•31/01/2015
Bromatologia II
Paulo Figueiredo
[email protected]
Programa
1. Análise de carboidratos: extracção e separação; métodos de
identificação. Determinação quantitativa: métodos físicos, químicos e
biológicos. determinação de fibra.
2. Análise de lípidos: extracção e determinação quantitativa; identificação
e quantificação de ácidos gordos.
3. Análise de proteínas: determinação de proteína total e azoto não
proteico. Separação e identificação de proteínas e aminoácidos.
4. Análise da humidade: métodos físicos e químicos. Obtenção e
determinação de cinzas.
6. Análise de minerais: identificação e determinção quantitativa.
7. Análise de vitaminas: identificação e determinação quantitativa de
vitaminas hidrossolúveis e lipossolúveis.
•1
•31/01/2015
Bibliografia
1. J. Adrian, J. Potus, A. Poiffait, P. Dauvillier, Análisis nutricional de
alimentos, 2000, Acribia
2. R. Matissek, F. M. Schnepel, G. Steiner, Análisis de los alimentos.
Fundamentos, métodos, aplicaciones, 1998, Acribia
3. H.-D. Belitz, W. Grosch, P. Schieberle, Food Chemistry, 2004, SpringerVerlag
4. O. R. Fennema, Food Chemistry, 1996, CRC
5. S. S. Nielsen, Food analysis, 2003, Springer
6. R. Owusu-Apenten, Introduction to food chemistry, 2004, CRC
7. A. Gomes de Castro, A química e a reologia no processamento dos
alimentos, 2003, Instituto Piaget
Web
1. http://www.pfigueiredo.org/uatla.html
•2
•31/01/2015
Avaliação
A. Exame – 100%
B. Avaliação contínua:
1. Frequência – 30 % + 30 %
2. Discussão de artigos – 30 %
3. Participação + Assiduidade – 10 %
Análise de carboidratos
6
Componentes mais abundantes dos alimentos
funções:
nutrientes
adoçantes
matéria-prima para produtos fermentados
propriedades reológicas da maioria dos alimentos de origem vegetal
responsáveis por reacções de escurecimento
•3
•31/01/2015
Análise de carboidratos
7
podem ocorrer isolados, ou física ou quimicamente associados a outras
moléculas
glicoproteínas
glicolípidos
fibras dietéticas
carboidratos não digeríveis
lenhina
Análise de carboidratos
8
razões para determinação de tipo e concentração de carboidratos nos
alimentos:
padronização
alimentos devem ter composições que respeitem a legislação
rotulagem nutricional
informação ao consumidor sobre teor nutricional
detecção de adulterações
cada alimento tem a sua “impressão digital” de carboidratos
qualidade alimentar
propriedades físico-químicas dos alimentos dependem do tipo e
concentração de carboidratos presentes
doçura, aparência, estabilidade, textura
económicas
evitar desperdício de ingredientes dispendiosos
processamento
eficácia de diversas operações depende do tipo e concentração
dos carboidratos presentes
•4
•31/01/2015
Análise de hidratos de carbono
9
Amostragem
moídas
causar mínima alteração no teor de humidade
lípidos e clorofila removidos por extracção com éter de petróleo
carboidratos insolúveis
outros interferentes removidos por:
descoloração
resinas de permuta iónica
precipitação por agentes clarificantes
Análise de carboidratos
10
Amostragem
agentes clarificantes:
solução básica de acetato de chumbo
descolora a solução
usado em polarimetria de soluções coloridas
ácidos fosfotungístico e tricloroacético
precipitam proteínas
ferricianeto de potássio e sulfato de zinco
precipitam proteínas
descoloram parcialmente a solução
sulfato de cobre
específico para determinação da lactose em leite
•5
•31/01/2015
Análise de carboidratos
11
Amostragem
requisitos dos agentes clarificantes:
remover completamente interferentes sem adsorver ou
modificar açúcares
excesso de clarificante não deve afectar procedimento
precipitado deve ser pequeno
procedimento relativamente simples
Análise de carboidratos
12
Amostragem
remoção de etanol
evaporação sob vácuo
•6
•31/01/2015
Análise de carboidratos
13
Análise de carboidratos
14
Amostragem
Métodos qualitativos
reacções coloridas
condensação de produtos de degradação de açúcares em
ácidos fortes com compostos orgânicos
antrona e fenol são dos mais utilizados
antrona reage especificamente com carboidratos em
solução concentrada de H2SO4
cor verde azulada
reacção com os produtos de degradação
hidroximetilfurfural ou furfural
•7
•31/01/2015
Análise de carboidratos
15
Métodos qualitativos
reacções coloridas
reacção de fenol com H2SO4
método simples, rápido, sensível, exacto e
específico
permite determinar quase todos os tipos de
carboidratos
cor produzida é estável
resultados reprodutíveis
poucos problemas com interferentes
Análise de carboidratos
16
Métodos qualitativos
propriedades redutoras do grupo carbonilo
não específicas
requerem remoção de outros agentes redutores
solução de Fehling é reagente mais conhecido
redução de cobre
•8
•31/01/2015
Análise de carboidratos
17
Métodos quantitativos
Munson-Walker
método gravimétrico
redução de cobre pelos grupos redutores dos carboidratos
2 reagentes de Fehling
A – sulfato de cobre
B – tartarato de sódio e potássio/NaOH
reacção com carboidratos redutores
forma precipitado de óxido de cobre
pp filtrado num cadinho de fundo poroso
pp lavado com água quente
pp seco e pesado
Análise de carboidratos
18
Métodos quantitativos
Munson-Walker
redução não é estequiométrica
calibração com soluções padrão de cada carboidrato
tabelas relacionam peso do pp com a quantidade de
carboidrato, para cada carboidrato
•9
•31/01/2015
Análise de carboidratos
19
Métodos quantitativos
Lane-Eynon
método titrimétrico
redução de cobre pelos grupos redutores dos carboidratos
adição da solução de carboidrato a mistura (1:1) em
ebulição das soluções de Fehling
azul de metileno usado como indicador
mudança de cor no ponto de viragem
método não é estequiométrico
utilização de tabelas e padrões
Análise de carboidratos
20
Métodos quantitativos
Somogyi
método microtitrimétrico
redução de cobre pelos grupos redutores dos carboidratos
usado para determinar pequenas quantidades de carboidratos
reagente de cobre contém:
tampão fosfato
iodeto de potássio
iodo vai oxidar ião cuproso
sulfato de sódio
minimiza oxidação do óxido cuproso por O2 do ar
•10
•31/01/2015
Análise de carboidratos
21
Métodos quantitativos
Somogyi
reagente adicionado em excesso, mas em quantidade
conhecida
carboidrato redutor reduz Cu a óxido cuproso
Cu2O oxidado pelo iodo
excesso de iodo titulado com tiossulfato de sódio
reacção não estequiométrica
requer padronização
Análise de carboidratos
22
Métodos quantitativos
Métodos cromatográficos
carboidratos separados e determinados individualmente
separação baseada em:
coeficiente de partição
polaridade
tamanho
cromatografia em papel
TLC
cromatografia em coluna
GC
requer amostras voláteis
em geral, necessário derivatizar
HPLC
actualmente mais rápido, específico, sensível e preciso
HPLC e GC usados em conjunto com NMR e MS
•11
•31/01/2015
Análise de carboidratos
23
Métodos quantitativos
Métodos cromatográficos
HPLC
análise de monossacáridos e oligossacáridos
também permite análise de polissacáridos, após hidrólise
método rápido, com elevado grau de exactidão
pode ser utilizado em ampla gama de concentrações
não requer derivatização
Análise de carboidratos
Métodos quantitativos
24
Métodos cromatográficos
HPLC
fases estacionárias
permuta aniónica
permuta catiónica
fase normal
fase reversa
•12
•31/01/2015
Análise de carboidratos
Métodos quantitativos
25
Métodos cromatográficos
HPLC
fases estacionárias
permuta aniónica
carboidratos têm pKa entre 12-14
em solução básica, grupos OH podem ionizar
separados em permuta aniónica
sequência de eluição:
açúcares álcoois (alditois)< monossacáridos
< dissacáridos < outros oligossacáridos
geralmente detectores electroquímicos
1. Glucose
2. Fructose
3. Maltose
4. Maltotriose
5. Maltotetraose
6. Maltopentaose
7. Maltohexaose
8. Maltoheptaose
Análise de carboidratos
Métodos quantitativos
26
Métodos cromatográficos
HPLC
fases estacionárias
permuta catiónica
separação por ordem decrescente de PM
oligossacáridos (DP>3) < trissacáridos < dissacáridos
< monossacáridos < alditois
muito eficazes para resolver monossacáridos
1.
2.
3.
4.
5.
Sucrose
Glucose
Fructose
Mannitol
Sorbitol
•13
•31/01/2015
Análise de carboidratos
Métodos quantitativos
27
Métodos cromatográficos
HPLC
fases estacionárias
fase normal
fase estacionária polar
sílica gel com grupos amino
fase móvel de polaridade crescente
acetonitrilo (50-85 %)/água
monossacáridos e alditois < dissacáridos < outros
oligossacáridos
açúcares redutores reagem com grupos amino
deterioração da coluna
Análise de carboidratos
Métodos quantitativos
28
Métodos cromatográficos
HPLC
fases estacionárias
fase reversa
fase estacionária hidrofóbica
sílica gel com cadeias alquilo ou fenilo
fase móvel polar
habitualmente água
monossacáridos têm tempos de retenção muito curtos
tendem a eluir num único pico não resolvido
adição de sais pode aumentar Rt
presença de anómeros
duplicação e/ou alargamento dos picos
adição de uma amina à fase móvel acelera
anomerização e reduz problema
•14
•31/01/2015
Análise de carboidratos
Métodos quantitativos
29
Métodos cromatográficos
HPLC
fases estacionárias
fase reversa
1. Fructose
2. Glucose
3. Maltose
4. Maltotriose
5. Maltotetraose
6. Maltopentaose
7. Maltohexaose
8. Maltoheptaose
9. Maltooctaose
Análise de carboidratos
Métodos quantitativos
30
Métodos cromatográficos
HPLC
detectores
índice de refracção
electroquímicos
derivatização pós-coluna
derivatização pré-coluna
•15
•31/01/2015
Análise de carboidratos
Métodos quantitativos
31
Métodos cromatográficos
HPLC
detectores
índice de refracção
aplicável a todos os carboidratos
medidas lineares numa larga gama de concentrações
principais limitações:
não permite utilização de gradientes de eluição
detecção mede massas, não concentrações
Análise de carboidratos
Métodos quantitativos
32
Métodos cromatográficos
HPLC
detectores
electroquímicos
detector de amperometria pulsada (PAD) usado
habitualmente com cromatografia de permuta aniónica
permite utilização de gradientes
requer utilização a pH elevado
•16
•31/01/2015
Análise de carboidratos
Métodos quantitativos
33
Métodos cromatográficos
HPLC
detectores
derivatização pós-coluna
aumento da sensibilidade de detecção por adição de um
grupo substituinte
concentração medida por UV/Vis ou fluorescência
maior sensibilidade que detectores de índice de refracção
Análise de carboidratos
Métodos quantitativos
34
Métodos cromatográficos
HPLC
detectores
derivatização pré-coluna
reacções têm que ser estequiométricas
derivatização de oligossacáridos com grupos aromáticos
aumento de resolução com HPLC em fase normal
•17
•31/01/2015
Análise de carboidratos
35
Métodos quantitativos
Métodos cromatográficos
GC
análise quantitativa e qualitativa
necessário converter os carboidratos em compostos
voláteis, por derivatização
peracetatos de alditol
peracetatos do ácido aldónico
Análise de carboidratos
Métodos quantitativos
GC
36
Métodos cromatográficos
principal problema:
necessários 2 passos de preparação
redução dos grupos aldeído a álcoois primários
conversão do carboidrato reduzido num éster de
peracetato volátil ou num éter pertrimetilsililado
cada passo tem que ser estequiométrico
•18
•31/01/2015
Análise de carboidratos
Métodos quantitativos
GC
37
Métodos cromatográficos
aplicação a carboidratos neutros
1. redução a alditois
carboidratos obtidos a partir do extracto com 80 %
EtOH ou por hidrólise de polissacáridos
redução com borohidreto de sódio dissolvido em
hidróxido de amónio (T ambiente)
adição de ácido acético, gota a gota
até parar libertação de H2
destruição do borohidreto em excesso
solução evaporada até secura
adição de metanol e evaporação até eliminação de iões
borato
se frutose estiver presente
reduzida a D-glucitol + D-manitol
Análise de carboidratos
Métodos quantitativos
GC
38
Métodos cromatográficos
aplicação a carboidratos neutros
2. acetilação de alditois
adição de anidrido acético
balão fechado e aquecido a 121 ºC
arrefecido
adição de água
decomposição do anidrido acético em excesso
evaporação até secura
3. GC dos peracetatos
resíduo dissolvido em clorofórmio
cromatografia isotérmica
identificação através dos Rt relativamente a
hexaacetato de inositol
padrão interno
•19
•31/01/2015
Análise de carboidratos
Métodos quantitativos
GC
39
Métodos cromatográficos
aplicação a hidrolisados de polissacáridos contendo ácidos urónicos
necessário um método diferente
1. redução
hidrolisado evaporado até secura
resíduo dissolvido em sol. carbonato de sódio
tratado com borohidreto de sódio em excesso
adição de ácido acético
decomposição do borohidreto em excesso
adição de metanol e evaporação até eliminação de iões
borato
ácidos urónicos reduzidos a ácidos aldónicos e
aldoses a alditois
Análise de carboidratos
Métodos quantitativos
GC
40
Métodos cromatográficos
aplicação a hidrolisados de polissacáridos contendo ácidos urónicos
2. preparação dos derivados trimetilsililados e cromatografia
ácidos aldónicos convertidos em éteres de per-TMS
directamente injectados
necessário utilizar gradiente de temperatura
identificação através dos Rt
•20
•31/01/2015
Análise de carboidratos
Métodos quantitativos
GC
41
Métodos cromatográficos
detector mais usado
FID
Análise de carboidratos
42
Métodos quantitativos
Métodos cromatográficos
TLC
usado em análise de rotina
análise rápida e simultânea de diversas amostras
identificação e quantificação de carboidratos em
melaços
•21
•31/01/2015
Análise de carboidratos
43
Métodos quantitativos
Espectrometria de massa
pouco usada
não rotineiro
MALDI-TOF em análise de séries homólogas de oligossacáridos
Análise de carboidratos
44
Métodos quantitativos
Métodos electroforéticos
carboidratos derivatizados por reacção com boratos
tornam-se electricamente carregados
carboidratos aplicados num gel ao qual se aplica uma
voltagem
separação baseada no tamanho
moléculas menores movem-se mais rapidamente no campo
eléctrico
•22
•31/01/2015
Análise de carboidratos
45
Métodos quantitativos
Métodos ópticos
refractometria
índice de refracção da solução de carboidratos
determinação de açúcares totais, como sólidos solúveis
utilização em controlo de qualidade
xaropes, geleias, sumos de fruta
polarimetria
polarímetro mede rotação óptica de uma solução pura de um
carboidrato
densimetria
medida da gravidade específica de uma solução açucarada
densidade é função da concentração de carboidrato
a uma dada temperatura (20 ºC)
resultados exactos para soluções puras
resultados aproximados para alimentos açucarados
(xaropes, ...)
Análise de carboidratos
46
Métodos quantitativos
Métodos enzimáticos
rápidos, muito específicos e sensíveis para baixas concentrações
sequência de reacções enzimáticas é método preferencial para
determinação de amido
requerem pouca preparação da amostra
alimentos líquidos podem ser analisados directamente
alimentos sólidos requerem prévia dissolução em água
existem diversos kits comerciais para analisar carboidratos
específicos
métodos mais frequentemente usados para determinar
concentrações:
permitir que a reacção enzimática finalize e medir a
concentração do produto
proporcional à concentração do substrato inicial
medição da velocidade inicial da reacção enzimática
proporcional à concentração do substrato
•23
•31/01/2015
Análise de carboidratos
47
Métodos quantitativos
Métodos enzimáticos
Análise de carboidratos
48
Métodos quantitativos
Métodos enzimáticos
preparação da amostra
recomendada utilização do tratamento de Carrez
adição de sol. de hexacianoferrato de potássio
adição de sol. de sulfato de zinco
adição de sol. de NaOH
destrói emulsões
precipita proteínas
absorve algumas cores
suspensão filtrada
filtrado límpido usado directamente para ensaios
•24
•31/01/2015
Análise de carboidratos
49
Métodos quantitativos
Métodos enzimáticos
ex: D-glucose/D-frutose
1) conversão de glucose em glucose-6-fosfato
por hexacinase e ATP
2) G6P oxidada por NADP+, na presença de G6P-desidrogenase
G6P + NADP+ ↓ Gluconato-6-fosfato + NADPH + H+
NADPH formado proporcional à concentração de G6P na
amostra
medido por espectrofotometria a 340 nm
concentração de frutose determinada por conversão da frutose
em glucose (por via enzimática) e repetição do
procedimento
Análise de carboidratos
50
Métodos quantitativos
Métodos enzimáticos
ex: maltose/sacarose
1) maltose e sacarose hidrolisadas por a-glucosidase
maltose ↓ 2 Glu; sacarose ↓ Glu + Fru
2) concentrações de glucose e frutose determinadas pelo
método anterior
problema:
se existirem outros oligossacáridos, estes também são
hidrolisados
•25
•31/01/2015
Análise de carboidratos
51
Métodos quantitativos
Métodos físicos
polarimetria
mede o ângulo de rotação da luz polarizada no plano, ao
atravessar uma solução
extensão da polarização proporcional à concentração das
espécies opticamente activas
a = [a]lc
a – ângulo de rotação medido
[a] – actividade óptica (constante
para cada espécie)
l – percurso óptico
c - concentração
Polarímetro:
•fonte de luz monocromática
•polarizador
•porta-amostra
•analisador (mede ângulo de rotação)
Análise de carboidratos
52
Métodos quantitativos
Métodos físicos
ângulo de rotação depende da temperatura e comprimento
de onda
usam-se condições padrão da risca D do sódio
T = 20 ºC; l = 589.3 nm
prepara-se uma curva de calibração a vs. c
ou
[a] tirado da bibliografia
concentração do carboidrato determinada por
medição do seu ângulo de rotação e
comparando com valores da curva de calibração
•26
•31/01/2015
Análise de carboidratos
53
Métodos quantitativos
Métodos físicos
refractometria
determinação do índice de refracção (n)
n
c
cm
c – velocidade da luz no vácuo
cm – velocidade da luz no
material
medição do ângulo de refracção (r) e do ângulo de
incidência (i) numa zona fronteira entre o material da
amostra e um padrão
para carboidratos, o material de referência é quartzo
Análise de carboidratos
54
Métodos quantitativos
Métodos físicos
índice de refracção de carboidratos aumenta
proporcionalmente à concentração
índice de refracção depende de temperatura e
comprimento de onda
medidas feitas a 20 ºC e 589.3 nm
método rápido e simples
uso rotineiro na indústria
análise de xaropes, mel, melaços, compotas, …
•27
•31/01/2015
Análise de carboidratos
55
Métodos quantitativos
Métodos físicos
infra-vermelho
restantes componentes principais dos alimentos não absorvem
radiação IV no mesmo comprimento de onda
possibilidade de determinar concentrações
processo rápido e não destrutivo
densidade
densidade de soluções aquosas aumenta com aumento da
concentração de carboidratos
densidade medida por densímetros ou garrafas de
densidade
uso de rotina na indústria
determinação em sumos e outras bebidas
Análise de carboidratos
56
Métodos quantitativos
Ensaios imunológicos
específicos para carboidratos de baixo peso molecular
carboidrato de interesse ligado a uma proteína
injectado num animal
animal desenvolve anticorpos específicos para o
carboidrato
anticorpos podem ser extraídos
usados como parte de kits para determinação da
concentração do carboidrato em alimentos
•28
•31/01/2015
Análise de carboidratos
57
Ex: Determinação de carboidratos totais e redutores
Reagentes
amostra
500 mL solução A: sulfato cúprico + H2SO4
500 mL solução B: tartarato de sódio e potássio + NaOH
solução de ferrocianeto de potássio 0.025 M
solução de acetato de zinco 1.0 M, com ác. acético 20 mL/L
solução de azul de metileno 1 %
HCl conc.
papel indicador de vermelho Congo
NaOH 40 %
HCl 1 N
NaOH 0.1 N
Análise de carboidratos
58
Ex: Determinação de carboidratos totais e redutores
Preparação da amostra
pesar ou pipetar quantidade suficiente para obter 250 mL de sol.
com ~1 % de carboidratos
juntar 50 mL H2O
agitar
neutralizar até pH 7.00
com NaOH 0.1 N
passar sol. para balão volumétrico de 250 mL
clarificar
volumes iguais de K4Fe(CN)6 e Zn2(CH3COO)2
agitar
completar volume do balão com H2O
filtrar sobre papel de filtro seco
obtém-se sol. a
•29
•31/01/2015
Análise de carboidratos
59
Ex: Determinação de carboidratos totais e redutores
Inversão da sacarose para determinação de carboidratos totais
pipetar 50 mL da sol. a para balão volumétrico de 100 mL
adicionar 5 mL HCl conc.
aquecer em banho-maria a 68-70 ºC (5 min)
arrefecer
colocar papel indicador no balão
neutralizar com NaOH 40 %
até papel ficar roxo
completar volume com H2O
agitar
obtém-se sol. b
Análise de carboidratos
60
Ex: Determinação de carboidratos totais e redutores
Método de Lane-Eynon
preparar licor de Fehling
misturar partes iguais de sols. A e B
agitar bem
1 mL = 5.00 mg glucose
colocar sol. a numa bureta de 50 mL
pipetar 10 mL do licor de Fehling para erlenmeyer de 125 mL
juntar igual volume de H2O
aquecer em bico de Bunsen até fervura
juntar 5 mL da sol. a
deixar ferver
adicionar 3-4 gotas de azul de metileno 1 %
reiniciar titulação
adição de porções de 0.5 mL da sol. a
perto do ponto final, cor da espuma sobrenadante começa
a desaparecer
pp vermelho tijolo (óxido cuproso)
•30
•31/01/2015
Análise de carboidratos
61
Ex: Determinação de carboidratos totais e redutores
Método de Lane-Eynon
continuar titulação gota a gota
no ponto final, sobrenadante totalmente incolor
repetir titulação com sol. a
adicionar de uma vez o volume gasto na anterior, menos 1 mL
ao recomeçar a ferver, juntar 3-4 gotas de azul de metileno
continuar titulção gota a gota, até desparecer a cor
repetir procedimento com sol. b
Análise de polissacáridos e fibra
62
Fibra bruta
materiais não digeríveis e insolúveis em ácidos e bases diluídas
celulose, lenhina, pentosanas
sem valor nutritivo
acção peristáltica do intestino
segundo as funções:
polissacáridos estruturais
celulose, hemicelulose, pectinas
compostos estruturais não polissacáridos
lenhina
polissacáridos não estruturais
gomas, mucilagens, carragenano, agar
•31
•31/01/2015
Análise de polissacáridos e fibra
63
importância da determinação da fibra bruta em alimentos e rações
avaliação nutritiva de rações
rações com muita fibra têm baixo valor nutritivo
eficiência na moagem e refinação de farinhas
verificação da maturação de fibras e vegetais
produtos muito maduros têm maior quantidade de fibra
adulterações
cascas em nozes moídas, sementes em frutas processadas
Análise de polissacáridos e fibra
64
1967
introdução do conceito de fibra dietética
digestão clássica com ácido e base para obter fibra bruta
conduz a incertezas e variabilidade relativamente ao
valor nutritivo
determinação inclui parte das proteínas e conduz a perca
de parte da lenhina
mais adequado separar lenhina, celulose e hemicelulose e
minimizar o teor de azoto
digestão enzimática
fibra dietética – matérias vegetais insolúveis que não são digeríveis
por enzimas proteolíticas e diastáticas e que não podem ser
utilizadas, excepto por fermentação microbiana no sistema
digestivo
•32
•31/01/2015
Análise de polissacáridos e fibra
65
fibra dietética
conjunto de todos os componentes não digeríveis de um
alimento
todos os polissacáridos, excepto amilose e amilopectina
fibra insolúvel
celulose, celulose microcristalina, lenhina, hemiceluloses e
amido resistente
fibra solúvel
restantes polissacáridos, pectina, gomas e hidrocolóides
Análise de polissacáridos e fibra
66
consumo tem benefícios fisiológicos
prevenção de:
cancros
doenças cardíacas
diabetes
•33
•31/01/2015
Análise de polissacáridos e fibra
67
Análise de amido
amostragem:
em alimentos naturais encontra-se sob forma de grânulos
necessário separá-lo dos outros componentes
secagem, trituração, maceração, filtração,
centrifugação
em alimentos termicamente processados é uma mistura de
amilose e amilopectina
secos, triturados e dispersos em EtOH/H2O (80:20)
monossacáridos e oligossacáridos solúveis
amido insolúvel
separado por filtração ou centrifugação
se algum amido em grânulos estiver presente:
amostra dispersa em água quente (> 65 ºC) com ácido
perclórico ou cloreto de cálcio
gelatinização do amido
Análise de polissacáridos e fibra
68
Análise de amido
métodos para determinação da concentração:
enzimas adicionadas a uma solução de amido para o degradar
a glucose
glucose analisada pelos métodos anteriores
concentração de amido calculada a partir da concentração
de glucose
adição de iodo leva à formação de um complexo insolúvel
determinado por gravimetria
secagem e pesagem do precipitado formado
determinado por titulação
quantidade de iodo necessária para precipitar o amido
utilização de métodos físicos
densidade, refractometria, polarimetria
desde que não existam componentes interferentes na
solução
•34
•31/01/2015
Análise de polissacáridos e fibra
69
Análise de amido
concentrações de amilose e amilopectina determinadas pelos
mesmos métodos usados para amido
necessário primeiro separar a amilose da amilopectina
agentes químicos que precipitem selectivamente um
dos dois
determinação da concentração do amido resistente
necessário adicionar DMSO
dissolve o amido antes de prosseguir com a análise
Análise de polissacáridos e fibra
70
Análise de amido
•35
•31/01/2015
Análise de polissacáridos e fibra
71
Análise de amido
ex:
amostra finamente triturada
adicionado EtOH 80 %
adição de DMSO
agitar e aquecer em banho-maria
adicionar sol. tamponizada de a-amilase
agitar em vortex
recolocar no banho
após 5 min, levar a 50 ºC
adicionar sol. de glucoamilase e tampão de acetato de sódio
(pH 4.5)
misturar e incubar a 50 ºC
transferir para balão volumétrico e perfazer volume com H2O
tirar aliquotas
tratar com reagente glucose oxidase/peroxidase e incubar
a 50 ºC
medir absorvância
Análise de polissacáridos e fibra
72
Análise de gomas e hidrocolóides
polissacáridos adicionados aos alimentos + gelatina
produtos cárneos processados
chocolates e derivados
gelados
molhos para saladas
análise difícil:
estruturas químicas diversas
diferentes solubilidades
diversos pesos moleculares
procedimento geral:
extracção da goma e fraccionamento do extracto
identificação e quantificação dos monossacáridos após
hidrólise ácida
fraccionamento provoca alguma perca de material
•36
•31/01/2015
Análise de polissacáridos e fibra
73
Análise de gomas e hidrocolóides
Análise de polissacáridos e fibra
74
Análise de gomas e hidrocolóides
amostra seca e pulverizada
preferível por liofilização
remoção de substâncias lipídicas
extracção em Soxhlet
clorofórmio/metanol (95:5)
solvente removido por secagem ao ar, seguido de exsicador
•37
•31/01/2015
Análise de polissacáridos e fibra
75
Análise de gomas e hidrocolóides
adição de EtOH 80 %
remoção de carboidratos solúveis, outros compostos de
baixo PM e cinzas
remoção de proteínas (para facilitar digestão)
extracto disperso em tampão de acetato de sódio (pH 6.5),
com NaCl
mistura aquecida
adição de papaína
mistura incubada
arrefecimento da mistura e adição de NaCl
adição de 4 volumes EtOH
polissacáridos precipitam
mistura centrifugada
Análise de polissacáridos e fibra
76
Análise de gomas e hidrocolóides
resíduo suspenso em tampão acetato (pH 4.5)
adicionar sol. de glucoamilase/amiloglucosidase, no mesmo tampão
incubar
remoção de amido e fibra insolúvel por centrifugação
arrefecer e adicionar NaCl
adicionar 4 volumes EtOH
precipita polissacáridos solúveis
mistura centrifugada
resíduo insolúvel é a fibra dietética solúvel
resíduo suspenso em água desionizada
diálise contra azida de sódio
anti-microbiana
diálise contra água desionizada
remoção da azida
resíduo liofilizado
•38
•31/01/2015
Análise de polissacáridos e fibra
77
Análise de gomas e hidrocolóides
resíduo colocado em frasco fechado
adicão de ácido trifluoroacético
solução aquecida
arrefecer e evaporar até secura
corrente de ar ou N2
determinação de monossacáridos
HPLC ou GC
Análise de polissacáridos e fibra
78
Análise de pectina
não é uma substância única
diversos graus de esterificação e amidação
principal componente comum:
éster metílico do ácido a-D-galacturónico
não existem métodos oficiais para determinação
estratégia mais comum:
precipitação com álcool
•39
•31/01/2015
Análise de polissacáridos e fibra
79
Análise de pectina
difícil hidrolisar ligações glicosídicas em ácidos urónicos
provoca decomposição
não é possível usar hidrólise ácida seguida de cromatografia
saponificação em NaOH
acidificação
adição de Ca2+
precipitação da pectina
pectato de cálcio lavado, seco e medido por gravimetria
Análise de polissacáridos e fibra
80
Análise de pectina
grau de esterificação
parâmetro importante em produtos naturais ou em que se
adiciona pectina
directamente medido por titulação
antes ou depois da saponificação
pectina isolada lavada com EtOH acidificado
grupos carboxilato convertidos em grupos ácido
carboxílico livres
ácido em excesso eliminado
dispersão do ácido pectínico em água titulada com base diluída
(NaOH), em excesso
saponificação dos grupos metiléster
titulação com ácido
determinação de base não saponificada
grau de esterificação
•40
•31/01/2015
Análise de polissacáridos e fibra
81
Análise de pectina
grau de esterificação
também pode ser medido por GC
medição do MeOH libertado pela saponificação
medição por NMR
Análise de polissacáridos e fibra
82
Análise de fibras
procedimentos habituais:
remoção de lípidos
amostra seca, finamente triturada
lípidos removidos por extracção com solvente
remoção de proteínas
hidrolisadas e solubilizadas
enzimas, ácidos fortes, bases fortes
aminoácidos separados da fibra por filtração ou
precipitação selectiva com soluções de EtOH
remoção de amido
amido gelatinizado em água quente
amido hidrolisado e solubilizado
enzimas, ácidos fortes, bases fortes
glucose separada por filtração ou precipitação
selectiva com soluções de EtOH
•41
•31/01/2015
Análise de polissacáridos e fibra
83
Análise de fibras
precipitação selectiva de fibras
fibras separadas por precipitação selectiva com soluções de
EtOH
análise de fibras
teor em fibra determinado por gravimetria
pesar uma fracção de fibra insolúvel, isolada da
amostra
teor em fibra determinado quimicamente
fibra hidrolisada a monossacáridos
concentração medida pelos métodos descritos
Análise de polissacáridos e fibra
84
Análise de fibras
•42
•31/01/2015
Análise de polissacáridos e fibra
85
Análise de fibras
métodos gravimétricos
carboidratos digeríveis, lípidos e proteínas solubilizados
selectivamente por reagentes químicos ou hidrolisados
enzimaticamente
matéria não solúvel ou não digerida filtrada
resíduo de fibra calculado por gravimetria
métodos químicos
carboidratos digeríveis removidos por via enzimática
componentes da fibra hidrolisados por ácido
monossacáridos obtidos medidos (valor da fibra)
Análise de polissacáridos e fibra
86
Análise de fibras
em ambos os métodos é necessário remover completamente o
amido digerível
provoca sobreestimação do valor da fibra
•43
•31/01/2015
Análise de polissacáridos e fibra
87
Análise de fibras
preparação da amostra
amostras com > 10 % lípidos
remoção de lípidos por extracção com éter de petróleo ou
hexano
centrifugação para remover solvente
extracção repetida 2 vezes
amostra seca a 70 ºC
estufa de vácuo, durante a noite
amostra triturada
passar num filtro com malha de 0.3-0.5 mm
regista-se a perca de peso para corrigir no cálculo de fibra dietética
devida a perca de gordura e humidade
Análise de polissacáridos e fibra
88
Análise de fibras
preparação da amostra
amostras não sólidas com < 10 % fibra
liofilizadas antes da análise
amostras não sólidas com > 10 % fibra
liofilização não necessária
•44
•31/01/2015
Análise de polissacáridos e fibra
89
Análise de fibras
métodos gravimétricos
método da fibra bruta
simples; não adequado para análise de alimentos
determina celulose e lenhina mas não hemiceluloses,
pectinas e hidrocoloides
digeridos pelo ácido e pela base
tende a cair em desuso
valor aproximado da fibra não digerível nos alimentos
extracção sequencial de uma amostra (após remoção de
lípidos) com 1.25 % H2SO4 e 1.25 % NaOH
resíduo insolúvel recolhido por filtração
seco, pesado e incinerado (correcção para
contaminação com minerais)
Análise de polissacáridos e fibra
90
Análise de fibras
•45
•31/01/2015
Análise de polissacáridos e fibra
91
Análise de fibras
métodos gravimétricos
método da fibra total
sancionado pela AOAC
utilizado pela indústria para vários alimentos
isolamento da fracção de interesse por precipitação selectiva
determinação da sua massa por pesagem
alimento sofre eliminação de gorduras, secagem e
gelatinização
digestão enzimática do amido e proteínas
a-amilase, amiloglucosidase, protease
adição de 95 % EtOH
precipitação de toda a fibra
solução filtrada
fibra recolhida, seca e pesada
Análise de polissacáridos e fibra
Análise de fibras
92
método da fibra total
amostra misturada com tampão
adição de a-amilase
ajuste de pH
mistura aquecida em banho-maria
gelatinização e digestão do amido
arrefecimento e adição de protease
digestão da proteína
ajuste do pH e adição de glucoamilase
total digestão do amido
passos subsequentes dependem de se querer determinar fibra total,
insolúvel ou solúvel
•46
•31/01/2015
Análise de polissacáridos e fibra
Análise de fibras
93
método da fibra total
determinação de fibra insolúvel e solúvel
mistura filtrada sob Celite
fibra insolúvel retida no filtro
lavada com água
o filtrado contém fibra solúvel
adição de EtOH e lavagem com água
pp fibra solúvel
filtrada sob vácuo, com Celite
resíduo lavado 3 vezes com EtOH
Análise de polissacáridos e fibra
Análise de fibras
94
método da fibra total
resíduos de fibra (total, insolúvel ou solúvel) nos filtros lavados
com EtOH 95 % e acetona
filtros secos na estufa, arrefecidos e pesados
alguma proteína e minerais complexam com constituintes da
parede celular
necessidade de corrigir
se se pretende determinar amido resistente
análise de triplicado de amostra
se não se pretende determinar amido resistente
amostras em duplicado
uma amostra para determinar teor em azoto
Kjeldahl
outra incinerada para determinar teor em cinzas
•47
•31/01/2015
Análise de polissacáridos e fibra
Análise de fibras
95
método da fibra total
fibra dietética expressa em percentagem de peso seco
fibra dietética total = fibra insolúvel + fibra solúvel
Branco (mg) =
R1 +R 2
-P-A
2
R 1 +R 2
-P-A-B
2
Fibra (%) =
x100
m1 +m2
2
Análise de polissacáridos e fibra
96
Análise de fibras
métodos gravimétricos
método da fibra total
processo alternativo:
componentes da fibra solúveis em água e insolúveis
determinados após filtração da amostra digerida
fibra solúvel fica no filtrado
fibra insolúvel no retentado
componente insolúvel seco e pesado
componente solúvel precipitado por adição de
EtOH 95 %
filtrado, seco e pesado
determina-se proteína e cinzas das diversas fracções
para corrigir o resultado
fibra = peso residual – peso (proteína + cinza)
tendência para sobrestimar o teor de fibra em alimentos com
teores elevados de monossacáridos
monossacáridos “presos” no pp
•48
•31/01/2015
Análise de polissacáridos e fibra
97
Análise de fibras
métodos químicos
teor de fibra considerado igual à soma dos monossacáridos mais a
lenhina restante (após remoção dos carboidratos)
monossacáridos determinados segundo métodos descritos
Análise de polissacáridos e fibra
98
Análise de fibras
métodos químicos
método Englyst-Cummings
elimina-se a gordura da amostra
amostra aquecida em água
gelatinização do amido
amido e proteínas digeridos por enzimas
fibra precipitada com EtOH 100 %
pp separado por centrifugação, lavado e seco
fibra hidrolisada por H2SO4 conc.
concentração dos monossacáridos obtidos determinada por
colorimetria, cromatografia, ...
massa da fibra na amostra considerada igual à massa de
monossacáridos
•49
•31/01/2015
Análise de polissacáridos e fibra
99
Análise de fibras
métodos químicos
método Englyst-Cummings
teores de fibra solúvel e insolúvel
passos de separação semelhantes aos dos métodos
gravimétricos
não dá informação sobre teor de lenhina
digestão ácida não conduz à sua degradação
alimentos que contêm elevados teores de lenhina (raros)
analisados por outro método
Análise de polissacáridos e fibra
100
Análise de fibras
métodos químicos
método Englyst-Cummings
•50
•31/01/2015
Análise de polissacáridos e fibra
101
Análise de fibras
métodos químicos
método Englyst-Cummings
mais rápido
menos requisitos técnicos
equipamento menos especializado
mais reprodutível que método da AOAC
Análise de polissacáridos e fibra
102
Análise de fibras
métodos detergentes
fibra por detergente ácido
Acid Detergent Fibre (ADF)
muito utilizado em rações
determinação de celulose + lenhina
W 
teor de fibra % = 100  2 
 W1 
W1 – peso da amostra (g)
W2 – peso do resíduo (g)
•51
•31/01/2015
Análise de polissacáridos e fibra
103
Análise de fibras
métodos detergentes
fibra por detergente neutro
Neutral Detergent Fibre (NDF)
método oficial para determinação da fibra dietética em grãos
de cereais
determinação de celulose + hemicelulose + lenhina
teor de fibra % = 100
(peso do cadinho + paredes celulares) - peso do cadinho
peso da amostra
paredes celulares ≡ resíduos de fibra
Análise de polissacáridos e fibra
104
Ex: Determinação de fibra por detergente ácido
Reagentes
amostra (ração animal)
sol. detergente ácido
adicionar 20 g CTAB a um balão volumétrico de 1 L
acertar volume com H2SO4 1 N
Procedimento
pesar 1 g da amostra
moer finamente e secar
colocar em frasco de refluxo com 100 mL do detergente ácido
aquecer até ebulição (5-10 min)
refluxar 60 min
terminar refluxo
agitar o frasco e filtrar em cadinho previamente incinerado e
pesado
adicionar água quente (90-100 ºC) até 2/3 do cadinho
deixar repousar 15-30 seg
•52
•31/01/2015
Análise de polissacáridos e fibra
105
Ex: Determinação de fibra por detergente ácido
secar sob vácuo
repetir lavagem com água quente
lavar 2 vezes com acetona
até total desaparecimento da cor
secar acetona sob vácuo
secar cadinho com a fibra
estufa com ventilação (3 h, 100 ºC)
pesar
•53