Ciência Animal, 15(2):89-97, 2005
Formas de diagnóstico da Maedi-Visna
(Diagnostic forms of Maedi-Visna )
Tânia Valeska Medeiros DANTAS* , Suzana Aparecida Costa de ARAÚJO, Jean Berg Alves
da SILVA, Aracelly Rafaelle Fernandes RICARTE & Maria Fátima da Silva TEIXEIRA
Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias/FAVET/Universidade Estadual do Ceará
RESUMO
Maedi-Visna vírus é um lentivírus ovino da família Retroviridae, sendo causa comum de prejuízo
econômico e responsável por muitas mortes em países produtores de ovinos, devido às lesões
pulmonares, na glândula mamária, sistema nervoso e /ou articulações. Várias formas de diagnóstico
podem ser usadas para detectar esta enfermidade, entre elas, o isolamento viral, ensaio
imunoenzimático (ELISA), imunodifusão em gel de ágar (IDGA), hibridização in situ, microscopia
eletrônica, histopatologia, imunohistoquímica, imunofluorescência indireta e dot-blot. A reação em
cadeia da polimerase (PCR) por sua vez tem sido utilizada de forma mais restrita devido ao seu
elevado custo. O isolamento em cultura de células da membrana sinovial de pequenos ruminantes
ou células do plexo coróide é determinante, porém demorada e dispendiosa. A hibridização in situ,
microscopia eletrônica, histopatologia e imunohistoquímica, são importantes, apesar de menos
sensíveis, porque permitem a localização do vírus in situ ou as lesões decorrentes da infecção
contribuindo desta forma para o estudo da patogênese viral. A sorologia é o método mais utilizado
para diagnóstico da enfermidade sendo o IDGA e o ELISA os mais empregados. O IDGA é o mais
usado rotineiramente devido a sua praticidade e baixo custo, e por ser recomendado pela Organização
Internacional de Epizootias (OIE). O ELISA apesar de boa especificidade e possibilitar um rápido
diagnóstico, tem sido menos utilizado. Tendo em vista a dificuldade de controle da Maedi-Visna é
importante a escolha de técnicas que propiciem um diagnóstico precoce e confiável da infecção.
PALAVRAS-CHAVES: diagnóstico, lentivírus ovino, Maedi-Visna
ABSTRACT
Maedi-Visna has been a common cause of economic damage and responsible for many deaths in
producing countries of sheep, which had its lesions in lung, mammary gland, nervous system and/
or joints. The Virus Maedi-Visna is sheep lentivirus of the Retroviridae family. Some tests can be
used to detect the disease, between them, the viral isolation, enzyme-linked immunosorbent assay
(ELISA), agar gel immunodiffusion test (IDGA), Hibridização in situ, electronic microscopy,
histopathology, immunohistochemistry, indirect imunofluorescence, dot-blot. The PCR has been
used of more restricted form which had its high cost. The isolation in cell’s culture of the membrane
small ruminant sinovial or the choroids plexus cells is decisive, however it is slow and costly. The
hibridizacao in situ, electronic microscopy, histopathology and immunohistochemistry are important,
although less sensible, because they allow to the localization of the virus in situ or lesons decorrent
of infection, contributing for the study of viral pathogenesis. The serology is method more used for
Autor para Correspondência
LABOVIR-PPGCV-UECE
Av. Paranjana, 1700, Itaperi 60740-000 Fortaleza-CE
e-mail:[email protected]
*
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diagnostic of disease being the IDGA and ELISA the more employee. The IDGA is more used
routinely who had its praticid and low cost and for being the recommended one for the Organization
International of Epizootias (OIE). Already the ELISA, although good specific and to make possible
a fast diagnosis, has been less used. In view of the difficulty of control of the Maedi-Visna the
choice of techniques is important that propitiate a precocious and trustworthy diagnosis of the
infection.
KEY WORDS: diagnosis, sheep lentivirus, Maedi-Visna
INTRODUÇÃO
O Maedi-Visna Vírus (MVV) é um vírus
de ovino não oncogênico que pertence à família
Retroviridae, gênero Lentivírus (PASICK, 1998)
que ocasiona a doença Maedi-Visna (MV). A MV
é uma importante doença de ovinos, resultante
de uma infecção persistente, constituindo uma
doença progressiva e lenta. Os animais
acometidos desenvolvem uma doença
neurológica degenerativa e inflamatória e/ou uma
pneumonia progressiva após um longo período
de incubação (FEVEREIRO et al., 1999). A
transmissão ocorre principalmente pela ingestão
de colostro e leite infectado e a principal forma
de infecção de rebanhos livres se dá por meio da
introdução de animais portadores oriundos de
rebanhos contaminados (BLACKLAWS et al.,
2004). O MVV infecta in vivo preferencialmente
células da linhagem monócito/macrófago
(NARAYAN & CLEMENTS, 1989).
Esta enfermidade pode ser diagnosticada
diretamente por isolamento do vírus através de
cultivo celular, microscopia eletrônica, reação em
cadeia de polimerase, hibridização in situ,
histopatologia e imunohistoquímica e
indiretamente por imunodifusão em gel de
agarose, imunofluorescência indireta, dot-blot e
imunoadsorção enzimática (ELISA).
Vários testes têm sido desenvolvidos para
detectar anticorpos contra MVV incluindo
imunodifusão em gel de ágar (IDGA) (CUTLIP
et al., 1977), recomendado pela Organização
Internacional de Epizootias (OIE), que apesar de
boa especificidade pode apresentar resultados
falsos negativos (KNOWLES, 1997), ELISA
(HOUWERS et al., 1982) e imunoblot
(TORFASON et al., 1992).
O controle da MV baseia-se na detecção
90
e sacrifício dos ovinos soropositivos. (MOOJEN,
2001). Desta forma, é fundamental para o
controle desta enfermidade o bom conhecimento
das formas de diagnóstico do agente. O
diagnóstico da MV pode ser obtido tanto pelo
uso de técnicas diretas, que objetivam a
identificação do agente em tecidos, secreções ou
líquidos corpóreos, quanto pelo uso de técnicas
indiretas que baseiam-se na identificação de
anticorpos circulantes contra o agente. Portanto
esta revisão teve como objetivo descrever as
principais formas de diagnóstico de Maedi-Visna,
mostrando os resultados de trabalhos realizados
com as diversas técnicas.
1. Métodos Diretos
1.1. Isolamento Viral
Apesar do isolamento em cultivo celular
ser um diagnóstico definitivo da infecção pelo
MVV, esta técnica é demorada, dispendiosa e
requer a implantação e manutenção de cultivos
celulares (KNOWLES, 1997). O MVV pode ser
isolado de animais pelo cocultivo de células
como leucócitos do sangue periférico (De la
CONCHA – BERMEJILLO, 1997), células
somáticas do leite, células de plexo coróide ovino
(RUSSO et al., 1982) e células de membrana
sinovial de pequenos ruminantes (PINHEIRO,
2001).
O MVV infecta ovinos e caprinos tanto
natural como experimentalmente (BANKS et al.,
1983; LEROUX et al., 1995; CASTRO et al.,
1999 ). Infecta, in vivo, células das linhagens de
monócitos e macrófagos (NARAYAN &
CLEMENTS, 1989). In vitro, o MVV replica em
cultivos de células fetais do plexo coróide
(SIGURDSSON et al., 1960), músculo liso
cardíaco (LEROUX et al., 1995), baço, timo,
linfonodo escapular (NARAYAN et al., 1980),
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membrana sinovial caprina (CRAWFORD et al.,
1980), células de linhagens fibroblásticas
imortalizadas (TEIXEIRA et al., 1997) e tecido
epitelial (LEE et al., 1996). O efeito citopático
produzido consiste na formação de células
gigantes multinucleadas (sincício) e lise celular
(CAREY & DALZIEL, 1983).
No Brasil, MOOJEN et al. (1995)
obteviveram o MVV pelo isolamento em células
infectadas de ovinos soropositivos. As células
infectadas foram submetidas à microscopia
eletrônica, concluído assim o primeiro
isolamento deste vírus no país.
1.2. Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR)
A reação em cadeia de polimerase tem
sido utilizada em alguns laboratórios de forma
mais restrita, pois é ainda um teste caro, porém
possui alta sensibilidade e especificidade, sendo
indicado para animais de alto valor zootécnico e
para aqueles que o resultado de outros testes não
tenham sido conclusivos (MOOJEN, 2001).
Vários trabalhos têm demonstrado com
sucesso o uso da técnica de PCR na detecção do
DNA proviral do MVV. A PCR permite a
identificação por amplificação direta de um
fragmento do ácido nucléico viral específico de
células de animais infectados (PINHEIRO,
2001).
Devido sua alta sensibilidade e
especificidade a PCR pode ser utilizada como
teste confirmatório em casos de resultados
inespecíficos da sorologia. O que pode ser
bastante útil em programas de erradicação da
enfermidade (KNOWLES, 1997).
A técnica de PCR também é bastante
versátil e já foi adaptada para vários tipos de
amostras clínicas, como sangue, leite, sêmen e
outros tecidos (BARLOUGH et al., 1994;
RIMSTAD et al., 1993; WAGTER et al., 1998;
TRAVASSOS et al.,1999; CELER, et al., 2000;
EXTRAMIANA et al., 2002). Entretanto, em se
tratando de animais jovens em estágios iniciais
da doença, as amostras sanguíneas são mais
eficientes para a detecção de DNA proviral
(WAGTER et al., 1998).
1.3. Hibridização in situ (HIS)
Segmentos específicos de ácido nucléico
de origem viral encontrados em tecidos ou células
infectados são capazes de ser detectados por
sondas marcadas por enzimas ou radiotivamente
através da HIS (BROWN, 1998).
ZINK et al. (1990) detectaram através da
HIS, quais as células e tecidos de caprinos
naturalmente infectados pelo vírus da artrite
encefalite caprina (CAEV) apresentavam
replicação viral, e observaram células com
transcritos virais nos pulmões, cérebro, glândula
mamária, articulações e medula espinhal.
1.4. Microscopia Eletrônica
CUTLIP & LAIRD (1976) estudando in
vitro, células embrionárias de pulmão ovino
infectado com o MVV observaram, por
microscópio eletrônico, vários brotamentos virais
com 120 a 140 nm de diâmetro, além de virions
livres no espaço extracelular, e, virions e
fragmentos virais no citoplasma de células
infectadas.
MOOJEN (1996), no Brasil, observou
partículas virais maduras na superfície e
brotamentos intracitoplasmáticos em cortes
ultrafinos de cultivo celular da MSC infectadas
com amostras de CAEV de origem francesa e,
de diferentes estados brasileiros.
ALMEIDA (2003) utilizando soro ovino
de um animal comprovadamente soropositivo e
apresentando sintomatologia característica da
doença, identificou partículas virais de MVV de
80nm através da microscopia eletrônica, e
visualizou monócitos infectados usando a técnica
de imunoperoxidase.
1.5. Histopatologia e Imunohistoquímica
Os exames anátomohistopatológico e
imunohistoquímica têm sido utilizados para
auxiliar o diagnóstico de infecções por lentivírus
de pequenos ruminantes (PINHEIRO, 2001).
GEORGSSON & PÁLSSON (1971)
fizeram um estudo histopatológico em ovinos
infectados natural e experimentalmente com
MVV e obtiveram como principais achados uma
inflamação intersticial crônica com densa
infiltração celular, hiperplasia do músculo liso
no septo alveolar e hiperplasia linfóide
perivascular e peribronquial. Com o passar do
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tempo à análise histopatológica passou a ser
utilizada como um auxílio ao diagnóstico, uma
vez que a mesma não é conclusiva, mesmo
quando associada ao conhecimento do quadro
clínico e epidemiológico.
O exame histológico de tecidos
pulmonares e mamários de ovinos naturalmente
infectados revelou a presença de fatores
tipicamente associados com o MVV. Os pulmões
apresentaram infiltração difusa de células
linfóide e macrófagos no interstício pulmonar,
com acúmulo peribronquiolar e perivascular
local. A glândula mamária mostrou pronunciada
hiperplasia linfóide e infiltração de células
mononucleares (CARROZZA et al., 2003).
ARAÚJO et al. (2004) fazendo um
estudo histológico de pulmões sorologicamente
positivos encontraram lesões macroscópicas e
histopatológicas características de MV nestes
animais e a imunohistoquímica de secções destes
pulmões, utilizando a IgG anti-gp 135,
demonstrou o agente viral em secções do pulmão
de animais soropositivos.
2 Métodos indiretos
2.1. Imunodifusão em Gel de Agarose (IDGA)
Recomendado pela OIE, por ser de fácil
aplicabilidade e não exigir equipamentos nem
instalações sofisticadas, o IDGA é a forma de
diagnóstico mais utilizada em todo mundo,
principalmente em programas de controle da
doença que já são empregados em vários países
(MOOJEN, 1995). Além da fácil aplicabilidade
o IDGA tem alta especificidade, o que acaba
credenciando-o para a realização dos
diagnósticos de triagem (VAREA et al., 2001).
De acordo com TIZARD (1998), os testes
de imunodifusão consistem em reações de
precipitação, realizada em gel de ágar em uma
placa de Petri ou em uma lâmina de microscópio.
Neste desenvolve-se uma linha de precipitação
visível entre os orifícios no ponto em que é
alcançada a relação ótima entre antígeno e
anticorpo.
Segundo VITU (1982), o teste de IDGA
é capaz de identificar animais experimentalmente
infectados com MVV cerca de quatro a cinco
meses após a infecção, e afirma ainda que este
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teste mostrou-se mais sensível que o teste de
fixação do complemento, sendo que quando
comparado com ELISA mostrou resultados
correlacionados, apesar de quando o teste
utilizado é o ELISA a infecção pode ser
identificada de forma mais precoce (sete semanas
pós período de incubação). Este fato foi
confirmado por LARSEN et al. (1982), que
avaliando ovinos infectados experimentalmente
observaram que a presença de anticorpos
precipitantes, podiam ser detectados de forma
mais precoce e com maior intensidade que a
fixação do complemento. O teste IDGA também
pode ser utilizado para a detecção de anticorpos
anti-MVV tanto no soro sanguíneo quanto no
colostro de animais infectados (ALKAN & TAN,
1998).
2.2. Reação de imunofluorescência Indireta (IFA)
As reações de imunofluorescência
indireta possibilitam a visualização da interação
antígeno/anticorpo, através de uma antiimunoglobulina marcada com fluorocromos.
Estas substâncias são capazes de absorver energia
luminosa tornando-se excitadas por um curto
espaço de tempo, e para retornarem ao seu estado
normal tais substâncias passam a liberar energia
na forma de fluorescência. Os fluorocromos mais
comuns são os do grupo da rodamina e
isotiocianato de fluoresceína (SCHADE, 1995).
São poucos os trabalhos empregando IFA
no diagnóstico do MVV. No Brasil, REISCHAK
(2000) desenvolveu IFA utilizando três vírus
brasileiros de caprinos e um de ovino e comparou
com o teste do IDGA usando antígeno do MVV,
verificou que a IFA detectou mais animais
soropositivos do que o IDGA, sendo que foram
observados resultados diferentes de acordo com
as cepas virais e os tipos celulares empregados.
2.3. ELISA
Devido à técnica do ELISA ter alto nível
de sensibilidade, reprodutibilidade e permitir
automação, tornou-se o método de eleição para
exame de um grande número de amostras.
Existem vários tipos de ELISA, como o direto,
indireto, duplo sanduíche direto.
Dentre outras vantagens do ELISA, estão
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a estabilidade e o pequeno volume de reagentes,
resultados de natureza quantitativa, possibilidade
de rápida execução diagnóstica, baixo nível de
risco biológico, também pode ser usada em
estudos epidemiológicos (TIZARD,1998).
Segundo KNOWLES (1997) diversos
teste de ELISA foram desenvolvidos para a
detecção de anticorpos para lentivirus de
pequenos ruminantes onde são empregados tanto
antígenos nativos como recombinantes.
HOUWERS et al. (1982) desenvolveram
ELISA para detecção de anticorpos para MVV
de fixação com um antígeno parcialmente
purificado, compararam com o IDGA e o teste
de fixação de complemento (FC) e verificaram
que todas as amostras positivas no IDGA, FC ou
ambas também foram positivas pelo ELISA. Em
adição, o ELISA detectou mais 11,5% de
soropositivos.
Na década passada, o uso de proteínas
recombinantes e/ou peptídeos sintéticos em
diferentes ELISAs aumentaram o diagnóstico
sorológico da infecção. Um ELISA desenvolvido
recentemente é baseado na proteína recombinante
de MVV do capsídeo (p25) e uma proteína
transmembranária sintética (TM) (De MARTINI
et al, 1999).
FEVEREIRO
et
al.
(1999)
desenvolveram ELISA com anticorpos
monoclonais (ELISA blocking) que comparado
ao ELISA indireto comercial, provou que o
ELISA blocking foi especifico, sensível e
apresentou alta reprodutividade e baixa
variabilidade.
PINHEIRO (2001) desenvolveu ELISA
indireto para diagnóstico da artrite encefalite
caprina com antígeno completo e DANTAS
(2004) ELISA para diagnóstico de Maedi-Visna
também com antígeno completo e ambos
encontraram resultados superiores ao IDGA com
relação a sensibilidade do teste, detectando maior
número de animais soropositivos para as
respectivas doenças.
Um largo número de ELISAs indiretos
baseados em antígenos recombinante ou
peptídeos têm sido descritos. Os antígenos
usados incluem gag recombinante p55, p25, p16,
proteína central p14, proteína transmenbranar gp
46 ou proteína purificada gp 135. Peptídeos
sintéticos derivados de p25 ou transmembranar
também tem sido usado. A sensibilidade desses
métodos variam consideravelmente entre < 40%
a 100%, enquanto a especificidade varia de 80%
a 100% (ANDRÉS et al., 2005).
2.4. Dot-Blot (DB)
O DB pode ser usado como método
qualitativo para um grande número de amostras
classificando-as em positivo e negativo ou como
uma técnica quantitativa para determinação da
concentração de antígeno (PINHEIRO, 2001).
O DB vem sendo utilizado no estudo e
diagnóstico de enfermidades tanto humanas
como animais em diferentes áreas, como
parasitologia, bacteriologia e virologia. Na
virologia desenvolveu-se DB para dengue
(BRANCH & LEVETT, 1999), sarampo (VAZ
DE LIMA et al., 1994), varicela (LEONARDI
et al., 1990), caxumba (LEONARDI et al., 1990),
newcastle (ROY & VENUGOPALAN, 1999),
raiva ( JAYAKUMAR et al., 1996), língua azul
(AFSHAR et al., 1992) e artrite encefalite caprina
(PINHEIRO, 2001 e OZYORUK et al., 2001).
2.5. Western-Blot (WB)
WB ou imunoblot não é usado como teste
de eleição porque é laborioso e demorado.
Entretanto, é utilizado frequentemente como
teste padrão para o diagnóstico de MVV
(TORFASON et al., 1992).
De MARTINI et al. (1999) mostraram
que WB detectou anticorpos em 31 soros de 33
ovinos infectados (94%) e de 0/5 (0%) de
negativos. Em outros estudos, a sensibilidade
do teste de WB comparada com o IDGA foi
76,9% e 75,4%, respectivamente (HECKERT et
al., 1992; BRODIE et al., 1992). Mostrando que
o WB é mais sensível do que o teste de IDGA.
Outros pesquisadores mostraram que WB é
igualmente sensível ou mais sensível do que
ELISA (BRODIE et al., 1992; HOUWERS &
NAUTA, 1989). Porém como a técnica é
demorada e laboriosa, vem sendo usada para
lentivirus de pequenos ruminantes somente para
esclarecer resultados divergentes e no estudo da
composição das proteínas virais dos LVPR
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(PINHEIRO, 2001).
CONSIDERAÇÕES FINAIS
A principal forma de detecção de animais
infectados pelo MV é o uso de testes sorológicos
como IDGA, que devido sua alta especificidade
e praticidade é o teste indicado pela OIE para o
diagnóstico da MV. Entretanto, possui um valor
limitado na identificação de animais em fase
inicial da infecção, constituindo um grande
problema quando na aquisição de animais. Assim
o diagnóstico precoce, técnicas moleculares de
detecção viral são mais indicadas, dentre elas a
PCR, que detecta a presença do material genético
do agente causador da doença, não necessitando
de nenhuma resposta do organismo.
Considerando o exposto a associação de testes
sorológicos e moleculares, provém um
diagnóstico confiável e precoce.
AGRADECIMENTOS
A Fundação Cearense de apoio ao Desenvolvimento
Científico e Tecnológico (FUNCAP) pelo apoio financeiro
em forma de bolsa de estudos.
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Recebido em: 06.10.2005
Aceito em: 10.12.2005
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