1
UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
FACULDADE DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA VETERINÁRIA
(CLÍNICA E REPRODUÇÃO ANIMAL)
PEDRO BITTENCOURT VELHO
DETECÇÃO MOLECULAR DE ORGANISMOS DA FAMÍLIA
Anaplasmataceae EM BOVINOS E OVINOS NO MUNICÍPIO DE
CACHOEIRAS DE MACACU E CARACTERIZAÇÃO GENOTÍPICA DE
GENES CODIFICANTES PARA PROTEÍNAS DE MEMBRANA DE
Anaplasma marginale DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO.
NITERÓI
2013
PEDRO BITTENCOURT VELHO
DETECÇÃO MOLECULAR DE ORGANISMOS DA FAMÍLIA
Anaplasmataceae EM BOVINOS E OVINOS NO MUNICÍPIO DE CACHOEIRAS
DE MACACU E CARACTERIZAÇÃO GENOTÍPICA DE GENES CODIFICANTES
PARA PROTEÍNAS DE MEMBRANA DE Anaplasma marginale DO ESTADO DO
RIO DE JANEIRO.
Tese apresentada ao Programa de PósGraduação em Medicina Veterinária Clínica
e
Reprodução
animal
da
Universidade Federal Fluminense, como
requisito parcial para a obtenção do Grau
de Doutor.
Orientadora: Prof.ª Dr.ª NÁDIA REGINA PEREIRA ALMOSNY
Niterói
2013
PEDRO BITTENCOURT VELHO
DETECÇÃO MOLECULAR DE ORGANISMOS DA FAMÍLIA
Anaplasmataceae EM BOVINOS E OVINOS NO MUNICÍPIO DE CACHOEIRAS
DE MACACU E CARACTERIZAÇÃO GENOTÍPICA DE GENES CODIFICANTES
PARA PROTEÍNAS DE MEMBRANA DE Anaplasma marginale DO ESTADO DO
RIO DE JANEIRO.
Tese apresentada ao Programa de PósGraduação em Medicina Veterinária Clínica
e
Reprodução
animal
da
Universidade Federal Fluminense, como
requisito parcial para a obtenção do Grau
de Doutor.
Março 2013
BANCA EXAMINADORA
___________________________________________________________________
Prof.ª Dr.ª Nádia Regina Pereira Almosny
Universidade Federal Fluminense
___________________________________________________________________
Prof. Dr. Huarrisson Azevedo Santos
Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro
___________________________________________________________________
Prof. Dr. Carlos Luiz Massard
Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro
___________________________________________________________________
Prof. Dr. Avelino José Bittencourt
Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro
___________________________________________________________________
Prof.ª Dr.ª Helena Keiko Toma
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Niterói
2013
AGRADECIMENTOS
À Ananda Müller, por estar comigo em todos os momentos, bons ou ruins.
Você é a principal razão de tudo isso.
À minha mãe, meu pai, meus irmãos, avós, tios e primos, e a toda minha
família, por todo o apoio e pelo amor e carinho que nunca faltaram em minha vida.
Incluo aqui, as pessoas que provam que uma família não pode ser definida apenas
por laços genéticos. César X. de B. S. Lima, Valeska Figueiredo, Ada S. Lima, Dona
Marly, Bárbara Müller, agradeço à todos vocês por serem parte da minha vida.
À
minha
orientadora,
Nádia
Almosny
pelo
exemplo
de
dedicação
competência.
Ao Huarrisson Azevedo Santos e à toda a equipe do Laboratório de
Hemoparasitos e Vetores
da UFRRJ, que me receberam de braços abertos e
tornaram possível a realização deste trabalho.
A todos os professores que participaram da minha formação profissional e
que tenho como exemplo todos os dias.
À coordenação do Programa de Pós-Graduação.
À Universidade Federal Fluminense, por ser, há doze anos, minha casa.
À todos meus amigos, pois sem vocês nada disso tem sentido.
À Coordenação de Aperfeiçoamento Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela
bolsa de estudos concedida.
“I don't know anything, but I do know that
everything is interesting
if you go into it deeply enough.”
Richard Feynman
SUMÁRIO
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
8
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
12
1 INTRODUÇÃO
16
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
18
2.1 FAMÍLIA Anaplasmataceae
18
2.2 Anaplasma marginale
19
2.2.1 EPIDEMIOLOGIA
20
2.2.2 MEDIDAS DE CONTROLE
20
2.2.3 ASPECTOS IMUNOLÓGICOS DA INFECÇÃO POR A. MARGINALE
22
2.2.4 ASPECTOS GERAIS DO GENOMA DE A. MARGINALE
25
2.2.5 PROTEÍNAS PRINCIPAIS DE SUPERFÍCIE (MSPS)
27
2.2.5.1 MSP 1
28
2.2.5.2 MSP 2
29
2.2.6 PROTEÍNAS EXTERNAS DE MEMBRANA (OMPS)
2.3 Anaplasma phagocytophilum
33
37
2.3.1 TRANSMISSÃO
39
2.3.2 INFECÇÃO
39
2.3.3 PATOGENIA
39
2.3.4 IMUNOSSUPRESSÃO
41
2.3.5 IMUNIDADE ADQUIRIDA
42
2.3.6 DIVERSIDADE ANTIGÊNICA
43
2.3.7 IMPORTÂNCIA ECONÔMICA
44
2.3.8 INFECÇÕES EM HUMANOS
45
2.4 Neorickettsia risticii
46
2.5 Anaplasma ovis
48
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 DETECÇÃO MOLECULAR DE ORGANISMOS DA FAMÍLIA
Anaplasmataceae EM BOVINOS E OVINOS NO MUNICÍPIO DE
CACHOEIRAS DE MACACU
3.1.1 ANIMAIS
51
51
51
3.1.2 CACHOEIRAS DE MACACU
51
3.1.3 COLETA DAS AMOSTRAS
52
3.1.4. HEMOGRAMAS E PESQUISA DE HEMOPARASITAS
53
3.1.5 BIOQUÍMICA SÉRICA
53
3.1.6 EXTRAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DO DNA GENÔMICO
54
3.1.7 PCR EM TEMPO REAL
54
3.1.7.1 PROTOCOLO I (Anaplasma phagocytophilum)
54
3.1.7.2 PROTOCOLO II (Neorickettsia risticii)
55
3.1.8 PCR
56
3.1.8.1 REAÇÕES DE PCR PARA Anaplasma marginale
56
3.1.8.2 REAÇÕES DE PCR PARA Anaplasma ovis
56
3.1.8.3 REAÇÕES DE PCR PARA FAMILIA ANAPLASMATACEAE
57
3.1.9 CLONAGEM E SEQUENCIAMENTO
3.2 CARACTERIZAÇÃO GENOTÍPICA DE GENES CODIFICANTES
PARA PROTEÍNAS DE MEMBRANA DE Anaplasma marginale DO
ESTADO DO RIO DE JANEIRO.
3.2.1 MESORREGIÕES E MUNICIPIOS ESTUDADOS
58
59
59
3.2.2 SELEÇÃO DAS AMOSTRAS
61
3.2.3 PCR PARA GENES CODIFICANTES DE PROTEÍNAS DE MEMBRANA
EXTERNA DE Anaplasma marginale
3.2.4 VISUALIZAÇÃO DOS PRODUTOS DE AMPLIFICAÇÃO
61
3.2.5 SEQUENCIAMENTO DOS PRODUTOS DE PCR
63
3.2.6 ANÁLISE DAS SEQUÊNCIAS
64
3.2.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA
65
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 DETECÇÃO MOLECULAR DE ORGANISMOS DA FAMÍLIA
Anaplasmataceae EM BOVINOS E OVINOS
4.1.2 BOVINOS
4.2.2 OVINOS
4.2 CARACTERIZAÇÃO GENOTÍPICA DE GENES CODIFICANTES
63
66
66
66
70
77
PARA PROTEÍNAS DE MEMBRANA DE Anaplasma marginale DO
ESTADO DO RIO DE JANEIRO.
5 CONCLUSÕES
89
6 OBRAS CITADAS
90
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
1 LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1
Mapa da localização geográfica do município de Cachoeiras de 52
Macacu (em vermelho) no estado do Rio de Janeiro.
FIGURA 2
Mapa ilustrativo das mesorregiões do estado do Rio de Janeiro.
60
FIGURA 3
Mapa da localização dos municípios utilizados no presente 60
estudo.
FIGURA 4
Fotografia de gel de agarose à 2% dos amplicons purificados da 64
PCR para genes de proteínas de membrana externa de A.
marginale, corado com Brometo de Etídio. Nas colunas: 1 e 20
está o Low DNA Mass Ladder; 2 a 6 – Omp 1; 7 a 11 – Omp 5; 12
a 16 Am 097; 17 a 19, 21 e 22 – Am 254; 23 a 27 – Am 956; 28 a
32 – SodB.
FIGURA 5
Árvore filogenética construída através software MEGA versao 5.1 79
(TAMURA et al., 2011) pelo metodo de Neighbor-Joining com
valores de bootstrap para 1000 réplicas obtida atraves da análise
das sequências preditivas de aminoácidos da proteína OMP1 dos
isolados de A. marginale.
FIGURA 6
Árvore filogenética construída através software MEGA versao 5.1 80
(TAMURA et al., 2011) pelo metodo de Neighbor-Joining com
valores de bootstrap para 1000 réplicas obtida atraves da análise
das sequências preditivas de aminoácidos da proteína OMP4 dos
isolados de A. marginale.
FIGURA 7
Árvore filogenética construída através software MEGA versao 5.1 81
(TAMURA et al., 2011) pelo metodo de Neighbor-Joining com
valores de bootstrap para 1000 réplicas obtida atraves da análise
das sequências preditivas de aminoácidos da proteína SODb dos
isolados de A. marginale.
FIGURA 8
Árvore filogenética construída através software MEGA versao 5.1 82
(TAMURA et al., 2011) pelo metodo de Neighbor-Joining com
valores de bootstrap para 1000 réplicas obtida atraves da análise
das sequências preditivas de aminoácidos da proteína PepA dos
isolados de A. marginale.
FIGURA 9
Árvore filogenética construída através software MEGA versao 5.1 83
(TAMURA et al., 2011) pelo metodo de Neighbor-Joining com
valores de bootstrap para 1000 réplicas obtida atraves da análise
das sequências preditivas de aminoácidos da proteína OMP5 dos
isolados de A. marginale.
FIGURA 10 Árvore filogenética construída através software MEGA versao 5.1 84
(TAMURA et al., 2011) pelo metodo de Neighbor-Joining com
valores de bootstrap para 1000 réplicas obtida atraves da análise
das sequências preditivas de aminoácidos da proteína OMP7 dos
isolados de A. marginale.
FIGURA 11 Árvore filogenética construída através software MEGA versao 5.1 85
(TAMURA et al., 2011) pelo metodo de Neighbor-Joining com
valores de bootstrap para 1000 réplicas obtida atraves da análise
das sequências preditivas de aminoácidos da proteína EF-Tu dos
isolados de A. marginale.
FIGURA 12 Árvore filogenética construída através software MEGA versao 5.1 86
(TAMURA et al., 2011) pelo metodo de Neighbor-Joining com
valores de bootstrap para 1000 réplicas obtida atraves da análise
das sequências preditivas de aminoácidos da proteína VirB9-1
dos isolados de A. marginale.
2 LISTA DE TABELAS
TABELA 1
Frequência de cães positivos na PCR para Anaplasma
marginale, em função das alterações laboratoriais observadas.
67
TABELA 2
Valores dos exames hematológicos e bioquímicos dos ovinos
positivos para Anaplasma phagocytophilum.
73
TABELA 3
Frequência de ovinos positivos na PCR em tempo real para
Anaplasma phagocytophilum, em função das alterações
laboratoriais observadas.
74
TABELA 4
Valores médios de “p-distance” para as sequências preditivas
de aminoácidos de proteínas de membrana externa de
Anaplasma marginale.
78
TABELA 5
Matriz representativa do número total de diferenças de
aminoácidos (abaixo da diagonal) e das diferenças de
aminoácidos por sítio (acima da diagonal) entre as sequências
preditivas de aminoácidos da proteína OMP1 de diferentes
isolados de Anaplasma marginale. As sequências analisadas
possuíam um total de 292 aminoácidos.
79
TABELA 6
Matriz representativa do número total de diferenças de
aminoácidos (abaixo da diagonal) e das diferenças de
aminoácidos por sítio (acima da diagonal) entre as sequências
preditivas de aminoácidos da proteína OMP4 de diferentes
isolados de Anaplasma marginale. As sequências analisadas
possuíam um total de 360 aminoácidos.
80
TABELA 7
Matriz representativa do número total de diferenças de
aminoácidos (abaixo da diagonal) e das diferenças de
aminoácidos por sítio (acima da diagonal) entre as sequências
preditivas de aminoácidos da proteína SODb de diferentes
isolados de Anaplasma marginale. As sequências analisadas
possuíam um total de 185 aminoácidos.
81
TABELA 8
Matriz representativa do número total de diferenças de
aminoácidos (abaixo da diagonal) e das diferenças de
aminoácidos por sítio (acima da diagonal) entre as sequências
preditivas de aminoácidos da proteína PepA de diferentes
isolados de Anaplasma marginale. As sequências analisadas
possuíam um total de 448 aminoácidos.
82
TABELA 9
Matriz representativa do número total de diferenças de
aminoácidos (abaixo da diagonal) e das diferenças de
aminoácidos por sítio (acima da diagonal) entre as sequências
preditivas de aminoácidos da proteína OMP5 de diferentes
isolados de Anaplasma marginale. As sequências analisadas
possuíam um total de 323 aminoácidos.
83
TABELA 10
Matriz representativa do número total de diferenças de
aminoácidos (abaixo da diagonal) e das diferenças de
aminoácidos por sítio (acima da diagonal) entre as sequências
preditivas de aminoácidos da proteína OMP7 de diferentes
isolados de Anaplasma marginale. As sequências analisadas
possuíam um total de 324 aminoácidos.
84
TABELA 11
Matriz representativa do número total de diferenças de
aminoácidos (abaixo da diagonal) e das diferenças de
aminoácidos por sítio (acima da diagonal) entre as sequências
preditivas de aminoácidos da proteína EF-Tu de diferentes
isolados de Anaplasma marginale. As sequências analisadas
possuíam um total de 312 aminoácidos.
85
TABELA 12
Matriz representativa do número total de diferenças de
aminoácidos (abaixo da diagonal) e das diferenças de
aminoácidos por sítio (acima da diagonal) entre as sequências
preditivas de aminoácidos da proteína VirB9-1 de diferentes
isolados de Anaplasma marginale. As sequências analisadas
possuíam um total de 231 aminoácidos.
87
3 LISTA DE QUADROS
QUADRO 1
Intervalo de referência para parâmetros hematológicos de
bovinos e ovinos.
53
QUADRO 2
Intervalo de referência para parâmetros bioquímicos de bovinos
e ovinos.
54
QUADRO 3
Iniciadores utilizados na amplificação de um fragmento de 122
pares de bases do gene msp2 de A. phagocytophilum.
55
QUADRO 4
Iniciadores utilizados na amplificação de fragmento de 85 pares
de bases do gene 16S rRNA de Neorickettsia risticii
56
QUADRO 5
Iniciadores utilizados na amplificação de fragmento de 345
pares de base do gene msp5 de Anaplasma marginale
56
QUADRO 6
Iniciadores utilizados na amplificação de fragmento de 346
pares de base do gene msp4 de Anaplasma ovis
57
QUADRO 7
Iniciadores utilizados na amplificação de fragmento de 932
pares de base do gene 16S rRNA de Anaplasma sp.
57
QUADRO 8
Iniciadores utilizados na amplificação de fragmento de 546
pares de base do gene 16S rRNA de Anaplasma sp.
58
QUADRO 9
Iniciadores utilizados na amplificação de genes de codificantes
de proteínas de membrana externa de Anaplasma marginale
61
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
µL
Microlitros
µM
Micromolar
AGE
Anaplasmose Granulocítica Equina
AGH
Anaplasmose Granulocítica Humana
ALT
Alanino aminotransferase
AST
Aspartato aminotransferase
BAC
“Bacterial Artificial Chromosome” ou Cromossomo Artificial Bacteriano
CDC
Centers for Disease Control and Prevention
CHGM Concentração de hemoglobina globular média
CID
Coagulação intravascular disseminada
DNA
Ácido desoxirribonucleico
dNTP
Trifosfatos desoxirribonucleosídeos
Dr.
Doutor
Dr.
a
Doutora
EDTA
Ácido etileno diamino tetracético
ELISA
Do inglês “Enzyme-Linked Imunosorbent Assay” ou ensaio imuno
enzimático
EMH
Erliquiose Monocítica Humana
EUA
Estados Unidos da América
fL
Fentolitros
FTC
Febre Transmitida por Carrapatos
g/dL
Gramas por decilitro
HCl
Ácido clorídrico
IBGE
Intituo Brasileiro de Geografia Estatística
KCl
Cloreto de Potássio
LE
Leucometria específica
LG
Leucometria global
M
Molar
m
Metros
MHC
Do inglês “Major Histocompability Complex” ou Complexo Maior de
Histocompatibilidade
mg/dL
Miligramas por decilitro
MgCl2
Cloreto de magnésio
mM
Milimolar
MSP
Major Surface Protein
No
Número
OMP
Outer Membrane Protein
p.
Página
pb
Pares de base
PCR
Do inglês “Polymerase Chain Reaction” ou reação em cadeia da polimerase
pH
Potencial hidrogeniônico
pmol
Picomol
PTN
Proteínas
q.s.p.
Quantidade suficiente para
RJ
Rio de Janeiro
RNAr
Ácido ribonucléico ribossomal
SP
São Paulo
Taq
Thermophilus aquaticus
TAE
Tris- Acetato- EDTA
U
Unidade internacional de medida
U/L
Unidades por litro
UFF
Universidade Federal Fluminense
UV
Ultravioleta
VG
Volume globular
VGM
Volume globular médio
14
RESUMO
Organismos da família Anaplasmataceae são capazes de infectar ruminantes
causando doenças e prejuízos econômicos. Destes, Anaplasma marginale é o mais
frequente e importante no Brasil. Anaplasma phagocytophilum é o agente da
Anaplasmose Granulocítica Humana, sendo ainda causador importante de doenças
em ruminantes na Europa. A vacinação é a principal alternativa para o controle da
infecção por A. marginale. Atualmente a busca por novos antígenos que sejam
capazes aumentar o grau de proteção dos rebanhos e até mesmo prevenir o estado
de portador é considerada de grande importância. Os objetivos do presente trabalho
foram determinar a frequência de infecções por membros da família
Anaplasmataceae em 94 bovinos e 59 ovinos de Cachoeiras de Macacu, RJ, a partir
da PCR e determinar o grau de conservação das sequências dos genes omp1,
omp4, omp5, omp7, SodB, am097, am254 (ef-tu) e am956 (PepA) em amostras de
A. marginale de cinco municípios representando quatro mesorregões do estado do
Rio de Janeiro. Dentre os bovinos de Cahoeiras de Macacu 35,1% (n=33) foram
positivos para A. marginale. Dentre os ovinos 6,78% (n=4) foram positivos para A.
phagocytophilum.
A frequência de animais apresentando neutrofilia foi
significativamente (p=0,0288) maior entre os bovinos PCR positivos para A.
marginale. Dimuições nas atividades séricas de AST e Fosfatase alcalina foram
significativamente (p=0,0041 e p=0,0007, respectivamente) mais presentes nos
ovinos PCR positivos para A. phagocytophilum. A análise dos valores médios do
número diferenças de aminoácidos por sitio (“p-distance”) entre todas as sequências
preditivas de aminoácidos avaliadas indicam que há pouca variabilidade nestas
proteínas. De acordo com estes dados, EF-Tu, SODb, PepA, OMP1 e OMP4 são as
proteínas menos variáveis, com valores médios de “p-distance” de 0,01; 0,02; 0,02;
0,02 e 0,02 respectivamente. Apenas OMP7 e VirB9-1 apresentaram valores
superiores à 5%, 0,11 e 0,08, respectivamente. As amostras do estado do Rio de
Janeiro apresentaram uma maior similaridade nas sequências preditivas entre si do
que quando comparadas a amostras do outros locais do Brasil e dos EUA. A
observação de A. phagocytophilum infectando ovinos no estado do Rio de Janeiro
indica que este agente de potencial zoonótico circula nesta região.
Palavras chave: Anaplasma marginale, Anaplasma phagocytophilum, bovinos,
ovinos, PCR, OMP.
15
ABSTRACT
Anaplasmataceae family organisms infect ruminants causing illnesses and economic
losses. Anaplasma marginale is considered the most frequent and important of those
agents in Brazil. Anaplasma phagocytophilum is the agent of Human Granulocytic
Anaplasmosis, and is a major cause of disease in ruminants in Europe. Vaccination
is the main strategy for the control of A. marginale. Currently the search for new
antigens able to increase the level of protection and/or even prevent the carrier state
is considered of great importance. The goals of this study were to determine the
frequency of Anaplasmataceae infections in 94 samples of cattle and 59 of sheep
from Cachoeiras de Macacu-RJ, using PCR and to determine the conservation
degree between the predictive amino acid sequences of omp1, omp4, omp5, omp7 ,
SodB, am097, AM254 (ef-tu) and am956 (PEPA) genes in A. marginale samples
from five municipalities representing four regions of Rio de Janeiro State. Among the
cattle, 35.1% (n = 33) were positive for A. marginale. Among sheep 6.78% (n = 4)
were positive for A. phagocytophilum. The frequency of animals presenting
neutrophilia was significantly (p = 0.0288) higher among the cows with a positive
PCR for A. marginale. Decreased serum activities of AST and Alkaline phosphatasis
were significantly more frequent (p = 0.0041 and p = 0.0007, respectively) in the
sheep positive for A. phagocytophilum. The analysis of the mean values of the
number of amino acid differences per site ("p-distance") between all predictive amino
acid sequences evaluated indicates that there is little variability in this protein.
According to these data, EF-Tu, SODb, PEPa, and OMP1 OMP4 proteins are less
variable, with values of "p-distance" of 0.01, 0.02, 0.02, 0.02 and 0 02 respectively.
Only OMP7 and VirB9-1 showed values higher than 5%, 0.11 and 0.08, respectively.
Samples of the state of Rio de Janeiro showed greater similarity in predictive
sequences among themselves than when compared to samples from other locations
in Brazil and the USA. The observation of A. phagocytophilum infecting sheep in the
state of Rio de Janeiro indicates that this potential zoonotic agent is present in this
region.
Key words: Anaplasma marginale, Anaplasma phagocytophlilum, cattle, sheep,
PCR,OMP,Vaccine
1 INTRODUÇÃO
A família Anaplasmataceae compreende diversos gêneros de Riquétsias
capazes de infectar animais domésticos, selvagens e seres humanos, além de
hospedeiros invertebrados como artrópodes e helmintos (DUMLER et al., 2001)
sendo o gênero Anaplasma o mais frequentemente encontrado infectando
ruminantes, através das espécies A. marginale, A. centrale, A. ovis, A. bovis e A.
phagocytophilum. Espécies do gênero Ehrlichia, como E. chaffeensis e E.
ruminantum, também são encontradas em ruminantes. No Brasil, Anaplasma
marginale é a espécie de maior importância, sendo descrita em todo o território
nacional (VIDOTTO & MARANA, 2001). No estado do Rio de Janeiro existem
estudos de soroprevalência nas regiões Norte Fluminense e do Médio Paraíba
(SOUZA et al. 2000; SOUZA et al. 2001). A situação da distribuição do agente nas
demais regiões do estado ainda não foi investigada. Poucos estudos foram
realizados pesquisando a existência de outros agentes da família Anaplasmataceae
em ruminantes no Brasil. Recentemente foi relatada a ocorrência de A. bovis em
bovinos no município de Campos dos Goytacazes (SANTOS & CARVALHO, 2006).
A detecção de E. chaffeensis em Cervo do Pantanal também já foi realizada
em território nacional (MACHADO et al., 2006). Desde 1940 se reconhece a
existência de uma Riquétsia como agente causador de doença febril em ovinos na
Escócia, sendo hoje este agente identificado como uma das variantes de A.
phagocytophilum (WOLDEHIWET, 2006). O mesmo agente já foi descrito infectando
caprinos e cervídeos em diversos países europeus. A. phagocytophilum é também o
agente da Anaplasmose Granulocítica Humana, doença que vem apresentando uma
crescente incidência nos EUA (DEMMA et al., 2006).
Devido aos prejuízos econômicos que podem ser causados por estes
agentes, à grande população de ácaros transmissores de hemoparasitos no Estado
do Rio de Janeiro e por muitas destas parasitoses possuírem potencial zoonótico,
torna-se necessária à caracterização dos agentes presentes nestas regiões,
permitindo que sejam traçadas estratégias de controle, métodos de diagnóstico
eficientes e um perfil hematológico e bioquímico desta população, proporcionando
assim, um maior conhecimento das características epidemiológicas da infecção de
ruminantes por estes parasitos no estado do Rio de Janeiro.
O sucesso de novas vacinas para anaplasmose usando tecnologias
moleculares dependera da capacidade em mimetizar ou redirecionar a resposta
hospedeira durante infecções naturais ou bloqueio da infecção de células
hospedeiras (KOCAN et al., 2003). O sequenciamento do genoma completo de A.
marginale possibilitou a identificação de 62 genes que codificam proteínas de
membrana anteriormente desconhecidas. Destas, 49 pertencem as superfamílias
msp1 e msp2. Como os genes da superfamília msp2 são expressos na superfície
bacteriana, o grau de conservação entre isolados de Anaplasma marginale emerge
como uma importante questão (RAMOS et al., 2007). As membranas externas de
patógenos intracelulares obrigatórios estão associadas a funções necessárias para a
sobrevivência, replicação e transmissão destes agentes, assim, as proteínas
expressas na superfície destes organismos são consideradas como potenciais
candidatas para o desenvolvimento de vacinas, tornando a caracterização destas
proteínas em diferentes isolados crítica para o desenvolvimento de novos
imunógenos (NOH et al. 2008).
Os objetivos do presente trabalho foram estudar a ocorrência de infecções por
organismos da família Anaplasmataceae em bovinos e ovinos de Cachoeiras de
Macacu – RJ e avaliar o grau de conservação de genes que codificam proteínas de
membrana de A. marginale entre isolados provenientes de diferentes mesorregiões
do Estado do Rio de Janeiro.
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 FAMÍLIA Anaplasmataceae
A
família
Anaplasmataceae
pertence
ao
Super-reino
Bacteria,
Filo
Proteobacteria, Classe Alphaproteobacteria, Ordem Rickettsiales. É composta de
organismos gram negativos, cocóides, pleomórficos, intracelulares obrigatórios,
encontrados exclusivamente em vacúolos no citoplasma da célula hospedeira.
Podem ser encontrados individualmente ou em inclusões compactas formadas por
varias unidades denominadas mórulas. Além disso, praticamente todos se
multiplicam tanto em vertebrados quanto em invertebrados (principalmente
carrapatos e trematódeos). Geralmente, parasitam células hematopoiéticas,
maduras ou imaturas, particularmente células mieloides e neutrófilos, em sangue
periférico ou tecidos, frequentemente em órgãos ricos em fagócitos mononucleares
de hospedeiros mamíferos como o baço, fígado e medula óssea, (POPOV et al.,
1998, RIKIHISA, 2006, KOCAN et al., 2010). Estudos das sequencias dos genes
codificadores da unidade 16S rRNA, da gênese de proteínas de superfície e análise
genética da proteína de choque térmico groESL, que forneceram evidências
moleculares da necessidade de uma reestruturação das famílias Rickettsiaceae e
Anaplasmataceae e dos gêneros Anaplasma, Ehrlichia, Cowdria, Neorickettsia e
Wolbachia. Os membros das tribos Ehrlichiaeae e Wolbachiaeae foram transferidos
para a família Anaplasmataceae com a eliminação da estrutura tribal da família
Rickettsiaceae. A análise filogenética indicou a formação de quarto grupos distintos
Anaplasma (similaridade mínima de 96.1%), Ehrlichia (97.7%), Wolbachia (95.6%) e
Neorickettsia (94.9%). O gênero Anaplasma passou então a incluir a espécie A.
phagocytophilum (englobando as espécies E. phagocytophila, E. equi e o agente da
19
erliquiose granulocítica humana), as espécies A. platys e A. bovis foram criadas para
substituir as espécies E. platys e E. bovis respectivamente (DUMLER et al., 2001).
2.2 Anaplasma marginale
A. marginale é uma riquétsia intraeritrocitária, agente da anaplasmose bovina
(VIDOTTO & MARANA, 2001) e se encontra amplamente distribuído em regiões
tropicais, subtropicais e temperadas, sendo encontrado nas Américas, Austrália, e
sudeste Africano (DALGLIESH et al., 1990).
A transmissão de Anaplasma marginale tem sido motivo de muita polêmica.
Apesar de este hemoparasito ser conhecido há 100 anos, ainda persistem muitas
dúvidas com relação aos meios e mecanismos de transmissão e à importância
epidemiológica dos possíveis vetores.
A principio, carrapatos ixodídeos, como
Riphicephalus microplus, Dermacentor andersoni, D. variabilis e D. occidentalis
(KESSLER e SCHENK, 1998).
No Brasil, podemos considerar o carrapato R.
microplus como vetores biológicos e os principais vetores (KESSLER, 2001). A
transmissão pode se dar tanto transestadialmente, quando se infecta e transmite o
patógeno durante os sucessivos ciclos de vida, quanto intraestadialmente, quando
se infecta e transmite o patógeno dentro do mesmo ciclo de vida (ERIKS et al.,
1993). Apesar da não ocorrência de transmissão transovariana em R. microplus
(RIBEIRO et al. 1996), e de realizar suas ecdises sobre o hospedeiro, comprovou-se
que, freqüentemente, os carrapatos mudam de hospedeiro, deslocando-se do local
de fixação do instar anterior para fixar-se e reiniciar a alimentação do novo instar
(MASON & NORVAL, 1981). Isto se explica devido à mobilidade dos novos instares
e dos machos. O hábito gregário dos bovinos, com freqüentes contatos físicos,
principalmente entre mãe e filho e animais em atividade sexual, facilita a passagem
de um bovino para outro. O agente também pode ser transmitido por dípteros
hematófagos, como, por exemplo, os dos gêneros Tabanus, Stomoxys, Haematobia,
Psorophora, e através de fômites contaminados (BARBET, 1995, KESSLER e
SCHENK, 1998).
O período de incubação da doença varia de 21 a 35 dias, concorrendo com a
manifestação de sintomas clínicos, de acordo com a taxa de inoculação e
sensibilidade do hospedeiro (KESSLER e SCHENK, 1998).
20
A doença aguda é caracterizada por febre, anemia, icterícia, perda de peso,
abortamento e queda da produção de leite (KOCAN et al., 2004). Nesta fase, mais
de 75% dos eritrócitos circulantes podem estar parasitados, podendo levar o animal
ao óbito em menos de 24 horas (VIDOTTO & MARANA, 2001).
2.2.1 EPIDEMIOLOGIA
No estado do Rio de Janeiro estudos de soroprevalência mostraram que
91,16% e 98,21% dos bovinos nas regiões Norte Fluminense e do Médio Paraíba,
respectivamente, foram positivos para A. marginale (SOUZA et al. 2000; SOUZA et
al. 2001). A anaplasmose bovina é responsável por grandes prejuízos econômicos,
especialmente em regiões de instabilidade enzoótica nas quais é particularmente
importante. Nessas regiões há um grande percentual de animais susceptíveis à
infecção por A. marginale (PALMER et al.,1986, ARAÚJO et al., 2003). Nesta
situação, a maioria dos animais não se infecta nos primeiros meses de vida, quando
são menos susceptíveis a essa infecção (MADRUGA et al., 1985). Nas regiões de
estabilidade enzoótica os animais apresentam um bom título de anticorpos e
usualmente não apresentam sinais clínicos, porém, populações de animais que são
introduzidos, provenientes de áreas livres de carrapato ou, de rebanhos sob controle
intensivo de carrapatos e, bezerros na faixa etária de 30 a 120 dias com baixa
imunidade apresentam risco de anaplasmose (MADRUGA et al., 1984).Nestes locais
os prejuízos causados pelos carrapatos podem ser mais significativos do que pelos
agentes por eles transmitidos (VIDOTTO & MARANA, 2001). Além de perdas
diretas, a anaplasmose representa um obstáculo para o melhoramento genético
nacional visto que limita a introdução de raças de padrão zootécnico mais elevado,
vindas de áreas livres da doença (MELÉNDEZ, 2000).
2.2.2 MEDIDAS DE CONTROLE
As medidas para o controle da anaplasmose não apresentaram mudanças
significativas nos últimos 60 anos. As medidas variam de acordo com as
características econômicas e geográficas de cada região e podem incluir: controle de
vetores artrópodes pelo uso de acaricidas, administração profilática de antibióticos e
21
vacinação. O controle de vetores não constitui uma solução prática para muitas
áreas, não impedindo ainda, a transmissão mecânica através de fômites. O uso de
antibióticos, além de caro, não é viável em sistemas de criação extensivos e trás o
risco do aumento da ocorrência de microrganismos resistentes (KOCAN et al.,
2010). A presença de isolados geográficos que não são transmitidos por carrapatos
tem grande influencia no controle da anaplasmose. Nas regiões nas quais tais
isolados são endêmicos, o controle deve se direcionar para prevenção da
transmissão mecânica através fômites contaminados por sangue infectado e
dípteros hematófagos e, em segundo plano, o combate aos vetores (DE LA FUENTE
et al., 2001b).
A vacinação é uma forma econômica e eficiente para o controle parcial da
anaplasmose bovina. As vacinas podem ser de dois tipos: vivas ou mortas. O uso de
vacinas vivas para o controle da anaplasmose envolve a infecção do animal, pela
inoculação de eritrócitos infectados com isolados atenuados de A. marginale ou
vacinas vivas contendo A. centrale, que é menos patogênico (KOCAN et al., 2003).
Tais métodos apresentam algumas limitações em seu uso, como efeitos adversos
em algumas categorias de animais (vacas prenhes, animais adultos), possibilidade
de veiculação de agentes patogênicos (no caso da premunição), sensibilização de
vacas contra grupos sanguíneos e, consequente, isoeritrólise neonatal em bezerros
(BRIZUELA et al., 1998; KESSLER e SCHENK, 1998).
O uso de vacinas mortas tem como principais vantagens o baixo risco de
contaminação com agentes infecciosos indesejáveis, estocagem barata e menor
número
de
reações adversas
pós-inoculação.
Suas
desvantagens
são
a
necessidade de reforços anuais, o alto custo de purificação de A. marginale à partir
de
eritrócitos
e
a
falta
de
proteção
cruzada
entre
isolados
separados
geograficamente. A imunidade protetora conferida pelas vacinas de organismos
mortos é, frequentemente, menor que a conferida pelas vacinas de organismos vivos
(KOCAN et al., 2003).
É importante ressaltar que a Anaplasmose pode ser exacerbada pela
vacinação em um número considerável de casos. O mecanismo pelo qual isto ocorre
ainda não foi esclarecido, mas acredita-se que possa estar ligado à antígenos
inapropriados e/ou resposta imune inadequada. Assim, para considerarmos uma
vacina como protetora, ela deve ser capaz de causar uma redução na parasitemia,
nos efeitos hemolíticos e na mortalidade (HOPE et al., 2004).
22
Nenhuma das vacinas hoje existentes é capaz de impedir que os animais se
tornem persistentemente infectados e, consequentemente, se tornem reservatórios
da infecção (KOCAN et al., 2003).
Atualmente, há pesquisas voltadas para o desenvolvimento de vacinas a
partir de proteínas de membrana oriundas de corpúsculos iniciais de A. marginale.
Tais proteínas são expostas na superfície da Riquétsia, sendo facilmente acessíveis
ao sistema imunológico do hospedeiro (ARAUJO et al., 2003).
Sabe-se que determinados isolados de A. marginale podem não ser capazes
de oferecer proteção cruzada para outros isolados, sejam eles utilizados em vacinas
vivas ou como antígenos em vacinas mortas (KOCAN et al., 2010). Estudos
filogenéticos recentes vêm demonstrando que há um maior número de isolados de
A. marginale do que se pensava previamente. Acredita-se que esta diversidade se
deva ao aumento da relocação de animais de uma área para outra (DE LA FUENTE
et al., 2001b, 2002, 2007).
2.2.3 ASPECTOS IMUNOLÓGICOS DA INFECÇÃO POR Anaplasma marginale
Muitas pesquisas têm sido feitas no intuito de melhor compreender a natureza
da resposta imunológica à infecção por A. marginale, buscando a identificação dos
antígenos que possuem papel decisivo nesta resposta (PALMER, 1989; PALMER et
al., 1999).
Há um mecanismo imunológico de exclusão da infecção entre Anaplasma
spp, que resulta na infecção por um único isolado geneticamente definido. Tal fato
contribui para a presença de isolados com genótipo e, características antigênicas
distintas em uma mesma localização geográfica, ajudando explicar as características
epidemiológicas da anaplasmose. Assim, infecções por A. centrale poderiam
prevenir que animais sejam infectados por A. marginale, fornecendo proteção devido
a cronicidade da infecção. A manutenção de diferentes genótipos de A. marginale
dentro de um mesmo rebanho em áreas endêmicas pode ser causada por eventos
de transmissão independentes (DE LA FUENTE et al., 2002).
Porém em 2004, Palmer et al., identificaram a presença de uma
superinfecção por dois isolados de A. marginale genotipicamente distintos. Sugerese que o fato possa ser comum dentro de uma região onde o organismo é endêmico
e 64% dos animais inoculados com o isolado vacinal vivo A. centrale, foram
23
subsequentemente infectados por transmissão natural de A. marginale e albergam
ambos os organismos.
Comumente, animais carreiam apenas um isolado, apesar da presença e
transmissão de isolados genotipicamente distintos dentro de uma mesma população
(PALMER et al., 2004). Este fato reforça a ocorrência da prevenção da
superinfecção, provavelmente decorrente do desenvolvimento de um amplo
repertório de variantes de respostas imune MSP2 especificas contra o primeiro
isolado de A. marginale. Como consequência deste fato, somente isolados com um
grande repertório de variações do pseudogene msp2 são capazes de escapar da
resposta imune do hospedeiro, sendo capazes de ocasionar a superinfecção.
Porém, se o repertorio do pseudogene dos isolados apresentar similaridades, as
variantes MSP2 que são apresentadas serão reconhecidas pelo hospedeiro e a
infecção debelada (RODRIGUEZ et al., 2005).
O sucesso de novas vacinas contra A. marginale utilizando técnicas de
biologia molecular vai depender de sua capacidade de mimetizar e/ou redirecionar a
resposta hospedeira durante infecções naturais ou bloquear infecção de células
hospedeiras (KOCAN et al., 2003).
Estudos demonstraram que a imunização com DNA simples é capaz de
induzir uma ampla gama de respostas imunológicas, incluindo a produção de
anticorpos, CD4, CD8, através de um processamento natural do antígeno, que é
apresentado em moléculas MHC de classes I e II (DUMLER et al., 2001, apud,
KANO et al., 2008).
O uso do DNA para o desenvolvimento de vacinas parece promissor por
induzir imunidade duradoura com uma ampla resposta imune celular e humoral e
podendo ser usado simultaneamente contra diversos agentes em uma mesma
vacinação (VAN DEN HURK et al. 2001). A modulação da magnitude e o
direcionamento da resposta imune em vacinas de DNA podem ser obtidos pela
coadministração de citocinas codificadas por plasmídios e antígenos. A vacina ideal
será aquela capaz de prevenir infecção bem como induzir resposta imune. A
possibilidade de bloqueio da infecção é uma meta importante, no entanto, até agora
nenhum antígeno identificado foi capaz de atingir tal objetivo (KOCAN et al., 2003).
Identificar candidatos à vacina apropriados não é uma tarefa simples.
Enquanto MSP1 nativo possui capacidade de estimular resposta imune protetora,
MSP1 recombinante não é eficaz na indução de níveis comparáveis de proteção,
24
sugerindo que a relação entre as proteínas na membrana pode ser um fator
importante na indução de resposta imune protetora. Algumas das MSPs conhecidas
se ligam a membrana através de ligações covalentes e não covalentes, sendo esta
relação um possível fator de influência na apresentação epítopos. O uso de vacinas
multivalentes pode ser uma alternativa necessária para o desenvolvimento de
reposta protetora efetiva, portanto, combinações apropriadas de proteínas/epítopos
devem ser exploradas em associação a métodos de apresentação apropriados
(BRAYTON et al., 2006).
Outra possibilidade para o desenvolvimento de vacinas é o uso do sistema de
cultura de células derivadas de embriões de carrapatos Ixodes scapularis. Esta
poderia servir como fonte de A. marginale, pois as MSPs se mantêm conservadas
mesmo após sucessivas passagens. O uso de culturas celulares podem ainda ser
empregado para testar a estabilidade e diversidade antigênica durante as passagens
em bovinos e carrapatos, determinar se há expressão seletiva dos antígenos de
importância biológica, desenvolver novos agentes terapêuticos e reagentes
diagnósticos (BARBET et al. 1999).
Anaplasma marginale apresenta diferenças na expressão e na estrutura
proteica entre o crescimento em células de carrapato e em eritrócitos bovinos. Estas
diferenças podem ser cruciais para o desenvolvimento de formulações vacinais
capazes de prevenir a infecção e transmissão do agente (KOCAN et al., 2001).
Atualmente as vacinas não previnem a infecção, e bovinos cronicamente infectados
constituem os principais reservatórios de A. marginale servindo como fonte de
infecção para transmissão mecânica, por fômites e dípteros hematófagos, e
biológica, por carrapatos (KOCAN et al., 2003).
Acredita-se que preparações de membrana de superfície externa possam ser
efetivas na imunização contra A. marginale. No entanto, as tentativas de
desenvolvimento de vacinas capazes de produzir imunidade protetora através das
proteínas de superfície conhecidas não tem obtido sucesso. Assim, fazendo uso da
crescente disponibilidade de sequencias genéticas conhecidas, novas proteínas de
superfície tem sido pesquisadas através de uma abordagem genômica e proteômica,
na busca por candidatos vacinais mais efetivos (BRAYTON et al., 2006).
A partir de um isolado de A. marginale obtido de uma vaca naturalmente
infectada em Oklahoma, Blouin et al., (2000) estabeleceram com sucesso um
sistema de cultivo do agente utilizando células de Ixodes scapularis. O isolado
25
proveniente desta cultura era capaz de produzir anaplasmose clinica no gado,
mantendo inalteradas as características de infectividade e de suas proteínas
principais de superfície mesmo após quatro anos de passagens sucessivas. Através
do sistema de cultivo de A. marginale, é possível obter organismos e componentes
para vacinas sem os custos da manutenção de animais e sem a presença da
membrana dos eritrócitos, evitando problemas associados como a isoeritrólise
neonatal. O isolado cultivado oferece ainda a vantagem de permitir um melhor
controle da presença de vírus e outros patógenos bovinos, que podem estar
presentes no sangue coletado diretamente de animais. Isolados recentes de campo
tem capacidade de produzir imunidade similar a resultante da infecção natural em
bovinos quando usados como imunógenos.
Aparentemente, na transição da bactéria do eritrócito para a célula do carrapato,
ocorre um remodelamento da superfície de A. marginale, com diminuição do numero
de proteínas nos complexos que são expressos na superfície das células de
carrapato. Atribui-se esta mudança a: diminuição da expressão proteica, diminuição
na exportação de proteínas para a superfície da bactéria, alteração na exibição ou
disfarce das proteínas na superfície por outras moléculas (NOH et al., 2008).
2.2.4 ASPECTOS GERAIS DO GENOMA DE A. marginale
Através da análise do genoma de bactérias uma série de importantes
descobertas vem sendo feitas, como o esclarecimento de rotas metabólicas que
podem ser testadas para descoberta de novos antibióticos, e o percentual
significativo de genes presentes na maioria dos genomas bacterianos que não estão
relacionados com nenhum outro gene identificado. A identificação de genes
bacterianos desconhecidos, bem como de suas funções, pode ajudar a entender os
mecanismos e adaptações que estes microrganismos utilizam para sobreviver como
parasitas obrigatórios. A maior parte das bactérias parasitas obrigatórios possui um
genoma muito reduzido, presumivelmente retendo apenas as funções mais
importantes para sua sobrevivência e propagação (PALMER, 2002).
Acredita-se que esta diminuição no tamanho do genoma seja resultado de um
processo de redução evolutiva, sendo o patógeno de hoje descendente de um
organismo com genoma maior. Sabe-se que as atividades de genes nucleares
homólogos podem tornar genes do endossimbionte descartáveis e, como
26
consequência, vulneráveis a supressão por mutação. Com o acúmulo dessas
mutações os genes tendem a ser a inativados e, eventualmente, a deleção. Ao longo
deste processo os genes foram sendo perdidos desde o momento em que um
primeiro ancestral viveu uma célula Eucariota. Quando os genes essenciais à vida
livre foram eliminados, o endosimbionte tornou-se um residente obrigatório de seu
hospedeiro (ANDERSSON et al., 1998).
Apesar da diminuição de seus genomas, os organismos intracelulares
obrigatórios mantém a capacidade de infectar, sobreviver, se reproduzir e causar
doença em seus hospedeiros. Uma parcela significativa de seus genomas está
voltada para famílias parálogas de moléculas polimórficas de superfície. Apesar da
deleção da maioria dos genes duplicados, existe um grande número de cópias de
genes que codificam proteínas de membrana polimórficas. Ao que tudo indica esta
manutenção se deve a pressão seletiva exercida pelo sistema imune do hospedeiro,
que permite a sobrevivência apenas dos organismos capazes de expressar diversos
grupos de moléculas antigenicamente distintas. (PALMER, 2002).
O genoma pequeno de A. marginale (1.197.687 pares de bases) permitiu que,
a partir do isolado St. Maries, originalmente obtido de um animal com anaplasmose
aguda, e com o uso de cromossomos artificiais bacterianos (BAC) se determinasse a
sequência genômica completa sem a necessidade de purificação do organismo a
partir da célula hospedeira. O genoma circular completo deste isolado possui
conteúdo G+C de 49,8%, fato este pouco comum em organismos intracelulares
obrigatórios. Conforme o esperado para uma bactéria intracelular que tem um
conteúdo codificador mínimo para manutenção da vida, o genoma possui uma alta
densidade de genes codificadores (86%). O genoma de A. marginale apresenta 949
sequencias de DNA codificantes, com uma tamanho médio de 1.077 pb e contém
um único operon de genes RNA ribossomais, que parecem ser típicos da ordem
Rickettsiales, e 37 genes de RNA transportadores, representando 20 aminoácidos.
Foram identificadas 62 proteinas de membrana externa (OMP) (BRAYTON et al.,
2005).
No sequenciamento do genoma de A. centrale foram encontrados 1.206.806
pb em um cromossomo circular, com 925 sequencias codificantes preditas, 19
pseudogenes, 37 tRNAs e um grupo único de genes RNA ribossomais e 10 genes
não encontrados nos isolados Saint Maries e Florida de A. marginale (HERNDOM et
al.,2010). O sequenciamento deste genoma tem grande importância na pesquisa
27
para o desenvolvimento de vacinas para A. marginale devido à capacidade de A.
centrale de produzir imunidade suficiente para prevenir o desenvolvimento de
doença clinica em bovinos (PIPANO, 1995), indicando, portanto, que os epítopos
cruciais para o desenvolvimento desta resposta imune devem ser conservados.
(HERNDOM et al.,2010).
2.2.5 PROTEÍNAS PRINCIPAIS DE SUPERFÍCIE (MSPS)
Seis proteínas principais de membrana (MSPs) de A. marginale derivadas de
eritrócitos bovinos foram identificadas, sendo consideradas conservadas em
organismos oriundos de carrapatos e de cultura de tecidos. As MSP1a, MSP4 e
MSP5, são proteínas de genes únicos, não apresentando variação antigênica
durante a multiplicação do agente. Por sua vez, MSP1b, MSP2 E MSP3 são
provenientes de famílias de multigenes e podem variar antigenicamente, em
especial, nos bovinos cronicamente infectados (BARBET et al., 2001).
As MSPs estão interagem tanto com os hospedeiros vertebrados quanto com
os invertebrados. Por isso, parecem evoluir mais rapidamente do que outros genes
nucleares, uma vez que estão sujeitas a pressões seletivas exercidas pelo sistema
imune dos dois hospedeiros (DE LA FUENTE et al., 2001).
Estudos sobre imunização contra Anaplasma tem se concentrado na
obtenção de frações antigênicas. Bovinos imunizados com corpúsculos iniciais ou
membrana destes apresentaram redução significativa da anemia e da parasitemia
(MONTENEGRO-JAMES et al., 1991; TEBELE et al, 1991; RODRIGUEZ et al.,
2000).
Plasmídios que codificam MSPs de A. marginale foram administrados a
camundongos Balb C, produzindo uma resposta superior à obtida com o uso de
plasmídios individuais, sugerindo que vacinas com múltiplos epítopos de DNA
devem ser avaliadas na proteção bovina contra a anaplasmose (KANO et al., 2008).
Vacinas
plasmidiais
que
codificam
MSP1a
demonstraram
induzir
soroconversão antígeno específica em camundongos e bovinos, sugerindo que
MSP1a expressa em plasmídios e nativa compartilham epítopos de linfócitos B,
indicando que as vacinas de DNA fornecem um método para direcionar o fenótipo da
resposta imune hospedeira (ARULKANTHAN et al., 1999).
28
Devido a natureza variável das MSPs, as tentativas para desenvolver uma
vacina de subunidade contra A. marginale ainda não apresentaram resultados
(RIDING et al., 2003). Apesar de possuírem características imunodominantes e
serem capazes estimular uma resposta imune protetora, não se tem obtido sucesso,
nas tentativas para produzir uma vacina contra um espectro de variantes
imunologicamente distintas. Isso se deve ao pouco progresso obtido rumo à
identificação de epítopos protetores conservados. a Considerando-se o principio de
que qualquer vacina deve proteger contra uma ampla gama de variantes
antigênicos, a pesquisa de antígenos conservados em A. marginale é importante
para a produção de uma vacina de subunidade contra o parasito (HOPE et al.,
2004).
2.2.5.1 MSP 1
O gene msp1α é o codificador de MSP1a que esta envolvida na adesão à
eritrócitos bovinos e células de carrapatos, e transmissão de A. marginale por
Dermacentor spp. (DE LA FUENTE et al., 2001a). MSP1b por sua vez é codificada
por ao menos dois genes, msp1β1 e msp1β2 (BOWIE et al., 2002). Acredita-se que
seja uma adesina para eritrócitos bovinos, entretanto comprovou-se não se tratar de
uma adesina para células de carrapato (DE LA FUENTE et al., 2001b).
Possivelmente, a associação entre MSP1a e MSP1b na superfície do
complexo de proteínas permite que A. marginale se ligue de maneira mais efetiva ao
eritrócito e/ou a célula do carrapato. MSP1a poderia ser uma subunidade essencial
no reconhecimento de receptores da célula do carrapato, enquanto a ligação ao
receptor do eritrócito poderia ser mediada por MSP1b ou por ambas subunidades
proteicas através da ligação de componentes eritrocitários distintos. O papel
diferencial de MSP1a e MSP1b na adesão as hemácias confere maior relevância ao
complexo MSP1 na multiplicação de A. marginale no hospedeiro mamífero e no
carrapato vetor, provavelmente como parte do processo de invasão (DE LA
FUENTE, 2001b).
Estudos realizados a partir de microscopia confirmaram a adesão de MSP1a
em eritrócitos, células IDE8 e células intestinais de D. variabilis e a adesão de
MSP1b somente a eritrócitos (KOCAN et al., 1981;DE LA FUENTE, 2001b).
29
O primeiro sítio de infecção por A. marginale em carrapatos são as células
intestinais, iniciando o desenvolvimento do ciclo. Sem a adesão e infecção das
células
intestinais
não
ocorre
a
infecção
das
glândulas
salivares
e,
consequentemente, a transmissão ao hospedeiro bovino. Desta forma, a adesão de
MSP1a as células intestinais é necessária para infecção, multiplicação e transmissão
de A. marginale. A capacidade de adesão de MSP1a foi avaliada em células
derivadas de duas espécies de carrapato I. scapularis e D. variabilis, indicando que
estes achados podem ser aplicados também a outras espécies de carrapatos (DE
LA FUENTE, 2001b).
A imunização de bovinos com MSP1 nativa promoveu proteção contra
isolados homólogos e heterólogos de A. marginale, demonstrando que apesar da
variação presente entre os diferentes isolados, há conservação de epítopos de
proteção cruzada (PALMER et al., 1989). Esta resposta humoral é caracterizada
pela produção de anticorpos contra MSP1, MSP1a ou MSP1b, inibindo a ligação de
A. marginale aos eritrócitos, neutralizando assim a invasão das Riquétsias às células
do hospedeiro (MCGAREY et al., 1994).
Aparentemente, MSP1a pode refletir o histórico da movimentação do gado em
determinada região, apesar de não funcionar bem como um marcador para
caracterização geográfica de isolados de A. marginale. Além disso, a pressão
seletiva exercida sobre MSP1a associada à sua função biológica tornam esta
proteína uma potencial candidata a vacina (DE LA FUENTE et al., 2003b)
As interações patógeno-vetor parecem influenciar as características das sequências
de MSP1a em isolados da America Latina. A relação entre B. microplus e A.
marginale aparentemente influencia o agrupamento dos isolados latino-americanos
de A. marginale em uma chave separada dos isolados Norte Americanos, que são
transmitidos principalmente por Dermacentor spp. (DE LA FUENTE et al., 2004).
2.2.5.2 MSP 2
A superfamília MSP2, constituída por msp2, msp3 e msp4, possui sete
pseudogenes e é transcrita como parte de um operon de quatro genes, os três
genes restantes foram chamados de genes operon associados (OPAGs 1-3) sendo
também incluídos nesta família (BRAYTON et al., 2005).
30
A estrutura de MSP2, que apresenta similaridades entre algumas espécies do
gênero Anaplasma, pode ser responsável, ao menos parcialmente, pela proteção
cruzada induzida pela vacinação com A. centrale. Proteínas como MSP4 e MSP5
que são conservadas antigenicamente entre A. centrale e A. marginale, também
podem ser requeridas para mimetizar a proteção induzida pela vacina viva de A.
centrale ou pela imunização com membranas externas purificadas (MOLAD et al.,
2004).
MSP2 e MSP3 de A. marginale, apresentam alto grau de variação durante o
curso da infecção, isto se dá como resultado de conversões sequenciais de genes,
dando origem a variantes estruturais e antigênicas com sítios únicos de expressão
(BRAYTON et al., 2002).
No genoma de A. marginale, há sítios simples de expressão para msp2 e
msp3, no entanto, pseudogenes funcionais múltiplos distribuídos pelo cromossomo
servem como molde para conversão podendo dar origem à variantes da camada de
superfície de MSP2 e MSP3 (BRAYTON et al., 2005). A existência de variantes
capazes de escapar da resposta imune dos hospedeiros vertebrados parecem ser
críticas para a longa persistência do parasita em indivíduos imunocompetentes
(FRENCH et al., 1999).
Anaplasma marginale expressa msp2 no eritrócito bovino e no intestino e
glândula salivar do carrapato. A expressão diferencial de genes nos hospedeiros
vertebrados e invertebrados é um reflexo das necessidades especializadas para
invasão, sobrevivência e replicação em cada hospedeiro (LOHR et al., 2002).
Em clones de A. marginale observou-se que MSP2 apresenta uma região
hipervariável central única, flanqueada por regiões N e C terminais altamente
conservadas. No entanto, a estrutura das variantes de MSP2 expressas durante
rickettsemia persistente possui grande similaridade com aquelas definidas pela
sequência de genes que codificam a proteína MSP2 de A. phagocytophilum
(FRENCH et al. 1999). A variação de MSP2 em A. marginale, definida por 17
transcritos expressos durante o ciclo de riquetsemia, ocorre somente em uma região
central única da proteína. MSP2 é codificada através de um RNA transcrito
policistrônico nos estágios eritrocitários de A. marginale, havendo um polimorfismo
no sítio de expressão genômico para este transcrito policistrônico msp2 e evidencias
de rearranjo genético durante infecção persistente. A disponibilidade do sítio de
expressão pode permitir a determinação das variantes de MSP2 que são expressas
31
durante ciclo de transmissão A. marginale entre carrapatos e bovinos. A partir destas
informações pode-se começar a compreender as possíveis bases moleculares para
a persistência da infecção, bem como pode permitir a identificação de mecanismos
de variação similares em outros patógenos relacionados à família Anaplasmataceae.
Acredita-se que diversos outros patógenos façam uso de mecanismos de expressão
de proteínas de superfície similares para evasão da resposta imune do hospedeiro,
tornando possível a manutenção de infecções crônicas (ALLEMAN et al., 2001).
Análises de um sítio de expressão policistrônico de msp2 em isolados de A.
marginale provenientes de cultura de células, glândula salivar de carrapatos e
bovinos com infecção aguda ou crônica demonstram a conservação das sequências
entre os diferentes estágios do isolado de Oklahoma, com exceção da região central
de MSP2, que apresenta marcante polimorfismo entre populações de A. marginale.
Estas principais sequências não apresentam variação em passagens em culturas,
nos estágios agudos da infecção dos eritrócitos bovinos e/ou glândulas salivares de
carrapatos, porém, variam em infecções crônicas nos hospedeiros bovinos.
Mudanças estruturais em um sítio de expressão para uma proteína externa de
membrana apresentam implicações para o desenvolvimento de vacinas contra A.
marginale e outros patógenos relacionados (BARBET et al., 2001).
Em 2001, Brown et al. identificaram a presença de múltiplos epítopos de
linfócitos Th naturalmente processados nas regiões N e C terminal de MSP2 que são
estruturalmente conservados entre o genogrupo II de Ehrlichia (hoje pertencente ao
gênero Anaplasma), e são reconhecidos pelo sistema imune bovino como diferentes
haplótipos de MHC de classe II. Este fato poderia ajudar a explicar a dominância
sorológica desta proteína, seja em humanos ou em animais infectados por este
grupo de microrganismos bem como pelos do gênero Ehrlichia (JONGEJAN et al.,
1989). Durante a infecção crônica, onde há o surgimento variações antigênicas do
microrganismo de forma sequencial, o desenvolvimento de uma resposta intensa de
linfócitos Th direcionada à epítopos não variáveis de MSP2 seria capaz de propiciar
um acelerado aporte de linfócitos B, com consequente produção de anticorpos
específicos para a variante presente. A combinação desta resposta com a produção
de interferon γ, parece ser o mecanismo que controla a riquetsemia, mantendo-a em
níveis baixos, como observado durante a fase crônica.
Algum grau de homogeneidade ocorre entre sequencias de MSP2 em
populações de A. marginale em cada estágio da multiplicação parasitaria. O padrão
32
do desenvolvimento de A. marginale em carrapatos apresenta diferenças
significativas em relação a agentes como Theileria e Babesia spp, nos quais as
glândulas salivares infectadas são descolonizadas quando os parasitos são
transmitidos ao hospedeiro vertebrado durante o repasto. No entanto, a causa
específica desta manutenção ainda não foi esclarecida, não se sabendo com clareza
se as infecções crônicas de glândulas salivares se devem totalmente a multiplicação
do microrganismo dentro destas ou se resulta do constante migração de organismos
de células intestinais e outros tecidos para as glândulas salivares. Em glândulas
salivares de Dermacentor variabilis cronicamente infectadas foi possível observar o
surgimento de populações com sequências de msp2 heterogêneas e de variantes de
MSP2. Esta variação parece ocorrer de maneira totalmente independente da
pressão seletiva exercida pela resposta imune adquirida de bovinos, sugerindo sua
relação com fatores inerentes ao hospedeiro invertebrado (DE LA FUENTE &
KOCAN, 2001). Um antígeno denominado ANA 29 foi caracterizado, através da
observação de um cDNA codificante para um antígeno não conhecido previamente e
que não apresenta
homologia significativa com nenhuma outra proteína de
bactérias ou outros microrganismos conhecidos no banco de dados. Não foram
encontrados ainda homólogos deste gene em Ehrlichia canis ou Ehrlichia
ruminantium, seja por PCR ou em hibridização por Southern Blotting. A existência de
homólogos deste gene em isolados de A. marginale e A. centrale, associada a
ausência do mesmo em organismos de outros gêneros dentro da família
Anaplasmataceae indica se tratar de um gene único e conservado em Anaplasma
spp. O antígeno ANA 29 induz uma resposta protetora contra o desafio de A.
marginale quando utilizado para imunização (HOPE et al., 2004).
Dentro da superfamília MSP2 são incluídos genes conhecidos como opag1 e
opag3. Sua função precisa ainda é desconhecida. Tem-se observado de que genes
estruturais bacterianos frequentemente se organizam em grupos que codificam
proteínas que apresentam funções relacionadas, portanto, é provável que a proteína
OPAG esteja envolvida nas interações da membrana de A. marginale. Ainda não são
conhecidas as características de expressão de opag1, ele pode ser expresso em
pequena quantidade ou mesmo não possuir expressão, por sua vez, opag3 é
expresso unicamente no interior do eritrócito durante fase aguda da parasitemia. As
diferenças na expressão gênica de proteínas de membrana externa dentro de um
mesmo operon constitui um achado novo em bactérias transmitidas por carrapatos, e
33
a regulação deste fenômeno pode fornecer valiosas pistas para uma melhor
compreensão dos mecanismos necessários para a adaptação do agente às
transições entre os hospedeiros vertebrado e invertebrado (LOHR et al. 2002).
As proteínas Am 778, Am 779 e Am 780 são expressas na superfície da
membrana de A. marginale e possuem alto grau de conservação entre diversas
espécies da família Anaplasmataceae como:
A. phagocytophilum, E. canis, E.
chaffeensis, E. ruminantium e Wolbachia spp (GE et al., 2007) Originalmente, Am
778 foi considerada uma proteína hipotética, codificada no mesmo lócus que codifica
Am 779 e 780. Acredita-se que complexos de proteínas expressos na superfície de
A. marginale isolados de eritrócitos sejam capazes de induzir imunidade protetora
similar àquela produzida por membranas externas purificadas (NOH et al., 2008). No
entanto, Albarrack et al. (2012) apontaram que Am779 é subdominante na resposta
imune à infecção, sendo capaz de estimular linfócitos T mas não de gerar resposta
protetora com produção de anticorpos. Ainda assim, o estudo de proteínas
subdominantes, porém abundantes e altamente conservadas continua sendo
considerado um ramo promissor para o eventual desenvolvimento de vacinas para
A. marginale.
A partir do isolado Saint Maries, que foi clonado em cromossomo artificial
bacteriano e sequenciado, foi possível conhecer mais detalhes do genoma de A.
marginale, que possui 1.197.687 pares de bases (pb). (BRAYTON et al., 2005). Um
dos aspectos mais relevantes da análise do genoma de A. marginale foi a
descoberta de novas proteínas de membrana do parasito. Poucas sequências
puderam ser classificadas como codificantes para proteínas de membrana externa
(outer membrane protein - OMP). Sendo a maior parte delas inserida nas
superfamílias MSP1 e MSP2 (BRAYTON et al., 2006).
2.2.6 PROTEÍNAS EXTERNAS DE MEMBRANA (OMPS)
As imunizações com preparações de membrana externa purificada tem
demonstrado capacidade de conferir proteção contra infecções agudas por A.
marginale e de evitar doença clínica (BROWN et al., 1998a). Uma abordagem
proteômica e genômica recentemente identificou 21 proteínas de potencial
imunogênico na membrana externa além das proteínas principais de superfície
MSP1 a MSP5. As proteínas externas de membrana (OMPs) de A. marginale tem
34
sido objeto de muitos estudos, visando esclarecer suas funções exatas. Pouco se
sabe ainda a respeito da sua influência na imunidade. Apesar de um grande número
de estudos terem se direcionado à OMPs específicas em busca de vacinas, não se
obteve ainda um grande sucesso em comparação aos resultados obtidos com as
imunizações que utilizam bactérias inteiras ou membranas externas intactas. É
possível que as OMPs não sejam capazes de apresentar epítopos suficientes para
induzir resposta em linfócitos T ou não sejam apresentadas de forma suficiente por
MHC classe II. A resposta a essas falhas está provavelmente na associação de
proteínas com diferentes características imunogênicas.
OMPs que sabidamente
contenham múltiplos epítopos de linfócitos T podem atuar como carreadores de
outras OMPs que apresentem menor capacidade neste sentido, como por exemplo,
na combinação de MSP1b1, que é um antígeno fraco, e MSP1a, rica em epítopos T,
que possui um significativo efeito imunogênico, sendo capaz de gerar altos níveis de
produção de anticorpos contra MSP1b1 (MACMILLAN et al., 2008).
Para uma compreensão efetiva da natureza da proteção produzida pelas
membranas externas de A. marginale, torna-se fundamental determinar a
complexidade das interações entre proteínas de membrana e qual a influência
destes complexos na resposta imune ao agente (MACMILLAN et al., 2008).
Dentre as proteínas recentemente descobertas estão as do sistema de
secreção tipo IV (TFSS): fator de elongação termo instável (EF-Tu), proteína
conjugal de transferência (VirB9-1), VirB9-2 e VirB10 (LOPEZ et al., 2007).
O TFSS (sistema de secreção tipo IV) atua como um transportador ATP
dependente de macromoléculas através da membrana, estando relacionado ao
sistema de conjugação em bactérias gram negativas (NIU et al., 2006). TFSS é um
dos poucos grupos de genes sintênicos presentes entre organismos riquétsiais. Isto
indica que a coordenação da expressão destes genes é critica para o microrganismo
(HOTOPP et al., 2006). Existe a possibilidade de que a expressão de TFSS esteja
associada aos mecanismos de sobrevivência de bactérias intracelulares obrigatórias
(NIU et al.,2006). Em outras bactérias gram negativas, o TFSS forma canais que
facilitam a secreção de moléculas, sendo necessário para a sobrevivência celular.
Em Anaplasma phagocytophilum, Ehrlichia chaffensis e Ehrlichia canis o TFSS são
altamente conservadas como proteínas ortólogas entre os três agentes. Por ser uma
exigência para a sobrevivência intracelular do microrganismo, possuindo assim
natureza altamente conservada mesmo entre isolados geograficamente distintos de
35
A. marginale, as proteínas TFSS de bactérias gram negativas constituem alvos
coerentes para investigação imunológica, considerando sua localização na
superfície da membrana O reconhecimento dos antígenos de TFSS por Células T
CD4 e por IgG2 de bovinos imunizados com a fração de membrana externa, fornece
uma razão para incluir estas proteínas no desenvolvimento de vacinas contra A.
marginale e patógenos relacionados (LOPEZ et al., 2007).
EF-Tu, assim como a leucil aminopeptidase (PepA), enzima que promove a
quebra de ligações peptídicas por hidrolise em vias metabólicas de aminoácidos,
foram inicialmente classificadas como proteínas citoplasmáticas, porém, após
analise pelo programa TMHMM, passaram a ser reconhecidas como proteínas
ancoradas à membrana externa e expostas ao meio extracelular (LOPEZ et al.,
2005).
Outro grupo de proteínas que fazem parte do TFSS são as superóxido
desmutases (SOD). Tais proteínas são metaloenzimas que tem como função a
catalisação da reação de dismutação: O2 > H2O2 > O2. São conhecidos outros tipos
de SODs, que podem ser distinguidas de acordo com o metal presente em seu sítio
ativo (ex:MnSOD, ZnSOD). Acredita-se que o gene sodb de Anaplasma e Ehrlichia
spp, provavelmente codifica uma FeSOD. Ferro SODs e Manganês SODs são
conhecidos por atuarem como uma defesa das células bacterianas contra injúrias
oxidativas causadas pelo acúmulo de oxigênio reativo, proveniente do próprio
metabolismo bacteriano, protegendo o material genético do microrganismo (OHASHI
et al., 2002).
Não se conhece bem a função de VIRB3, porém, foi estabelecido que virb3 e
virb5 são genes essenciais de virulência (BERGER & CHRISTIE, 1994).
Estabeleceu-se ainda que VirB9-1 é ortólogo a VirB9-2 (MCLEOD et al., 2004),
possuindo função de responsável pela transferência de complexos proteína-DNA e
de macromoléculas entre células (LOPEZ et al., 2007).
O gene am854 codifica uma proteína classificada como sendo de membrana
através da análise pelo software TMHMM (LOPEZ et al., 2005). No mesmo
experimento, foi observado que AM854 se trata de uma lipoproteína associada a um
peptideoglicano, que faz parte dos componentes estruturais da membrana externa e
que possui homologia com proteínas relacionadas à Ehrlichia canis em análises ao
submetidas ao BLAST.
36
Foram identificadas dentro da superfamília MSP2, 15 OMPs (outer membrane
proteins), com sequências semelhantes à msp2 e/ou msp4. Estes genes podem ser
agrupados de forma isolada ou em estrutura similar a um operon (BRAYTON et al.
2006). Os genes omp2, omp3 e omp6 são, provavelmente, pseudogenes, uma vez
que não houve detecção de seus transcritos em estágios eritrocitários de diferentes
isolados de A. marginale (NOH et al. 2006; RAMOS et al. 2007).
As OMPs 4, 7, 10 e 14 ainda são proteínas com função indefinida em A.
marginale. São consideradas como membros da superfamília MSP2 devido a
homologia de sequencias aos antígenos de superfície da família pfam01617
(BRAYTON et al. 2005). Entretanto, estas OMPs servem como alvos para anticorpos
induzidos pela imunização de bovinos com membrana externa purificada e,
especificamente, por altos títulos de IgG2, que normalmente esta associada à
imunidade protetora (LOPEZ et al. 2005).
O isolado vacinal AMCE tem presentes em seu genoma apenas os genes
omp1, omp4, omp5, omp7, omp9, omp10, omp11, omp12, omp13 e omp14
(Genbank CP001759). A família das omps 1-15 presentes nos isolados americanos
de A. marginale se encontra reduzida no isolado AMCE. Nele as OMPs 7-9 estão
colapsadas em uma única região codante, e os homólogos OMPs 2, 3, 6 e 15 estão
ausentes (HERNDON et al., 2010).
A incorporação de múltiplos epítopos na imunização com DNA consiste de um
novo método para aumentar o potencial imunogênico, conferindo um maior grau de
proteção ao animal vacinado quando em comparação à vacinas de epítopo único
(KANO et al., 2008).
A expressão diferencial de omp1, omp4, omp7, omp8, omp9, e omp11 entre
tipos celulares aparenta ser regulada transcricionalmente. Os omps podem ser
transcritos nos eritrócitos bovinos, no intestino e na glândula salivar do carrapato, e
em cultura de células de carrapatos da linhagem IDE8. As proteínas OMP1, 4, 7, 8, 9
e 11 são expressas em eritrócitos bovinos infectados com A. marginale. Em células
de carrapatos, no entanto, a expressão das proteínas OMP 1, 4, 7, 8, 9 encontra-se
bastante reduzida e, no caso de OMP11, completamente ausente (NOH ET al.,
2006). Estas OMPs podem ter um papel na indução da imunidade protetora obtida
após a imunização com membrana externa purificada de A. marginale (BROWN et
al., 1998b). Nenhuma das MSPs anteriormente identificadas foi capaz de induzir
imunidade consistente (PALMER et al., 1988). As OMPs 4, 7, 10 e 14 tem sido
37
apontadas como alvos para anticorpos induzidos pela imunização de gado com
membranas externas purificadas e, especificamente, por altos títulos de IgG2
(BROWN et al., 1998a). A membrana de A. marginale é composta por proteínas com
amplas uniões covalentes e não covalentes intra e intermoleculares. Acredita-se que
as OMPs expressas desempenhem um papel de importância na manutenção desta
conformação estrutural (VIDOTTO et al., 1994).
O fato das OMPs não apresentarem grandes variações e de serem expressas
no interior dos eritrócitos infectados, as torna alvos interessantes para investigações
a respeito de sua importância na imunidade e relevância para o desenvolvimento de
vacinas (NOH et al., 2006).
Com a disponibilidade da sequência do genoma completo do isolado de St.
Maries de A. marginale, novas pesquisas para a identificação de OMPs ainda não
descritas no complexo de imunógenos de membranas externas se tornaram
possíveis. Tal fato possibilitou ainda a comparação do grau de conservação das
sequências de proteínas entre isolados distintos. Ao serem imunizados com
membranas externas de A. marginale purificadas bovinos obtiveram completa
proteção contra infecção, associada com a secreção de interferon γ mediada por
linfócitos T CD4+ e titulo de anticorpos IgG2. Assim, por meio de uma abordagem
genômica e proteômica foi possível a identificação de novas OMPs utilizando-se
anticorpos IgG2 de animais vacinados com estas com membranas purificadas.
Pesquisas sobre MSP2 de A.marginale realizadas no BLAST indicam que algumas
tem homologia com proteínas de A. phagocytophilum e com espécies do gênero
Ehrlichia (LOPEZ et al., 2005).
A análise das sequências genes omp1, omp4, omp5, omp7, omp8, omp10,
omp14, omp15, sodb, opag1, opag3, virb3, VirB9-1, pepA, ef-tu e am854,
de
diversas proteínas de membrana externa de um isolado brasileiro de A. marginale,
proveniente da zona da mata de Pernambuco, apontou homologia entre 92-100%,
com exceção de omp7, em comparação a isolados de outros países, indicando a alta
conservação e dando suporte à ideia de que estas proteínas possam ser utilizadas
na elaboração de vacinas (GUEDES JUNIOR et al., 2010)
2.3 Anaplasma phagocytophilum
38
Anaplasma phagocytophilum é o agente causador da Anaplasmose
Granulocitotrópica e possui ampla distribuição geográfica, sendo encontrado nos
Estados Unidos, Reino Unido, Noruega, Suécia, Suíça, Alemanha, Holanda,
Eslovênia, Espanha, França, Itália, Rússia, Coréia do Sul e Tailândia (GREIG &
ARMSTRONG, 2006; BELTRAME et al., 2006; AMUSATEGUI et al., 2006;
MATSUMOTO et al., 2006). Os tipos celulares infectados são principalmente
neutrófilos e eosinófilos, ocasionalmente o microrganismo pode ser visualizado em
monócitos (WOLDEHIWET, 2006) e eosinófilos (GREIG & ARMSTRONG, 2006).
O parasita já foi detectado infectando cães, equinos, gatos e seres humanos
(AGUERO-ROSENFELD, et al. 1996, BARLOUGH, et al. 1996; GREIG et al. 1996;
EGENVALL, et al. 1997; LAPPIN, et al. 2004). Na Europa, A. phagocytophilum é
reconhecido
como
um
agente
de
grande
importância
em
ruminantes
(WOLDEHIWET, 2006), tendo sido descritos em ovinos, caprinos, bovinos e lhamas
(DUMLER et al., 2005). Diversas espécies de roedores e cervídeos são implicadas
como reservatórios naturais do agente tanto nos EUA como na Europa (GREIG &
ARMSTRONG, 2006; WOLDEHIWET, 2006). Carrapatos coletados de aves
migratórias na Suécia estavam infectados por A. phagocytophilum, indicando que
estas
aves
podem
ter
um
papel
na
distribuição
geográfica
do
agente
(BJÖERSDORFF et al., 2001). Recentemente o agente foi descrito em roedores
selvagens, sugerindo que estes animais podem atuar como reservatórios da
infecção (LIZ et al., 2000).
Anaplasma phagocytophilum é a Riquétsia causadora da febre transmitida por
carrapatos (FTC), e da Anaplasmose Granulocítica em equinos (AGE) e seres
humanos (AGH) (MATSUMOTO et al., 2006). A infecção de ruminantes por A.
phagocytophilum
vem
sendo
descrita
na
Europa
há
mais
de
70
anos
(WOLDEHIWET, 2006). No Japão, o microrganismo foi encontrado em cervídeos e
bovinos (KAWAHARA et al., 2006; OOSHIRO et al., 2008). Nos EUA o agente é
frequentemente encontrado no Veado da Cauda Branca (Odocoileus virginianus).
A variante de A. phagocytophilum, responsável por causar a FTC em
ovinos, bovinos e caprinos, foi descrita pela primeira vez em 1940, o mesmo agente
foi detectado em seguida causando doença em ovinos e bovinos em outras partes
do
Reino
Unido, Escandinávia,
Irlanda
e
em
outras
partes
da
Europa
(WOLDEHIWET, 2010). As variantes de FTC em ruminantes na Europa diferem
daquelas que provocam AGH nos EUA e em partes da Europa com relação a sua
39
distribuição, hospedeiros susceptíveis, forma clínica e gravidade da doença. Nos
EUA, ruminantes domésticos não parecem ser susceptíveis à infecção por A.
phagocytophilum (PUSTERLA et al., 2001) enquanto que na Europa FTC é uma
doença comum em ruminantes (WOLDEHIWET & SCOTT, 1993).
2.3.1 TRANSMISSÃO
Em geral, os vetores são carrapatos ixodídeos, em especial do gênero Ixodes
(GREIG & ARMSTRONG, 2006). Na Coréia do Sul, o DNA do agente foi detectado
também em carrapatos da espécie Haemaphysalis longicornis (KIM et al., 2003). A
principal via de transmissão da infecção é através do carrapato vetor, mas a
transmissão transplacentária já foi observada em bovinos (PUSTERLA et al., 1997).
2.3.2 INFECÇÃO
A maioria dos surtos de FTC ocorre entre os rebanhos de ovelhas e bovinos
recém-introduzidos em pastagens infestadas por carrapatos, mas surtos isolados
têm sido relatados em cabras (GRAY et al., 1988). Entre os ruminantes de vida livre
no Reino Unido, o organismo foi detectado em cabras selvagens (Capra hircus)
(FOSTER & GREIG, 1969) e em cervídeos (Cervus elaphus; Dama dama; Capreolus
capreolus) (MCDIARMID, 1965; ALBERDI et al, 2000). O organismo foi detectado
também em uma variedade de cervídeos incluindo alce (Alces alces) e camurça
(Rupicapra rupicapra) na Noruega (STUEN et al, 2001; JENKINS et al, 2001),
Eslovénia (PETROVEC et al, 2002), Suíça (LIZ et al., 2002) e na Áustria (POLIN et
al., 2004). Não se sabe se as variantes de AGH podem causar doença clínica em
ruminantes domésticos em condições naturais. De acordo com TATE et al. (2005) os
cervos e as cabras são suscetíveis à infecção experimental com uma variante AGH,
Ap-Variante 1 (MASSUNG et al., 2006).
2.3.3 PATOGENIA
Os estágios iniciais da patogênese de A. phagocytophilum em seus vários
hospedeiros mamíferos continuam pouco claros. Por exemplo, ainda não se
estabeleceu o sítio de replicação das bactérias após sua entrada na derme pelo
repasto do carrapato e antes da bacteremia, que ocorre em quatro a sete dias. Um
40
estudo com ovinos infectados por variantes de FTC não demonstrou nenhuma
evidência de infecção em neutrófilos imaturos liberados da medula óssea ao sangue
periférico (WOLDEHIWET & SCOTT, 1982c). Quando ovelhas infectadas com uma
variante FTC foram tratadas com dexametasona, durante o período de pico de
bacteremia, a proporção de granulócitos circulantes aumentou para mais de 90%
dentro de duas horas, mas a porcentagem de neutrófilos infectados foi reduzida, o
que sugere que os neutrófilos imaturos mobilizados a partir da reserva de medula
óssea não foram infectados antes da sua chegada ao sangue periférico. Estudos in
vitro também demonstraram que as células endoteliais microvasculares podem
permitir o crescimento de variantes de AGH (MUNDERLOH et al., 2004).
Durante
o
período
de
pico
de
bacteremia
das
variantes
de
A.
phagocytophilum em ovinos, caprinos e bovinos, até 90% dos granulócitos podem
ser infectados, sendo a intensidade de bacteremia e a reação febril influenciadas
pela amostra infectante, imunidade do hospedeiro e susceptibilidade (FOGGIE,
1951; WOLDEHIWET & SCOTT, 1982a; WOLDEHIWET & SCOTT, 1993). Durante o
período de bacteremia dos organismos estão presentes nos neutrófilos, eosinófilos e
monócitos, sendo a infecção em monócitos mais predominante em fases tardias da
FTC (WOLDEHIWET, 1987a).
Em ovinos e bovinos com FTC e em cavalos com AGE, o período de
bacteremia é acompanhado de febre alta, que geralmente dura cerca de sete dias,
mas pode durar por períodos mais longos ( WOLDEHIWET, 1987a). A reação febril,
que pode ser superior a 41,8C, atinge o seu pico máximo durante o segundo dia de
bacteremia e pode durar até de duas semanas (FOGGIE, 1951; WOLDEHIWET,
1987a). Reações febris secundárias pode também ocorrer de duas a quatro
semanas após a primeira reação febril.
Um dos principais efeitos da infecção por variantes de FTC é leucopenia
severa devido à neutropenia e linfopenia. Trombocitopenia também é descrita
(FOSTER & CAMERON, 1969; WOLDEHIWET, 1987a; GOKCE & WOLDEHIWET,
1999a). Em ovinos e bovinos infectados o número de neutrófilos circulantes é
marcadamente reduzido durante o período de febre e bacteremia e pode continuar a
ser reduzido, por algum tempo, após o desaparecimento da reação febril e
bacteremia (WOLDEHIWET, 1987a). O período neutropênico coincide com
susceptibilidade aumentada a infecções bacterianas piogênicas (WOLDEHIWET &
SCOTT, 1993). A neutropenia atinge o seu ponto mais crítico de cerca de seis dias
41
após o início da bacteremia e febre, mas a linfopenia aparece mais cedo, atingindo o
seu ponto mais intenso cerca de cinco dias antes (WOLDEHIWET, 1987a). A
eosinopenia pronunciada é também relatada como uma característica importante da
FTC (VAN MIERT et al, 1984; WOLDEHIWET, 1987a;. CAMPBELL et al, 1994). A
linfopenia ocorre devido à redução no número de linfócitos T e B (WOLDEHIWET,
1991).
Anemia também é descrita em bovinos infectados por FTC (PURNELL et al,
1977, BRUN-HANSEN et al, 1998) e uma redução do número de eritrócitos
circulantes, hematócrito, volume corpuscular médio e concentração de hemoglobina
também foi relatada em ruminantes experimentalmente infectados (VAN MIERT et
al, 1984; GOKCE & WOLDEHIWET, 1999).
2.3.4 IMUNOSSUPRESSÃO
Os animais infectados podem apresentar sinais de imunossupressão, ficando
predispostos a infecções secundárias. Isso se dá devido a capacidade da riquétsia
de inibir as capacidades fagocíticas e bactericidas de neutrófilos (WHIST et al.,
2002).
Os primeiros relatos de FTC em ovinos e bovinos descrevem uma série de
sinais clínicos que eram atribuídos a infecções secundárias. Por exemplo, até 30%
de cordeiros infectados por FTC podem desenvolver “Tick pyaemia”, uma
claudicação incapacitante e paralisia, comum em fazendas infestadas por
carrapatos, devido à infecção por Staphylococcus aureus. Quando Hudson (1950)
descreveu pela primeira vez a doença em gado leiteiro, os sinais mais
predominantes clínicos observados foram tosse e diminuição na produção de leite.
Outros pesquisadores observaram sinais clínicos semelhantes em bovinos (FOGGIE
& ALLISON, 1960). Outros estudos no Reino Unido e Escandinávia estabeleceram
claramente que as variantes FTC são imunossupressoras, resultando em síndromes
de doenças, incluindo, “Tick pyaemia”, abortos (BRODIE et al., 1986; JONES &
DAVIES, 1995; GARCIA-PEREZ et al., 2003), pasteurelose (GILMOUR et al., 1982;
OVERAS et al., 1993) e listeriose septicemica (GRONSTOL & ULVUND, 1977).
Em bovinos, os primeiros indícios da doença podem ser sinais respiratórios,
devido a infecções secundárias, e uma queda na produção de leite (HUDSON,
1950). Em alguns casos, aborto em um grande número de vacas prenhes pode
42
ocorrer, especialmente quando as ovelhas e vacas são movidas para pastagens
infestadas durante os últimos estágios da prenhez (GARCIA-PEREZ et al., 2003).
Em cordeiros jovens, os principais sinais clínicos são provavelmente aqueles de
“Tick pyaemia”, a complicação mais comum e grave de FTC (BRODIE et al, 1986;
WOLDEHIWET & SCOTT, 1993). É, portanto, importante considerar FTC quando os
animais
que
foram
recentemente
introduzidos
em
pastagens
infestadas
desenvolvem doença febril, ou nos casos em que os sinais são mascarados por
infecções secundárias.
Estudos iniciais indicaram que os neutrófilos isolados a partir de ovelhas
infectadas apresentaram redução na capacidade de diapedese in vivo (FOSTER &
CAMERON, 1970), redução de migração in vitro (WOLDEHIWET & SCOTT, 1982c)
e diminuição de aderência a superfícies de vidro (WOLDEHIWET, 1987a). Outros
estudos in vivo, demonstraram que o organismo influencia negativamente na
capacidade fagocítica e bactericida de neutrófilos de ovinos (WOLDEHIWET, 1987a;
BATUNGBACAL, 1995; WHIST et al, 2002) e que os neutrófilos infectados são mais
susceptíveis aos citotoxinas de Mannheimia (anteriormente Pasteurella) haemolytica
(WOLDEHIWET et al., 1993). Existe alguma evidência para sugerir que o efeito
imunossupressor do organismo não está limitado aos seus efeitos sobre
granulócitos. Estudos em ovinos infectados com FTC também têm demonstrado que
alguns fatores liberados no decurso do período de bacteremia podem causar
diminuição na migração de leucócitos e reduzida resposta proliferativa de linfócitos
(WOLDEHIWET & SCOTT, 1982b; WOLDEHIWET, 1987b; GOKCE et al, 1999).
2.3.5 IMUNIDADE ADQUIRIDA
Os animais infectados podem permanecer como portadores por meses, ou
mesmo anos após se recuperarem de uma infecção (WOLDEHIWET, 2006). As
primeiras observações com ovinos e bovinos infectados por variantes FTC
demonstraram que após a remoção do carrapato de pastagens infestadas e
reintrodução de alguns meses mais tarde, alguns animais desenvolveram reação
febril e bacteremia, enquanto outros permaneceram imunes (HUDSON, 1950;
FOGGIE, 1951). Estudos experimentais têm também demonstrado que a infecção
primária é seguida por um grau variável de resistência (FOGGIE, 1951;
WOLDEHIWET E SCOTT, 1982a). Alguns animais resistiram à reinfecção por
43
apenas alguns meses, mas outros foram protegidos contra bacteremia após o
desafio com a mesma variante por mais de um ano (FOGGIE, 1951; WOLDEHIWET
& SCOTT, 1993). A resistência foi influenciada pela variante, a idade e o tipo de
hospedeiro, o período de tempo entre a infecção primária e desafio e a frequência
da exposição à infecção (FOGGIE, 1951; WOLDEHIWET E SCOTT, 1982a).
Apesar de ovinos e bovinos previamente expostos a uma variante FTC terem
apresentado febre e bacteremia após a exposição a uma segunda variante de FTC,
a duração da febre e a magnitude bacteremia foram significativamente mais baixas
do que as observadas em animais nunca antes expostos ao agente (WOLDEHIWET
& SCOTT, 1982b), sugerindo que as diferentes variantes compartilham alguns
antígenos comuns. Em um estudo experimental com anticorpos, IgG e IgM
específicos foram detectados em ovelhas dentro de duas semanas após a infecção
com uma variante FTC, IgM sendo predominante durante as primeiras três semanas
e depois IgG (WOLDEHIWET & SCOTT, 1982). No entanto, o mesmo estudo
demonstrou que a classe de anticorpos IgM continuou a ser detectada no soro de
animais persistentemente infectados.
Ovelhas que tenham se recuperado de uma infecção por A. phagocytophilum
podem continuar a abrigar o organismo por várias semanas ou mesmo anos. O
sangue de um animal foi demonstrado infectante para ovelhas nunca antes expostas
ao agente durante 25 meses (FOGGIE, 1951). Ovelhas persistentemente infectadas
não desenvolvem sinais clínicos, mas podem desenvolver bacteremia após
esplenectomia e podem servir de fonte potencial para infecção em ovelhas que não
tiveram contato com o agente. (FOGGIE, 1951; WOLDEHIWET & SCOTT, 1993).
Infecções persistentes com variantes de AGH também têm sido relatadas em
condições naturais, em ratos (TELFORD et al, 1996, CASTRO et al, 2001).
Entretanto, um estudo indicou que em cavalos infectados o estado de portador com
variantes AGE é incomum (NYINDO et al ., 1978). Há muito poucos estudos para
investigar infecções persistentes de AGH em humanos.
2.3.6 DIVERSIDADE ANTIGÊNICA
Os primeiros estudos utilizando variantes de FTC de ovelhas e bovinos
sugeriram uma alta diversidade antigênica entre diferentes isolados de A.
phagocytophilum (FOGGIE de 1951). Animais sensibilizados não resistiram a
44
desafios sequenciais com várias variantes heterólogas, cada um causando uma
reação . A infecção com um isolado bovino não conferia proteção contra um desafio
com isolado de ovinos (FOGGIE E ALLISON, 1960). Entretanto, alterações
sequenciais em algumas das principais proteínas de superfície de Anaplasma spp.
durante suas recorrentes bacteremias (FRENCH et al, 1999;.. ZHI et al, 1999),
geraram dúvida se a grande variabilidade observada inicialmente em ruminantes
infectados por FTC eram um reflexo verdadeiro de uma diversidade de variantes.
Embora significativo progresso tenha sido alcançado, os mecanismos de variação
antigênica dentro das mesmas variantes e em diferentes linhagens, parecem ser
complexos. Aparentemente, a alta variação antigênica observada esta relacionada à
expressão variável de genes parálogos que codificam a principal proteína de
membrana externa da bactéria (ZHI et al., 1999).
A diferenciação das variantes de FTC, AGH ou outras variantes de A.
phagocytophilum requer a sequenciamento de fragmentos amplificados do gene 16S
de RNAr, em que as variantes de FTC diferem das variantes AGE / AGH em três
posições (CHEN et al., 1994). Cinco variantes foram detectadas em um rebanho
norueguês de ovelhas infectadas por FTC (STUEN et al., 2002). Outra diferença
entre a sequências de diferentes isolados foi relatada a partir da análise do operon
groESL de choque térmico (POLIN et al., 2004). As variantes que infectam os
ruminantes na Europa podem ser diferenciadas de variantes que infectam cães,
cavalos e seres humanos por sequenciamento msp4, um dos genes que codificam
as principais proteínas de superfície (DE LA FUENTE et al., 2005b).
2.3.7 IMPORTÂNCIA ECONÔMICA
Quase metade da população de ovinos (> 30 milhões) no Reino Unido vive
em áreas montanhosas, muitas vezes infestadas por carrapatos, estima-se que
aproximadamente 300.000 cordeiros desenvolveram “Tick pyaemia” secundário a
FTC (BRODIE et al., 1986 ). A maioria dos cordeiros que desenvolvem a
complicação morrem, ou não são de nenhum valor econômico. De acordo com um
estudo na França, vacas infectadas podem sofrer parada total na produção de leite
durante a fase aguda da infecção (JONCOUR et al., 2000). A perda econômica para
os produtores de leite devido à FTC não tem sido investigada, mas é provável que
seja considerável e estão relacionadas a abortos, diminuição na produção de leite e
45
morte por infecções secundárias. Portanto, há justificativa econômica e de bem-estar
para o diagnóstico e controle da FTC e febre do pasto em ruminantes.
2.3.8 INFECÇÕES EM HUMANOS
Até o presente momento cinco espécies da família Anaplasmataceae foram
descritas infectando humanos: Ehrlichia chaffeensis, Ehrlichia ewingii, Ehrlichia
canis, Anaplasma phagocytophilum e Neorickettsia sennetsu (DUMLER, 2005). O
número de casos de Erliquiose Monocítica Humana (EMH), causada por E.
chaffeensis, e de Anaplasmose Granulocítica Humana (AGH), causada por A.
phagocytophilium, nos EUA cresceu 32% entre os períodos 1999/00 e 2001/02
(DEMMA et al., 2006). Desde 1986, pelo menos 1.979 casos de EMH, 2.189 de AGH
e 153 casos de Erliquiose “inespecífica” foram notificados ao CDC (Centers for
Disease Control and Prevention) nos EUA. Estes dados colocam AGH e EMH,
respectivamente, como a terceira e a quarta doenças transmitidas por carrapatos
mais comuns nos EUA, atrás apenas da Doença de Lyme e da Febre Maculosa das
Montanhas Rochosas (DUMLER, 2005).
A AGH ocorre atualmente em ao menos 14 países europeus (BLANCO &
OTEO, 2002; STRLE, 2004). Estudos também mostram a presença de E.
chaffeensis e A. phagocytophilum na Coréia do Sul (HEO et al., 2002). Na América
da Sul, há relato de infecção humana por E. canis na Venezuela, com pacientes
apresentando sintomatologia clínica (PEREZ et al., 2006).
No Brasil já foram relatados casos suspeitos de EMH em Minas Gerais, onde
se observou títulos de anticorpos para E. chaffeensis em dois pacientes com
sintomatologia clínica. Não houve identificação molecular do agente em nenhum dos
casos (CALIC et al., 2005).
Variantes de A. phagocytophilum que causam AGH em humanos na Europa
são geneticamente diferentes das variantes de FTC que afetam ruminantes. As
tentativas de reproduzir doença clínica e bacteremia em gado com variantes AGH ou
AGE não foram bem sucedidas (PUSTERLA et al., 2001). Contudo, um estudo
recente mostrou que a variante de AGH norte americana (variante Ap-1), que não
está associada com a doença humana e não infecta ratos, pode infectar cervídeos e
caprinos (MASSUNG et al., 2006).
46
É difícil se estabelecer a duração e magnitude da bacteremia em pacientes
humanos infectados com variantes HGA porque exame laboratorial é raramente
realizado durante as fases iniciais da infecção. No entanto, os poucos dados
publicados parecem indicar que as taxas de infecção de granulócitos humanos são
inferiores as observadas em cavalos infectados com variantes AGE e ruminantes
infectados com variantes FTC. Em um estudo (AGUERO-ROSENFELD et al., 1996)
apenas três dos 12 (25%) pacientes com sinais clínicos de AGH tiveram mórulas
detectáveis em neutrófilos e eosinófilos. A proporção de granulócitos infectados foi
muito baixa, variando entre 0,3% e 6%. Reações febris são também os principais
sinais de infecção por AGH, mas a duração da febre durante a infecção primária não
esta claramente definida porque os pacientes são geralmente tratados com
doxiciclina precocemente. No entanto, um estudo esloveno, onde 26 de 30 pacientes
que não foram tratados com antibióticos demonstrou que o período febril teve uma
duração média de sete dias (LOTRIČ-FURLAN et al., 2001).
Nos seres humanos infectados com variantes AGH os principais efeitos
hematológicos também são leucopenia e trombocitopenia (BAKKEN & DUMLER,
2000). Embora o número de pacientes investigados seja pequeno, há também
provas suficientes de imunossupressão em humanos infectados com variantes de
AGH (LEPIDI et al., 2000). Esta conclusão é baseada no número de mortes por
infecções secundárias documentadas e falhas de órgãos em casos confirmados
(AGUERO-ROSENFELD et al, 1996). A maioria das mortes após AGH não poderia
ser diretamente atribuída à infecção em si, mas aos achados patológicos envolvidos
com inabilidade de defesa do hospedeiro e presença de infecções secundárias
(DUMLER, 1997). Assim, o diagnóstico de AGH pode ser facilmente mascarado por
infecções secundárias ou confundido com outras causas de síndromes gripais ou
pirexia de origem desconhecida.
O diagnóstico laboratorial é semelhante ao usado em ovinos e bovinos
infectados com variantes de FTC, incluindo a detecção de inclusões citoplasmáticas
em granulócitos, o isolamento de células HL-60, a detecção de ácidos nucleicos
específicos por PCR e determinação de títulos de anticorpos (AGUEROROSENFELD, 2002).
2.4 Neorickettsia risticii
47
Neorickettsia risticii é o agente causador da Febre do Potomac em equinos,
doença caracterizada por febre, leucopenia, apatia, anorexia, desidratação, diarréia
aquosa, laminite e/ou abortamento (RIKIHISA & PERRY, 1985). A mortalidade da
doença varia entre 5 e 30%(RIKIHISA, 1991). A doença foi observada pela primeira
vez em 1979, porém somente em 1984 foi detectada a presença do agente nas
células intestinais de cavalos infectados (RIKIHISA et al., 1984).
A infecção é observada principalmente nos meses mais quentes, em especial
de junho a setembro no hemisfério norte. Atualmente este agente é observado com
frequência nos EUA e no Canadá (PALMER et al., 1986; MCLAUGHLIN et al., 1996;
HELLER et al., 2004). Na América do Sul o agente já foi descrito no Brasil e no
Uruguai (DUTRA et al., 2001). Assim como nos Estados Unidos, a enfermidade
demonstra tendência sazonal e endêmica, com a ocorrência da maioria dos casos
nos meses mais quentes do ano e em regiões alagadiças no Rio Grande do Sul e no
Uruguai (GOETZ et al., 1989; DUTRA et al., 2001).
Neorickettsia risticii apresenta uma grande semelhança genética com
organismos como Neorickettsia sennetsu e Neorickettsia helminthoeca (LIN et al.,
2009), ambos transmitidos por via oral, indicando que este mesmo padrão de
transmissão se aplique a N. risticii (BARLOUGH et al. 1998; PUSTERLA et al. 2000).
No ambiente natural, Neorickettsia spp. são encontradas no interior de trematódeos
que usam caramujos e insetos aquáticos como hospedeiros intermediários e
morcegos e pássaros insetívoros como hospedeiros definitivos, podendo ser
transmitidas tanto de forma de transestadial como transovariana, sem que ocorra
prejuízo aparente ao trematódeo hospedeiro (GIBSON et al., 2005). Após a ingestão
cercárias de trematódeos infectadas N. risticii é transmitida de forma horizontal para
os animais se reproduzindo no interior de monócitos, macrófagos, mastócitos e
células do epitélio intestinal (MOTT et al., 1997).
Observa-se uma depleção do número de células caliciformes e perda das
microvilosidades das células do epitélio intestinal. A patogênese da diarréia aquosa
está relacionada a uma redução do transporte de eletrólitos, principalmente Na+ e Cl, com consequente prejuízo da reabsorção de água (RIKIHISA, 1991). Dentre as
alterações patológicas mais consistentemente encontrada podemos citar a presença
de conteúdo fluído no cólon maior e ceco, e a presença de áreas hiperêmicas de
extensão e distribuição variáveis ao longo da mucosa intestinal. O conteúdo
presente no intestino Delgado varia de consistência mucosa a aquosa (Cordes et al.
48
1986). As alterações microscópicas revelam uma enterocolite linfohistiocitária,
caracterizada por congestão, necrose epitelial superficial e infiltrado inflamatório
mononuclear na lâmina própria e submucosa do ceco e cólon maior (Dutra et al.
2001).
Acredita-se que diferentes espécies de caramujos estejam envolvidas na
transmissão de N. risticii. No norte da Califórnia, caramujos das espécies Juga
yrekaensis, Planorbella subcrenata e do gênero Stagnicola são apontados como
possíveis vetores de trematódeos portadores de N. risticii. Além disso, o DNA da
riquétsia já foi detectado em cercárias encontradas em caramujos Elimia livescens
no Estado de Ohio e Elimia virginica na Pensilvânia, EUA (BARLOUGH et al. 1998;
KANTER et al., 2000; PUSTERLA et al., 2013).
No Brasil a presença de trematódeos infectados foi observada em caramujos
do gênero Heleobia, das espécies H. piscium, H. parchappei e H. davisi (COIMBRA
et al., 2005).
Perry et al., em 1989 avaliaram o papel de outras espécies de animais, além
dos equinos, na epidemiologia da doença, observando a presença de cães, gatos,
suínos e caprinos com sorologia positiva para N. risticii em regiões nas quais o
agente é endêmico.
A susceptibilidade de bovinos à infecção por N. risticii foi testada através da infecção
experimental de dois animais. Foi possível a detecção do DNA do agente no sangue,
entre os dias 9 e 12 pós-inoculação, e nas fezes entre os dias 13 e 18. Nenhum dos
animais apresentou sinais clínicos de doença (PUSTERLA et al.,2001). Estes dados
indicam que ruminantes, dentre outros animais, podem ser susceptíveis a infecção
por N. risticii, podendo ter um papel na epidemiologia desta riquétsia.
2.5 Anaplasma ovis
Anaplasma ovis é classicamente considerado o agente da anaplasmose em
ovinos e caprinos (KOCAN et al., 2010), porém estudos demonstram que cervídeos
(DE LA FUENTE et al, 2008) e bovinos (HORNOK et al., 2010; HORNOK et al.,
2012) também podem ser infectados.
A ocorrência de A. ovis, tem sido relatada em vários países da Europa como
Hungria (HORNOK et al., 2007) Italia (DE LA FUENTE et al., 2005), Turquia (SAYIN
et al., 1997), Grécia (PAPADOPOULOS, 1999), Romênia e Bulgaria (CHRISTOVA et
49
al., 2003), África, Estados Unidos (NDUNG’U et al., 1995) e Ásia (LIU et al., 2005).
No entanto, nos países da América do Sul, dentre os quais o Brasil, os estudos
acerca da ocorrência de anaplasmose em pequenos ruminantes são escassos. No
semiárido de Pernambuco foram observadas frequências de anticorpos para
Anaplasma sp. em 11,93% e 16,17% dos caprinos e ovinos testados,
respectivamente (RAMOS et al.,2008).
Carrapatos do gênero Dermacentor são apontados como o vetor de A. ovis no
oeste dos EUA. Na Europa, carrapatos da espécie Rhipicephalus bursa são
apontados como os principais vetores (DE LA FUENTE et al., 2007). Já foi detectada
a presença do DNA de A. ovis em moscas da família Hippoboscidae, das espécies
Melophagus ovinus e Lipoptena cervi, que infectam respectivamente ovinos e
cervídeos (HORNOK et al.,2011).
A infecção por A. ovis é geralmente subclínica, com febre discreta e poucos
prejuízos econômicos perceptíveis (STUEN, 2013). Anemia hemolítica é o principal
achado nos casos em que há o agravamento da doença. A associação entre a
infecção por A. ovis e a ocorrência de abortamentos foi relatada por Barry e Van
Niekerk (1990) em caprinos na África do Sul. Os achados indicavam a transmissão
transplacentária do agente, levando a morte do feto por anemia hemolítica.
Em ovelhas experimentalmente infectadas a parasitemia foi detectada no
terceiro dia pós infecção, atingindo níveis máximos no 12º dia.
Os valores do
hematócrito, hematimetria e hemoglobinometria sofreram diminuição enquanto o
volume globular médio aumentou significativamente durante o curso da infecção.
Aumento do número de Reticulócitos e presença de ponteado basofílico também
foram observados. Não foram encontradas alterações no leucograma e nenhum dos
animais apresentou febre. A anemia observada foi classificada como sendo
macrocítica e normocrômica, com características regenerativas, compatível com
quadro hemolítico (YASINI et al., 2012).
Chochlakis et al.,(2010) relatam um caso de infecção por A. ovis em ser
humano, no Chipre. Uma mulher de 27 anos apresentou um quadro de febre
persistente (11 dias) e não responsiva ao tratamento após uma picada de carrapato.
Ao ser internada em um hospital ela apresentava hepatoesplenomegalia e
linfonodos aumentados. As alterações laboratoriais observadas foram Anemia
moderada, trombocitopenia, aumento das atividades séricas de AST, ALT, GGT e
LDH, aumento nos níveis de Proteína C Reativa e aumento da Velocidade de
50
Hemossedimentação. O diagnóstico foi obtido através da detecção por PCR do
agente em amostras de sangue da paciente.
51
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 DETECÇÃO MOLECULAR DE ORGANISMOS DA FAMÍLIA Anaplasmataceae
EM BOVINOS E OVINOS NO MUNICÍPIO DE CACHOEIRAS DE MACACU
3.1.1 ANIMAIS
Foram coletadas amostras de bovinos e ovinos provenientes da Fazenda
Escola da Faculdade de Veterinária – UFF localizada no município de Cachoeiras de
Macacu – RJ.
As amostras de 94 bovinos da Raça Girolando foram submetidas a testes
para a detecção de A.phagocytophilum, N. risticii e A. marginale.
As amostras de 59 bovinos da raça Santa Inês foram submetidas a testes
para a detecção de A.phagocytophilum, N. risticii, A. marginale e A. ovis.
3.1.2 CACHOEIRAS DE MACACU
O município de Cachoeiras de Macacu (Figura 1), localizado no estado do Rio
de Janeiro, Brasil, encontra-se a uma latitude 22º27'45"sul e a uma longitude
42º39'11" oeste, estando a sede do município a uma altitude entre cinquenta e 57
metros. De acordo com o censo de 2010 do Instituto Brasileiro de Geografia e
Estatística (IBGE), o município possui população de 54.273 habitantes, área
territorial de 953,801 Km2.
52
Figura 1: Mapa da localização geográfica do município de Cachoeiras de Macacu
(em vermelho) no estado do Rio de Janeiro.
3.1.3 COLETA DAS AMOSTRAS
Foram coletadas amostras de sangue
sangue periférico, da veia mamária nos bovinos
b
e da jugular nos ovinos, e confeccionados esfregaços sanguíneos de todos os
animais de ambos os plantéis.
As amostras de sangue foram acondicionadas em tubos contendo
anticoagulante (EDTA) e tubos sem anticoagulante, que foram refrigerados (4ºC) em
caixa térmica contendo gelo.
As amostras foram encaminhadas ao Laboratório Clínico Veterinário do
Hospital Veterinário Firmino Mársico Filho, da UFF, para realização de hemograma,
hemograma
pesquisa de hemoparasitas e dosagens bioquímicas.
53
3.1.4. HEMOGRAMAS E PESQUISA DE HEMOPARASITAS
Os hemogramas foram realizados no Laboratório Clínico Veterinário da
Faculdade de Veterinária da UFF, em um contador automático de células veterinário,
POSCH-100i (Sysmex®), que determina análises quantitativas do eritrograma
(hematócrito, hematimetria e hemoglobinometria), além de calcular os índices
hematimétricos (VGM e CHGM) e determinar o valor quantitativo de leucócitos totais
e plaquetas. Para a realização de leucometria específica, hematoscopia e
diagnóstico morfológico de hemoparasitas, esfregaços sanguíneos foram corados
por Giemsa (MERK®) e visualizados em microscópio óptico em objetiva de imersão.
As proteínas plasmáticas totais e o fibrinogênio foram determinados por
refratometria. O intervalo de referência utilizado na avaliação dos hemogramas se
encontra no Quadro 1.
Quadro 1: Intervalo de referência para parâmetros hematológicos de bovinos e
ovinos.
HEMOGRAMA - Intervalo de Referência*
Hematimetria (x106/µ
µL)
Hemoglobina (g/dL)
Volume Globular (%)
VGM (fL)
CHGM (%)
Leucometria Global (/µ
µL)
Basófilos (/µ
µL)
Eosinófilos (/µ
µL)
Mielócitos (/µ
µL)
Metamielócitos (/µ
µL)
Bastonetes (/µ
µL)
Neutrófilos Segmentados (/µ
µL)
Linfócitos (/µ
µL)
Monócitos (/µ
µL)
Bovinos
Ovinos
5,0 – 10,0
8,0 15,0
24 – 46
40 – 60
30 – 36
4.000 – 12.000
0 – 120
0 – 2400
0
0
0 – 200
600 – 4000
2500 – 7500
25 – 840
8,0 – 16,0
8,0 – 16,0
24 – 50
23 – 48
31 – 38
4.000 – 12.000
Raros
0 – 1000
0
0
0 – 300
700 – 6000
2000 – 9000
0 – 750
*JAIN, 1993
As amostras de sangue total foram congeladas em freezer -20ºC e
transportadas sob refrigeração (4ºC) para o Laboratório de Hemoparasitos e vetores
da UFRRJ, para posterior extração do DNA e realização da PCR.
3.1.5 BIOQUÍMICA SÉRICA
54
As dosagens bioquímicas foram realizadas no Laboratório Clínico Veterinário
da Faculdade de Veterinária da UFF, em um analisador semiautomático BIO-2000
(Bioplus®). Os parâmetros analisados foram: ALT, AST, fosfatase alcalina, ureia e
creatinina. Os intervalos de referência utilizados se encontram no Quadro 2.
Quadro 2: Intervalo de referência para parâmetros bioquímicos de bovinos e ovinos
PERFIL BIOQUÍMICO - Intervalos de Referência*
ALT(U/L)
AST(U/L)
Fosfatase Alcalina (U/L)
Uréia (mg/dL)
Creatinina sérica(mg/dL)
Bovinos
14,0 – 38,0
20,0 – 34,0
0,0 - 488,0
20,0 – 30,0
1,0 – 2,0
Ovinos
34,0 – 42,0
68,0 – 90,0
68,0 – 387,0
8,0 – 20,0
1,2 – 1,9
*KANEKO, 1998
3.1.6 EXTRAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DO DNA GENÔMICO
O DNA das amostras dos grupos I, II E III foi extraído no Laboratório de
Hemoparasitos e Vetores do Departamento de Parasitologia Animal da UFRRJ, a
partir de 200 µL de sangue total utilizando-se o PureLink® Genomic DNA Mini Kit
(Invitrogen™) de acordo com as instruções do fabricante.
O DNA de extraído foi quantificado individualmente em espectrofotômetro
NanoDrop 2000c (Thermo Scientific), obtendo-se a concentração de DNA em
nanogramas por microlitro (ng/µL). Posteriormente, preparou-se uma solução de uso
de DNA, com quantidade padronizada de 60ng/µL em todas as amostras com
concentração superior a este valor, diluindo-se o DNA no tampão de eluição
proveniente do kit de extração PureLink® Genomic DNA Mini Kit (Invitrogen™). As
amostras de DNA com concentração padronizada foram estocadas a -20ºC até o
momento de sua utilização para a PCR.
3.1.7 PCR EM TEMPO REAL
3.1.7.1 PROTOCOLO I ( ANAPLASMA PHAGOCYTOPHILUM)
55
As amostras dos grupos I e II foram testadas para a presença de um
fragmento amplificado de 122 pares de bases do gene msp2 de A. phagocytophilum.
A PCR em tempo real foi realizada por meio do sistema de detecção Taqman, sendo
utilizada a sonda 939p-TTAAGGACAACATGCTTGTAGCTATGGAAGCGC marcada
com fluorescência na extremidade 5' com o "reporter dye" 6-FAM e na extremidade
3' com o "quencher" TAMRA. Os iniciadores utilizados foram o 903f "forward" e o
1024r "reverse"(Quadro 3) (DRAZENOVICH et al., 2006). Para reação com volume
final de 12µL foram utilizados 6µL taqman universal PCR master mix (1X) (Applied
Biosystems, Foster City -CA, USA), 3 microlitros de DNA alvo, 200 nM de cada
iniciador e 100nM da sonda. As condições de reação foram as seguintes: 50ºC
durante 2 minutos, 95º C durante 10 minutos, e 40 ciclos a 95ºC durante 15
segundos, seguido por 60ºC durante 1 minuto no equipamento StepOnePlus
(Applied Biosystems, Foster City-CA, USA). Foram consideradas positivas somente
as amostras com Ct ("cycle threshold") menor ou igual a 40.
Quadro 3: Iniciadores utilizados na amplificação de um fragmento de 122 pares de
bases do gene msp2 de A. phagocytophilum.
Iniciadores
Sequências (5’ – 3’)
903f
1024r
AGTTTGACTGGAACACACCTGATC
CTCGTAACCAATCTCAAGCTCAAC
3.1.7.2 PROTOCOLO II (NEORICKETTSIA RISTICII)
A PCR em tempo real foi realizada por meio do sistema de detecção Taqman e a
sonda utilizada foi a ER77p:ACGCACCCGTCTGCCACGGGA marcada com
fluorescência na extremidade 5' com o "reporter dye" 6-FAM e na extremidade 3'
com o "quencher" TAMRA. Os iniciadores utilizados foram o ER 133f "forward" e o
ER 54 "reverse" (Quadro 4). Proporcionando um fragmento amplificado de 85 pares
de bases do gene 16S rRNA (PUSTERLA et al., 2000)
56
Para reação com volume final de 12µL foram utilizados 6µL taqman universal
PCR master mix (1X) (Applied Biosystems, Foster City -CA, USA), 400 nM de cada
iniciador, 100 nM da sonda e 3µL de DNA alvo.
As condições de reação são: uma etapa inicial de 50º C por 2 minutos, 10
minutos de desnaturação inicial, 45 ciclos de 95ºC por 15 segundos e 60ºC por 60
segundos. Foram consideradas positivas somente as amostras com Ct ("cycle
threshold") menor ou igual a 40.
Quadro 4: Iniciadores utilizados na amplificação de fragmento de 85 pares de bases
do gene 16S rRNA de Neorickettsia risticii
Iniciadores
Sequências (5’ – 3’)
GTTATTCCCTACTACCAGGCAAGTTC
AACGGAATCAGGGCTGCTT
ER133f
ER54r
3.1.8 PCR
3.1.8.1 REAÇÕES DE PCR PARA ANAPLASMA MARGINALE
Para a detecção de A. marginale o protocolo de detecção utilizou os
iniciadores internal forward e external reverse (Quadro 5), que amplificam um
fragmento de 345pb do gene msp5 (TORIONI DE ECHAIDE et al., 1998).
As
reações foram preparadas para um volume final de 25µL com 22,5µL deMasterMix
contendo
22U/mL Taq DNA polimerase, 22mM Tris-HCl (pH 8.4), 55mM KCl,
1.65mM MgCl2, 220µM dNTPs, 0,2µM de cada iniciador e 2µL de DNA alvo.
Quadro 5: Iniciadores utilizados na amplificação de fragmento de 345 pares de base
do gene msp5 de Anaplasma marginale
Iniciadores
Sequências (5’ – 3’)
Internal foward
External reverse
TACACGTGCCCTACCGACTTA
TCCTCGCCTTGCCCCTCAGA
As condições de reação foram: aquecimento a 95°C por 3 minutos, seguido
de 35 ciclos de 95°C por 30s, 65°C por 58s e 72°C por 30s com uma extensão final
a 72°C durante 10 minutos.
3.1.8.2 REAÇÕES DE PCR PARA ANAPLASMA OVIS
57
Para a detecção de A. ovis o protocolo de detecção utilizou os iniciadores
AovisMSP4Fw
e AovisMSP4Rev (Quadro 6), que amplificam um fragmento de
346pb do gene msp4
de A. ovis (TORINA et al., 2012).
As reações foram
preparadas para um volume final de 50µL com 1,25U de Taq DNA polimerase,
22mM Tris-HCl (pH 8.4), 55mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 0.2 mM de cada dNTP, 0,4µM
de cada iniciador e 2µL de DNA alvo.
Quadro 6: Iniciadores utilizados na amplificação de fragmento de 346 pares de base
do gene msp4 de Anaplasma ovis
Iniciadores
Sequências (5’ – 3’)
AovisMSP4Fw
AovisMSP4Rev
TGAAGGGAGCGGGGTCATGGG
GAGTAATTGCAGCCAGGGACTCT
As condições de reação foram: aquecimento a 95°C por 10 s, seguido de 30
ciclos de 94°C por 30s, 62°C por 15s e 72°C por 30s com uma extensão final a 72°C
durante 5 minutos.
3.1.8.3 REAÇÕES DE PCR PARA FAMILIA ANAPLASMATACEAE
Para a detecção de organismos da família Anaplasmataceae o protocolo de
detecção utilizou os iniciadores ge3a e ge10r (Quadro 7), que amplificam um
fragmento de 932pb do gene 16S rRNA (MASSUNG et al., 1998). As reações foram
preparadas para um volume final de 50µL com 200 µM de cada dNTP, 1,25U de Taq
DNA polimerase, 22mM Tris-HCl (pH 8.4), 55mM KCl, 1.65mM MgCl2, 220µM
dNTPs, 0,5µM de cada iniciador e 2µL de DNA alvo.
Quadro 7: Iniciadores utilizados na amplificação de fragmento de 932 pares de base
do gene 16S rRNA de Anaplasma sp.
Iniciadores
Sequências (5’ – 3’)
CACATGCAAGTCGAACGGATTATTC
TTCCGTTAAGAAGGATCTAATCTCC
ge3a
ge10r
As condições de reação foram: aquecimento a 95°C por 2 minutos, seguido
de 40 ciclos de 94°C por 30s, 55°C por 30s e 72°C por 1 minuto com uma extensão
final a 72°C durante 5 minutos.
58
A reação nested utilizou os iniciadores ge3a e ge10r (Quadro 8), que
amplificam um fragmento de 546pb do gene 16S rRNA (MASSUNG et al., 1998). As
reações foram preparadas para um volume final de 50µL com 200 µM de cada
dNTP, 1,25U de Taq DNA polimerase, 22mM Tris-HCl (pH 8.4), 55mM KCl, 1.65mM
MgCl2, 220µM dNTPs, 0,5µM de cada iniciador e 1µL do amplicom da reação
anterior..
Quadro 8: Iniciadores utilizados na amplificação de fragmento de 546 pares de base
do gene 16S rRNA de Anaplasma sp.
Iniciadores
Sequências (5’ – 3’)
AACGGATTATTCTTTATAGCTTGCT
GGCAGTATTAAAAGCAGCTCCAGG
ge9f
ge2
As condições de reação foram: aquecimento a 95°C por 2 minutos, seguido
de 30 ciclos de 94°C por 30s, 55°C por 30s e 72°C por 1 minuto com uma extensão
final a 72°C durante 5 minutos.
3.1.9 CLONAGEM E SEQUENCIAMENTO
As amostras positivas na PCR em tempo real para A. phagocytophilum foram
submetidas novamente a amplificação de 122pb do gene msp2 através de uma
touchdown PCR. As reações de PCR foram realizadas em volume final de 50µL
contendo: 5,0µL do tampão da PCR (10mM Tris-Cl (pH=8,3), 50mM KCl)
(Invitrogen®), 3,0mM (MgCl2 -50 mM, Invitrogen®), 0,2 mM de cada nucleotídeo
(dATP, dGTP, dTTP e dCTP-100mM) (Invitrogen®), 0,2µM dos primers 903f e 1024r
(DRAZENOVICH et al. 2006), 0,05% de Tween 20 10%, 5,0% de Glicerol 87%, 1,5U
de Platinum Taq DNA Polimerase (Invitrogen®) e 5,0 µL da amostra de DNA
(aproximadamente 150ng de DNA total). O programa de amplificação constituiu de
um passo de desnaturação inicial a 95 ºC por 5 min, 10 ciclos com temperatura de
desnaturação de 95 ºC por 30s, temperatura de anelamento começando em 65 ºC
com decréscimo de 0,5 ºC a cada ciclo e terminando em 60 ºC por 20s em cada
ciclo, temperatura de extensão de 72 ºC por 20s, seguido de 35 ciclos com
temperatura de desnaturação de 95 ºC, anelamento a 60 ºC por 20s, extensão a 72
ºC por 20s e extensão final a 72 ºC por 2 min.
59
Os produtos da PCR foram purificados, em seguida clonados e sequenciados
(SANGER et al., 1977). A clonagem foi realizada em vetor pGEM-T® Easy Vector
System (Promega, Madison, WI, USA), de acordo com as recomendações do
fabricante. O DNA plasmidial dos clones positivos foram isolados pelo kit
PureYieldTM Plasmid Miniprep System (Invitrogen, Carlsband, CA, USA.) seguindo
as recomendações do fabricante e em seguida foram enviados para o
sequenciamento no Centro de Estudos do Genoma Humano da Universidade de
São Paulo (USP) (ABI 3730 DNA Analyser – Applied Biosystems/Perkin Elmer, CA,
USA). A identidade do fragmento de 122pb do gene msp2 de A. phagocytophilum
sequenciado no presente estudo foi analisada através do alinhamento múltiplo
utilizando a ferramenta Basic Local Alignment Search Tool (BLAST).
3.2 CARACTERIZAÇÃO GENOTÍPICA DE GENES CODIFICANTES PARA
PROTEÍNAS DE MEMBRANA DE Anaplasma marginale DO ESTADO DO RIO DE
JANEIRO.
3.2.1 MESORREGIÕES E MUNICIPIOS ESTUDADOS
Foram selecionadas amostras positiva para A. marginale, provenientes de
bovinos, de cinco municípios do estado do Rio de Janeiro: Cachoeiras de Macacu,
Seropédica, Macuco, Campos dos Goytacazes e Bom Jesus do Itabapoana.
Macuco
está
localizado
a
uma latitude 21º59’02”
sul
e
a
uma longitude 42º15'10" oeste, estando a uma altitude de 266 metros. Seropédica
se encontra a uma latitude 22° 44' 38" S e longitude 43° 42' 28" O. Bom Jesus do
Itabapoana, estando localizado em latitude de 21° 08' 02" S e longitude de 41° 40'
48" O. Campos dos Goytacazes situa-se 21° 45' 14" S de latitude e 41° 19' 26" O de
longitude.
Estes municípios representam quatro das seis mesorregiões do Estado do Rio
de Janeiro, sendo elas: Mesorregião Metropolitana (Cachoeiras de Macacu e
Seropédica), Mesorregião do Centro Fluminense (Macuco), Mesorregião do
Noroeste Fluminense (Bom Jesus do Itabapoana) e Mesorregião do Norte
Fluminense (Campos dos Goytacazes). As mesorregiões e os municípios estudados
estão representados nas Figuras 2 e 3, respectivamente.
60
Figura 2: Mapa das mesorregiões do estado do Rio de Janeiro.
Figura 3: Mapa dos municípios utilizados no presente estudo.
61
3.2.2 SELEÇÃO DAS AMOSTRAS
A amostra representante de Cachoeiras de Macacu foi selecionada dentre as
positivas do presente estudo. As amostras de Macuco e Bom Jesus do Itabapoana
foram selecionadas a partir da detecção por PCR do agente em amostras de sangue
bovino provenientes dos referidos municípios. A amostra de Campos dos
Goytacazes foi selecionada a partir de amostras positivas em esfregaços
sanguíneos. A amostra de Seropédica é a amostra controle positiva utilizada nas
reações para detecção para detecção de A. marginale no Laboratório de
Hemoparasitos e Vetores do Departamento de Parasitologia Animal da UFRRJ.
Todas as amostras foram submetidas a PCR para confirmação do diagnóstico
de infecção por A. marginale (protocolo descrito no ítem 3.1.8.1), sendo então
selecionadas dentre as positivas uma representante de cada município. O sangue
das amostras escolhidas foi congelado em freezer -20ºC até posterior extração do
DNA, realização da PCR e sequenciamento.
3.2.3 PCR PARA GENES
Anaplasma marginale
CODIFICANTES DE
PROTEÍNAS
DE
MEMBRANA EXTERNA
DE
As amostras foram submetidas a PCR para os seguintes genes codificantes
de proteínas de A. marginale: Omp 1, Omp 4,Omp 5, Omp 7, Am 097, Am 254, Am
956, e SodB. Para amplificação dos genes de selecionadas foram realizadas PCR
utilizando os iniciadores listados no Quadro 9. Estes oligonucleotídeos foram
desenhados com base na sequencia do genoma do isolado Saint Maries de A.
marginale, disponível no Genbank, para amplificar genes completos por Ramos et
al., 2007.
Quadro 9: Iniciadores utilizados na amplificação de genes de codificantes de
proteínas de membrana externa de Anaplasma marginale
Iniciadores
Omp 1 f
Sequências (5’ – 3’)
Produto (pb)
AAGGTCTACGGCTTGGTTTACGCTGCGTTGTCTTT
977
Omp 1 r
AGTCTGATACCGCACTCAAACCCAAAATAGTCCAG
62
Omp 4 f
CAGCATATCATTGAATACAGGAGGAAGTCGCTTAT
1128
Omp 4 r
GTGGCTAGCCGCTTTGGAGATGTTACCAG
Omp 5 f
CTGGTGGTGGAGAGTTTGCCTATG
1112
Omp 5 r
AACTCGAGCTTCAGCCCCAGATTG
Omp 7 f
TCTTTTCTGTTGGGTGCGGTTGTA
1121
Omp 7 r
CGCGCCTTGACATCTTCCTC
Am 097 f
ATGAAAAAGGCTTTCATGGTTT
813
Am 097 r
CTACCCACGTCCCCTTCTG
Am 254 f
ATGACAGAAGGGAGAAAGCC
1182
Am 254 r
CTACTCCAAAATCTCAGTTATGATAC
Am 956 f
ATGTGCTATGGTACTCGCATC
1605
Am 956 r
TCACTTTTCGTAATACTTCGACACA
Opag 3 f
TGTGGGTTGCACACACTACC
936
Opag 3 r
CTAAAAACCATCACCAAATGC
SodB f
TCACACACCCGCGGTTTCAAGCCT
664
SodB r
TCCGCTGCGCAGTTGGTATACAT
A reação foi preparada para volume final de 25µL contendo 5 µL de tampão
(1x), 1,5 mM MgCl2 , 0,25mM de cada dNTP, 0,5 µM de cada oligonucleotídeo
iniciador, 1,5 U de Taq DNA polimerase e aproximadamente 100 ng de DNA
genômico. Foi preparada uma reação para cada gene nas seguintes condições:
94oC por 4 minutos seguido de 35 ciclos de desnaturação a 94oC por 1 minuto,
anelamento a 55oC por 1 minuto, e extensão a 72oC também por 1 minuto, seguida
de uma etapa de extensão final a 72oC por 4 min.
63
3.2.4 VISUALIZAÇÃO DOS PRODUTOS DE AMPLIFICAÇÃO
Para a vizualização dos resultados, os produtos da PCR foram adicionados a
uma solução contendo azul de bromofenol e glicerol e colocados em gel de agarose
à 1,0%, sendo submetidos à eletroforese por 60 minutos a 90 volts. O tampão de
corrida era composto de solução de Tris-Acetato-EDTA (TAE 1x). O gel foi corado
em solução de brometo de etídeo 0,01% (Invitrogen, Carlsbad, EUA) e posterior
visualização em sistema de foto-documentação UV. Para determinação dos
tamanhos dos produtos amplificados foi utilizado o marcador de peso molecular 1kb
Plus DNA Ladder (Invitrogen™).
3.2.5 SEQUENCIAMENTO DOS PRODUTOS DE PCR
Os produtos amplificados da PCR para cada um dos genes de proteínas de
membrana externa de A. marginale foram purificados com o uso do kit Wizard® SV
Gel and PCR Clean-Up System (Promega) de acordo com as instruções do
fabricante. Em seguida foi feita a eletroforese em gel de agarose dos amplicons para
quantificação de DNA (Figura 4), por comparação com bandas do Low Mass DNA
Ladder (Invitrogen). O DNA purificado foi enviados para o sequenciamento no Centro
de Estudos do Genoma Humano da Universidade de São Paulo (USP) (ABI 3730
DNA Analyser – Applied Biosystems/Perkin Elmer, CA, USA). Foram realizados
quatro sequenciamentos para cada gene, dois com o oligonucleotideo iniciador
senso e dois com o oligonucleotideo iniciador antisenso
64
Figura 4: Fotografia de gel de agarose à 2% dos amplicons purificados da PCR para
genes de proteínas de membrana externa de A. marginale, corado com Brometo de
Etídio. Nas colunas: 1 e 20 está o Low DNA Mass Ladder; 2 a 6 – Omp 1; 7 a 11 –
Omp 5; 12 a 16 Am 097; 17 a 19, 21 e 22 – Am 254; 23 a 27 – Am 956; 28 a 32 –
SodB.
3.2.6 ANÁLISE DAS SEQUÊNCIAS
A análise dos eletroferogramas, montagem dos genes e a geração da
sequência consenso foram feitas com o auxilio do software DNA Baser Sequence
Aligner v3.5.4.
A
busca
por
homologia
foi
realizada
pelo
algoritimo
BLASTn
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov), comparando as sequências obtidas com os seguintes
isolados de A. marginale: Saint Maries (AM St Maries) (Genbank CP000030), Florida
(AM Florida) (CP001079) ambas com genoma completo e as sequências completas
de cada gene avaliado no presente estudo da amostra Anaplasma marginale strain
NE-Brazil (AM NE-Brasil), proveniente do estado de Pernambuco.
65
A predicao das sequencias de aminoacidos dos genes foram obtidas com o
software MEGA versao 5.1 (TAMURA et al., 2007) e posteriormente o alinhamento
multiplo entre as sequencias foi realizado com o algoritmo CLUSTAL W
As sequências obtidas foram alinhadas para gerar árvores filogenéticas
utilizando-se o método de “neighbor-joining” a partir do software MEGA (Versão 5.1),
no modelo “Kimura 2-parameters”. Os Valores de “bootstrap” com 1000 replicações
foram utilizados para estimar a confiabilidade dos ramos na árvore de “neighborjoining”.
3.2.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os resultados do diagnóstico pela PCR ou PCR em tempo real foram
associados através do teste exato de Fisher em nível de 5% de significância com as
frequências das alterações hematológicas e bioquímicas. Todas as análises
estatísticas foram realizadas utilizando o programa BioEstat 5.0 (AYRES, 2000).
66
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 DETECÇÃO MOLECULAR DE ORGANISMOS DA FAMÍLIA Anaplasmataceae
EM BOVINOS E OVINOS
4.1.2 BOVINOS
Dentre os 94 bovinos avaliados no grupo I, 35,1% (n=33) foram positivos na
PCR para A. marginale. Nenhum dos animais testados foi positivo para A.
phagocytophilum ou N. risticii. Na pesquisa em lâminas 24 animais foram positivos,
sendo apenas 21 desses confirmados pela PCR.
A presença de A. marginale já era esperada, uma vez que há relatos da
exposição de bovinos ao agente no Rio de Janeiro. As regiões afetadas podem ser
caracterizadas como sendo áreas de estabilidade enzoótica, onde os vetores e o
agente estão presentes constantemente e os animais são mais adaptados ao
parasito, ou de instabilidade enzoótica, nas quais fatores ecológicos e climáticos não
favorecem o desenvolvimento de vetores durante algum período do ano, como são
os casos do sertão de Sergipe e do extremo sul do Rio Grande do Sul (SOUZA et al.
2001; ALMEIDA et al., 2006). A prevalência da infecção no Brasil é extremamente
variável, com índices de 12,3 a 100% (VIDOTTO & MARANA, 2001). Nas regiões
Norte Fluminense e do Médio Paraíba foram observadas soroprevalências de
91,16% e 98,21% dos bovinos, respectivamente (SOUZA et al. 2000; SOUZA et al.
2001), sendo o estado do Rio de Janeiro, assim como a maior parte do país,
considerado como uma zona de estabilidade enzoótica. Foi também revelada uma
frequência de 5,42% (16/295) de bubalinos positivos para A. marginale no Estado do
Rio de Janeiro (CORRÊA, 2011).
67
São poucos os estudos de prevalência que fazem uso de técnicas
moleculares para o diagnóstico de A. marginale sendo mais fequentes os que fazem
uso do diagnóstico sorológico. Na região sudoeste da Amazônia, estudos feitos por
meio da PCR revelaram que a frequência de infecção por A. marginale foi de 98,6%
(1.627/1.650) nas amostras provenientes de Rondônia de 92,87% (208/225) nas
amostras do Acre (BRITTO et al., 2010). Na região sul da Bahia, no município de
Ibicaraí, 63,1% das amostras de sangue bovino testadas por meio de nested PCR
para A. marginale foram positivas (AMORIM, 2011). Em Umuarama, localizada no
noroeste do Paraná, os soros de 226 vacas de sete rebanhos da raça Nelore, foram
testados por cELISA sendo 76,1% dos animais reagentes ao teste (YOSHIHARA et
al., 2003). Ainda no estado do Paraná, porém na região centro-sul, determinou-se a
soroprevalência de A. marginale nas regiões de Ponta Grossa, Guarapuava e
Laranjeiras do Sul.
58,74% foram positivos pelo cELISA-PR1, indicando uma
porcentagem significativa de animais susceptíveis à infecção por A. marginale,
sugerindo que essa é uma região de instabilidade de enzoótica (MARANA et al.,
2009).
Devido às diferenças nos métodos diagnósticos utilizados, a comparação
entre os resultados do presente estudo com outros realizados no país se torna mais
difícil. Métodos indiretos, como o ELISA detectam a exposição ao agente e não
necessariamente a infecção, ao contrário dos métodos diretos como a PCR. Ainda
assim, a frequência observada no presente trabalho foi consideravelmente menor do
que a de estudos por PCR como o de Britto et al.(2010) e o de Amorim (2011). A
grande diferença geográfica e climática entre as regiões pode ser responsável por
resultados tão distintos, visto que a interação entre os vetores e o hospedeiro pode
ser influenciada pelas condições locais, além de eventuais diferenças de manejo e
estratégias de controle de vetores nas diferentes regiões.
Animais que apresentam uma resposta imune efetiva sobrevivem à infecção
aguda, podendo tanto eliminar a infecção quanto reduzir a parasitemia para níveis
baixos, geralmente indetectáveis na microscopia, tornando-se uma infecção crônica
(FRENCH et al., 1998). Portanto, mesmo em uma área de estabilidade enzoótica,
animais portadores com uma parasitemia muito baixa poderiam apresentar
resultados falsos negativos na PCR.
A infecção crônica por A. marginale se caracteriza pela ocorrência de ciclos
de parasitemia. Em cada ciclo observam-se novos variantes antigênicos de msp2,
68
contribuindo para evasão da resposta imune do hospedeiro e garantindo a
manutenção da infecção crônica (FRENCH et al., 1998 e 1999). A magnitude e a
duração dos ciclos sugerem que a recorrência da infecção está ligada a variação
antigênica contínua pelo agente, com subsequente desenvolvimento de resposta
imune primária pelo hospedeiro (ALLEMAN et al., 1997).
Outros fatores que devem ser levados em consideração são as limitações
referentes ao tamanho da amostra e a concentração geográfica dos animais, que
podem contribuir para a discrepância entre os resultados encontrados neste trabalho
em comparação a outras regiões.
Estudos de diagnóstico molecular, mais detalhados e aprofundados, nesta e
em outras regiões, são necessários para uma se obter maior clareza acerca da
situação da prevalência de A. marginale no estado do Rio de Janeiro.
A frequência de cães positivos na PCR para Anaplasma marginale, em função
das alterações laboratoriais observadas se encontra na tabela 1.
Tabela 1: Frequência de cães positivos na PCR para Anaplasma marginale, em
função das alterações laboratoriais observadas.
PCR para
Anaplasma marginale
Alterações
Total
Positivo
Negativo
Leucocitose
Sim
16
25
41
Não
17
36
53
Total (p = 0.5193)
33
61
94
Eosinofilia
Sim
3
2
5
Não
30
59
89
Total (p=0.3401)
33
61
94
Neutrofilia
Sim
14
12
26
Não
19
49
68
Total (p = 0.0288)*
33
61
94
Linfocitose
Sim
19
22
41
Não
14
39
53
Total (p = 0.0525)
33
61
94
ALT aumentada
Sim
5
12
17
Não
28
49
77
Total (p=0.7801)
33
61
94
Creatinina diminuída
Sim
9
14
23
69
Não
24
47
71
Total (p=0.8020)
33
61
94
* Diferença entre frequência de alterações considerada significativa pelo teste Exato
de Fisher (p<0,05).
Com relação aos resultados dos exames hematológicos, não foi possível
observar diferenças no eritrograma dos animais positivos e negativos, estando tanto
os parâmetros quantitativos (VG, hematimetria e hemoglobinometria) quanto os
qualitativos (VGM e CHGM) dentro dos intervalos de referência nos animais dos dois
grupos. Os eritrócitos são o único tipo cellular infectado por A. marginale em
bovinos. A presence da riquétsia nas hemácias desencadeia um processo de
resposta imunológica que leva à destruição das células parasitadas por um aumento
da atividade eritrofagocítica do animal (KOCAN et al.,2010). A destruição das células
infectadas leva ao quadro de anemia hemolítica observado nos animais com
anaplasmose clínica, sendo a presença de anemia macrocítica um achado frequente
nos animais infectados (ASHUMA et al., 2013). A ausência de alterações se justifica
pelo caráter assintomático da infecção em áreas de estabilidade enzoótica, nas
quais os animais possuem títulos de anticorpos elevados o suficiente para conter a
doença (MADRUGA et al, 1984).
Dentre os parâmetros que apresentaram alterações apenas a presença de
neutrofilia esteve significativamente mais presente entre os animais positivos. O
aumento da contagem de neutrófilos tem três causas principais: processos
inflamatórios, resposta a corticosteroides e estímulo adrenérgico. Em geral a
resposta inflamatória em bovinos é caracterizada por uma fase inicial de
neutropenia, seguida de uma gradativa recuperação no número de neutrófilos
circulantes até o consequente desenvolvimento de uma neutrofilia que pode ou não
ocorrer acompanhada de um desvio à esquerda (THRALL, 2004). A neutrofilia não é
usualmente relatada como um achado laboratorial comum na anaplasmose, sendo,
portanto, um achado inesperado no presente estudo. A possibilidade de a presença
do agente no organismo, mesmo que de forma subclínica, ajudar a desencadear
algum tipo de estímulo inflamatório crônico não pode ser completamente descartada.
Outro fator que poderia influenciar neste resultado seria a presença de alguma
variável de confundimento não identificada no presente estudo, como a possível
presença de outros agentes infecciosos ou parasitários associados à presença de A.
marginale ou um eventual maior grau de infestação por ectoparasitos nos animais
70
positivos. Estudos mais detalhados se fazem necessários para o esclarecimento
desta questão.
Não foram observadas alterações significativas dos parâmetros bioquímicos
dos animais infectados. As alterações bioquímicas geralmente observadas na
anaplasmose estão muito relacionadas a função hepática. Aumentos nas atividades
de AST e fosfatase alcalina, e na concentração de bilirrubina são os (ASHUMA et al.,
2013). O aumento de bilirrubina observado é um achado frequente nos processos
hemolíticos. O excesso de bilirrubina precisa ser metabolizado no fígado para sua
posterior excreção via bile. Este processo pode levar a uma sobrecarga hepática,
com consequente aumento de marcadores como AST e fosfatase alcalina (THRALL,
2004). Considerando a ausência de alterações no eritrograma dos animais positivos
no presente estudo, a inexistência de alterações bioquímicas torna-se um achado
previsível, uma vez que as alterações descritas são geralmente decorrentes do
processo hemolítico, que não ocorreu nos animais avaliados neste trabalho.
4.2.2 OVINOS
Dentre os 59 ovinos testados 6,78% (n=4) foram positivos na PCR em Tempo
Real para A. phagocytophilum. Nenhum dos animais testados foi positivo para A.
marginale, A. ovis ou N. risticii. Nenhum animal foi positivo na pesquisa de
hemoparasitas em esfregaço sanguíneo.
Este microrganismo já foi descrito infectando bovinos, caprinos e uma grande
variedade de cervídeos (GRAY et al., 1988, STUEN et al., 2001, LIZ et al., 2002,
POLIN et al., 2004).
Há poucos estudos indicando a presença de A.
phagocytophilum no Brasil. Dentre 20 equinos com sintomatologia clínica compatível
com
Anaplasmose Granulocítica
Equina
no
Centro-oeste
do
Brasil,
65%
apresentaram anticorpos contra o agente em teste ELISA, sem que, no entanto
apresentassem resultado positivo na nested PCR (SALVAGNI et al., 2010). Em
estudo realizado na divisa dos estados de São Paulo e Mato Grosso do Sul, 16,78%
dos Cervos do pantanal (Blastocerus dichotomus) apresentaram resultado positivo
em reação de imunofluorescência indireta para A. phagocytophilum e 48,95% foram
positivos em PCR para Anaplasma spp (SACCHI et al., 2012). Recentemente A.
phagocytophilum foi detectado infectando cães no Estado do Rio de Janeiro, tendo
71
sido encontrado por meio de PCR em tempo real em 7,11% dos animais testados
(SANTOS et al., 2011).
A presença deste agente infectando também ovinos no Rio de Janeiro reforça
a necessidade do desenvolvimento de mais estudos visando esclarecer a situação
epidemiológica desta Riquétsia no Rio de Janeiro e no Brasil. Uma das questões
ainda existentes sobre seu ciclo de transmissão em território nacional é sobre que
carrapatos atuam como vetores nesta região.
Os vetores implicados na transmissão do agente são carrapatos ixodídeos de
diversas espécies (WOLDEHIWET, 2006). Os carrapatos do complexo Ixodes
persulcatus, incluindo as espécies I. ricinus na Europa, I. persulcatus no Leste
Europeu e Ásia, I. scapularis e I. pacificus na América do Norte são considerados os
principais vetores de A. phagocytophilum (ALLEMAN & WAMSLEY, 2008) Outras
espécies de carrapatos, como Ixodes trianguliceps, Ixodes hexagonus, Ixodes
ventalloi e R. sanguineus também têm sido implicados na transmissão do agente
(BOWN et al., 2003; NIJHOF et al., 2007; SANTOS et al., 2009; GHAFAR et
al.,2012).
Santos et al.,( 2011) sugerem, com base no pico sasonal de atividade de
carrapatos adultos Amblyomma cajennense na região estudada, que este pode
desempenhar o papel de vetor de A. phagocytophilum. Antes da descoberta de que
de que roedores de vida livre podem ser reservatórios de variantes de A.
phagocytophilum, pensava-se que as variantes de FTC eram mantidas em um ciclo
carrapato-ruminante, com infecção persistente dos ruminantes domésticos e de vida
livre, servindo como a fonte de transmissão contínua, uma vez que transmissão
transovariana não foi demonstrada. A recente descrição de que os ratos Apodemus
sylvaticus; Apodemus flavicollis; Microtus agrestis e Clethrinomyces glareolus são
hospedeiros competentes de A. phagocytophilum (OGDEN et al, 1998a;. LIZ et al,
2000, BOWN et al, 2003, 2006), sugere que os roedores também podem ser
reservatórios de infecção. No entanto, em comparação com os ruminantes, os ratos
parecem desenvolver baixos níveis de bacteremia e possuem ciclos de vida mais
curtos. O papel das aves como reservatórios potenciais de A. phagocytophilum não
foi claramente estabelecida, mas um relatório nos EUA sugeriu que pelo menos duas
espécies de aves, Turdus migratorius e Catharus fuscescens, podem ser
reservatórios para variantes de AGH (BJOERSDORFF et al., 2001; DANIELS et al.,
2002). As aves são hospedeiros competentes que podem desempenhar um papel
72
importante na dispersão de carrapatos infectados. Recentemente, o DNA de A.
phagocytophilum foi detectado no sangue de um Carcará (Caracara plancus) e dois
urubus de cabeça preta (Coragyps atratus) no Brasil (MACHADO et al.,2012).
Portanto, para possibilitar uma maior compreensão da epidemiologia de A.
phagocytophilum no Rio de Janeiro, é necessária uma abordagem ampla, com
estudos abrangendo não somente espécies domésticas, como também roedores e
aves selvagens, além de trabalhos direcionados à identificação dos carrapatos que
podem estar atuando como vetores.
Outro ponto de importância para é a identificação de que variantes genéticas
estão presentes no Brasil, uma vez que a epidemiologia de A. phagocytophlilum
apresenta diferenças regionais significativas.
Nos EUA, a doença em humanos apresenta maior severidade e vem
apresentando um aumento no número de casos enquanto praticamente não há
relatos em ruminantes domésticos. Na Europa os casos em humanos são raros e de
menos gravidade, porém a infecção em ruminantes é frequente e com quadros
clínicos importantes (WOLDEHIWET, 2006). São descritos três grupos genéticos
principais de A. phagocytophlilum, cada um com características distintas. Eles
correspondem aos três agentes agrupados nesta espécie em 2001: Ehrlichia equi, E.
phagocytophila e o Agente da Erliquiose Granulocítica Humana. As três variantes
apresentam uma homologia de 99,1% na sequência do gene codificador da unidade
16S do RNAr, e uma grande ocorrência de reações cruzadas em testes sorológicos
(DUMLER et al., 2001).
Apesar de possuirem grande similaridade genética, os três grupos possuem
diferentes características acerca de sua distribuição e espectro de hospedeiros
(GREIG e ARMSTRONG, 2006) A variante E. phagocytophila é encontrada
causando doença fundamentalmente em ruminantes na Europa (PUSTERLA et al.
1999; STUEN et al. 2002). Até o presente momento, os casos europeus de infecções
em cães, gatos e seres humanos foram identificados como pertencentes ao grupo do
Agente da Erliquiose Granulocítica Humana (EGENVALL, et al., 1997; PETROVEC
et al., 1997; PUSTERLA et al., 1997; BJÖERSDORFF et al., 1999). A infecção
experimental de equinos com este grupo produziu doença clínica idêntica à induzida
pelo grupo de E. equi (BARLOUGH et al.,1995). Nos Estados Unidos há relatos da
ocorrência da variante do Agente da Erliquiose Granulocítica Humana em cães,
gatos e seres humanos e da variante de E. equi em equinos na Califórnia (GREIG e
73
ARMSTRONG, 2006). Ademais, variaçãoes genéticas já foram observadas nos
genes 16S rRNA, groEL, msp2, msp4 e ankA de A. phagocytophilum (SILAGHI et
al., 2011).
Através da análise do gene Anka em amostras provenientes de infecções em
diferentes espécies de animais, Scharf et al. (2011) observaram que as sequências
se dividiam em quarto grupos distintos. As sequências de cães, humanos, equinos e
gatos se concentravam no grupo I enquanto as amostras de ovinos, bovinos, bisão
europeu (Bison bonasus) e veado vermelho (Cervus elaphus) faziam parte dos
grupos I e IV. Além disso, sequências provenientes de corças (Capreolus capreolus)
se dividiam em dois outros grupos (II e III).
Em cães existem cinco variantes genéticas de A. phagocytophilum, com
diferenças de um a dois nucleotídeos na sequência do gene 16S RNA (POITOUT et
al., 2005). Organismos detectados em dois cães na Suíça possuíam sequências do
gene 16S RNA idênticas entre si e quando comparadas à sequências do gene 16S
RNA encontradas em humanos com anaplasmose granulocítica (PUSTERLA et al.,
1997). O grau com o qual a variação genética contribui para alterar a patogenicidade
de diferentes variantes de A. phagocytophilum ainda é pouco compreendido.
Considerando estas informações, e sabendo-se que A. phagocytophilum já foi
detectado infectando cães e ovinos, e da existência de evidências de infecções em
equinos e cervídeos, é possível que mais de uma variante esteja em circulação no
Brasil.
Os valores do eritrograma, leucograma e bioquímica sérica dos animais
positivos e a frequência de cães positivos na PCR em tempo real para Anaplasma
phagocytophilum, em função das alterações laboratoriais
observadas
estão
nas
Tabela 2 e 3 respectivamente.
Tabela 2: Valores dos exames hematológicos e bioquímicos dos ovinos positivos
para Anaplasma phagocytophilum.
Valores de
Parâmetro
1
2
3
4
Referência
Hematimetria (x 106/µL)
11,08
9,63
11,26
10.87
8,0 – 16,0
Hemoglobina (g/dL)
11,7
9,5
10,3
10,2
8,0 – 16,0
Volume Globular (%)
33,9
26,1
31,6
30,9
24 – 50
VGM (fL)
30,6
27,1
28,1
28,4
23 – 48
74
CHGM (%)
34,5
36,4
32,6
33,0
31 – 38
Leucometria Global (/µL)
7200
5900
6700
8300
4.000 – 12.000
0
59
67
83
Raros
Eosinófilos (/µL)
576
236
268
332
0 – 1000
Neutrófilos (/µL)
3168
3422
2345
3237
700 – 6000
Linfócitos (/µL)
3024
1888
3953
4067
2000 – 9000
Monócitos (/µL)
432
295
67
581
0 – 750
Fibrinogênio (mg/dL)
200
400
800
400
100 – 500
ALT(U/L)
10
5
15
15
34,0 – 42,0
AST(U/L)
83
41
31
62
68,0 – 90,0
Fosfatase Alcalina (U/L)
58
66
33
41
68,0 – 387,0
Uréia (mg/dL)
27
34
11
35
8,0 – 20,0
Creatinina sérica(mg/dL)
0,6
0,3
0,6
0,3
1,2 – 1,9
Basófilos (/µL)
Tabela 3: Frequência de cães positivos na PCR em tempo real para Anaplasma
phagocytophilum, em função das alterações laboratoriais observadas.
PCR em tempo real para
Anaplasma phagocytophilum
Alterações
Total
Positivo
Negativo
Linfopenia
Sim
1
2
3
Não
3
53
56
Total (p = 0.1929)
4
55
59
Hiperfibrinogenemia
Sim
1
17
18
Não
3
38
41
Total (p=1.0000)
4
55
59
ALT diminuída
Sim
4
34
38
Não
0
21
21
Total (p = 0.2864)
4
55
59
AST diminuída
Sim
3
4
7
Não
1
51
52
Total (p = 0.0041)*
4
55
59
Fosfatase Alcalina diminuída
4
55
59
Sim
4
7
11
Não
0
48
48
Total (p=0.0007)*
4
55
59
Uréia aumentada
Sim
3
36
41
Não
1
19
18
Total (p=1.0000)
4
55
59
Creatinina diminuída
75
Sim
4
51
55
Não
0
4
4
Total (p=1.0000)
4
55
59
* Diferença entre frequência de alterações considerada significativa pelo teste Exato
de Fisher (p<0,05).
Dentre todos os parâmetros laboratoriais avaliados, somente as dosagens de
AST e fosfatase alcalina apresentaram alterações significativas. A diminuição da
atividade sérica da AST e da fosfatase alcalina foi significativamente mais presente
nos animais positivos (p=0,0041 e p=0,0007, respectivamente). Todos os quatro
animais apresentaram atividades séricas de fosfatase alcalina diminuídas sendo que
dois deles exibiram também diminuição de AST.
Alterações como neutropenia e linfopenia, costumam ser observadas em
ovinos infectados (GOKCE & WOLDEHIWET, 1999). Outras alterações possíveis
são a redução do número de eritrócitos circulantes, do hematócrito, volume globular
médio e da concentração de hemoglobina (VAN MIERT et al, 1984; GOKCE &
WOLDEHIWET, 1999).
Em um estudo comparando as características da doença em ovinos e
caprinos infectados experimentalmente foram observadas diferenças nas alterações
clínicas e hematológicas nas duas espécies. Os ovinos apresentaram um período de
incubação menor e febre por mais tempo do que os caprinos. Os animais
apresentaram um aumento transitório do número de neutrófilos seguido de uma
linfopenia aguda e uma neutropenia persistente, que tiveram maior duração nos
ovinos. Ambas as espécies apresentaram diminuições nos parametros quantitativos
do eritrograma (hematimetria, volume globular e hemoglobinometria) porém, apenas
os ovinos apresentaram aumentos em parâmetros qualitativos (VGM e HGM)
(GOKCE & WOLDEHIWET, 1999). A variante utilizada no referido estudo foi
encontrada originalmente infectando ovinos, sendo possível supor que seja menos
patogênica em outras espécies, como, por exemplo, caprinos.
A comparação entre as alterações da bioquímica sérica entre ovinos e
caprinos
experimentalmente
infectados
mostrou
que
ambas
as
espécies
apresentaram diminuições nas dosagens de fosfatase alcalina, zinco e ferro.
Ocorreu ainda um aumento nas concentrações de bilirrubina total, uréia e creatinina.
As reduções na atividade sérica da fosfatase alcalina, assim como a observada no
76
presente estudo, e na concentração de ferro foram significativamente mais severas
nos ovinos (GOKCE & WOLDEHIWET, 1999).
Em cães os achados laboratoriais mais consistentes são a trombocitopenia,
linfopenia, hipoalbuminemia, elevação de fosfatase alcalina, aumento da atividade
da amilase e proteinúria (NEER, 1998). . A contagem de neutrófilos está,
geralmente, dentro dos limites de referência sem a ocorrência de desvio a esquerda
(GREIG et al., 1996; EGENVALL, et al., 1997; PUSTERLA et al., 1997) estando
anemia normocítica normocrômica de caráter arregenerativo presente em menos da
metade dos animais (GREIG e ARMSTRONG, 2006). Poucas alterações na
bioquímica sérica são descritas. Hipoalbuminemia e aumento da atividade sérica da
fosfatase alcalina foram observados em cães infectados nos EUA (GREIG et al.,
1996). Podem ocorrer, ainda, aumento da atividade da amilase e proteinúria (NEER,
1998).
Em humanos as alterações laboratoriais podem ser de grande valia em
pacientes com histórico de exposição ou mordidas por carrapatos e estas incluem
trombocitopenia, leucopenia, anemia e aumento das atividades das transaminases,
sugerindo moderada injúria hepática.
A ausência de alterações nos animais do presente estudo pode ser um indício
da presença de animais portadores. Ovelhas que tenham se recuperado de uma
infecção por A. phagocytophilum podem continuar a abrigar o organismo por várias
semanas ou mesmo anos. O sangue de um animal foi demonstrado infectante para
ovelhas
nunca
antes
expostas
ao
agente
(FOGGIE,
1951).
Ovelhas
persistentemente infectadas não desenvolvem sinais clínicos, mas podem
desenvolver bacteremia após esplenectomia e podem servir de fonte potencial para
infecção em ovelhas que não tiveram contato com o agente. (FOGGIE, 1951;
WOLDEHIWET & SCOTT, 1993). Infecções persistentes com variantes de AGH
também têm sido relatadas em condições naturais, em ratos (TELFORD et ai, 1996,
CASTRO et al, 2001). Entretanto, um estudo indicou que em cavalos infectados o
estado de portador com variantes AGE é incomum (NYINDO et al ., 1978). Há muito
poucos estudos para investigar infecções persistentes de AGH em humanos.
Existe ainda a possibilidade de infecção por uma variante que tenha outra
espécie animal como seu hospedeiro original, causando neste caso uma forma mais
branda da infecção, como na infecção experimental em cavalos com uma variante
77
oriunda de ruminantes, que induziu soroconversão sem o desenvolvimento de
sintomatologia clínica (PUSTERLA et al.,1998).
A caracterização molecular das variantes de A. phagocytophilum presentes no
Brasil em conjunto com estudos voltados para a determinação dos vetores são
fundamentais para o entendimento dos possíveis impactos das infecções por este
agente no território nacional tanto em animais quanto em seres humanos.
Visando a confirmação do diagnóstico, foram sequenciados 122pb do gene
msp2 de A. phagocytophilum. As sequencias obtidas no presente estudo
apresentaram 99% de identidade com outros isolados de A. phagocytophilum da
Ásia, Europa e América do Norte, depositados no GenBank, confirmando a presença
deste agente em ovinos no Brasil. Ensaios de PCR baseandos no gene msp2
apresentam alta sensibilidade e especificidade, porém as sequencias obtidas podem
não ser úteis para distinguir variantes proximamente relacionadas (COURTNEY et
al. 2004). No intuito de proporcionar uma caracterização mais precisa da variante de
A. phagocytophilum encontrada neste estudo, outros ensaios serão conduzidos
visando sequenciar uma porção maior do gene msp2 e eventualmente de outros
genes das amostras positivas e testar sua homologia frente a outros isolados, cujo
as sequências estão depositadas no GenBank. Com isso será possível estabelecer
com maior clareza quais são as caracteristicas genotípicas presentes nos isolados
brasileiros.
4.2 CARACTERIZAÇÃO GENOTÍPICA DE GENES CODIFICANTES PARA
PROTEÍNAS DE MEMBRANA DE Anaplasma marginale DO ESTADO DO RIO DE
JANEIRO.
A partir das sequências parciais dos genes omp1, omp4, omp5, omp7, sodb,
am097 (VirB9-1), am956 (PepA) e am254 (ef-tu) obtidas neste estudo foram
geradas as sequências preditivas de aminoácidos codificados pelos mesmos,
contruídas árvores filogenéticas para cada um dos genes estudados, medidos o
número total de diferenças de aminoácidos e a “p-distance”, que é dada pela razão
entre o número de mudanças de aminoácidos de uma sequência e o total de sítios
avaliados, comparando as amostras provenientes de Cachoeiras de Macacu,
Seropédica, Macuco, Campos dos Goytacazes e Bom Jesus do Itabapoana, todos
no estado do Rio de Janeiro, além dos isolados de Saint Maries (nº de acesso no
78
GenBank:CP000030), Florida (nº de acesso no GenBank:CP001079) e com as
sequências do isolado brasileiro Pernambuco – Zona da Mata correspondentes aos
genes estudados (nº de acesso no GenBank: GU991619, GU991620, GU991621,
GU991622, GU991630, GU991631, GU991629 e GU991618).
A análise dos valores médios da “p-distance” entre todas as sequências
avaliadas (Tabela 4) indicam que de modo geral há pouca variabilidade nestas
proteínas. Apenas OMP7 e VirB9-1 apresentaram valores médios de “p-distance”
superiores à 5%. De acordo com estes dados, EF-Tu, SODb, PepA, OMP1 e OMP4
são as proteínas menos variáveis dentre as estudadas.
Tabela 4: Valores médios de “p-distance” para as sequências preditivas de
aminoácidos de proteínas de membrana externa de Anaplasma marginale.
Proteínas
OMP1
OMP4
OMP5
OMP7
PepA
VirB9-1
EF-Tu
SODb
“p-distance” média
0,02
0,02
0,05
0,11
0.02
0,08
0,01
0,02
No entanto os valores médios não fornecem informações acerca de eventuais
diferenças entre isolados específicos, sendo necessários dados mais detalhados
para uma interpretação correta das características das proteínas de membrana
externa dos diferentes isolados.
A análise das árvores das sequências preditivas de aminoácidos (figuras 5, 6,
7 e 8) e das matrizes de quantidade de mudanças de aminoácidos e “p-distance”
(tabelas 5, 6, 7 e 8), das proteínas OMP1, OMP4, SODb e PepA de A. marginale e
apontam claramente para o agrupamento das amostras do Rio de Janeiro em um
clado distinto das demais avaliadas no presente estudo. Curiosamente, o isolado
brasileiro de Pernambuco apresentou maior semelhança com os isolados de St.
Maries e Florida, ambos dos EUA do que com as amostras do estado do Rio de
Janeiro.
79
Figura 5: Árvore filogenética construída através software MEGA versao 5.1
(TAMURA et al., 2011) pelo metodo de Neighbor-Joining com valores de bootstrap
para 1000 réplicas obtida atraves da análise das sequências preditivas de
aminoácidos da proteína OMP1 dos isolados de A. marginale.
Tabela 5: Matriz representativa do número total de diferenças de aminoácidos
(abaixo da diagonal) e das diferenças de aminoácidos por sítio (acima da diagonal)
entre as sequências preditivas de aminoácidos da proteína OMP1 de diferentes
isolados de Anaplasma marginale. As sequências analisadas possuíam um total de
292 aminoácidos.
OMP1
SM*
FL*
PE*
BJ*
CM*
MA*
SE*
CG*
SM*
----0
2
5
7
6
7
6
FL*
0,00
----2
5
7
6
7
6
PE*
0,01
0,01
----7
9
8
9
8
BJ*
0,02
0,02
0,02
----2
1
2
2
CM*
0,02
0,02
0,03
0,01
----3
4
4
MA*
0,02
0,02
0,03
0,00
0,01
-----3
3
SE*
0,02
0,02
0,03
0,01
0,01
0,01
----4
CG*
0,02
0,02
0,03
0,01
0,01
0,01
0,01
-----
* SM (Saint maries), FL (Florida), PE (Zona da Mata – Pernambuco), BJ (Bom Jesus do Itabapoana), CM
(Cachoeiras de Macacu), MA (Macuco), SE (Seropédica), CG (Campos dos Goytacazes).
Os isolados da Florida e St. Maries são os de maior identidade na sequência
preditiva da proteína OMP1, não apresentando nenhuma mudança de aminoácidos
entre si. O isolado do nordeste brasileiro apresenta uma distância pequena dos
isolados americanos (“p-distance” = 0,01). As amostras do estado do Rio de Janeiro
não diferem muito umas das outras, com uma média de distância interna de 0,01.
O agrupamento das amostras do Rio de Janeiro sugere que amostras de
regiões geográficas próximas sejam mais parecidas do que as de outros locais.
80
Figura 6: Árvore filogenética construída através software MEGA versao 5.1
(TAMURA et al., 2011) pelo metodo de Neighbor-Joining com valores de bootstrap
para 1000 réplicas obtida atraves da análise das sequências preditivas de
aminoácidos da proteína OMP4 dos isolados de A. marginale.
Tabela 6: Matriz representativa do número total de diferenças de aminoácidos
(abaixo da diagonal) e das diferenças de aminoácidos por sítio (acima da diagonal)
entre as sequências preditivas de aminoácidos da proteína OMP4 de diferentes
isolados de Anaplasma marginale. As sequências analisadas possuíam um total de
360 aminoácidos.
OMP4
SM*
FL*
PE*
BJ*
CM*
MA*
SE*
CG*
SM*
----2
5
8
7
7
7
10
FL*
0,01
-----7
6
5
5
5
8
PE*
0,01
0,01
----12
11
11
11
14
BJ*
0,00
0,01
0,01
----1
1
1
2
CM*
0,01
0,01
0,01
0,01
----0
0
3
MA*
0,02
0,02
0,02
0,02
0,02
----0
3
SE*
0,02
0,02
0,02
0,02
0,02
0,00
----3
CG*
0,02
0,03
0,03
0,03
0,03
0,01
0,01
-----
* SM (Saint maries), FL (Florida), PE (Zona da Mata – Pernambuco), BJ (Bom Jesus do Itabapoana), CM
(Cachoeiras de Macacu), MA (Macuco), SE (Seropédica), CG (Campos dos Goytacazes).
Apesar de apresentar a mesma “p-distance” que OMP1, OMP4 apresentou
algumas características distintas. As amostras do Rio de Janeiro são mais
semelhantes entre si, com distância média interna de 0,00, enquanto as amostras
americanas neste caso apresentam distância de 0,01, estando incluídas no mesmo
grupo que a amostra de Pernambuco, que novamente é a com maior número de
alterações de aminoácidos.
81
Figura 7: Árvore filogenética construída através software MEGA versao 5.1
(TAMURA et al., 2011) pelo metodo de Neighbor-Joining
Neighbor Joining com valores de bootstrap
para 1000 réplicas obtida atraves da análise das sequências preditivas de
aminoácidos da proteína
na SODb dos isolados de A. marginale.
Tabela 7: Matriz representativa do número total de diferenças
diferenças de aminoácidos
(abaixo da diagonal) e das diferenças de aminoácidos por sítio (acima da diagonal)
entre as sequências preditivas de aminoácidos da proteína SODb de diferentes
isolados de Anaplasma marginale.
marginale. As sequências analisadas possuíam um total
t
de
185 aminoácidos.
SODb
SM*
FL*
PE*
BJ*
CM*
MA*
SE*
CG*
SM*
----0
0
4
4
4
5
6
FL**
0,00
----0
4
4
4
5
6
PE*
0,00
0,00
----4
4
4
5
6
BJ*
0,02
0,02
0,02
----0
0
1
2
CM*
0,02
0,02
0,02
0,00
----0
1
2
MA*
0,02
0,02
0,02
0,00
0,00
----1
2
SE*
0,03
0,03
0,03
0,01
0,01
0,01
----3
CG*
0,03
0,03
0,03
0,01
0,01
0,01
0,02
-----
* SM (Saint maries), FL (Florida), PE (Zona da Mata – Pernambuco), BJ (Bom Jesus do Itabapoana), CM
(Cachoeiras de Macacu), MA (Macuco), SE (Seropédica), CG (Campos dos Goytacazes).
A sequência de aminoácidos de SODb se mostrou bastante conservada, tanto
em uma análise geral de todos os isolados quanto dentro dos grupos. Os isolados
americanos e o isolado de Pernambuco possuem uma identidade de 100%, não
havendo nenhuma
enhuma diferença de aminoácido entre os três. Entre as amostras do Rio
de Janeiro a distância média foi de 0,01,
0,01, com pouca variação das sequências.
82
Figura 8: Árvore filogenética construída através software MEGA versao 5.1
(TAMURA et al., 2011) pelo metodo de Neighbor-Joining com valores de bootstrap
para 1000 réplicas obtida atraves da análise das sequências preditivas de
aminoácidos da proteína PepA dos isolados de A. marginale.
Tabela 8: Matriz representativa do número total de diferenças de aminoácidos
(abaixo da diagonal) e das diferenças de aminoácidos por sítio (acima da diagonal)
entre as sequências preditivas de aminoácidos da proteína PepA de diferentes
isolados de Anaplasma marginale. As sequências analisadas possuíam um total de
448 aminoácidos.
PepA
SM*
FL*
PE*
BJ*
CM*
MA*
SE*
CG*
SM*
----1
5
12
10
9
18
16
FL*
0,00
----4
13
11
10
19
17
PE*
0,01
0,01
----17
15
14
23
21
BJ*
0,03
0,03
0,04
----4
3
12
10
CM*
0,02
0,02
0,03
0,01
----1
10
8
MA*
0,02
0,02
0,03
0,01
0,00
----9
7
SE*
0,04
0,04
0,05
0,03
0,02
0,02
----6
CG*
0,04
0,04
0,05
0,02
0,02
0,02
0,01
-----
* SM (Saint maries), FL (Florida), PE (Zona da Mata – Pernambuco), BJ (Bom Jesus do Itabapoana), CM
(Cachoeiras de Macacu), MA (Macuco), SE (Seropédica), CG (Campos dos Goytacazes).
As sequências de PepA seguem aproximadamente o mesmo padrão das
proteínas descritas anteriormente, com as amostras do Rio de Janeiro agrupadas,
apresentando poucas mudanças de aminoácidos, e distantes do isolado de
Pernambuco que possui mais semelhanças com os isolados norte-americanos.
Considerando o fato de PepA ser uma proteína ancorada na membrana de A.
marginale e de apresentar sequência preditiva de aminoácidos altamente
conservada, mais estudos devem ser dedicados, para avaliacao de sua
imunogenicidade e potencial como antigeno vacinal.
83
Nas árvores filogenéticas (figuras 9 e 10) e nas matrizes de quantidade de
mudanças de aminoácidos e “p-distance” (tabelas 9 e 10) de OMP5 e OMP7, o
isolado da flórida se agrupa de forma mais similar às amostras do Rio de Janeiro, de
maneira que os isolados de St. Maries e de Pernambuco apresentam sequências de
aminoácidos similares nestas duas proteínas.
Figura 9: Árvore filogenética construída através software MEGA versao 5.1
(TAMURA et al., 2011) pelo metodo de Neighbor-Joining com valores de bootstrap
para 1000 réplicas obtida atraves da análise das sequências preditivas de
aminoácidos da proteína OMP5 dos isolados de A. marginale.
Tabela 9: Matriz representativa do número total de diferenças de aminoácidos
(abaixo da diagonal) e das diferenças de aminoácidos por sítio (acima da diagonal)
entre as sequências preditivas de aminoácidos da proteína OMP5 de diferentes
isolados de Anaplasma marginale. As sequências analisadas possuíam um total de
323 aminoácidos.
OMP5
SM*
FL*
PE*
BJ*
CM*
MA*
SE*
CG*
SM*
----29
10
34
31
34
34
34
FL*
0,09
----21
5
2
5
5
5
PE*
0,03
0,07
----26
23
26
26
26
BJ*
0,11
0,02
0,08
----3
0
6
6
CM*
0,10
0,01
0,07
0,01
----3
3
3
MA*
0,11
0,02
0,08
0,00
0,01
----6
6
SE*
0,11
0,02
0,08
0,02
0,01
0,02
----0
CG*
0,11
0,02
0,08
0,02
0,01
0,02
0,00
-----
* SM (Saint maries), FL (Florida), PE (Zona da Mata – Pernambuco), BJ (Bom Jesus do Itabapoana), CM
(Cachoeiras de Macacu), MA (Macuco), SE (Seropédica), CG (Campos dos Goytacazes).
No caso de OMP5, o isolado St. Maries é aquele que apresenta maiores
diferenças em relação aos demais, com valores de diferenças de aminoácidos
84
elevadas. O isolado de Pernambuco acaba sendo o mais próximo do St. Maries “pdistance” = 0,03).
Figura 10: Árvore filogenética construída através software MEGA versao 5.1
(TAMURA et al., 2011) pelo metodo de Neighbor-Joining com valores de bootstrap
para 1000 réplicas obtida atraves da análise das sequências preditivas de
aminoácidos da proteína OMP1 dos isolados de A. marginale.
Tabela 10: Matriz representativa do número total de diferenças de aminoácidos
(abaixo da diagonal) e das diferenças de aminoácidos por sítio (acima da diagonal)
entre as sequências preditivas de aminoácidos da proteína OMP7 de diferentes
isolados de Anaplasma marginale. As sequências analisadas possuíam um total de
324 aminoácidos.
OMP7
SM*
FL*
PE*
BJ*
CM*
MA*
SE*
CG*
SM*
----61
87
69
66
66
66
69
FL*
0,19
----59
12
6
6
6
12
PE*
0,27
0,18
----70
64
64
64
70
BJ*
0,21
0,04
0,22
----6
6
6
0
CM*
0,20
0,02
0,20
0,02
----0
0
6
MA*
0,20
0,02
0,20
0,02
0,00
----0
6
SE*
0,20
0,02
0,20
0,02
0,00
0,00
----6
CG*
0,21
0,04
0,22
0,00
0,02
0,02
0,02
-----
* SM (Saint maries), FL (Florida), PE (Zona da Mata – Pernambuco), BJ (Bom Jesus do Itabapoana), CM
(Cachoeiras de Macacu), MA (Macuco), SE (Seropédica), CG (Campos dos Goytacazes).
OMP7 foi a proteína com maior variabilidade. Este resultado é compativel com
o que foi observado por Guedes Jr et al. (2010), que relatou uma identidade de
apenas 65% e 72%, respectivamente, dos isolados St. Maries e Florida, , em
comparação ao isolado da Zona da Mata de Pernambuco.
85
Nos casos de EF-Tu (figura 11; tabela 11), as sequências preditiva dos
aminoacidos de EF-Tu apresentaram pouca variação. A árvore filogenética
produzida atraves das sequencias preditivas de aminoacidos de EFTu alinhou o
isolado St. Maries próximo às amostras do Rio de Janeiro. Novamente o isolado de
Pernambuco apresentou diferenças em comparação as amostras brasileiras
estudadas.
Figura 11: Árvore filogenética construída através software MEGA versao 5.1
(TAMURA et al., 2011) pelo metodo de Neighbor-Joining com valores de bootstrap
para 1000 réplicas obtida atraves da análise das sequências preditivas de
aminoácidos da proteína OMP1 dos isolados de A. marginale.
Tabela 11: Matriz representativa do número total de diferenças de aminoácidos
(abaixo da diagonal) e das diferenças de aminoácidos por sítio (acima da diagonal)
entre as sequências preditivas de aminoácidos da proteína EF-Tu de diferentes
isolados de Anaplasma marginale. As sequências analisadas possuíam um total de
312 aminoácidos.
EF-Tu
SM*
FL*
PE*
BJ*
CM*
MA*
SE*
CG*
SM*
----4
4
0
0
0
2
2
FL*
0,01
----0
4
4
4
6
6
PE*
0,01
0,00
----4
4
4
6
6
BJ*
0,00
0,01
0,01
----0
0
2
2
CM*
0,00
0,01
0,01
0,00
----0
2
2
MA*
0,00
0,01
0,01
0,00
0,00
----2
2
SE*
0,01
0,02
0,02
0,01
0,01
0,01
----4
CG*
0,01
0,02
0,02
0,01
0,01
0,01
0,01
-----
* SM (Saint maries), FL (Florida), PE (Zona da Mata – Pernambuco), BJ (Bom Jesus do Itabapoana), CM
(Cachoeiras de Macacu), MA (Macuco), SE (Seropédica), CG (Campos dos Goytacazes).
EF-Tu é uma hidrolase, enzima envolvida na síntese proteica, tendo como
função promover a elongação da cadeia durante a síntese de polipeptídios nos
ribossomos. A expressão de ef-tu em Escherichia coli produziu proteína
86
recombinante capaz de induzir a resposta proliferativa de linfócitos T e títulos de
IgG2 superiores aos de IgG1 em bovinos, indicando boa capacidade imunogênica da
proteína (ARAUJO et al., 2008; LOPEZ et al., 2008).
Em comparacao com os genes de proteinas de membrana estudados neste
trabalho, EF-Tu assume relativa importancia como possivel candidato a antigeno
vacinal, por apresentar o menor valor médio de “p-distance”, apenas 0,01. Há ainda
poucas substituições de aminoácidos nas sequências preditivas de EF-Tu, sendo
considerado como um gene altamente conservado. Tanto a infecção natural como a
experimental de bovinos por VirB9-2, VirB10 e EF-Tu, membros do TFSS, gera uma
resposta humoral específica capaz de ser detectada por ELISA com proteínas
recombinantes, reforçando que tais proteínas apresentam potencial imunogênico. Os
epítopos são conservados, mesmo entre isolados heterólogos de A. marginale (Rio
Grande do Norte e Alagoas). Estas características tem grande importância para o
desenvolvimento de imunógenos, em especial, em países como o Brasil, por suas
dimensões continentais. Por serem reconhecidos por bovinos infectados com
isolados homólogos e heterólogos, VirB9-2, VirB10 e EF-Tu se tornam proteínas de
bom potencial para o desenvolvimento de vacinas contra A. marginale (ARAUJO et
al., 2008).
Na análise dos dados de VirB9-1 (figura 12, tabela 12) podemos perceber
uma divisão em dois grupos, o isolado Florida e o isolado de Pernambuco em um
deles e as amostras do Rio de Janeiro e do isolado St. Maries.
Figura 12: Árvore filogenética construída através software MEGA versao 5.1
(TAMURA et al., 2011) pelo metodo de Neighbor-Joining com valores de bootstrap
87
para 1000 réplicas obtida atraves da análise das sequências preditivas de
aminoácidos da proteína VirB9-1 dos isolados de A. marginale.
Tabela 12: Matriz representativa do número total de diferenças de aminoácidos
(abaixo da diagonal) e das diferenças de aminoácidos por sítio (acima da diagonal)
entre as sequências preditivas de aminoácidos da proteína VirB9-1 de diferentes
isolados de Anaplasma marginale. As sequências analisadas possuíam um total de
231 aminoácidos.
VirB9-1
SM*
FL*
PE*
BJ*
CM*
MA*
SE*
CG*
SM*
----39
39
3
3
3
3
6
FL*
0,17
----2
41
41
41
41
44
PE*
0,17
0,01
----41
41
41
41
44
BJ*
0,01
0,18
0,18
----0
0
0
3
CM*
0,01
0,18
0,18
0,00
----0
0
3
MA*
0,01
0,18
0,18
0,00
0,00
----0
3
SE*
0,01
0,18
0,18
0,00
0,00
0,00
----3
CG*
0,03
0,19
0,19
0,01
0,01
0,01
0,01
-----
* SM (Saint maries), FL (Florida), PE (Zona da Mata – Pernambuco), BJ (Bom Jesus do Itabapoana), CM
(Cachoeiras de Macacu), MA (Macuco), SE (Seropédica), CG (Campos dos Goytacazes).
Um dos fatores mais interessantes observados neste estudo foi a
manutenção, em todas as sequências preditivas estudadas, de um clado das
amostras do estado do Rio de Janeiro. A semelhança entre estes isolados parece
sugerir que amostras de uma mesma região geográfica possuam maior similaridade.
No entanto, frequentemente o isolado proveniente da Zona da Mata de Pernambuco
apresentou muitas diferenças em relação às amostras do Rio de Janeiro. É possível
que em outras regiões do país existam ainda mais variantes destas proteínas. Para
que possamos entender as características, e desenvolver métodos diagnósticos e de
imunização a partir das proteínas de membrana externa, são necessários mais
estudos como esse em outras regiões do Brasil.
As proteínas de membrana externa são capazes de produzir imunidade
quando usadas em vacinas. Achados recentes demonstram que proteínas
individuais ou combinações de proteínas são capazes de induzir resposta imune.
Com a identificação de antigenos com maior potencial imunogênico sera possível o
desenvolvimento de novas vacinas (NOH et al. 2013).
Segundo Noh et al. (2006), A variacao ocorrida na sequência de OMP7
provavelmente está associada a substituicoes de nucleotideos em sua regiao
central, que mantem a moldura de leitura mas introduz variacoes de aminoacidos.
Os genes que codificam OMPs 7 a 9, partilham de extensas areas de homologia nas
88
extremidades 5’ e 3’, onde podem ocorrer recombinacoes enquanto que as areas N
e C terminais apresentam relativa conservacao. Como a inoculacao de AMCE e
capaz de proteger contra isolados
Entre as sequencias preditivas de aminoacidos das proteinas avaliadas,
OMP1, OMP4, EF-Tu, SODB, e PepA, demonstrando alto grau de conservacao. Isto
sugere que estas sejam proteinas importantes para o desenvolvimento de
imunogenos capazes de promover protecao cruzada entre isolados.
89
5 CONCLUSÕES
A partir dos resultados do presente trabalho pode-se concluir:
- Anaplasma phagocytophilum está presente em Cahoeiras de Macacu, RJ,
infectando ovinos.
- As sequencias preditivas de aminoacidos das proteínas de membrana externa de
Anaplasma marginale OMP1, OMP4, EF-Tu, SODB, e PepA, apresentaram um alto
grau de conservação.
-OMP7 apresentou a maior variação na sequência preditiva de aminoacidos das
proteínas de membrana externa de Anaplasma marginale avaliadas.
- As proteínas de membrana externa dos isolados de Anaplasma marginale do
estado do Rio de Janeiro apresentam menor variação entre si do que em
comparação a isolados de outras regiões do Brasil e dos EUA.
- A presença de neutrofilia foi significativamente mais frequente nos bovinos
positivos para Anaplasma marginale em Cachoeiras de Macacu.
- A diminuição da atividade sérica de AST e Fosfatase alcalina foi significativamente
mais frequente nos ovinos positivos para Anaplasma phagocytophilum em
Cachoeiras de Macacu.
90
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