica, a caatinga, reflete as inter-relações entre fatores naturais
e os fatores antrópicos e se apresenta com fisionomia variada, o que dá origem a
muitas controvérsias quando se tenta classificá-la (AUBRÉVILLE, 1965).
De um modo geral, as espécies da caatinga estão adaptadas para
enfrentarem a estação seca, seja por modificações do ritmo biológico, seja por
mudanças no metabolismo da água: espinescência, acumulação da água nos
tecidos e nas raízes, esclerofilia e emurchecimento das folhas, redução do
tamanho das folhas e dos folíolos, sem atingir uma verdadeira microfilia que
caracteriza muitas espécies de outras regiões semiáridas do mundo tropical,
excetuando-se os gêneros Caesalpinia echinata Lam. e Mimosa caesalpiniaefolia
Benth. (KOECHLIN et al. 1980).
A região sisaleira baiana encontra-se inserida no semiárido do estado da
Bahia, possuindo uma estrutura fundiária caracterizada de um lado pelo grande
latifúndio e de outro pelo processo de minifundialização. Desta dicotomia
resultam distorções graves na sustentabilidade da agricultura familiar.
O governo do estado da Bahia, inspirado no conceito de Território de
Identidade descrito pelo geógrafo Milton Santos como áreas geográficas formadas
por unidades dinâmicas, indivisíveis dos seres humanos e de suas ações, criou um
programa com base na territorialidade subdividindo o estado em 26 partes. Este
5
programa assimila princípios básicos da democratização das políticas públicas
como à descentralização das decisões, a regionalização das ações e a coresponsabilidade na aplicação de recursos, e na execução e avaliação de projetos.
Os territórios Identidade Sisal e Identidade Piemonte da Diamantina
ocupam uma área de 21.256,50 Km2, com 552.713 habitantes, dos quais 348.222
(63%) vivem na área rural. (SEAGRI, 2011) (Fig. 1 e 2). O Índice de
Desenvolvimento Humano (IDH) médio do território é 0,60. Segundo dados do
Instituto de Desenvolvimento da Região do Sisal (IDR-SISAL) trabalham na
lavoura 64.350 agricultores familiares, 2.344 famílias estão assentadas e 413
famílias são de pescadores, além de uma comunidade quilombola e um
agrupamento indígena (IDR-SISAL, 2010). O território de Identidade Piemonte
da Diamantina é formado por 24 municípios, nove se destacam como os mais
representativos em termos de produção de sisal (Fig.2).
Figura 1. Mapa do território de Identidade Sisal (SEAGRI, 2011).
6
Figura 2. Mapa de Identidade Piemonte da Diamantina (SEAGRI, 2011).
2.2 - Produção de sisal no estado da Bahia
A produtividade média de sisal no estado, em 2009, após alguns
investimentos, chegou a 1.200 quilos por hectare, indicando um crescimento em
relação a 2009, que alcançou 1.033 kg/ha. Dessa forma, o sisal mostra ser um
grande potencial econômico para o Estado, e, em particular, para a agricultura
familiar. A espécie apresenta potencial genético de produção que pode chegar a
2.500 kg/ha. Nos últimos dez anos, a produtividade de sisal variou muito na
Bahia. A mais baixa foi verificada nos anos de 2002 e 2003 com 852 kg/ha. Em
2010, o estado da Bahia, mais uma vez se destacou no cenário produtor de sisal, a
região dos municípios estudados tiveram uma produção em kg/ha expressiva:
Campo Formoso 78.610; Jacobina 12.000; Ourolândia 10.000; Santaluz 30.000;
7
São Domingos 6.000; Valente 12.000. Esse resultado foi atribuído ao fato de o
governo federal, através da CONAB, instituir políticas de preço mínimo, que
melhor remunera os custos de produção da cultura, ampliando a capacidade de
investimento do agricultor. (IBGE, 2010) (Fig. 3).
Campo Formoso 78.610
Jacobina 12.00
Ourolândia 10.000
Santaluz 30.000
São Domingos 6.000
Valente 12.000
Figura 3. Produção de sisal por hectare nas seis localidades de coleta das populações
amostrais. Dados: IBGE 2009.
Adaptado ao clima semiárido do nordeste brasileiro, a produtividade
nacional de fibra de sisal (Agave sisalana), em 2007, foi em média 245 mil
toneladas (FAO, 2009). De acordo com os dados do (IBGE) no Brasil, o estado da
Bahia detém 95% da produção brasileira (233 mil toneladas de fibra de sisal)
seguido pelos estados da Paraíba (4,1%), Rio Grande do Norte (0,6%) e Ceará
(0,3%) IBGE (2010) (Fig. 4).
8
100%
90%
80%
70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
MA
PI
CE
RN
PB
PE
AL
SE
BA
Figura 4. Produção de sisal na região nordeste do Brasil, classificada por estado.
Dados: IBGE, 2009.
2.3 - O Agave sisalana Perr. (Sisal)
Originário da Península de Yucatán, no México o Agave sisalana foi
trazido da Florida por volta de 1903, pelo engenheiro agrônomo Horácio Urpia
Júnior, que introduziu os primeiros bulbilhos no Brasil. Em 1911, mudas foram
enviadas para a Bahia e Pernambuco. Porém, somente a partir do final da década
de 1930 passou a ser visto como uma alternativa econômica (SUINAGA, 2006).
Introduzido nos estados da Paraíba, Bahia e Rio Grande do Norte, em virtude das
condições climáticas propícias, por ser uma planta semixerófila, que requer clima
quente e grande luminosidade, o sisal se adaptou bem às regiões semiáridas, sendo
altamente resistente a estiagens prolongadas, pois apresenta estruturas peculiares
de defesa contra as condições de aridez (SILVA & BELTRÃO, 1999; CNA,
2010).
A
espécie
é
uma
monocotiledônea
de
elevada
complexidade
morfofisiológica, apresentando via fotossintética CAM e uma baixa taxa de
crescimento (GENTRY, 1982).
A planta pode atingir mais de 1,70 cm de altura (Fig.5A). As folhas
podem chegar a quase dois metros de comprimento e 10 cm de largura, são
destituídas de pecíolos, apresentam sua superfície abaxial côncava e a adaxial,
9
convexa, com superfície serosa, moldadas com um espinho terminal com 20 a 25
mm de comprimento, apresentam forma lanceolada, com parênquima espesso e
esponjoso suculento, permitindo o armazenamento de água e uma camada de cera
que impede a perda dessa água. A disposição em roseta das folhas é vista como
um mecanismo de defesa contra herbívoros, bem como um meio para obter água
de forma mais eficiente (GENTRY, 1982, Fig.5B). Nos Agaves o sistema vascular
se alonga através das folhas criando as fibras, que no Agave sisalana é um produto de
importância econômica (IRISH & IRISH, 2000).
A espécie apresenta sistema radicular fibroso e em forma de tufo, é
destituída de raiz principal, possuindo dois tipos de raízes designadas por
transportadoras e alimentadoras, sendo as primeiras responsáveis pela fixação da
planta ao solo (SILVA & BELTRÃO, 1999).
O Agave sisalana apresenta um ciclo perene, podendo se reproduzir tanto
assexuadamente como sexuadamente. Na reprodução assexuada existem dois
mecanismos, através de rizomas produzindo rebentos que formarão novos
indivíduos ou por bulbilhos os quais se desenvolvem a partir de células estaminais
na flor (NOBEL, 1988; ARIZAGA & EZCURRA, 1995).
Pelo fato de ser uma planta monocárpica, o sisal floresce apenas uma vez,
no final do ciclo vegetativo após cerca de oito a dez anos do plantio, emitindo o
que os agricultores denominam de “flecha” “poste” ou “pendão de Agave”
formado por folhas atrofiadas, ou brácteas justapostas, semelhantes a “escamas”,
estreitas, com ápice provido de espinhos, atingindo de 6 a 9 metros de altura
(Fig.5C). A metade superior do pedúnculo apresenta-se com 22 a 40 ramificações
tricotômicas com flores (Fig.5D) que, podem formar frutos sementes, ou apenas
bulbilhos, enquanto vai ocorrendo a morte do sisal (LOCK, 1962; SILVA et al.
1999; SILVA et al. 2008; SUINAGA et al. 2006).
As flores do sisal são perfeitamente normais e o pólen viável, mas os
frutos não são formados devido ao desenvolvimento de uma “camada de
abscisão” entre a base do ovário e o pedicelo, ou pedúnculo da flor, logo após as
flores terem murchado (LOCK, 1962).
A flor é bissexuada, sendo encontrada agrupada em cachos situados no
final de cada ramo da panícula. Cada flor possui seis estames que estão inseridos
na base da corola, sendo os estames constituídos por anteras trilobadas (Fig. 5E).
10
Apresenta um estigma trilobado, com ovário ínfero trilocular (SILVA &
BELTRÃO, 1999).
11
Figura 5. (A) Altura da planta de Agave sisalana Perr. ; (B) Disposição das folhas; (C) Pendão de
Agave; (D) Ramificações tricotômicas com inflorescência; (E) Flores de Agave sisalana Perr.
12
Após a queda das flores desenvolvem-se, na panícula os “bulbilhos”
novas plantinhas (Fig.6A) que são utilizados como mudas de propagação
vegetativa (SILVA & BELTRÃO, 1999; SUINAGA et al. 2006a).
Os “filhotes” ou “rebentões”, como normalmente são chamados pelos
agricultores, são mudas que nascem ao lado das plantas-mãe e se ligam a elas
através de caules subterrâneos (Fig.6B). Os rebentos desenvolvem-se com a
assimilação de substâncias nutritivas elaboradas pela planta mãe. O crescimento
desordenado dos rebentões acarreta problemas na lavoura, dificultando a
circulação dos trabalhadores e a limpeza (capina) da roça de sisal. Além disso,
para evitar competição por fotoassimiladores é importante que seja feita a retirada
dos rebentos após a colheita das folhas, deixando apenas um ou dois que
substituirão a planta-mãe (CNPA/EMBRAPA).
Em alguns casos ocorre a esporádica formação de frutos, que podem
aparecer isolados, ou em produção simultânea aos bulbilhos na panícula.
SALGADO et al. (1979) demonstraram que todos os trabalhos visando ao
melhoramento genético de Agave sisalana foram infrutíferos por meio da
propagação sexual. O fruto do sisal é pouco conhecido dos produtores
nordestinos, estudantes e técnicos, devido a sua rara produção pelas plantas.
O corte é feito bem rente à base, para evitar perda de fibra e ataque de
patógenos, devendo-se ter o cuidado de deixar aproximadamente entre cinco e dez
folhas na planta (Fig.6C). A colheita é feita manualmente, uma ou duas vezes por
ano, a partir do terceiro ano (Fig.6D).
13
Figura 6. (A) Bulbilhos de sisal; (B) Rebentos de sisal; (C) Coleta de folhas de sisal; (D) Folhas de
sisal coletadas.
2.4 - Diversidade genética em populações naturais
O estudo da diversidade genética compreende a descrição dos níveis de
variabilidade genética mantida dentro das populações e como esta se distribui
entre as mesmas (HAMRICK, 1989). Fatores evolutivos como a deriva genética e
seleção
natural
são
afetados
pela
dinâmica
populacional
de
plantas,
proporcionando modificações na estrutura genética e das populações (GAIOTTO
et al. 2003).
14
Estudar a diversidade genética entre acessos de uma cultura, além de
possibilitar a identificação de materiais genéticos muito próximos ou duplicados,
indica aqueles genótipos mais distantes geneticamente, os quais poderão ser
recomendados para futuros programas de policruzamentos no desenvolvimento de
cultivares melhorados (SCAPIM et al. 1999).
Populações naturais de animais e plantas raramente são compostas de
alelos distribuídos aleatoriamente, mas refletem um complexo mosaico de
genótipos. (HAMRICK, 1990; ASPINWALL & CHRISTIAN, 1992; LYNCH &
MILLIGAN, 1994; HÄNFLING & BRANDL, 1998; SCHLÄPFER & FISCHER,
1988; AYRES & RYAN, 1998). A abundância relativa desses genótipos não é
fixa, mas pode variar ao longo do ciclo de vida da espécie. Assim, as populações
naturais de plantas e animais são geneticamente estruturadas no tempo e no
espaço (HOSSAERT-MCKEY et al. 1996). Essas afirmações surgiram com o
avanço das técnicas de biologia molecular ao longo das últimas décadas, que
possibilitaram quantificar a variabilidade genética.
Ao longo do tempo a estrutura genética tem se mostrado resultante de
processos como reprodução e dispersão e da sobrevivência dos indivíduos de uma
população. LOVELESS & HAMRICK (1994) analisaram várias características
em espécies de plantas, a fim de analisar a variabilidade genética. Dentre estas
estão o efeito de sistemas de acasalamento, morfologia floral, mecanismos de
polinização, modos de dispersão, ciclos de vida e o tamanho das populações.
Em plantas clonais, que possuem um sistema misto de reprodução sexual
e assexual, a clonalidade pode afetar a variação genética e a estrutura das
populações. Um crescimento clonal não produz qualquer variação genética a
menos que ocorra uma mutação (HARPER, 1977; ABRAHAMSON, 1980).
Os padrões espaciais e genéticos resultam geralmente da heterogeneidade
ambiental e pressões seletivas diferenciais. Enquanto os padrões espaciais
frequentemente têm implicações genéticas, os padrões genéticos podem existir
sem uma distribuição espacial não aleatória dos indivíduos. De forma contrária,
uma população pode ter uma distribuição espacial sem qualquer acompanhamento
de estrutura genética (LOVELESS & HAMRICK 1984).
15
A heterogeneidade temporal e um fator importante que deve ser levado em
conta quando se estuda a diversidade genética de populações naturais, já que
mudanças podem ocorrer ao longo do tempo na população pela ação natural ou
antrópica. Estudos já demonstraram que este fator pode influenciar a variação
genética dentro e entre populações (HOSSAERT-MCKEY et al. 1996).
Segundo HAMRICK (1990), os padrões de colonização e os eventos
estocásticos que afetam o estabelecimento e a mortalidade também são
importantes, juntamente com a heterogeneidade ambiental, para explicar a
ocorrência agrupada das plantas em locais distintos. Vários trabalhos evidenciam
que a variabilidade genética em populações de plantas está distribuída não
aleatoriamente. Similarmente às próprias plantas, os genes e genótipos tendem a
estar agrupados, com diferentes marcadores genéticos ocorrendo a pequenas
distâncias.
2.5 - Marcadores Moleculares
Até meados da década de 60, os estudos genéticos eram desenvolvidos
com marcadores morfológicos de fácil identificação no organismo e geralmente
regidos por um único gene. Suas principais vantagens residiam no fato de serem
simples rápidos e com baixo custo de análise (BRETTING & WIDRLECHENER,
1995).
Apesar
dos
marcadores
morfológicos
terem
contribuído
significativamente para o estabelecimento dos princípios teóricos do mapeamento
genético e das análises de ligação gênica (KNAPP, 1991), um pequeno número de
marcadores morfológicos diferentes em uma mesma linhagem diminui a
probabilidade de se encontrar associações significativas entre esses, e caracteres
de importância para programas econômicos ou estudos teóricos (BORÉM, 1998).
Além disso, tais marcadores frequentemente são afetados pela ação gênica de
dominância, efeito ambiental, pleiotropia e epistasia (PATERSON et al. 1991).
O surgimento da reação em cadeia da polimerase (Polymerase Chain
Reaction - PCR) foi um dos passos revolucionários nos estudos genéticos, pois
possibilitou a produção de múltiplas cópias de seqüências específicas de DNA
16
sem a necessidade de clonar esses segmentos (ALBERTS et al. 1994). A
metodologia usada para a amplificação in vitro de sequências de DNA (pequenas
moléculas de DNA de fita simples) iniciadores de sequência conhecida e
complementar às extremidades do segmento a ser amplificado (Primers),
direcionando a síntese de DNA alvo em ciclos repetidos. As variações
(polimorfismos) são geradas pela variação existente no genoma do organismo,
que são identificadas através do uso de Primers que flanqueiam regiões de
interesse, auxiliando nos estudos de genética de população (MULLIS, 1990;
BARCACCIA et al. 2003).
Com a PCR, o DNA passou a ser o ponto focal na genética de
populações, aprimorando as técnicas de biologia molecular (BORÉM, 1998). As
tecnologias de análise molecular da variabilidade do DNA permitiram determinar
pontos de referência nos cromossomos, que passaram a ser chamados
“marcadores moleculares” (FERREIRA & GRATTAPAGLIA, 1998).
Qualquer sequência genômica proveniente de um segmento específico de
DNA correspondente a regiões expressas ou não do genoma é chamada de
Marcador Molecular. O desenvolvimento desses marcadores veio dar um impulso
à pesquisa genética, propiciando a detecção de polimorfismo de DNA com
comportamento Mendeliano, passível de ser utilizado em diferentes áreas da
genética e do melhoramento de plantas (FERREIRA & GRATTAPAGLIA,
1998).
Os marcadores moleculares fornecem ferramentas únicas capazes de
identificar a variação genética existente entre e dentro de populações, em função
do alto grau de precisão e informação que pode ser obtido pelo “fingerprinting”
molecular ou genotipagem que é a impressão digital de um determinado genótipo,
permitindo a obtenção de seu perfil genético e sua diferenciação inequívoca de
outro genótipo (FERREIRA & GRATTAPAGLIA, 1998; BREDEMEIJER et al.
2002; MAGALHÃES et al. 2003; VIJAYAN et al. 2004).
Os distintos tipos de marcadores moleculares hoje disponíveis
diferenciam-se pela tecnologia utilizada para revelar variabilidade no DNA,
polimorfismo molecular, expressão gênica, distribuição no genoma, custo de
implementação e operação (GRIFFITH et al., 2000).
17
Para FERREIRA
&
GRATTAPAGLIA
(1998), os
marcadores
moleculares se caracterizam pela:
a) Unicidade: cada indivíduo tem um perfil de DNA único com exceção
de clones de uma planta ou gêmeos univitelinos no caso de animais;
b) Mutabilidade extremamente baixa: o DNA de um indivíduo é o
mesmo em todas as células e este é estável ao longo de sua vida;
c) Estabilidade física: moléculas de DNA podem ser recuperadas,
purificadas e analisadas com sucesso a partir de praticamente todo e
qualquer material biológico;
d) Variabilidade: apesar do fato de que a maior parte do genoma é muito
conservada entre indivíduos, algumas regiões genômicas específicas são
altamente variáveis permitindo uma discriminação altamente precisa.
Os métodos que utilizam diretamente o DNA apresentam grandes
vantagens por não serem afetados pelo ambiente e por apresentarem um elevado
poder de discriminação. Além disso, o polimorfismo de DNA pode ser muito útil
na definição de um grupo de acessos geneticamente representado pelo
germoplasma do qual ele é originado. Uma coleção nuclear representa um
subgrupo derivado de uma coleção inteira que é composta de um pequeno número
de acessos que juntos devem representar o máximo possível da diversidade
genética existente em toda a coleção (FRANKEL & BROWN, 1984).
2.6 - Estudos com Marcadores Moleculares em Agave
2.6.1 - RAPD
Uma das técnicas de análise genética muito utilizada em estudos
populacionais consiste na utilização de marcadores moleculares RAPD (Random
Amplified Polymorphic DNA, WILLIAMS et al.1990). Esta tecnologia é muito
utilizada na obtenção de informações na análise genômica. Utiliza um único
Primer em vez de um par, e esse tem sequência arbitrária de modo que o alvo é
18
desconhecido e irrelevante. Os marcadores RAPD se baseiam na amplificação de
fragmentos de DNA sendo vantajosa pela simplicidade e rapidez a baixos custos.
Assim, grande quantidade de polimorfismo e de segmentos de DNA é obtida em
curto espaço de tempo, apresentando-se de forma binária, ou seja, pela presença
ou ausência da banda.
ROJAS et al. (2007) estudaram seis populações de variedades de Agave:
"Manso" (Agave salmiana var. "Salmiana"), "Ayoteco" (Agave salmiana var.
"Ayoteco"), "Verde", "Carrizo" (Agave mapisaga Trel), "Negro" e "Xilometl" no
Nordeste do Estado do México, para determinar a diversidade genética entre e
dentro delas, obter a impressão digital genética relevante, e fazer comparações
para diferenciar suas variantes genéticas, usando RAPD e variáveis morfológicas.
A análise de variância mostrou diferenças significativas (P ≤ 0,01) entre as
populações para a altura da planta, número de folhas, comprimento da folha,
largura da folha, número de espinhos laterais e comprimento da coluna principal.
O percentual total de locos polimórficos foi de 73,2%, mas dentro de populações a
variabilidade genética foi reduzida, com percentagens de locos polimórficos que
variaram de 12,2% para o maguey "Verde" e 32,5% no maguey "Manso" e
"Ayoteco". A diversidade genética média de Nei (H) foi de 0,28 ± 0,20,
confirmando a baixa diversidade dentro das populações. O grau de fluxo gênico
foi baixo (Nm = 0,24), indicando a ocorrência de menos de um migrante por
geração entre as seis populações.
RODRÍGUES-GARAY et al. (2008) avaliaram por meio de caracteres
morfológicos e por RAPD, a diversidade genética em 49 espécies de Agave
tequilana Weber var. azul de diferentes regiões produtoras de tequila, e dezoito de
Agave angustifolia Haw var. Lineño do sul do estado de Jalisco no México. Treze
caracteres morfológicos e três diferentes Primers de RAPD aleatórios foram
utilizados. Os resultados indicaram que diferenças existem em nível genômico,
onde a diversidade foi maior quando comparada com dados morfológicos.
Embora a correlação entre os dados morfológicos e RAPD tenha sido baixa,
ambos os métodos permitiram a diferenciação entre Agave angustifolia de Agave
tequilana.
NAVARRO-QUEZADA et al (2003) estudaram através da técnica de
RAPD a diferenciação genética do complexo Agave desertii var. desertii, Agave
19
cerulata Trel. e Agave subsimplex Trel. no deserto de Sonora. A diferenciação
genética e o status taxonômico em relação à distribuição espacial de 14
populações do complexo foram analisados para compreender a evolução e o
processo de especiação dentro do gênero. Frequências alélicas, níveis de variação
genética, heterozigosidade esperada (HS), proporção de lócus polimórficos (P), e
diferenciação genética foram estimadas utilizando 41 loci RAPD. Todas as três
espécies apresentaram altos níveis de variação genética.
2.6.2 - AFLP
Em 1993, os pesquisadores ZABEAU & VOS, desenvolveram e
divulgaram outro marcador molecular denominado AFLP (Amplified Fragment
Length Polymorphism - Polimorfismo de Comprimento de Fragmentos
Amplificados). Esta técnica combina os alvos para estudo do polimorfismo pelos
marcadores RFLP e RAPD: a distribuição aleatória de sítios de restrição entre
genomas e a amplificação aleatória de fragmentos empregando-se Primers de
sequências arbitrárias. A característica fundamental desta técnica é a capacidade
de revelar simultaneamente muitas regiões diferentes distribuídas aleatoriamente
ao longo do genoma (MUELLER & WOLFENBARGER, 1999).
GIL-VEGAS et al. (2006), estudaram nove variedades de Agave
tequilana Weber utilizando a técnica de AFLP, visando determinar a proximidade
genética entre elas e a Agave tequilana var. “Azul”. Nesse trabalho encontraram
um nível significativo de diversidade entre Agave tequilana
var. “Azul”
cultivadas quando comparadas com outras coletadas em Guanajuato no estado do
México. Para as nove variedades de Agave tequilana, um total de 333 bandas
foram analisadas das quais 203 foram polimórficas (61%) sobre todas as
variedades e 78 de 301 foram polimórficas em Agave tequilana var. “Azul”
(26%). A análise de AFLP revelou diferenças nos padrões genotípicos de bandas
entre diferentes Agave tequilana var. “Azul” de amostras coletadas em campos
diferentes em Guanajuato, indicando um nível significativo de diversidade na
Agave tequilana var. “Azul” de germoplasmas cultivados nesta região.
20
HERNANDEZ & FLORES (2004) fizeram um inventário das espécies de
Agave, no estado de Jalisco no México, utilizando AFLP, revelando uma ampla
diversidade genética entre os genótipos estudados.
INFANTE et al. (2003) fizeram uma análise com marcadores
moleculares, usando AFLP para estudo da variabilidade genética assexuada em
Agave fourcroydes Lem. Demonstrando as diferenças no padrão de amplificação
em uma população natural, enquanto esse padrão é conservado em amostras da
mesma planta. Uma análise de cinco diferentes populações mostrou diferenças ao
nível de população. A comparação do padrão de bandas AFLP entre duas plantasmãe com seus descendentes mostra que nesta espécie a variabilidade genética é
gerada e transmitida aos descendentes através da reprodução assexuada.
Consequentemente é possível selecionar os indivíduos de uma população clonal
para a melhoria populacional.
2.6.3 – ISSR
ISSRs são marcadores semiarbitrários, ampliados por PCR em presença
de um oligonucleotídeo complementar para um microssatélite designado.
Como um marcador com base em PCR, o ISSR tem algumas vantagens
quando comparado aos outros marcadores. A amplificação não requer
informações de sucessão do genoma e de padrões altamente polimórficos
(ZIETKIEWICZ et al. 1994). Cada faixa corresponde a uma sequência de DNA
delimitada por dois microssatélites invertidos. Também, as sequências-alvo dos
ISSRs são abundantes ao longo do genoma de eucariontes e evoluem rapidamente
(FANG et al. 1997; ESSELMAN et al.1999). Os ISSRs têm provado serem úteis
no estudo de genética de populações, especialmente em detecção clonal,
diversidade e revelação de indivíduos proximamente relacionados (SALIMATH
et al. 1995; OLIVEIRA et al. 1996).
Esta técnica de amplificação, visando a marcação de genes dominantes
em múltiplos locos, tem-se revelado consistente na identificação de cultivares e
espécies estreitamente relacionadas (GODWIN et al. 1997; BORNET &
BRANCHARD, 2001) e para estimar a diversidade genética, estrutura
21
populacional e processos evolutivos em plantas (WOLFF & MORGANRICHARDS, 1998; ZIZUMBO-VILLARREAL et al. 2005). Além disso, tem sido
desenvolvida e utilizada em estudos similares de Agave (AGUIRRE, 2004;
ROCHA, 2006).
DÁVILA et al. (2007)
usaram marcadores ISSR para avaliar sua
utilidade em estabelecer relações genéticas entre Agave cocui Trel. e outras
espécies do mesmo gênero, bem como a variabilidade genética existente entre os
indivíduos da espécie Agave cocui Trel., Agave angustifolia Haw. e Agave
tequilana . A técnica mostrou-se muito útil para determinar variações genéticas
inter e intra-populacional em espécies de Agave.
GOTTDIENER (2008) utilizou marcadores ISSR pra estudar a
diversidade genética e estrutura de populações selvagens e cultivadas de Agave
cupreata e Agave potatorum. No trabalho foram estimadas as distâncias genéticas
que separavam as populações estabelecendo-se as relações genéticas entre elas.
Noventa lócus polimórficos foram amplificados por meio de quatro Primers de
ISSR. Em ambas as espécies foram encontradas baixa diversidade genética entre
as populações.
GONZÁLEZ & HAMRICK (2005) estudaram a Biologia reprodutiva e
genética de populações cultivadas e selvagens de Agave garciae-mondozae da
região de Chilapa, Gro. México, através da técnica de ISSR encontrando níveis de
variação genética e fluxo gênico relativamente alto e diferenciação genética
moderada.
Estudando doze populações de Agave striata Zucc. utilizou marcadores
ISSR, encontrando altos níveis de variação genética HERNANDEZ (2006).
EGUIARTE et al. (2003) analisaram a variação genética dentro e entre
populações de duas espécies produtoras de mezcal Agave potatorum e Agave
cupreata Trel. selvagens e de herbário, através da técnica de ISSR, com intuito de
avaliar os seus recursos genéticos, os relacionamentos de parentesco entre as
populações e
o impacto que a extração excessiva desses recursos, o
desmatamento e as diferentes práticas de gestão podem trazer.
22
2.6.4 - Análise da diversidade e estrutura genética a partir de marcadores
moleculares dominantes (ISSRs).
O método de ISSR foi escolhido para esse estudo por ser uma técnica
simples, eficiente, possuir alta reprodutibilidade e gerar altos índices de
polimorfismo (REDDY et al., 2002). Vários estudos têm apresentado alto
conteúdo de informação genética revelado por estes marcadores, que parecem ser
especialmente apropriados para estudos filogenéticos, de avaliação da diversidade
genética e identificação de cultivares (RAKOCZY-TROJANOWSKA &
BOLIBOK, 2004).
Os estudos de genética de populações pretendem determinar a variação
genética existente em populações naturais e explicar quais as suas origens,
manutenção e importância evolutiva (HARTL & CLARK, 1997). Estas variações
são quantificadas em função da estrutura genética da população, o que permite
determinar e predizer o estado atual das populações, fazer conjecturas e
reconstruir a história evolutiva da espécie (HEDRICK, 2000).
As forças evolutivas afetam a variação genética nas populações naturais.
A fonte principal do aumento da variação é a mutação. A endogamia e a deriva
gênica diminuem a variação. A seleção e o fluxo gênico podem aumentar ou
diminuir os níveis de variação dependendo da situação e da espécie (HEDRICK,
2000). O resultado final da variação genética nas populações se deve em grande
parte, à ação de uma ou de várias forças evolutivas.
A diversidade genética é introduzida continuamente nas populações e
pode ser perdida por deriva genética, endocruzamentos e pela maior parte dos
tipos de seleção natural (NEI, 1987). As forças que geram e amplificam a
variabilidade genética são fundamentais para o processo evolutivo, pois a
adaptação de cada espécie ao longo das gerações depende da existência da
variabilidade sobre a qual a seleção natural possa atuar (BRAMMER, 1993).
Entre um grupo de progenitores, a diversidade genética tem sido avaliada
com o objetivo de identificar as combinações hibridas de maior efeito heterótico e
maior heterozigose de tal forma que, em suas gerações segregantes, se tenha
23
maior possibilidade de recuperação de genótipos superiores (CRUZ & REGAZZI,
2001).
NODARI & GUERRA (2004) associaram o conceito de diversidade à
variação genética propondo que a heterozigosidade esperada é uma medida para
quantificar a diversidade. Considera-se que, a nível genético, qualquer diferença
alélica na presença ou ausência de "loci" é causada por um códon. Portanto, a
partir de dados de freqüência de alelos, é possível calcular estatisticamente o
número médio de diferenças nos codons ou bases de nucleotídeos por loco, uma
vez que este número é uma medida direta de diferenças genéticas entre duas
populações, e é considerado como uma medida de distância genética (NEI, 1987).
A estrutura genética de uma população desempenha um papel
preponderante na sua evolução, podendo influenciar nos níveis de seleção, na
quantidade de variação genética e na manutenção da capacidade de explorar as
oportunidades do ambiente. O uso do termo estrutura genética tem sido feito de
várias maneiras, entre as diversas definições, uma das mais abrangentes e ao
mesmo tempo sucinta diz que:
e a distribuição não ao acaso de alelos ou
genótipos no tempo e no espaço. Esta pode apresentar-se estruturada
espacialmente em diferentes escalas, tais como: populações, subpopulações ou
entre indivíduos vizinhos devido aos sistemas de reprodução e dispersão, e
também da história de vida das espécies, gerando um maior grau de parentesco
dentro dos grupos do que entre os grupos (LOVELESS & HAMRICK 1984).
A determinação da estrutura e da variação genética entre e dentro de
populações, por marcadores dominantes, tornou-se possível a partir da introdução
da estatística ɸ, por EXCOFFIER et al. (1992) e usada pela primeira vez por
HUFF et al. (1993).
EXCOFFIER et al. (1992) desenvolveram uma análise de variância que
incorporava informações sobre a divergência de DNA de dados provenientes de
haplótipos. Esta nova abordagem denominada análise de variância molecular
(AMOVA), possibilitou a produção de estimativas dos componentes de variância
das análogas estatísticas F, chamada pelos autores de estatística Fst ɸ, que mostra
a correlação da diversidade dos haplótipos em diferentes níveis de subdivisão
hierárquica. Na estatística de F de Wright (Wright), o haplótipo de um indivíduo é
24
representado por um vetor p, com valores (1), caso a banda esteja presente e (0),
quando não estiver presente (EXCOFFIER et al. 1992).
A estrutura genética é estimada por meio do GST ou pela análise de
variância molecular (AMOVA), ambos produzindo resultados semelhantes
(NYBOM & BARTISH, 2000). Outros parâmetros observados são o número de
alelos efetivos e a porcentagem de lócus polimórficos.
O método de AMOVA ajusta variados tipos de matrizes de entrada
fornecida por diversos tipos de marcadores moleculares e diferentes tipos de
pressuposições evolutivas, sem modificar a estrutura básica da análise. A base
dessa análise de variância está na forma de tratamento das distâncias genéticas
como desvios da média de um grupo utilizando os quadrados dos desvios como
variância, permitindo a partição da variação genética entre e dentro das
populações analisadas. A correlação entre os pares de haplótipos aleatórios dentro
da população é feita tomando em consideração os pares de haplótipos ao acaso da
espécie como um todo, associada à diversidade entre os pares de indivíduos
tomados ao acaso dentro de uma região (EXCOFFIER et al., 1992).
Outro tipo de análise em genética de populações é a utilização do índice de
Shannon Wainer (LEWONTIN, 1972), usado em estudos de genética de
populações para indicar a diversidade da espécie por área. O uso desse índice é
importante como medida de diversidade populacional, quando se tem dados
dominantes, quando não é possível detectar os genótipos heterozigotos.
Os coeficientes de Similaridade, disponíveis para dados binários,
baseiam-se na comparação entre o número de atributos comuns para um par de
objetos e o número total de atributos envolvidos. Tais coeficientes podem ser
facilmente convertidos para coeficientes de dissimilaridade: se a similaridade for
denominada s, a medida será o seu complementar (1-s). Os coeficientes de
similaridade podem ser divididos em dois grupos: os que consideram a ausência
conjunta e os que não consideram a ausência conjunta (MEYER, 2002;
CARLINI-GARCIA, 1998).
Segundo CLIFFORD & STEPHENSON (1975), a escolha dos
coeficientes, que estão restritos ao intervalo [0,1] é mais adequada, pois índices
que tendem ao infinito são sensíveis a pequenas mudanças, especialmente em a. O
25
Coeficiente de Jaccard compara o número de bandas comuns presentes e o
número de bandas envolvidas, excluindo o número de ausências conjuntas
(MEYER, 2002).
O coeficiente de similaridade de Jaccard de acordo com SNEATH &
SOKAL (1973) é determinado a partir da expressão: Sij= a/(a+b+c)
Onde a é o número de vezes que ocorre a presença de bandas nos dois
indivíduos (i e j) simultaneamente, b é o número de vezes que ocorre a presença
de banda apenas no indivíduo i e c é o número de ocorrências de banda somente
no indivíduo j. Valores de similaridade igual a um foram utilizados para
identificação de indivíduos com o mesmo perfil de bandas, e estes foram
determinados como clones. O complemento do índice de Jaccard (1-S) foi
utilizado para descrever a dissimilaridade (D) entre indivíduos. A dissimilaridade
média entre grupos de indivíduos como um índice descritivo para comparação da
diversidade entre diferentes grupos e populações (RIBEIRO, 2009).
Dentre os métodos de agrupamento mais utilizados, estão os
hierárquicos e os de otimização. Nos métodos hierárquicos, o agrupamento dos
genitores é realizado por meio de um processo que se repete em vários níveis até
que seja construído o dendrograma, que permitirá estabelecer a relação entre esses
genitores (CRUZ & SCHUSTER, 2004).
26
3. OBJETIVOS
3.1 - Objetivo geral
Analisar a diversidade genética em acessos de Agave sisalana (sisal), da
região sisaleira baiana, visando conhecer a variabilidade intra e interpopulacional
existente em seis municípios de maior representatividade no cultivo do sisal no
estado da Bahia, por meio de marcadores moleculares dominantes do tipo ISSR
(Inter Simple Sequence Repeats).
3.2 - Objetivos específicos
 Calcular os níveis de variação genética.
 Estudar a estrutura genética das populações através da estatística GST e
calculando a divisão da variação genética por meio da análise de AMOVA
(Analysis of Molecular Variance).
 Estimar as distâncias genéticas que separam as populações e estabelecer
relações genéticas entre as mesmas, através de métodos de distância e
agrupamento, e métodos de inferência bayesiana.
 Comparar os índices de diversidade genética obtidos em Agave sisalana
em relação a outras plantas cultivadas através de propagação assexuada e
populações naturais em geral.
27
4. HIPÓTESES
Este trabalho teve como base as seguintes hipóteses:
1. O Agave sisalana é uma espécie predominantemente de reprodução
clonal, e por isso deve apresentar baixa diversidade e estruturação genética.
2. Devido ao fato de Agave sisalana ser uma espécie introduzida, a
variabilidade e a divergência genética entre as populações deve ser baixa devido
ao efeito do fundador na introdução dos indivíduos originais.
28
5. MATERIAL E MÉTODOS
5.1 - Área de estudo e amostragem
A pesquisa foi realizada em áreas do semiárido baiano, caracterizadas
pela alternância de duas estações bem marcadas: a das chuvas e a da seca. A
vegetação é representada pela caatinga hipoxerófila.
Os municípios escolhidos para fornecimento dos indivíduos (bulbilhos e
rebentos) para o desenvolvimento do presente trabalho (Fig.7) compõem a área de
Identidade do Sisal e Piemonte da Diamantina, demonstrados nas figuras (Fig.1 e
2). Justifica-se a escolha de: JAC, CF, VAL, SD, STL, e OUR, conforme as
coordenadas geográficas relacionadas (Tab. 1), por apresentarem a agricultura
sisaleira e atividades a ela relacionadas como sua mais importante atividade
econômica, em cada município foi coletada uma única população. As distâncias
entre as cidades estão demonstradas na (Tab.2).
A amostragem constitui-se em uma etapa de grande importância no
delineamento da pesquisa, pois é capaz de determinar a validade dos dados
obtidos. Sua idéia básica refere-se "à coleta de dados relativos a alguns elementos
da população e a sua análise, que pode proporcionar informações relevantes sobre
toda a população". A amostragem probabilística foi escolhida para a realização do
projeto, pois é importante que cada elemento da população tenha uma chance
conhecida e diferente de zero de ser selecionado para compor a amostra
(MATTAR, 1996).
29
Figura 7. Regiões escolhidas para coleta dos genótipos de sisal – Adaptado de SEI (2011).
30
Tabela 1. Coordenadas geográficas e altitudes dos locais de coleta das seis
populações de sisal (Agave sisalana) cultivadas no estado da Bahia.
Municípios
Número de indivíduos
Coordenadas
por município
geográficas
Altitude (m)
S 11° 01’ 19,4’’
Jacobina (JAC)
25
742
W 40° 46’ 07,6’’
S 11° 25’ 49,5’’
Campo Formoso (CF)
25
580
W 40° 35’ 38,8’’
S 11° 20’ 29,3’’
Valente (VAL)
25
358
W 39° 27’ 30,3’’
S 11º 27’ 56’’
São Domingos (SD)
25
310
W 39º 31’ 34’’
S 11° 15’ 21’’
Santaluz (STL)
25
370
W 39° 22’ 29’’
S 10° 48’ 09.0’’
Ourolândia (OUR)
25
667
W 41° 16’ 11,9’’
31
Tabela 2. Distâncias em Km, entre os municípios de coleta das populações de
Agave sisalana.
Municípios
JAC
CF
VAL
SD
STL
JAC
-
-
-
-
-
CF
101
-
-
VAL
137
203
-
-
-
SD
123
189
14
-
-
STL
158
224
20
35
-
OUR
69
170
206
192
227
-
-
Legenda: Municípios: Ver tabela 1 para o nome das populações.
5.2 - Coleta de campo - Material vegetal
Nas seis localidades escolhidas, o espaço amostral em cada fazenda foi
determinado medido em quadrados (Fig. 8A e 8B), um maior com 100 m2
subdividido em cinco menores de 25m2 cada (ANEXO 1).
Os bulbilhos e os rebentos foram coletados com cuidado para não haver
mistura de genótipos (Fig. 8C). Em cada município coletou-se 25 indivíduos de
forma aleatória, visando obter uma amostra randômica, proporcionando a todos os
indivíduos da população a mesma chance de serem coletados.
As plantas fornecedoras dos genótipos foram enumeradas e marcadas
para facilitar outras coletas caso fossem necessárias (Fig.8D).
32
Figuras 8. (A e B) Demarcação do espaço amostral em uma das áreas de coleta; (C) Coleta de
bulbilhos; (D) Marcação de uma planta fornecedora de genótipos.
33
5.3 - Extração de DNA genômico
Logo após as coletas, os materiais foram levados ao Laboratório de
Sistemática Molecular de Plantas (LAMOL) da Universidade Estadual de Feira de
Santana- BA (UEFS), onde todas as etapas experimentais foram realizadas.
Para extração de DNA do material fresco, foi seguido o protocolo de
DOYLE & DOYLE (1987) fazendo adaptações a microtubos em substituição aos
tubos. (Conforme Anexo 2).
5.4 – Verificação da integridade do DNA
A amostragem inicial foi de 150 indivíduos, mas observou-se que na
população de SD, dez indivíduos apresentaram baixa qualidade do DNA,
reduzindo assim, o tamanho amostral a 140 indivíduos, não foi feita uma nova
recoleta na população por não haver bulbilhos disponíveis por ocasião na fazenda,
já que a emissão dos bulbilhos ocorre apenas uma vez durante todo o ciclo
reprodutivo da planta.
As amostras de DNA foram aplicadas em gel de agarose a 1,2%. Após a
migração do DNA no gel por eletroforese, visualizando em trans-iluminador com
luz ultravioleta/365 Nm e fotografado, possibilitando a avaliação da qualidade e
integridade geral do DNA das amostras. Esta avaliação, algumas vezes, revelou a
necessidade de novas extrações para que fosse obtida uma amostra de melhor
qualidade.
34
5.5 - Condições de amplificação
5.5.1 - Seleção dos Primers
Foram testados 18 Primers através de uma reação de PCR, em seis
indivíduos, um de cada população, escolhidos de forma aleatória para a
verificação do perfil de amplificação. A visualização de cada Primer foi feita em
gel de agarose após eletroforese. Dos 18 Primers de ISSR testados nove
demonstraram maiores índices de variabilidade os quais foram utilizados na
realização do experimento (Tab.3). Como os ISSRs constituem marcadores
dominantes multilocos o uso de um número pequeno de Primers é suficiente para
fornecer informações relevantes para os estudos de polimorfismos dentro e entre
populações de plantas (GE et al. 2005; 2006; XIA et al. 2007; LI & JIN, 2008).
Os volumes dos componentes do mix de amplificação foram testados um
a um a fim de encontrar concentrações que melhor produzissem os resultados
esperados de amplificação.
As amplificações do DNA foram realizadas em termociclador, para cada
reação, foi preparado um volume maior de 30 μl caso houvesse uma eventual
necessidade de correr um novo gel. Cada mix de amplificação foi composto por:
Tampão 10X; MgCl2 (1,25mM); DNTP (1,25mM); Primer a 10 pmol; aditivo
Betaína (0,005mM); Taq DNA polimerase (5U); H2O (q.s.p.) e 0,8 μl de DNA
total, com concentração de 80ng.
O programa utilizado no termociclador para as reações de PCR obedeceu
às seguintes condições: 94ºC por 1,5 minutos de Pré-melt, a seguir, a 35 ciclos de
amplificação. Em cada ciclo os passos foram: 94ºC por 40 segundos para
desnaturação; anelamento em 46ºC por 45 segundos e extensão 72ºC, por 1,5
minutos. Após os ciclos, as amostras foram mantidas a 72ºC por 7 minutos, para
extensão final.
35
Tabela 3: Relação dos Primers de ISSR amplificados e suas respectivas
sequências iniciadoras.
Primer
Sequência iniciadora
UBC 814
(CT)8-TG
UBC 902
(GT)6-AY
UBC 844
(CT)8-RC
UBC 899
(CA)6-RG
MAO
(CTC)4-RC
OMAR
(GAG)4-RC
JOHN
(AG)7-YC
GOOFY
(GT)7-YG
MANNY
(CAC)4-RC
Os produtos da reação foram separados em eletroforese em gel de
agarose 1,8 % em Tampão SB 1X, corados com brometo de etídio e fotografados
sob luz UV.
36
5.6 - Estudo de variabilidade
As análises estatísticas foram realizadas através de programas
computacionais utilizados em estudos genético-populacionais.
Na interpretação e análise dos géis, apenas as bandas mais visíveis para
cada indivíduo foram selecionadas como marcadores moleculares. Esses dados
foram inseridos no programa GelCompar II versão 5.1 (Applied Maths, EUA), o
qual fez a análise e associação entre todos os géis dos diversos Primers para todas
as populações, obtendo-se assim uma matriz binária de valores zero e um,
relacionando ausência ou presença dos marcadores nos diferentes loci
selecionados, nas seis populações de Agave sisalana. Como houve dados faltantes
a análise foi feita duas vezes; uma vez considerando esses dados e outra vez sem
levá-los em consideração.
As bandas amplificadas em pares de base tiveram o tamanho de seus
fragmentos estimados comparando-os com o marcador ladder 100 pb (Ludwig). A
partir dos resultados obtidos, uma matriz binária foi construída pelo programa
GelCompar II, observando a presença de bandas exclusivas dentro de uma
população ou entre populações, o número e a porcentagem de bandas polimórficas
por Primers, determinando assim, a quantidade de lócus polimórficos para cada
população.
A análise dos perfis genéticos dos dados permitiu fazer estimativa dos
componentes de variância atribuindo às diferenças existentes entre as seis
populações, entre as regiões e entre indivíduos dentro das regiões utilizando o
coeficiente de similaridade de Jaccard (1908), através dos programas GenAlEx
(PEAKALL & SMOUSE, 2006), PopGene 2.2 (ROHLF, 2002) e Structure 2.3.3
(PRITCHARD et al., 2000).
A matriz de similaridade construída a partir do índice de Jaccard foi
aplicada à análise de agrupamento segundo o método das médias aritméticas de
grupos não ponderados UPGMA - Unweighted Pair Group Method with
Arithmetic Mean e utilizada para a construção de um dendrograma. Segundo o
recomendado pelo método UPGMA, considerou-se as seis populações, que foram
agrupadas de forma sucessiva, baseando-se em sua proximidade.
37
O dendrograma construído representou graficamente os agrupamentos,
sob a forma de diagrama de árvore nos quais o eixo das abcissas está
representando as populações e o eixo das ordenadas representa os níveis em que
os indivíduos foram agrupados.
O programa PopGene (Population Genetic Analisys) Versão 1.31 (YEH
et al. 1999) foi usado para estimar a partir das frequências alélicas os seguintes
parâmetros de Diversidade Genética: Índice Shannon-Wiener (I), Heterozigose
Esperada (He), diferenciação genética intrapopulacional (GST), porcentagem de
locos polimórficos (P%) e Número de migrantes (Nm) (NEI, 1973); Distância
Genética (NEI, 1978) e Número de Alelos por Loco.
A diferenciação genética e a distribuição da variabilidade genética entre e
dentro da espécie foi estimada através da Análise de Variância Molecular
(AMOVA) (EXCOFFIER et al, 1992), utilizando o programa PopGene, Versão
1.31 (YEH et al., 1999). Os componentes de variância utilizados foram: o ST
análogo ao GST, estima a variabilidade genética que existe entre as populações e a
sua significância, considerando o conjunto como um todo; o PR estima a
diversidade entre as populações; o PT estima a diversidade dentro e entre as
populações e o RT que mensura a diversidade apenas entre as regiões.
Como os marcadores moleculares ISSR’s são marcadores dominantes, os
heterozigotos não podem ser distinguidos. Por isso, foram estimados com base na
frequência dos alelos recessivos a partir de indivíduos sem presença de
determinada banda. Partindo do pressuposto de que cada faixa da matriz
corresponde a um locus genético (banda), as frequências alélicas foram estimadas
em q = raiz quadrada da frequência de '0' fenótipos, utilizando a correção de
(LYNCH
&
MILLIGAN,
1994),
aplicado
pelo
software
AFLPsurv
(VEKEMANS, 2002).
O software AFLPsurv produz matrizes de pares de distâncias genéticas
entre populações (com bootstraps) e os coeficientes de parentesco entre os
indivíduos em pares, fazendo vários testes de significância baseado em
permutações aleatórias (VEKEMANS, 2002).
O cálculo da relação genética entre pares de indivíduos, através do
estimador de relação genética (rxy) de RITLAND (1996) foi feito através do
38
programa GenAlEx 6.0, o qual permitiu que fosse medida a proporção de alelos
idênticos por descendência entre dois indivíduos. O programa calculou também, o
número de alelos efetivos (Ae), ou seja, aqueles que efetivamente passarão à
geração seguinte (PEAKALL & SMOUSE, 2006).
A análise dos dados utilizando o programa GenAlEx Versão 6.0,
permitiu determinar os parâmetros abaixo (PEAKALL & SMOUSE, 2006)
- Tamanho da amostra: Número de acessos analisados.
- Frequência de alelos: A proporção de uma forma alélica de um gene
entre todas as cópias de um gene na população.
- Número de alelos: número de alelos gerada pelo locus.
- Número de alelos privados e de partilha de alelos.
O programa GenAlEx Versão 6.0 (PEAKALL & SMOUSE, 2006) foi
utilizado também para fazer a análise de coordenada principal (PCoA), que é uma
técnica de ordenação multivariada que procura reduzir a dimensionalidade da
matriz de dados através da localização de eixos que representem as maiores
extensões da população no espaço N-dimensional, resumindo a composição de
indivíduos das populações. Os resultados foram plotados usando software
Microsoft Excel 2007. Esta análise produziu estimativas de componentes de
variância e valores similares para as estatísticas F, refletindo a correlação da
diversidade haplotípica em diferentes níveis de subdivisão hierárquica
(EXCOFFIER et al. 1992).
O software Structure 2.3.3 (FALUSH et al 2009), implementa uma
abordagem bayesiana a partir de dados de genótipo. Seu uso permitiu inferir a
existência de populações distintas, estudando as zonas híbridas, os migrantes,
identificando a presença de indivíduos miscigenados e estimando as frequências
alélicas da população pressupondo que cada indivíduo possa ter ascendência de
uma única população. O algoritmo básico foi descrito por PRITCHARD et al.
(2000). As extensões para o método foram publicadas por (FALUSH et al. 2003,
2007; HUBISZ et al. 2009). O software Structure não só é capaz de detectar a
estrutura de conjuntos de dados simulados de acordo com um modelo de ilha, mas
também desempenha muito bem quando confrontado com mais complexos
39
esquemas de migração hierárquica. Em tais situações, o nível superior hierárquico
da estrutura da população é detectado (EVANNO, 2005).
40
6. RESULTADOS
Os Primers utilizados geraram um total de 143 bandas, variando de 13 a 19
por Primer (Tab.4).
Tabela 4. Primers utilizados, seqüências e número de bandas amplificadas.
Nome do Primer
N° de bandas Polimórficas
MAO (CTC)4-RC
15
GOOFY (GT)7- YG
15
JOHN (AG)7-YC
16
MANNY (CAC)4-RC
17
OMAR (GAG)4-RC
19
UBC 814 (CT)8-TG
13
UBC 844(CT)8-RC
18
UBC 899(CA)6-RG
16
UBC 902 (GT)6-AY
14
Total
143
Onde: R = purina (A ou G) e Y = pirimidina (C ou T).
Dos 143 locos obtidos, 136 foram polimórficos (95,1%). A porcentagem
de locos polimórficos (%P) variou, de 57,34% nas populações de (CF e STL) a
82,52% na população de (VAL). A média de locos polimórficos nas populações
foi 63,63% (Tab. 5). Esses resultados obedecem ao critério de polimorfismo de
95% de frequência adotada pelo software. A heterozigosidade média esperada
(He) nas populações variou de 0, 150 (STL) a 0, 259 (VAL) com valor médio de
0, 180. A heterozigosidade esperada (He), não apresentou diferença significativa
entre as populações. Para o índice de Shannon (I), também não foi observada
diferença significativa, os valores variaram de 0, 235 (STL) a 0, 394 (VAL), a
41
média para esse Índice foi: I = 0, 279. Foram observadas bandas específicas nas
populações de VAL e OUR (Tab. 5).
Tabela 5. Diversidade genética de seis populações de Agave sisalana do semiárido
baiano, com base em nove marcadores de ISSR.
Diversidade genética
População
%P
He
I
Ae
N° de bandas privadas
JAC
59,44
0,167
0,258
1,276
0
CF
57,34
0,164
0,254
1,269
0
VAL
82,52
0,259
0,394
1,437
3
SD
59,44
0,167
0,261
1,267
0
STL
57,34
0,150
0,235
1,246
0
OUR
65,73
0,175
0,273
1,281
4
Valor Médio
63,63
0,180
0,279
1,296
1,16
Legenda: Populações: Ver tabela 1 pra o nome das populações.
P = Porcentagem de lócus polimórficos; He = heterozigosidade esperada; I = Índice de Shannon;
Ae – Alelos efetivos.
O dendrograma observado na figura 9 demonstra a estrutura de
agrupamento que indica a existência de dois grupos reunindo as populações
amostrais. No primeiro grupo as populações JAC e CF estão agrupadas com alto
suporte (100% de bootstrap) e em seguida ligadas à população OUR (94% BS). O
outro grupo inclui as populações VAL, SD e STL (100% BS), porém as relações
entre elas demonstraram ser pouco definida, já que o suporte do agrupamento
entre as populações VAL e SD é baixo (65%)
42
Pop 2
CF
Pop 6
OUR
Pop 1
JAC
Pop 3
VAL
Pop 4
SD
Pop 5
STL
0,016
0,032
100
0,048
Distância de Nei
0,064
0,08
65
0,096
94
100
0,112
0,128
0,144
0
Figura 9. Dendrograma mostrando as relações fenéticas entre as populações de Agave
sisalana de seis localidades: JAC, CF, VAL, SD, STL e OUR, com base em UPGMA.
Nas figuras 10 e 11 são apresentadas as análises de coordenadas
principais (PCoA) de todos os indivíduos das populações, indicando a
porcentagem de variação explicada pelos três primeiros eixos. As três
coordenadas
explicam
14%,
8,69%
e
6,61%
da
variação
genética,
respectivamente.
No primeiro eixo (14%) observa-se uma clara separação de dois grupos,
apesar de haver uma pequena sobreposição de alguns poucos indivíduos. O
primeiro grupo foi composto pelas populações de JAC, CF e OUR, estando as
mesmas relacionadas positivamente com o eixo; o segundo grupo formado pelas
43
populações de VAL, SD e STL (Fig.11), associadas negativamente a este eixo. No
segundo eixo (8,69%) é possível perceber uma leve sepação dentro do primeiro
grupo entre as três populações.
0,32
0,24
0,16
Coordinate 2
0,08
0
-0,08
-0,16
-0,24
-0,32
-0,4
-0,4
-0,32
-0,24
-0,16
-0,08
0
0,08
0,16
0,24
0,32
Coordinate 1
Figura 10. Análise de coordenadas principais (PCoA) de 6 populações de Agave sisalana.
Eixo 1 ˟ 2 correspondendo a 22,69%.
44
O terceiro eixo (6,61%) permitiu ainda, dentro do grupo 2, a separação da
população de OUR das de JAC, CF (Fig. 11). O restante percentual de variação
em eixos subsequentes são as diferenças de indivíduos dentro das populações.
0,32
0,24
Coordinate 3
0,16
0,08
0
-0,08
-0,16
-0,24
-0,4
-0,32
-0,24
-0,16
-0,08
0
0,08
0,16
0,24
0,32
Coordinate 1
Figura.11. Análises de coordenadas principais (PCoA) de seis populações de Agave sisalana
Eixo 1 ˟ 3,correspondendo a 20,61%.
Os grupamentos das populações foram compatíveis com a origem
geográfica das mesmas. As populações foram separadas de acordo com os
territórios de Identidade propostos pelo governo do Estado. As populações de
JAC, de CF e de OUR denominadas de grupo 1 estão localizadas no território de
Identidade Piemonte da Diamantina (Fig. 2) e as populações de VAL, SD e de
STL denominadas de grupo 2 estão localizadas no território de Identidade Sisal
(Fig. 1).
A análise da estrutura populacional confirmou a existência de diferenças
genéticas entre os dois grupos. O K obtido nos métodos indicou a maior
probabilidade para divisão do conjunto de populações em dois grupos (K=2). Os
45
gráficos com k=2 (Fig. 12) mostraram que apesar de haver uma separação em dois
grupos, houve também uma leve sobreposição de indivíduos dos municípios de
JAC, CF e OUR (região 1), dos de VAL, SD e STL ( região 2).
A utilização de modelo indutivo permitiu identificar as relações de
parentesco entre os indivíduos avaliados. A partir da análise do gráfico produzido
pelo programa, pode-se observar que os indivíduos das populações VAL, SD e
STL (respectivamente VAL, SD e STL) podem ter sido inseridos nas populações
de JAC, na qual se observou que para alguns indivíduos a variação genômica
flutuou de 15% a 98% com relação aos das populações VAL, SD e STL. Em
relação ao município de CF também foi observada uma pequena mistura
genômica variando entre 5% e 95% com esses municípios. Já para a população de
OUR observou-se uma discreta mistura genômica também com as populações
VAL, SD e STL. (Fig. 12).
Figura 12. Gráfico de estruturação genética partir da analise dos dados de marcadores dominantes
de ISSR com o software STRUCTURE em seis populações de sisal cultivados no estado da Bahia
1JAC. 2CF. 3VAL. 4SD. 5STL e 6OUR.
A diversidade genética obtida foi significativa (P<0,001) dentro das
populações. Do total de variância genética molecular encontrada para a espécie,
27% se deve às divergências entre populações, enquanto que 73% é atribuida às
diferenças entre indivíduos.
46
A análise de variância molecular das populações levando em
consideração sua subdivisão entre as regiões (11,44%), entre populações (18,11%)
e dentro das populações (70,44%) confirmou a variabilidade (Tab. 6 ).
Tabela 6. Resumo da análise de variância molecular (AMOVA).
População
FV
% Total
Entre populações
27
Dentro de populações
73
Todas
Todas
Estatística
PT = 0,272**
Entre regiões
11,44
RT=0,114**
Entre populações
18,11
PR=0,205**
Dentro das populações
70,44
PT= 0,296**
Os valores de GST e Nm médio encontrado para as populações foram
respectivamente 0,235 e 1,63. Considerando-se os dois grupos de populações
produzidos pela análise de agrupamento, verifica-se que o grupo 1 apresentou GST
e Nm iguais a 0,145; 2,96 e o grupo 2 apresentou respectivamente 0,172; 2,41. O
nível de heterozigosidade total (Ht), para as análises a nivel de espécie (global) foi
de 0,236. O grupo 2 apresentou uma média de heterozigosidade 0,192, maior que
a do grupo 0,169. (Tab 7).
Tabela 7. Valores de GST, Nm, Ht e Hs para as seis populações estudadas e para
os dois grupos de população.
Populações
GST
Nm
Ht
He
Todas
0,235
1,63
0,236
0,180
Grupo 1
0,145
2,96
0,197
0,169
Grupo 2
0,172
2,41
0,232
0,192
Grupo 1 – Populações (JAC; CF e OUR; Grupo 2 – Populações (VAL; SD; STL).
Nm=0,5 (1-GST)/ GST.
47
7. DISCUSSÃO
Este é o primeiro estudo feito para se avaliar os níveis de diversidade
genética e sua distribuição em populações de Agave sisalana, cultivadas.
Segundo COLOMBO et al. (1998), para estimar relações genéticas entre
populações com resultados confiáveis, é necessário usar entre sete e 30 Primers –
RAPD gerando de 50 a 200 lócus polimórficos. Nesse trabalho foram utilizados
nove Primers gerando 143 lócus polimórficos. Estudando genética espacial de
soja selvagem, foram utilizados 15 Primers ISSR, obtendo-se 182 fragmentos
(JIN et al. 2006). ALMEIDA et al. (2009), utilizaram oito Primers de ISSR para
caracterizar molecularmente cultivares de cana-de-açúcar, produzindo 95% de
polimorfismo. ARNAU et al. (2003) na diferenciação de 30 cultivares de
morango, utilizaram cinco Primers de ISSR, gerando um total de 390 bandas das
quais 113 foram polimórficas demonstrando o alto poder de discriminação dessa
técnica. OKUN et al. (2008) utilizaram cinco marcadores ISSR, que foram usados
para analisar a diversidade genética dentro e entre populações de eucaliptos
obtendo 41 bandas polimórficas. Dessa forma, comparados os resultados obtidos
nesse trabalho, com os encontrados na literatura para RAPD, por serem
marcadores semelhantes, confirma-se a validação do número de Primers e locos
polimórficos necessários para o desenvolvimento de um trabalho de genética de
populações produzindo resultados confiáveis.
Em alguns trabalhos com populações naturais (GE & SUN, 2001;
ALEXANDER et al. 2004; XIA et al. 2007), a porcentagem de locos polimórficos
tem sido utilizada como medida de diversidade genética. Utilizando marcadores
dominantes ISSR, GEORGE et al. (2009) encontraram 99% de locos polimórficos
para Piperia yadonii (Orchidaceae). LOUSADA et al 2010 utilizaram nove
Primers ISSR, produzindo 89 fragmentos, apresentando uma diversidade genética
de 56,6% de locos polimórficos. Esses resultados fortalecem os encontrados neste
trabalho.
Neste trabalho foram encontrados níveis de heterozigosidade esperada
relativamente altos, tanto para análise ao nível de espécie total quanto para média
das populações. Os valores encontrados neste estudo são semelhantes aos
48
encontrados por alguns autores para outras Agaves utilizando a técnica de ISSR
(Tab. 8).
Os resultados obtidos a partir da análise de agrupamento demonstram que
as distâncias genéticas dentro dos grupos são menores, o que pode ser explicado
pela menor distância geográfica entre as populações que compõem cada grupo. A
tendência das populações em se agruparem de acordo com sua localização
geográfica evidencia uma estruturação espacial da variabilidade.
As proporções de mistura genômica observadas na análise do gráfico
(Fig.12) podem ser atribuídas à introdução de mudas dessas três localidades
aleatoriamente, por fazendeiros, ou mesmo por trabalhadores rurais, já que se
observa uma grande distância geográfica entre as regiões.
Em estudos realizados por GONZALEZ et al. (2004), em Agave garciaemendozae, foi observado que 86,05% da variação ocorria dentro das populações e
2,64% da diversidade entre as regiões, sugerindo que para esta espécie de Agave
há um isolamento por distância.
Nesse trabalho, com relação à diversidade genética total detectada para
cada população, os resultados indicaram que a população de VAL apresenta maior
diversidade entre as seis populações analisadas, seguida da população de JAC.
Isso pode ser observado tanto através das porcentagens de bandas polimórficas,
quanto através do Índice de Diversidade de Shannon-Wiener. Essa maior
diversidade observada para a população de VAL pode ter tido inicio com o
transporte de mudas por parte dos agricultores e atualmente mantida por conta do
modo reprodutivo.
Os valores encontrados demonstram altos níveis de diversidade genética
dentro das populações de Agave sisalana. Esses valores obtidos apresentaram o
mesmo padrão que os propostos por NYBOM (2004) na avaliação da diversidade
entre e dentro de populações de angiospermas e gimnospermas (Tab.8).
As espécies vegetais diferem marcadamente quanto ao modo como a
diversidade genética é particionada entre as populações. O padrão de divisão está
correlacionado com os sistemas de reprodução e os parâmetros da história de vida
(HAMRICK & GODT, 1989). Espécies que são principalmente de longa duração
como é o caso do Agave sisalana, apresentam maior diversidade genética dentro
49
das populações do que entre. No presente estudo pudemos observar que os dois
grupos de populações foram formados levando em consideração as altitudes.
Em espécies que se reproduzem preferencialmente por fecundação
cruzada, espera-se em geral encontrar alta diversidade dentro de populações e
baixa divergência entre populações, exatamente o contrário do esperado para
espécies que se reproduzem preferencialmente por autofecundação (LOVELESS
& HAMRICK, 1984; HAMRICK & GODT, 1996). Isso pode indicar uma suposta
alogamia para o sisal.
Plantas que se reproduzem com eficiência também por via assexuada são
consideradas por alguns autores como portadoras de menor variabilidade genética
(CHEN et al.,2006). Estudos com plantas de reprodução sexuada e assexuada
mostram que a diversidade não é necessariamente reduzida dentro das populações
quando comparadas com plantas de reprodução exclusivamente por via sexuada
(ELLSTRAND & ROOSE (1987), WIDEN et al.1994 apud SARTHOU et al.
2001; HAN et al. 2007). Em Bromeliaceae, por exemplo, verifica-se que um
sistema misto de reprodução sexuada e assexuada, pode promover altos níveis de
diversidade para populações de algumas espécies (SARTHOU et al. 2001,
GONZÁLES-ASTORGA et al. 2004; CAVALLARI, 2004).
Em termos gerais, propõe-se que tanto a família Agavaceae quanto o
gênero Agave parecem ser auto-compatíveis por conta do padrão reprodutivo com
isso, genes recessivos deletérios são expressos em forma homozigótica reduzindo
a adequação das sementes, impedindo o seu desenvolvimento ou impedindo a
formação de frutos (EGUIARTE et. al., 2000).
50
Tabela 8. Variabilidade genética em grupos de Agavaceae e média utilizando
marcadores moleculares.
Trabalho
%P
He
I
Técnica
Referência
Agave sisalana
63,6
0,24
0,28
ISSR
Este trabalho
Agave striata
81,0
0,27
0,19
ISSR
Agave cupreata
89,0
0,26
-
ISSR
AGUIRRE (2004)
Agave potatorum
83,0
0,25
-
ISSR
AGUIRRE (2004)
Agave victoriaereginae
HERNÁNDEZ
(2006)
MARTINEZ83,0
0,33
-
Isoenzimas
PALACIOS et
al.(1999)
Yucca filamentosa
68,0
-
0,20
Isoenzimas
Agave subsimplex
76,0
0,14
-
RAPD
Agave deserti
78,0
0,19
-
RAPDs
Perenes longevas
-
0,24
-
RAPDs
Monocotiledôneas
-
0,19
-
RAPDs
MASSEY &
HAMRICK (1998)
NAVARRO et
al.(2003)
NAVARRO et al.
(2003)
NYBOM &
BARTISH (2000)
NYBOM (2004)
Legenda: %P = Porcentagem de lócus polimórficos He=Heterozigose esperada I=Índice de Shannon.
51
O fluxo gênico é o principal componente da estrutura de populações. Se
há altos níveis de fluxo gênico entre as populações, eles evoluem juntas, mas se os
níveis estão baixos, cada população evolui quase independente. Como o fluxo de
genes é necessário para impedir a evolução independente de populações de uma
espécie, esta vai depender de outras forças evolutivas presentes e de sua estrutura
(modelo espacial que se enquadra na espécie). (SLATKIN, 1994).
Segundo SLATIKN (1987) apud HAN et al. (2007), em genética de
populações uma diferenciação significativa da população ocorre quando o fluxo
gênico (Nm) é menor que um migrante por geração dentro de uma população ou
ainda quando o GST, análogo ao Fst é maior que 0, 25. Comparando os valores
deste trabalho (Nm=1,63) com aqueles encontrados em outras espécies de Agaves,
nota-se que Agave cupreata e Agave garcia-mendozae apresentaram valores
semelhantes (Nm= 1,49; 1,3 respectivamente, ISSRs), enquanto a estimativa para
Agave potatorum (Nm= 2,99, ISSRs) foi maior, nesse caso o fluxo de genes
supera os efeitos da deriva genética e previne a diferenciação local.
A diferenciação genética da Agave sisalana quando comparada com
valores obtidos em outras espécies ISSR demonstrou que são geneticamente
próximas. Por exemplo, Agave sisalana (ɸST = 0,12), Agave cupreata (ɸST=0,14)
Agave potatorum (ɸST = 0.08) (AGUIRRE, 2004; EGUIARTE et.al. 2003), Agave
garciae-mendozae (ɸST = 0,10) (GONZÁLEZ & HAMRICK, 2005). (Tab. 8).
Resultados obtidos através de RAPD em agaváceas foram parecidos com
os encontrados com ISSR; Agave cerulata (ɸST
=
0,1), Agave subsimplex (ɸST
=
0,08) e Agave deserti (ɸST = 0,14) (NAVARRO et al. 2003). No caso do Agave
lechuguilla (ɸST = 0, 083), SILVA & EGUIARTE (2003b), utilizando isoenzimas
obtiveram resultados indicadores de baixa diferenciação genética. No entanto, são
muito mais baixos que os apresentados em Agave subsimplex (ɸST = 0,31) e Agave
victoriae-reginae (ɸST = 0,33) usando isoenzimas (MARTINEZ-PALACIOS et al.
1999). Comparando com Perenes longevas NYBOM, (2004), encontrou ɸST = 0,25
e GST = 0,19 (Tab.8).
52
Tabela 9. Estimativas de variação dentro das populações e / ou variação entre as
populações, obtidas com marcadores moleculares diferentes.
ɸST
GST
Técnica
Referência
Agave sisalana
0,12
0,235
ISSRs
Este trabalho
Agave cupreata
0,14
0,294
ISSRs
Espécie
AGUIRRE (2004)
EGUIARTE et.al.(2003)
AGUIRRE (2004)
Agave potatorum
0,08
0,269
ISSRs
EGUIARTE et.al.(2003)
Agave garciae-mendozae
0,10
-
ISSRs
Agave subsimplex
0,31
-
Isoenzimas
Agave lechuguilla
0,39
-
Isoenzimas
Agave victoriae-reginae
0,33
-
Isoenzimas
Agave subsimplex
0,08
0,070
RAPDs
NAVARRO et al.(2003)
Agave striata
0,26
-
RAPDs
TREJO (2006)
Agave cerulata
0,10
0,095
RAPDs
NAVARRO et al.(2003)
Agave deserti
0,14
0,149
RAPDs
NAVARRO et al.(2003)
Perenes longevas
0.25
0,19
RAPDs
NYBOM (2004)
Monocotiledôneas
0,38
-
RAPDs
Legenda:
ɸST = Variância total entre as populações; GST
subpopulações.
=
GONZÁLEZ (2005)
MARTINEZPALACIOS et al.(1999)
SILVA & EGUIARTE
(2003b)
MARTINEZPALACIOS et al.(1999)
NYBOM & BARTISH
(2000)
Diferenciação genética entre as
53
Em Agave sisalana, os estudos com marcadores moleculares ainda são
incipientes, não havendo até o momento qualquer informação sobre trabalhos com
uso de marcadores ISSR.
VARGAS-PONCE et al. (2009), utilizaram a técnica de ISSR para
comparar populações selvagens de Agave angustifolia, com plantações comerciais
de Agave tequilana. Os resultados através da AMOVA foram utilizados para
confirmar que populações de Agave angustifolia tradicionais apresentam uma
diversidade genética (HT = 0, 442) similar à suas populações selvagens (HT = 0,
428) e maior estrutura genética (ɸST= 0, 405; ɸST = 0, 212). Em contraste, a
diversidade genética de Agave azul comercial (He = 0,118) foi 73% menor. Esses
resultados são indicativos de que a maior variação ocorria dentro das populações,
mas que, nas espécies cultivadas sob a agricultura tradicional, a variação entre as
populações é quase tão alta quanto a variação dentro das populações e quase o
dobro da variação entre as populações selvagens. A análise desses dados, podem
ser de grande importância na certificação da Agave (mezcals) para permitir a
conservação da diversidade genética, ecológica e cultural atual podendo
desempenhar um papel fundamental na preservação dos agroecossistemas
tradicionais.
54
8. IMPLICAÇÕES PARA A CONSERVAÇÃO DA ESPÉCIE
A variabilidade genética dentro de uma espécie constitui uma importante
fonte de genes que devem ser considerados na formação de bancos de
germoplasma para uso no melhoramento, na transformação gênica com intento da
obtenção de maior produtividade e outras características almejadas, pois genótipos
divergentes enriquecem a variabilidade natural da espécie, o que confere maiores
possibilidades de adaptação a diferentes ambientes (NODARI & GUERRA,
2004).
A caracterização genética é importante para os programas de conservação
de recursos genéticos, pois avalia a distância entre as populações em estudo e
pode auxiliar na escolha dos indivíduos a serem utilizados na conservação ex situ
e in situ, mediante a estimativa de índices de similaridade entre os indivíduos
analisados. Além disso, possibilita a indicação de acasalamentos ou cruzamentos
que favorecerão a manutenção da máxima variabilidade genética.
A Agave sisalana é propagada de forma assexuada e sexuada. Desde a
sua chegada ao Brasil, a reprodução vegetativa por meio de rebentões sempre
predominou. Este estudo confirma relatos de variação genética em plantas
propagadas assexuadamente como a Agave tequilana e mostra que a variação
elevada também pode ser encontrada entre os indivíduos obtidos a partir de uma
única planta-mãe.
A propagação in vitro poderá ser explorada como uma alternativa para a
produção de plantas com boas características genéticas para plantios comerciais.
Para isso será necessário determinar os níveis de variabilidade genética produzida
por este processo, a fim de determinar e controlar a natureza molecular das
mutações subjacentes e os mecanismos que as causam.
55
9. CONCLUSÕES
O estudo da variabilidade genética em Agave sisalana, por meio de dados
obtidos com marcadores ISSR possibilitou chegar às seguintes conclusões:
Os marcadores ISSR mostraram ser uma alternativa de detecção de
variabilidade genética em espécies ainda pouco conhecidas e que não dispõem de
marcadores espécie-específicos.
A diversidade genética encontrada para a espécie Agave sisalana com os
nove iniciadores ISSR avaliados foi considerada alta, diferente do esperado no
início da pesquisa, por conta do sistema reprodutivo.
O estudo da estrutura genética das seis populações mostrou que a maior
diversidade genética encontra-se dentro de suas populações.
Fatores biológicos e geográficos podem estar influenciando na dinâmica
populacional de Agave sisalana no estado da Bahia.
A caracterização genética de populações e espécies de plantas , é um
passo complementar importante para o delineamento de estratégias de
conservação in situ ou ex situ.
56
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68
ANEXO
69
ANEXO 1
Padrão estabelecido para coleta dos indivíduos.
1
2
1
5
3
População 1
Região (Localidade): ________________
Número de indivíduos da população: 25
Tamanho do quadrado maior: _________
Tamanho de cada quadrado menor: ________
Data da coleta: ______/_______/2009
4
70
Coordenadas geográficas:
Quadrado maior
S ________;________;___________
W________;________;___________
Quadrado menor 1
S________;________;___________
W________;________;___________
Quadrado menor 2
S________;________;___________
W________;________;___________
Quadrado menor 3
S________;________;___________
W________;________;___________
Quadrado menor 4
S________;________;___________
W________;________;___________
Quadrado menor 5
S________;________;___________
W________;________;___________
71
ANEXO 2
Protocolo de extração de DNA
Extração de DNA em Amostra fresca
1. Pesar 100µg de material fresco;
2. Macerar e adicionar 800µl de CTAB, homogeneizar;
3. Incubar por 10 minutos ( 60-64°C;
4. Adicionar 800µl de Clorofórmio/ álcool isoamilico;
5. Levar ao Shaker por 1h;
6. Centrifugar a 13000 rpm por 10 minutos (temperatura ambiente);
7. Retira sobrenadante para novo tubo de 1,5 ml;
8. Adicionar isopropanol gelado (2/3 ou mais do volume) – levar ao freezer overnight;
9. Centrifugar por 5 minutos (13000 rpm);
10. Descartar a parte líquida;
11. Lavar com álcool etílico 70%;
12. Centrifugar por 5 minutos (13000 rpm) – repetir esse procedimento 2 ou 3 vezes;
13. Secar over-night;
14. Ressuspender em 100µl de TE por 48h na bancada (ou até que o “pellet” esteja
totalmente ressuspendido);
15. Quantificar.