Departamento de Bioquímica
Instituto de Química - USP
EXERCÍCIOS
BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL
QBQ 0316
2011
Professores
Carlos T. Hotta
Fabio Luis Forti
Ohara Augusto
Ricardo J. Giordano
1
1. Para obter um emprego de bioquímico, solicita-se que você assista a um vídeo que
mostra um colega purificando a citrato sintase a partir de coração de boi. Em
determinados passos do protocolo (descrito abaixo) o entrevistador para o vídeo e lhe
coloca questões. Responda as questões formuladas (em itálico).
a) Vinte quilos de coração bovino são retirados de um matadouro e transportados ao
laboratório em gelo. O bioquímico começa a processar os corações e realiza todas as
etapas numa câmara fria (~5 oC) ou sob gelo. O tecido cardíaco é picado, suspenso em
uma solução de sacarose 0,2 M tamponada a pH 7,2 e homogeneizado com um
homogeneizador de alta velocidade. Porque foi utilizado tecido cardíaco e em grande
quantidade para purificar a citrato sintase? Qual o propósito de manter o tecido frio e
suspendê-lo em sacarose 0,2 M a pH 7,2? O que ocorre com o tecido quando é
homogenizado?
b) O homogenato do tecido, que é denso e opaco, é submetido a uma série de etapas de
centrifugação diferencial. O que se consegue com esse procedimento?
c) A purificação continua com a fração que contém principalmente mitocôndrias
intactas. Essas são então lisadas osmóticamente. O lisado que é menos denso que o
homogenado, mais ainda opaco, consiste principalmente de membranas mitocôndriais e
conteúdo mitocôndrial interno. Ao lisado, adiciona-se sulfato de amônio até uma
concentração específica. A solução é centrifugada, o precipitado descartado e o
sobrenadante recolhido. A este, que é mais claro que o lisado, adiciona-se mais sulfato
de amônio. Nova centrifugação é realizada, mas desta vez, o precipitado é recolhido
porque contém a proteína de interesse. Qual a razão para se adicionar o sal em duas
etapas?
d) O precipitado de sulfato de amônio é solubilizado e dialisado contra grandes volumes
de uma solução tamponada a pH 7,2. Por que o sulfato de amônio não é incluído no
tampão de diálise? Por que se utiliza uma solução tamponada em vez de água?
e) A solução dialisada é aplicada em uma coluna de cromatografia por exclusão. A
eluição das proteínas da coluna é acompanhada por medidas de absorção de luz das
frações a 280 nm. A primeira fração protêica que sai da coluna é recolhida e todas as
outras frações são descartadas. O que a coleta da primeira fração nos diz sobre a
2
proteína de interesse? Por que a absorção de luz a 280 nm é uma boa maneira de se
monitorar a presença de proteínas nas frações eluídas?
f) A fração coletada em e) é então aplicada numa coluna cromatográfica de troca
catiônica. Após desprezar a solução inicial que deixa a coluna, o bioquímico adiciona
uma solução de pH mais alto à coluna e colhe a fração protéica que é imediatamente
eluída. Qual a razão para o bioquímico fazer isso?
2. O ácido dinitrosalicílico (DNS) pode ser usado para medir a quantidade de açucares
redutores em amostras, pois a reação deste com o grupo aldeído livre presente no
carbono 1 das aldoses, ou com o grupo cetônico presente em frutoses, libera um produto
que absorve luz a 540 nm. Alunos de um curso de bioquímica experimental, usando
uma solução 5 mM de glicose, montaram a seguinte curva padrão e obtiveram os
seguintes resultados após ferver as amostras por 10 min.
Glicose
L
0
Água
L
500
reagente DNS
L
500
Massa de glicose
(g)
Abs
540 nm
0,005
50
450
500
0,120
100
400
500
0,240
150
350
500
0,360
200
300
500
0,480
250
250
500
0,600
300
200
500
0,720
350
150
500
0,840
400
100
500
0,960
450
50
500
1,080
500
0
500
1,200
O reagente da Glicose Oxidase (TGO) pode ser usado para medir especificamente a
quantidade de glicose presente em uma amostra. A glicose oxidase, ao oxidar glicose,
reduz um grupo NAD+ para NADH. Essa reação pode ser acoplada à oxidação de um
grupo como a o-dianisidina, a qual ao ser oxidada passa a absorver luz a 420nm. Foi
montada uma curva padrão com uma solução de glicose 0,5 mM e, após incubar a
amostra por 1 hora a 37°C para ocorrer a reação foram obtidos os seguintes resultados
3
Glicose
L
0
Água
L
500
reagente TGO
L
500
Massa de glicose
(g)
Abs
420 nm
0,020
50
450
500
0,100
100
400
500
0,200
150
350
500
0,300
200
300
500
0,400
250
250
500
0,500
300
200
500
0,600
350
150
500
0,700
400
100
500
0,800
450
50
500
0,900
500
0
500
1,000
O reagente Fenol-Sulfúrico (FS) pode ser usado para medir a quantidade de açucares
presentes em uma amostra, pois após a hidrólise pelo ácido sulfúrico e a reação do fenol
com os grupos hidroxila é gerado um produto que absorve a 490 nm. Foi montada a
curva padrão abaixo com uma solução de glicose 1 mM e após a reação foram obtidos
os dados abaixo
Glicose
L
0
Água
L
400
reagente FS
L
400
Massa de glicose
(g)
Abs
490 nm
0,001
10
390
400
0,056
20
380
400
0,087
50
350
400
0,207
100
300
400
0,380
150
250
400
0,577
200
200
400
0,765
250
150
400
0,979
300
100
400
1,180
400
0
400
1,514
4
Uma série de homogeneizados do caule de diferentes linhagens de cana de açúcar foi
testada para saber qual das linhagens possui a maior quantidade de açucares solúveis, o
que é de grande interesse para a indústria açucareira. Uma certa massa de tecido foi
homogenizada em água e este material foi centrifugado por 10 min a 10.000 xg a 4°C.
O sobrenadante foi diluído é usado para determinação de açucares com os métodos do
ácido dinitrosalícilico (DNS), glicose oxidase (TGO) e fenol-sulfúrico (FS). Os
resultados estão expostos na tabela abaixo.
Linhagem
Volume final
do
sobrenadante
(mL)
10
Diluição
(x)
Amostra
(L)
Abs
540nm
(DNS)
Abs
420 nm
(TGO)
Abs
490 nm
(FS)
1
Massa
de
tecido
(g)
10
100
100
0,001
0,003
0,812
2
5
10
20
100
0,005
0,001
1,525
3
7
10
30
100
0,003
0,002
1,210
4
2
10
5
100
-0,002
-0,009
0,994
5
25
10
200
100
-0,010
0,001
0,853
6
12
10
100
100
0,000
0,007
1,112
7
8
10
100
100
0,001
-0,008
1,215
8
10
10
100
100
0,003
-0,001
1,336
9
4
10
15
100
0,002
0,001
1,201
10
1
10
2
100
-0,008
0,002
1,487
Qual das técnicas é a melhor para esse teste? Como você explicaria esses resultados?
Calcule a concentração de açucares solúveis nos diferentes homogeneizados e a
quantidade de açúcar que pode ser obtida por grama de tecido vegetal. Qual das plantas
é a melhor para a produção de sacarose?
3. Uma indústria farmacêutica está interessada na produção de alfa-glicosidase de
levedura para geração de glicose e frutose a partir de açúcar da cana (sacarose). Para tal
obteve várias linhagens de levedura e necessita medir a atividade de alfa-glicosidase
presente nas células. Quais das técnicas – DNS, TGO ou FS – você usaria para medir a
atividade dessa enzima, usando sacarose como substrato
5
4. A indústria farmacêutica preparou lisados de levedura de diferentes linhagens. Em
todas as amostras usou 1g de células e obtiveram 10 mL de lisado. Esses lisados foram
utilizados para ensaios enzimáticos, empregando p-nitrofenil -glicosídeo (pNPglc)
como substrato. Foram obtidos os resultados a seguir
linhagem diluição
l
lisado
diluído
L
água
L
Abs 420 Abs 420 Abs 420 Abs 420
30 min
45 min
60 min
pNPglc 15 min
A
100x
100
100
200
0,050
0,100
0,150
0,200
B
50x
20
180
200
0,080
0,160
0,240
0,320
C
8x
50
150
200
0,250
0,500
0,750
1,000
D
70x
200
0
200
0,100
0,200
0,300
0,400
E
500x
200
0
200
0,010
0,020
0,030
0,040
F
200x
200
0
200
0,075
0,150
0,225
0,300
As mesmas amostras foram submetidas à determinação de proteínas com o reagente de
Bradford (comassie blue G), obtendo-se os dados a seguir. Confeccionou-se também
uma curva padrão usando albumina de ovo.
Dados para amostras experimentais
linhagem diluição
l
lisado
diluído
L
água
Reagente
Abs 595
Bradford
15 min
(mL)
A
20x
100
0
1
0,265
B
50x
20
80
1
0,320
C
10x
50
50
1
0,550
D
20x
80
20
1
0,105
E
5x
10
90
1
0,750
F
80x
100
0
1
0,415
6
Dados da curva padrão
Albumina
L
0,2 g/L
água
Reagente
Massa
de
de
Bradford
proteína
(mL)
Abs
595nm
0
100
1
0,010
10
90
1
0,080
20
80
1
0,160
30
70
1
0,240
40
60
1
0,320
50
50
1
0,400
60
40
1
0,480
70
30
1
0,560
80
20
1
0,640
90
10
1
0,720
100
0
1
0,800
Calcule a concentração de atividade enzimática no lisado de cada uma das linhagens de
levedura. Calcule também a atividade obtida por grama de células. Calcule a
concentração de proteína em cada um dos lisados e a atividade específica de cada um
dos materiais. Se o próprio lisado for utilizado industrialmente como fonte de enzima,
qual das linhagens é melhor para produzir essa enzima em larga escala? Se for
necessário purificar a enzima, qual das linhagens é a melhor fonte? Justifique as
respostas.
5 .– Um homogeneizado do epitélio do tubo digestivo de rato apresenta atividade da
enzima alfa-glicosidase. Para as condições de preparação deste homogeneizado obtevese uma atividade enzimática de 80 mU/ml e uma atividade específica de 80 mU/mg. A
fim de purificar esta alfa-glicosidase, 1,5 ml deste homogeneizado foram submetidos a
uma cromatografia de troca iônica em uma coluna DEAE-celulose e obteve-se o
seguinte perfil de atividade de alfa-glicosidase nos tubos coletados durante a
cromatografia:
7
abs 420nm
(linha contínua)
0,3
1
0,2
0,5
0,1
0
[NaCl]
(M)
(linha
tracejada)
0
0
5
10
15
20
tubos
Os tubos com maior atividade de alfa-glicosidase foram reunidos. Este material com
volume de 1,0 ml foi denominado “material DEAE”. Em seguida, o material DEAE foi
utilizado para determinação de atividade enzimática e concentração de proteína total.
As condições do ensaio de atividade enzimática e os resultados obtidos estão descritos
na tabela abaixo:
Substrato
(p-nitrofenil -
Tempo de
Material DEAE
incubação a 30°C
Abs 420nm
(min)
glucosídeo 4 mM)
50 microlitros
50 microlitros
5
0,1
50 microlitros
50 microlitros
10
0,19
50 microlitros
50 microlitros
15
0,32
50 microlitros
50 microlitros
20
0,4
Nas condições de ensaio de atividade de alfa-glicosidase descritas acima, a curva padrão
utilizada para cálculo da atividade enzimática tem a equação Abs = 0.0056 nmols.
As condições utilizadas para determinação da concentração de proteína total estão
descritas na tabela abaixo:
Material DEAE
(ml)
0,01 ml
Água
(ml)
0,99 ml
Reagente de
Bradford
(comassie blue G)
1 ml
0,04 ml
0,96 ml
1 ml
0,13
0,05 ml
0,95 ml
1 ml
0,15
0,1 ml
0,90 ml
1 ml
0,35
Abs 595 nm
0,052
8
A curva padrão do reagente de Bradford preparada nas mesmas condições de volume
que a tabela acima está apresentada a seguir.
y = 0,01x + 0,05
2
R =1
abs 595nm
0,2
0,1
0
0
2
4
6
8
10
12
microgramas de proteína
Utilizando estas informações e resultados determine:
1 – A atividade enzimática (mU/ml) do “material DEAE”
2 – A concentração de proteína total (mg/ml) do “material DEAE”
3 – A atividade específica do “material DEAE”
4 – A recuperação de atividade enzimática após a cromatografia de troca iônica
5 – O enriquecimento da atividade enzimática após a cromatografia de troca iônica
Obs: 1 mU (miliunidade) de atividade enzimática corresponde a quantidade de enzima
que catalisa uma reação química com a velocidade de formação de 1 nmol de
produto/minuto.
6 . As figuras a seguir apresentam o perfil de eluição da atividade de alfa-glicosidase em
uma cromatografia de troca aniônica em coluna DEAE-celulose. Cada uma das
cromatografias foi realizada utilizando um tampão com pH diferente (9,0 – 8,0 – 6,0).
Com base nos resultados responda qual a provável faixa de valores do pI (ponto
isoelétrico) desta alfa-glicosidase.
9
abs 420nm
(linha contínua)
0.3
1
0.8
0.2
0.6
0.4
0.1
0.2
0
[NaCl]
(M)
(linha
tracejada)
pH 9
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
tubos
tampão pH 9
abs 420nm
(linha contínua)
0,3
1
0,8
0,2
0,6
0,4
0,1
0,2
0
[NaCl]
(M)
(linha
tracejada)
pH 8,0
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
tubos
tampão pH 8
abs 420nm
(linha contínua)
0,3
1
pH 6,0
0,8
0,2
0,6
0,4
0,1
0,2
0
[NaCl]
(M)
(linha
tracejada)
0
0
2
4
6
8 10 12 14 16 18 20
tubos
tampão pH 6
7. Você conseguiu purificar uma celulase através da marcha de purificação a seguir.
1º passo: cromatografia de troca aniônica em pH 10.
2º passo: cromatografia de filtração em gel em pH 6,0.
Após cada passo os tubos que continham a atividade de celulase foram reunidos. Para
este material foi calculada a atividade enzimática total de celulase e também a
quantidade de proteína. A tabela abaixo resume estes resultados.
Passo
Atividade de celulase Atividade de celulase Proteína total
Proteína total
aplicada (U)
recuperada (U)
aplicada (mg)
recuperada (mg)
Troca iônica
500
100
1.0
0.05
Filtração em gel
100
80
0.05
0.02
10
Após cada cromatografia os tubos que continham atividade de celulase também foram
reunidos e analisados por SDS-PAGE.
Figura 1 – SDS-PAGE de materiais recolhidos ao longo da marcha de purificação.
M
T
F
P kDa
Início
45
31
23
14
Fim
M – meio de cultura; T – material recuperado após cromatografia de troca aniônica. F –
material recuperado após cromatografia de filtração em gel; P – padrões de peso
molecular.
Para a coluna de filtração em gel usada na marcha de purificação foi previamente
preparada uma curva de calibração utilizando proteínas de diferentes pesos moleculares.
Os dados obtidos estão descritos na tabela abaixo juntamente com o resultado para
cromatografia da celulase.
Tabela 2 – Volumes de eluição na cromatografia de filtração em gel em uma coluna
cujo, volume total é 25ml.
Material
Proteína padrão de 2.000.000 daltons
Proteína padrão de 66.000 daltons
Proteína padrão de 45.000 daltons
Proteína padrão de 12.400 daltons
Proteína padrão de 6.500 daltons
ATIVIDADE CELULÁSICA
Volume de eluição (mL)
7.53
9.38
10.46
13.70
16.22
9.58
a) Calcule a recuperação da atividade enzimática após cada um dos passos da
purificação da celulase.
b) Calcule a atividade específica da celulase após cada um dos passos da marcha de
purificação.
c) Qual dos passos é melhor na purificação desta enzima? Por quê?
11
d) Calcule a massa molecular da enzima determinada por SDS-PAGE e por filtração em
gel. Compare os valores e formule hipóteses para explicar os resultados.
8. O gráfico abaixo representa a atividade enzimática de alfa-glicosidase eluída em uma
cromatografia de troca iônica em coluna DEAE-celulose. Sabendo que o ponto
isoelétrico (pI) desta enzima é 7,0 e que esta cromatografia foi feita em tampão pH 8,
construa um esboço do gráfico esperado para cromatografias realizadas em pH 9,0 e pH
4,0. Estes esboços devem indicar o ponto de eluição da atividade enzimática em relação
ao gradiente de NaCl.
abs 420nm
(linha contínua)
0,3
1
0,8
0,2
0,6
0,4
0,1
0,2
0
[NaCl]
(M)
(linha
tracejada)
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
tubos
tampão pH 8
9. Duas proteínas A e B apresentam uma solubilidade em função do pH dada pelo
gráfico abaixo. Quando uma mistura dessas proteínas em tampão de pH 6,0 é aplicada
em uma coluna de troca aniônica, uma delas é eluída normamente, enquanto a outra só é
eluída após adição de tampão com quantidades crescentes de NaCl.
Baseado nos dados acima, diga qual proteína é eluída após adição de NaCl. Justifique
sua resposta.
10. Um bioquímico recebeu uma amostra para análise. Nela, havia diversas proteínas
que precisavam ser separadas umas das outras. Numa primeira etapa, o bioquímico
utilizou uma coluna de gel filtração recomendada para proteínas de alto peso molecular
(>60 kDa) e obteve o seguinte perfil de eluição:
12
Figura - Perfil da cromatografia de gel filtração em Superdex-200. As proteínas
separadas foram coletadas nos tubos 1, 2, 3 e 4, conforme indicado na figura. Os
volumes aproximados de eluição para cada tubo foram:
Tubo 1 = 10 ml
Tubo 2 = 11 ml
Tubo 3 = 13 ml
Tubo 4 = entre 14,5 e 15 ml
Volumes aproximados (+/- 0,5 ml)
Usando essa mesma coluna de gel filtração, nas mesmas condições da corrida anterior, o
bioquímico analisou os padrões de peso molecular, obtendo os seguintes resultados:
Padrão
Proteína padrão de 2.000 kDa
Proteína padrão de 250
kDa
Proteína padrão de 170 kDa
Proteína padrão de 65 kDa
Proteína padrão de 24 kDa
Volume total da coluna = 25 ml
Vol. Eluição (ml)
7.53
9.38
10.46
13.70
16.22
Os tubos marcados de 1 a 4 foram então analisados por SDS-PAGE em condições
redutoras e não redutoras, sendo obtido o seguinte perfil:
Figura - Eletroforese de SDS-PAGE em condições redutoras (c/-mercaptoetanol) e
não redutoras das proteínas contidas nos tubos 1, 2, 3 e 4. No último poço, encontram-se
os padrões de pesos moleculares.
13
Após analisar os dados, o bioquímico então decidiu submeter a amostra do tubo 4 a uma
cromatografia de troca de ânions (-) em pH 7, seguida de eletroforese SDS-PAGE das
frações obtidas. Os resultados da cromatografia e da eletroforese estão na figura abaixo:
Figura - Cromatografia de troca de ânions das proteínas no tubo 4 e eletroforese das
proteínas presentes nos tubos 4A e 4B.
O bioquímico deu-se então por satisfeito e escreveu o seu relatório final.
a) Quantas proteínas estavam presentes na amostra?
b) Qual o peso molecular de cada uma delas? Quais continham mais de uma subunidade e qual o peso molecular de cada cadeia proteica?
c) Qual o pI aproximado de cada proteína do tubo 4 (maior, menor ou próximo de 7)?
11. Para uma alfa-glicosidase foram determinadas as velocidades de hidrólise de
diferentes concentrações de substrato (NpaGlc) na presença de diferentes concentrações
de um inibidor. Estes dados estão apresentados na tabela abaixo. Baseando-se nesta
tabela determine o Vmax e o Km para a hidrólise do substrato e o Ki para este inibidor.
[S] (mM)
[I] (mM)
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.75
1
1.5
2
2.5
4
6
0
0.91
1.67
2.31
2.86
3.33
4.29
5.00
6.00
6.67
7.14
8.00
8.57
V (nmol/min)
2
4
0.48
0.32
0.91
0.63
1.30
0.91
1.67
1.18
2.00
1.43
2.73
2.00
3.33
2.50
4.29
3.33
5.00
4.00
5.56
4.55
6.67
5.71
7.50
6.67
6
0.24
0.48
0.70
0.91
1.11
1.58
2.00
2.73
3.33
3.85
5.00
6.00
8
0.20
0.38
0.57
0.74
0.91
1.30
1.67
2.31
2.86
3.33
4.44
5.45
14
8
10
8.89
9.09
8.00
8.33
7.27
7.69
6.67
7.14
6.15
6.67
12. Tecido embrionário de fígado contém uma enzima que catalisa a reação S
P.
Tecido de fígado adulto também apresenta a atividade S
P. Alguns dados
cinéticos obtidos com extratos dos dois tecidos são apresentados abaixo. Que
conclusões você pode tirar com relação a identidade das duas enzimas?
[S]
[M]
1,67 x 10-5
2,5 x 10-5
3,33 x 10-5
5,0 x 10-5
7,0 x 10-5
1,0 x 10-4
1,5 x 10-4
1,67 x 10-4
2,0 x 10-4
3,0 x 10-4
Velocidade Inicial Observada
(-moles x mg de proteína-1 x min-1)
Extrato de Fígado
Extrato de Fígado
Adulto (E1)
Embrionário (E2)
1,05
5,00
1,54
6,66
1,98
8,00
2,86
10,00
3,78
11,67
5,00
13,33
6,67
15,0
7,15
15,4
8,00
16,0
10,00
17,1
13. Durante danos consideráveis do fígado, uma enzima (E1 do Probl. 1) é liberada na
corrente sanguínea. Após exercícios intensos, uma enzima de músculo, E3, que catalisa
a mesma reação, é liberado na corrente sanguínea. E1 E3 podem ser diferenciadas
facilmente porque apresentam diferentes valores de Km (A Km da enzima de músculo é 2
x 10-5 M.) Uma determinação com uma amostra de sangue de um paciente apresentou os
resultados dados na tabela abaixo. O paciente sofre de uma doença do fígado, ou
simplesmente tem se exercitado violentamente? (O paciente chegou inconsciente no
hospital, de modo que você não pode fazer a ele nenhuma pergunta).
[S] (M)
v (moles x ml de soro-1 x min-1)
5 x 10-5
7 x 10-5
1 x 10-4
1,5 x 10-4
2 x 10-4
3 x 10-4
6 x 10-4
43
57
75
100
120
150
200
15
14. Os dados cinéticos abaixo foram obtidos para diferentes inibidores de uma enzima.
Determine a natureza de cada inibidor e calcule o Ki.
Velocidade Inicial (nmoles/min)
[S] (mM) (Controle) +I a 6M +X a 30M +Y a 4mM +Z a 0,2mM
0,200
16,67
6,25
5,56
10,00
8,89
0,250
20,00
7,69
6,67
11,11
10,81
0,333
24,98
10,00
8,33
12,50
13,78
0,500
33,33
14,29
11,11
14,29
19,05
1,00
50,00
25,00
16,67
16,67
30,77
2,00
66,67
40,00
22,22
18,18
44,44
2,50
71,40
45,45
23,81
18,52
48,78
3,33
76,92
52,63
25,64
18,87
54,04
4,00
80,00
57,14
26,67
19,00
57,14
5,00
83,33
62,50
27,77
19,23
60,60
15. Um nonapeptideo foi submetido a uma série de experimentos a fim de determinar
sua estrutura primária. Inicialmente o peptídeo foi incubado com dinitrofluorobenzeno
(DNF) e a seguir submetido a uma hidrólise ácida (HCl 6N – 110ºC – 3h). Os produtos
deste procedimento foram analisados em cromatografia de camada delgada revelando o
resultado abaixo:
Peptídeo Phe
Ala
Asp
Posteriormente o nonapeptídeo foi hidrolisado na presença de quimotripsina. Os
produtos desta reação foram separados e submetidos à degradação de Edman,
obtendo-se o resultado abaixo:
Produto 1: Ala – Arg – Pro – Glu
Produto 2: Ala – Gly – Phe
Produto 3: Ala – Phe
16
Por fim, o oligopeptideo foi hidrolisado na presença de tripsina, os produtos
foram separados e submetidos à degradação de Edman. O resultado obtido foi:
Produto 1: Ala – Phe – Ala – Gly – Phe – Ala – Arg
Produto 2: Pro – Glu
Qual a estrutura primária deste oligopeptideo?
Dados: Quimotripsina catalisa a hidrólise de ligações peptídicas após Phe.
Tripsina catalisa a hidrólise de ligações peptídicas após Arg.
16. Uma mistura dos seguintes peptídeos: lisil-lisina e leucil-leucil-leucina foi
submetida a uma corrida cromatográfica em papel no sistema de solvente composto por:
butanol: ácido acético; água (4:1:1). Qual o peptídeo que apresenta maior Rf e por que?
17. Um estudante executou o seguinte protocolo:
1. Pesar 10 mg de um dipeptídeo, 1mg de fenilalanina, 1 mg de ácido aspártico e 1 mg
de glicina
2. Colocá-los em tubos separados com tampa de rosca e seguir os passos abaixo para
cada um destes tubos.
3. Adicionar ao tubo 0,75 mL de bicarbonato de sódio.
4. Adicionar ao tubo 0,5 mL de DNF (dinitrofluorobenzeno) preparado em etanol.
5. Fechar o tubo.
6. Transferir o tubo para um banho a 30oC.
7. Incubar o tubo por 3h.
8. Retirar o tubo após esse período.
9. Resfriar o tubo.
10. Acidificar o meio com duas gotas de ácido clorídrico 6M.
11. Transferir o tubo para um concentrador a vácuo
12. Incubar o tubo por 15 min para secar o etanol.
13. Retirar o tubo após esse período.
14. Adicionar ao tubo 1 mL de ácido clorídrico 6M.
15. Transferir o tubo para um bloco térmico (115° C).
16. Incubar o tubo por 3h.
17. Retirar o tubo após esse período.
18. Resfriar o tubo em temperatura ambiente.
19. Retirar 20 μL e transferir para um tubo de ensaio.
20. Transferir o tubo de ensaio para um concentrador a vácuo.
21. Aguardar a amostra secar completamente.
22. Retirar o tubo após esse período.
23. Resfriar o tubo.
24. Adicionar 20 μL de etanol ao tubo.
Em seguida 2 μl do material correspondente ao passo 24 para cada uma das amostras
iniciais (dipeptídeo, fenilalanina, glicina e ácido aspártico) foram submetidos à
separação em cromatografia de camada delgada utilizando a fase móvel ClorofórmioMetanol-Ácido acético 95-4-1. Foi obtido o resultado abaixo.
17
Responda:
a) O protocolo acima foi realizado com o objetivo de obter qual informação a respeito
do dipeptídeo?
Considerando que estudante deixou de anotar a identificação das amostras 2, 3 e 4 e
sabe apenas que a amostra 1 corresponde ao dipeptídeo.
b) identifique o material (tipo de aminoácido) presente nas amostras 2, 3 e 4. Justifique
sua resposta.
c) identifique as “manchas” indicadas com as setas no material 1. Justifique sua
resposta.
d) Caso os passos 14 a 22 fossem omitidos do protocolo acima, qual das bandas
(manchas) do material 1 teria uma migração diferente? Justifique a resposta.
e) Caso os aminoácidos fenilanalina, ácido aspártico e glicina fossem dissolvidos em
etanol e diretamente submetidos à separação em cromatografia de camada delgada em
placa de sílica sem passarem pelas etapas do protocolo acima, qual das fases móveis
sugeridas abaixo seria a mais indicada. Justifique sua resposta. Clorofórmio-MetanolÁcido acético (95-4-1) Clorofórmio-Metanol-Acido acético (60-30-10) ClorofórmioMetanol (97-3)
18