(11) (21)
República Federativa do Brasil
PI 0508655-8 A
(22) Data de Depósito: 10/03/2005
(43) Data de Publicação: 14/08/2007
(RPI 1910)
Ministério do Desenvolvimento, Indústria
e do Comércio Exterior
Instituto Nacional da Propriedade Industrial
(54) Título: COMPOSIÇÃO DE VACINA; MÉTODO
PARA A PREVENÇÃO OU ATENUAÇÃO DE
ERLIQUIOSE CANINA EM UM CÃO; E COMPOSIÇÃO
DE ESTIRPE DESAFIANTE
(30) Prioridade Unionista: 11/03/2004
(71) Depositante(s):
US 60/552,350
Wyeth (US)
(72) Inventor(es): Thomas Jay Hess, Yu-Wei Chiang, Hsien-Jue
Chu (Steve), Liangbiao Hu (George)
(74) Procurador:
Trench, Rossi e Watanabe
(86) Pedido Internacional:
PCT US2005/007875 de 10/03/2005
(87) Publicação Internacional: WO
2005/087803 de 22/09/2005
(51) Int. CL:
CO7K 14/29 (2007.01)
A61K 39/02 (2007.01)
(57) Resumo: COMPOSIÇÃO DE VACINA; MÉTODO PARA À
PREVENÇÃO OU ATENUAÇÃO DE ERLIQUIOSE CANINA EM UM CÃO;
E COMPOSIÇÃO DE ESTIRPE DESAFIANTE. A presente invenção
proporciona uma composição de vacina segura e eficaz que compreende;
uma quantidade imunizante eficaz de uma bacterina de Ehrlichia canis; um
veículo
farmacologicamente
aceitável;
e
uma
quantidade
imunogenicamente estimulante de um sistema adjuvante que consiste
essencialmente em um agente indutor de resposta de anticorpo e um
agente indutor de resposta imunitária mediada por célula. A presente
invenção proporciona também um método para a prevenção ou atenuação
de erliquiose canina em cães.
•• •• • • • • • •••• •• • • •• • • • •
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"COMPOSIÇÃO DE VACINA; MÉTODO PARA A PREVENÇÃO OU
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.......
ATENUAÇÃO DE ERLIQUIOSE CANINA EM UM CÃO; E COMPOSIÇÃO DE
ESTIRPE DESAFIANTE".
ANTECEDENTES DA INVEÇÃO
A Erliquiose canina é uma doença letal causada
5
por Ehrlichia canis (E. canis), um patógeno intracelular
transportado pelo sangue, e infecta todas as raças de cães
em qualquer fase de crescimento. Erliquiose canina é
transmitida pelo carrapato marrom do cão,
10
sanguineous,
Rhipicephalus
que se acredita ser o reservatório primário
para a doença. Erliquiose canina é uma doença
potencialmente letal que é endêmica nos E.U.A e ocorre no
mundo todo. Comumente, os sintomas progridem de um estado
de doença agudo para crônico, dependendo da raça do
15 organismo e estado imunológico do hospedeiro. Em casos
agudos, sintomas incluem secreção mucopurulenta ocular e
nasal, desidratação, hiperplasia reticuloendotelial, febre,
linfadenopatia generalizada, esplenomegalia e
trombocitopenia. Em casos crônicos, sinais variáveis de
20 anorexia, depressão, perda de vigor, rigidez e relutância
para andar, edema dos membros ou escroto, e tosse ou
dispinéia podem ocorrer.
Atualmente não há vacina disponível para o
tratamento eficaz ou prevenção de erliquiose canina. O
25 tratamento comum para todas as formas de erliquiose é a
administração de um antibiótico, tal como tetraciclina, por
um mínimo de 2 semanas para casos agudos, ou 1-2 meses em
casos crônicos. Em casos crônicos, as anormalidades
hematológicas podem persistir por 3-6 meses, ou pela vida
30 inteira.
Terapia
de suporte pode ser necessária para
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combater perda e disfunção de órgão específico. Claramente,
a prevenção eficaz da doença seria preferida a um regime de
antibióticos pós-infecção.
Portanto, é um objetivo da presente invenção
5 proporcionar uma composição de vacina segura e eficaz útil
para a indução de imunidade protetora contra erliquiose
canina em cães.
É um outro objetivo desta invenção proporcionar
um método para a prevenção ou atenuação de erliquiose
10 canina em cães.
É ainda um outro objetivo desta invenção
proporcionar um método para indução de erliquiose clínica
em um animal de teste. O referido método é útil para a
avaliação e estudo das defesas de hospedeiro e mecanismos
15 patogênicos, e para o desenvolvimento aperfeiçoado de
vacinas contra erliquiose.
É ainda uma característica da invenção que a
composição de vacina possa proteger cães contra múltiplas
cepas de
E. canis
que se originam de uma variedade de
20 regiões geográficas.
É ainda uma outra característica desta invenção
que imunidade protetora eficaz contra erliquiose canina
possa ser conferida a cães de qualquer idade.
Ainda, objetivos e características da invenção
25 tornar-se-ão aparentes a partir da descrição detalhada dada
abaixo.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A presente invenção proporciona uma composição de
vacina segura e eficaz que compreende: uma quantidade
30 imunizante eficaz de uma bacterina de
Ehrlichia canis
~I O CO
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inativada, um veículo farmacologicamente aceitável, e uma
quantidade estimulante de um sistema adjuvante que
compreende ou consiste essencialmente em um agente indutor
de resposta de anticorpo e um agente indutor de resposta
5 imunitária mediada por célula (CMI).
A presente invenção proporciona também um método
para a prevenção ou atenuação de erliquiose canina em cães.
A presente invenção proporciona ainda um método
para a indução de infecção clínica por
E. canis
em um
10 animal de teste, que é útil para o estudo e avaliação de
defesas de hospedeiro e mecanismos patogênicos, e para o
desenvolvimento avançado do tratamento e prevenção de
erliquiose canina.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
15
O agente causador de erliquiose canina
Ehrlichia canis (E. canis),
é
uma bactéria Gram-negativa da
ordem Rickettsiales, que ocorre tanto sozinha como em
inclusões compactas em leucócitos mamíferos circulantes, e
é transmitida por carrapatos.
Erliquiose canina é endêmica
20 em muitas partes dos E.U.A e é sabido que ocorre no mundo
todo. Erliquiose aguda, que ocorre naturalmente, mimetiza a
febre maculosa das Montanhas Rochosas. A maior parte dos
casos agudos ocorre nos meses mais quentes, que é
coincidente com a maior atividade do vetor carrapato.
25 Erliquiose canina pode ser uma doença letal. Com muita
freqüência, é uma doença crônica que pode afetar um cão de
qualquer idade provocando vários sintomas tais como
anorexia, depressão, perda de vigor, rigidez e relutância
para andar, edema dos membros ou escroto, tosse ou
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dispinéia. Até hoje, não existem tratamentos eficazes por
vacinação ou imunização contra erliquiose canina.
Surpreendentemente, foi agora verificado que uma
composição de vacina, que compreende uma quantidade
5 imunizante eficaz de uma bacterina de E. canis inativada,
um veículo farmacologicamente aceitável, e uma quantidade
imunologicamente estimulante de um sistema adjuvante que
consiste essencialmente em um agente indutor de resposta de
anticorpo e um agente indutor de resposta imunitária
10 mediada por célula (CMI), pode ser administrada a cães em
qualquer estágio de crescimento para prevenir ou atenuar
erliquiose canina, preferivelmente em 16 semanas de idade
ou mais velhos.
Bacterina de
E. canis
adequada para uso na
15 composição da invenção pode ser de uma ou mais cepas.
Bacterina de E. canis adequada para uso na composição de
vacina da presente invenção pode ser de uma ou mais cepas,
tais como aquelas designadas como Ebony, Broadfoot,
Florida, Israel 611, Kogashima, Louisiana, Oklahoma,
20 Venezuela, a cepa Jake da Universidade do Estado da
Carolina do Norte (NCSU), os isolados Demon, DJ e Fuzzy da
NCSU, linhagens de células infectadas com
E. canis
com
qualquer das cepas designadas, linhagens de células DH82
infectadas com E. canis ou as linhagens de células DH82
25 infectadas com
E. Canis
depositadas em American Type
Culture Collection (ATCC, Rockville, MD), e com o número de
acesso CRL 10390, conforme descritas na Patente US
5.192.679, ou similares. Uma bacterina de E. canis adequada
para uso na composição de vacina da presente invenção pode
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ser preferivelmente de duas cepas de
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E. canis,
tais como
Ebony e Broadfoot.
A cepa Ebony, por exemplo, é 99,9% homóloga com a
cepa Oklahoma com base na seqüência de DNA recombinante
5 (rDNA) 16S (i.e., um diferença de nucleotídeo) [Mathew JS
et al., Attempted transmission of
Ehrlichia canis
por
Rhipicephalus sanguineus after passage in cell culture, Am
J Vet Res, novembro de 1996; 57(11):1594-8], e mostrou ser
transmissível para cães por carrapato marrom do cão ninfal
10 ou adulto (Rhipicephalus sanguineus)
(Mathew, 1996).
A cepa Florida mostrou conter um principal gene
de proteína de 28 kDa imunorreativa conservado (Patente US
6.458.942) e um gene p30 pertencente à família de múltiplos
genes omp-1 (Patente US 6.432.649). Além disso, a Patente
15 US 6.043.085 revela que a cepa Florida tem uma proteína
antigênica imunodominante de 120 kDa, contendo 14
repetições com 36 aminoácidos cada, que são previstas como
estando expostas na superfície. As unidades de repetição
são hidrófilos que formam o núcleo das regiões expostas na
20 superfície da proteína, e são ricas em serina e ácido
glutâmico. Serina e ácido glutâmico compreendem cada um 19%
dos aminoácidos de uma unidade de repetição. Acredita-se
que a cepa Florida seja menos virulenta que a cepa E. canis
Jake (NCSU) [Breitschwerdt et al., Doxycycline hyclate
25 treatment of experimental canine Ehrlichiosis followed by
challenge inoculation with two
Ehrlichia canis
strains,
Antimicorbial Agent and Chemotherapy, fevereiro de 1988;
42(2):362-68], enquanto a comparação serológica com a cepa
Oklahoma revelou 100% de especificidade e 87,5% de
30 sensibilidade [Dawnson JE et al. Serological comparison of
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human ehrlichiosis using two Ehrlichia canis isolates. J.
Infect Dis., março de 1991; 163(3):564-7].
Além de crescer em uma linhagem de célula canina
contínua (por exemplo, DH82) (Keysary A et al. The first
5 isolation, in
chracterization of
vitro
propagation, and genetic
Ehrlichia canis
in Israel, Vet.
Parasitol., abril de 1996; 62(3-4):331(40), a cepa Israel
611 tem crescido em uma linhagem de célula de macráfago de
camundongo contínua (por exemplo, J774A1) (Keysary A et al.
10 Cultivation of Ehrlichia canis in a continuous BALB/C mouse
macrophage cell culture line, J Vet Diag. Invest., novembro
de 2001; 13(6):521-3). Israe1611 tem duas formas de
mórulas: (1) empacotadas de forma compacta e (2)
empacotadas de forma frouxa, e sua seqüência de genes de
15 rRNA 2S é de três nucleotídeos diferentes da cepa Oklahoma
e quatro nucleotídeos diferentes da cepa Florida, com um
intervalo de um nucleotídeo em cada (Keysary, 1996). O grau
de diferença de homologia da cepa Oklahoma é de 0,54%,
enquanto a diferença da cepa Florida é de 0,61% (Keysary,
20
1996).
Como a cepa Florida, a cepa Louisiana tem um
principal gene de proteína de 28 kDa imunorreativa
conservado (Patente US 6.458.942), um gene p30 pertencente
a uma família de múltiplos genes omp-1 (Patente US
25 6.432.649, e, como mostrado na Patente US 6.043.085, uma
proteína antigênica imunodominante, contendo 14 repetições
com 35 aminoácidos cada, que são prognosticadas como
estando expostas na superfície. As unidades de repetição
são hidrófilos que formam o núcleo das regiões expostas na
30 superfície da proteína, e são ricas em serina e ácido
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glutâmico. Serina e ácido glutâmico compreendem cada um 19%
•
dos aminoácidos de uma unidade de repetição.
De forma também similar, a cepa Oklahoma tem um
principal gene de proteína de 28 kDa imunorreativa
5 conservado (Patente US 6.458.942), um gene p30 pertencendo
a uma família de múltiplos genes omp-1 (Patente US
6.432.649), e, como revelado na Patente US 6.043.085, uma
proteína antigênica imunodominante de 120 kDa, contendo 14
repetições como 36 aminoácidos cada, que são prognosticadas
10 como estando expostas na superfície. As unidades de
repetição são hidrófilos, que formam o núcleo das regiões
expostas na superfície da proteína, e são ricas em serina e
ácido glutâmico. Serina e ácido glutâmico compreendem cada
um 19% dos aminoácidos de uma unidade de repetição.
15 Adicionalmente, McBride JW et al constatou que Oklahona
possui um gene de glicoproteína (2.064 bp) que codifica
proteínas de 548 a 688 aminoácidos com massas moleculares
prognosticadas de somente 61 e 73 kDa, mas com mobilidades
eletroforéticas de 140 kDa (P140), respectivamente. O gene
20 de proteína de 140 kDa tem quatorze (14) unidades de
repetição de 108 bp, dispostas em tandem, quase idênticas.
A região de 14 repetições (78%) do gene P140 (1.620 bp) foi
expressa em
Escherichia coli.
A proteína recombinante
exibiu massas moleculares variando de 1,6 a 2 vezes maior
25 que aquelas prognosticadas pelas seqüências de aminoácidos.
Anticorpos contra as proteínas recombinantes reagem com E.
canis
P140. Carboidrato foi detectado nas proteínas
recombinantes de
E. canis.
Uma análise da composição de
carboidratos identificou glicose, galactose, e xilose nas
30 proteínas recombinantes. A presença de somente um sítio
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para glicosilação ligada a N (Asn-Xaa-Ser/Thr), falta de
efeito de N-glicosidase F, a presença de sítios de
glicosilação 70 e 126 Ser/Thr nas regiões de repetição de
P120 e P140, respectivamente, e uma alta razão molar de
5 carboidrato para proteína sugerem que glicanas podem ser
ligadas em O (McBride JW et al. Glycosilation of Homologous
Immunodominant Proteínas of
Ehrlichia canis.
Ehrlichia chaffeensis
e
Infection and Immunity, janeiro de 2000,
68(1):13-18). Oklahoma pode crescer na linhagem de célula
10 HD82 de macrófago canino em meio essencial mínimo contendo
12,5% de soro fetal bovino e 200 mM de L-glutamina (Bowie,
M. V. et al. Potential value of major antigenic protein 2
for serological diagnosis of heartwater and related
Ehrlichia) infections, Clin. Diagnostic Lab. Immun., março
15 de 1999; 6(2):209-15). Uma comparação sorológica com cepa
FL revelou 100% de especificidade e 87,5% de sensibilidade
(Dawson, 1991, acima). Similaridade de 99,9%, com base na
seqüência de rDNA 16S, foi encontrada com as cepas Ebony
(Mathew, 1996), Kagoshima 1 (Unver A et al. Analysis of 16S
20 rRNA gene sequences of
Ehrlichia canis,
Anaplasma platys,
and Wolbachia species from canine blood in Japan, Ann NY
Acad. Sci., junho de 2003; 990:692-8), e Venezuela (Unver A
et al. Molecular and antigenic comparison of
Ehrlichia
canis isolates from dogs, ticks, and a human in Venezuela,
25
J Clin Microbiol., agosto de 2001; 39(8):2788-93).
Para os isolados NCSU, Demon, DJ e Fuzzi, e cepa
Jake, todos possuem um principal gene de proteína de 28 kDa
imunorreativa conservado (Patente US 6.458.942). Foi
mostrado que DJ, Fuzzy e Jake têm também gene p30
30 pertencendo à família de múltiplos genes omp-1 (Patente US
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6.432.649). Acredita-se que a cepa Jake seja mais virulenta
que a cepa Florida (Breitschwerdt, 1998, acima).
Particularmente a seqüência inteira de rRNA 16S
de Kagoshima 1 foi constatada ser a mais similar às
5 seqüências das cepas E. canis Oklahoma e Venezuela (1 par
de bases de diferença em 1.387) com 99,9% de identidade de
seqüência (Unver, 2003, acima). Além de, e de modo similar,
a sua alta identidade de seqüência à cepa Kagoshima 1, a
cepa Venezuela é 99,9% similar à cepa Oklahoma com base na
10 seqüência de rDNA 16S (Unver, 2001).
Na prática preferida, a bacterina de
E. canis é
crescida em uma linhagem de células macrófagos de monócitos
caninos, algumas vezes referida como células macrófagos de
monócitos caninos ou linhagem de células macrófagos
15 caninas, suportada por um meio contendo RPMI1640
suplementado com soro fetal bovino, glicose e glutamina.
Preferivelmente, as células são cultivadas em um meio de
suporte que pode ser RPMI1640, OptiMEM, ou AIM V,
preferivelmente RPMI1640, suplementado com até 10% de soro
20 fetal bovino, 0,5% de hidrolisado de lactalbumina, 20 pg/mL
de Polymyxin B, 110 pg/mL de piruvato de sódio, 2,5 mg/mL
de bicarbonato de sódio, 4 mg/mL de glicose, 6 mg/mL de Lglutamina, 0,55 mg/mL de sulfato de magnésio, e cultivadas
por até 95 dias, preferivelmente por até 35 dias, mais
25 preferivelmente cerca de 5 a 10 dias, para obtenção de um
título de 2x10 4 TCID 50 (Dose Infecciosa da Cultura de
Tecido), e então a cultura é colhida e processada para
inativação.
A bacterina de
E. canis
acima obtida pode ser
30 então inativada por meios de inativação convencionais. Por
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exemplo, inativação química usando-se agentes químicos de
inativação
propiolactona,
tal
como
formalina,
etilenoimina
mertiolato,
binária,
beta-
gluteraldeído,
dodecil sulfato de sódio, ou similares, ou uma mistura
5 destes, sendo a formalina o agente de inativação preferido.
A bacterina pode ser também inativada por calor ou
psoraleno em presença de luz ultravioleta.
A quantidade imunizante eficaz da bacterina de E.
canis
inativada pode variar dependendo da cepa ou cepas
10 escolhidas e pode ser qualquer quantidade suficiente para
produzir uma resposta imunoprotetora. Quantidades em que a
unidade de dosagem compreende pelo menos cerca de lx10 4
50 de bacterina de E. canis inativada são adequadas.
Como usado aqui, o termo "agente indutor de
15 resposta de anticorpo" designa qualquer composto, ou
combinação de compostos, capaz de intensificar a resposta
de imunidade humoral. Exemplos típicos são copolímero de
etileno anidrido maléico (EMA), emulsões de látex de um
copolímero de estireno com uma mistura de ácido acrílico e
20 ácido metacrílico, tal como NEOCRYL ® A-640 (Avecia Neo
Resius, Frankfort, IN), hidróxido de alumínio, ou
similares, ou uma mistura destes. O agente indutor de
resposta de anticorpo da presente invenção é,
preferivelmente, uma mistura de EMA e NEOCRYL ® . NEOCRYL ® é
25 uma marca registrada da Avecia BV, Sluisweg, 12. Caixa
Postal 123 NL-5140 AC Waalwijk, Países Baixos, para
polímeros e copolímeros acrílicos contidos em água. A
referência numérica A640 significa um grau deste. NEOCRYL
A640 é um copolímero acrílico estirenado aquoso não
30 coalescido, tendo um pH de cerca de 7,5, uma viscosidade de
TCID
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cerca de 100 cps (Brookfield 25 °C), um peso de 1,15 kg por
litro (8,6 lb/galão) conforme fornecido contendo 40% de
sólidos em peso, uma peso específico de 1,30 mg/L, um
temperatura de transição vítrea
(Tg)
de 44 °C, um
5 temperatura mínima de formação de filme (MFFT) de 40 °C, e
um número de ácido (não volátil) de 50. Especificamente,
e
NEOCRYL A640 é um copolímero acrílico aquoso não
coalescido com estireno. Mais especificamente, NEOCRYL ®
A640éumaelsãodátxeumcoplírdestino
10 com uma mistura de ácido acrílico e metacrílico.
Graus adequados do copolímero de EMA úteis nesta
invenção são os copolímeros de etileno linear-anidrido
maléico, tal como EMA-31 (Monsanto Co., St. Louis, MO), que
é um copolímero funcional ácido. Esses copolímeros são pós
15 de escoamento livre, brancos, finos, solúveis em água tendo
as seguintes propriedades típicas: um ponto de amolecimento
de cerca de 170 °C, uma temperatura de decomposição de cerca
de 247 ° C, um pH (solução a 1%) de 2,3, e uma viscosidade
específica (solução a 1% em dimetil formamida) de 0,9-1,2
20 g/100 mL.
O termo "agente indutor de resposta imunitária
mediada por célula (CMI)", como usado aqui, designa
qualquer agente, ou combinação de agentes, capaz de
intensificar uma resposta à imunidade celular. Exemplos
25 típicos são materiais biológicos, tal como cepa atenuada de
Mycobacterium bovis,
bacilos de Calmette-Guérin (BCG)
(Calbiochem, La Jolla, CA) ou similares, e citocinas
relacionadas a Th1, tal como interlecuina-12 (IL-12),
interleucina-18 (IL-18), interferon gama, ou similares,
30 preferivelmente IL-12; ou substâncias que são emulsões de
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óleo em água, tal como uma emulsão parafínica de óleo em
água como EMULSIGEN® SA (MVP Laboratories, Ralston, NE),
óleo de SP (uma composição de esqualeno, Pluronic ® L121 e
Tween® 80 (esqualeno é da VWR/Kodak, Rochester, Nova
5 Iorque, e o Pluronic ® L121 disponível da Basf , Mt. Olive,
NJ), SAF-1(Formulação 1 Adjuvante Syntex, uma composição do
análogo de treonila de mauramil dipeptídeo, Tween 80,
Pluronic L121 e esqualeno, que é descrita por Byars, N.E.
e Allisoin, A.C., Vaccine, 5(3):223-28) ou similares,
10 preferivelmente EMULSIGEN ® e mais preferivelmente, uma
emulsão de óleo em água. EMULSIGEN ® é uma marca registrada
da Modern Veterinary Products, 5404 Miller Ave. Omaha,
Nebrasca 68127, E.U.A, para adjuvantes antigênicos
veterinários de natureza óleo em água emulsificada. As
15 letras SA significam um grau deste. EMULSIGEN® SA, uma base
adjuvante de óleo emulsificado parafínico, é de um branco
leitoso quando misturado com Caldo Tríptico de Soja (TSB)
(20% de concentração final), com uma viscosidade de 25-50
cps (Viscosímetro Brookfield LV, fuso #18, a 30 rpm), e
20 compreende pelo menos 80% de gotas na fase oleosa menores
ou iguais a oito (8) micra. Pluronic ® é uma marca
registrada da BASF Corporation para copolímeros em bloco de
óxido de etileno e óxido de propileno e a referência
numérica L121 designa um grau deste.
25
Quantidades imunogenicamente estimulantes podem
variar de acordo com o agente indutor de resposta de
anticorpo, o agente indutor CMI, o componente de bacterina
de E.
canis,
o grau de exposição infecciosa potencial, o
método de administração da composição de vacina, o estágio
30 de crescimento e tamanho do cão, ou similares. Além disso,
•
•
13
••
4eol
•
99 ••••••
a ip o • 1 •• •55 111•
• • •••
•
•
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••
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•
•
•
•
•
quantidades imunogenicamente estimulantes do sistema
adjuvante são uma quantidade suficiente para intensificar
uma imunorresposta ao agente imunizante - bacterina de
canis.
E.
Em geral, quantidades cerca de 1% a 6% v/v,
5 preferivelmente cerca de 4% v/v do agente indutor de
resposta de anticorpo e cerca de 3% a 7% v/v,
preferivelmente cerca de 5% v/v, do agente indutor CMI são
adequadas.
Veículos farmacologicamente aceitáveis adequados
10 para uso na composição de vacina da invenção podem ser
qualquer veículo líquido convencional adequado para
composições farmacêuticas veterinárias, e, preferivelmente,
é uma solução balanceada de sais tal como é adequado para
uso em meios de cultura de tecido.
15
Além da bacterina de
E. canis
inativada como
ingrediente ativo, é contemplado que a composição de vacina
da invenção pode conter também outros componentes ativos
tais como um componente antipatogênico direcionado contra
vírus da raiva, doença de Lime
(Borrelia burgdorferi),
20 vírus da cinomose canina, parvovírus canino, adenovírus
canino,
vírus
interrogans
corona
canino,
Giárdia;
Leptospira
tais como sorovariantes
canicola,
icteorhaemorrhagiae, pomona, grippotyphosa ou bratislava ou
similares, ou uma combinação destes.
25
Em uma modalidade da invenção, o componente de
bacterina de E. canis da invenção pode ser incorporado em
lipossomas usando-se tecnologia conhecida tal como aquela
descrita em
Immunology,
Nature,
1974, 252, 252-254 ou
Journal of
1978, 120, 1109-13. Em uma outra modalidade da
30 invenção, o componente de bacterina de E. canis inativada
•
•
14
ée
é 11
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•
•
•
•
•
•
•
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••
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• • • • • •
•
•
*******
• •
•
•
•
•
•
•
da invenção pode ser conjugado a compostos biológicos
adequados tais como polissacarídeos, peptídeos, proteína,
ou simulares, ou combinação destes.
Em uma modalidade preferida da invenção, a
5 composição de vacina inventiva pode ser formulada em uma
forma de unidade de dosagem para facilitar administração e
assegurar uniformidade de dosagem. Aqui, uma unidade de
dosagem, conforme ela pertença à composição de vacina da
invenção, refere-se a unidades fisicamente separadas
10 adequadas como dosagens unitárias para animais, cada
unidade contendo uma quantidade predeterminada de bacterina
de E. canis calculada para produzir o efeito imunogênico
desejado em associação com o sistema adjuvante requerido e
carreador ou veículo.
15
A composição de vacina inventiva pode ser
administrada parentalmente, por exemplo,
intramuscularmente, subcutaneamente, intraperitonealmente,
intradermicamente ou similares, preferivelmente, subcutânea
ou intradermicamente, e mais preferivelmente,
20 subcutaneamente; ou a dita composição pode ser administrada
oral ou intranasalmente.
Por conseguinte, a presente invenção proporciona
também um método para a prevenção ou atenuação de
erliquiose canina em cães que compreende administrar ao cão
25 uma composição de vacina segura e eficaz como descrita
acima.
Na prática preferida, a composição de vacina da
invenção é administrada parenteralmente, oralmente, ou
intranasalmente, preferivelmente parenteralmente, mais
30 preferivelmente subcutaneamente, em quantidades eficazes de
•
15
••• • • •• ••• •••
•• •• • •• ••• •• •• • • • ••• ••• ••• •
•
•• • • *******
• •
•
•
• •
•
•
acordo com um programa determinado pelo tempo de exposição
•
•
potencial a um veículo da bacterina de
E.
canis.
Desse
modo, o animal tratado pode ter tempo para criar imunidade
antes da exposição natural. Por exemplo, um programa de
5 tratamento típico pode incluir administração parenteral,
preferivelmente injeção subcutânea, pelo menos 5 semanas
antes da exposição potencial. Pelo menos duas
administrações são preferidas, por exemplo, a primeira a
cerca de 5 semanas e a segunda a cerca de 2 semanas antes
10 da exposição potencial do animal tratado.
De modo a estudar e avaliar eficazmente os
mecanismos patogénicos da bacterina de
E.
canis
e os
mecanismos de defesa do hospedeiro canino e assim avançar
na técnica de vacina e aperfeiçoar produtos de vacina, deve
15 ser criado um eficaz modelo de desafiante. Embora
diferentes modelos de desafiante de erliquiose canina sejam
conhecidos, nenhum tem sido eficaz em provocar uma alta
percentagem de animais de teste para demonstrar sintomas
clínicos persistentes e graves que são comumentes
20 associados à erliquiose canina, tal como secreção ocular
mucopurulenta, desidratação, ou similares. Portanto, um
modelo de desafiante melhor e mais consistentemente eficaz
é necessário para a avaliação de vacinas e fármacos, e o
estudo de bacterina de
E.
canis
e doença causadas pela
25 mesma.
Surpreendentemente,
desafiante de
E.
canis
foi verificado que
um
particularmente eficaz pode ser
obtido em um animal de teste por administração ao dito
animal de teste de um estirpe desafiante de células
30 mononucleares de sangue periférico (PBMC) contendo uma
16
.
.
cultura virulenta de
E. canis.
••
•
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• •
•
•
•
•
A cultura virulenta de E.
canis é preparada por passagens repetidas do microrganismo
de E. canis, tal como E. canis Ebony, E. canis Broadfoot ou
similares, preferivelmente
E. canis
Ebony, em um
5 hospedeiro; separação das PBMC da amostra de sangue do
hospedeiro; e mistura das PBMC separadas com soro fetal
bovino a 20% e sulfóxido de dimetila a 10%. Por
conseguinte, a presente invenção proporciona também um
método para induzir erliquiose canina clínica em um animal
10 de teste, que compreende administrar ao dito animal uma
quantidade eficaz de estirpe desafiante de
E. canis,
consiste essencialmente em um microrganismo de
que
E. canis
virulenta em células mononucleares de sangue periférico.
Culturas viáveis da cada E. canis Broadfoot (algumas vezes
15 referido como E. canis BF, ou Bradfoot) e E. canis Ebony
(algumas vezes referido como Ebony) foram depositadas na
ATCC (sob os termos e as exigências do Tratado de Budapeste
referentes ao depósito de microrganismos para fins de
procedimento de patente) e receberam, respectivamente, os
20 números de acesso ATCC PTA-5811 para a cepa Bradfoot, e
PTA-5811 para a cepa Ebony.
Na prática real, a virulência do microrganismo E.
canis é
aumentada por passagens repetidas em um animal
hospedeiro. Amostras de sangue integral do hospedeiro são
25 colocadas em um meio gradiente tal como Histopaque ® 1077,
centrifugadas, e a camada de PBMC é separada. As PBMC assim
obtidas são misturadas com soro fetal bovino a 20% e
sulfóxido de dimetila a 10% e congeladas em nitrogênio
líquido para armazenagem de modo a proporcionar um
30 suprimento de estirpe desafiante consistente e contínuo.
•
•
17
• ••• • • •• ••• •••
•
••
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•• • • * * * * *** •
••
• • • •
• • •
•
•
Esse estirpe desafiante pode ser diluído com solução salina
tampão antes da administração a um animal de teste. A
administração pode ser qualquer via de inoculação
convencional tal como subcutânea, intramuscular,
5 intradérmica, ou similares, e mais preferivelmente é por
administração subcutânea.
Para um entendimento mais claro da invenção, os
seguintes exemplos são dados abaixo. Esses exemplos são
meramente ilustrativos e não são de modo algum para serem
10 entendidos como limitativos do escopo ou princípios básicos
da invenção. Certamente, várias modificações da invenção,
além daquelas mostradas e descritas aqui, tornar-se-ão
aparentes para aqueles versados na técnica a partir dos
exemplos estabelecidos a seguir e na descrição anterior. É
15 pretendido que tais modificações fiquem dentro do escopo
das reivindicações apensas.
A menos que de outro modo indicado, todas as
partes estão em peso.
EXEMPLO 1
20
Avaliação de Modelo de Desafiante de
E. canis
Virulenta
A. Preparação de estirpe desafiante
Bactérias da cepa
E. canis
Ebony vivas são
passadas repetidamente em cães. Amostras de sangue integral
25 dos cães infectados são centrifugadas a 2.500xg por 15
minutos. O revestimento amarelo claro é coletado e diluído
com solução tamponada de fosfato (PBS), então formado em
camadas sobre Histopaque 1077 e o material em camadas é
centrifugado 400xg por 45 minutos. As PBMC são coletadas e
30 lavadas com PBS. As PBMC são misturadas com soro fetal
18
• ••• • ••• • . .
•• •• •• •• • •• ••
• • ..
• • • ** * ****
•
.
•
bovino a 20% e sulfóxido de dimetila a 10% e congeladas em
••• •
•
..
nitrogênio líquido. Antes do uso, o estirpe desafiante é
diluído com solução salina tamponada para uma diluição
final de estirpe desafiante para solução salina tamponada
5
de 1:3 ou 1:4.
B. Método de desafiante
Nessa avaliação, 20 cães com idades variando de 8
a 12 meses são aleatorizados em 2 grupos. Os cães são
desafiados via a rota subcutânea com 1 mL do estirpe
10 desafiante diluído. Um grupo é desafiado com uma solução
1:3
de estirpe desafiante, e o grupo remanescente é
desafiado com uma diluição
1:4
de estirpe desafiante.
Depois do desafiante, os cães são observados e amostras de
sangue são tiradas 3 vezes por semana de modo a monitorar
15 os sinais clínicos da doença, incluindo trombocitopenia,
por um total de 56 dias.
C. Observações
Os sinais clínicos observados incluíram secreções
nasais e oculares mucopurulentas, depressão, desidratação,
20 linfadenopatia e edema corneano. As secreções oculares
mucopurulentas e desidratação são os sinais mais freqüentes
observados. As secreções oculares mucopurulentas e
desidratação são específicas do progresso da doença e
refletem indiretamente a gravidade da doença. Uma
25 incidência por ponto de tempo de observação para cada sinal
clínico é registrada e a incidência total entre os grupos é
comparada. Dos pontos de tempo observados, 53% (diluição
1:3) e 35% (diluição 1:4) tinham secreção ocular
mucopurulenta e 44% (diluição 1:3) e 30% (diluição 1:4)
30 tinham desidratação.
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6: 6 . 6 66 .
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•
Nessa avaliação foi também observada uma alta
taxa de mortalidade. A indução de mortalidade é a indicação
mais surpreendente da patogênese potencial da bacterina de
E. canis usada no estirpe desafiante. Para o tratamento com
5 diluição 1:3,
100% dos cães se enquadraram na definição de
caso de erliquiose e para o tratamento com diluição
1:4,
80% se enquadraram na definição de erliquiose. Os dados são
apresentados na Tabela I.
Temperaturas retais foram registradas como um
10 indicador de infecção por Ehrlichia. A maior parte dos cães
infectados apresentava algumas incidências de temperatura
retal elevada. Os dados estão mostrados na Tabela II.
Trombocitopenia (contagens de plaquetas abaixo de
200.000/pL) foi observada começando a cerca de 12 dias pós15 desafiante (DPC) e durante o tempo remanescente observado.
Os dados são mostrados na Tabela III.
D. Conclusões
O modelo de desafiante descrito aqui produz
sinais clínicos graves de erliquiose canina em cães e
20 proporciona uma definição de caso de doença erliquiose para
uso em estudo posterior e avaliação de tratamentos para a
mesma. A definição de caso clínico de erliquiose canina
será definida por mortalidade, pelo menos três dias
consecutivos de observação de secreção ocular mucopurulenta
25 e/ou pelo menos três dias consecutivos de observação de
desidratação.
20
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•
TABELA I
Número de
animais
com
Sinais
por 3 dias
consecutiv
os
% de
animais
com sinais
por 3 dias
consecutivo
s
Duração
média
dos
sinais
clínicos
Incidênc
ia total
dos
sinais
clínicos
relacion
ados
DILUIÇÃ
O
Sinais
Clínicos
1:3
Secreção Nasal
Mucopurulenta
1/10
10%
0,5 dia
5
1:3
Secreção
Ocular
Mucopurulenta*
Depressão
Desidratação*
Linfadenopatia
Edema Corneano
Morte*
Secreção Nasal
Mucopurulenta
7/10
70%
4,8 dias
48
2/10
6/10
O
1/10
9/10
O
20%
60%
O
10%
90%
O
1,1 dia
4,0 dias
O
1,2 dia
11
40
O
12
0,1 dia
1
7/10
70%
3,8 dias
40
O
5/10
O
1/10
4/10
O
50%
O
10%
40%
0,7 dia
3,4 dias
O
0,5 dia
7
34
O
5
NA
1:3
1:3
1:3
1:3
1:3
1:4
1:4
1:4
1:4
1:4
1:4
1:4
Secreção
Ocular
Mucopurulenta
*
Depressão
Desidratação*
Linfadenopatia
Edema Corneano
Morte*
* Sinais são incluídos no caso de definição de
erliquiose.
•
21
••
•••
•
•
•
•
•
••
•
• •
• •
• ••
••.
•
•
•
•
1.
•
• •••
•
•• ••• • ••
•• • •• • ••• •
• •
•
TABELA II
Temperatura Retal °C
Pós desafiante
12 Dias
14 Dias
28 Dias
42 Dias
40,39
40,94
NA
NA
39,50
39,56
39,22
37,33
39,44
39,72
NA
39,00
39,00
32,28
39,39
39,39
39,94
39,00
39,28
39,78
38,61
39,17
39,44
40,28
40,22
40,06
40,44
39,33
38,33
39,56
39,44
40,06
39,22
39,22
40,56
38,39
39,22
39,61
39,72
39,28
40,61
38,94
39,06
38,78
40
39,9
39,9
32,89
38,61
38,94
39,11
40,50
39
38,94
39,83
38,89
39,22
39,17
40,67
39,22
38,89
39
39,94
39,44
40,11
38,67
39,72
39,44
39
39,5
39,17
38,44
40,78
39,44
38,78
38,89
NA
39,61
39,89
39,83
-
Diluição
1:3
1:3
1:3
1:3
1:3
1:3
1:3
1:3
1:3
1:3
1:4
1:4
1:4
1:4
1:4
1:4
1:4
1:4
1:4
1:4
-
56 Dias
NA
NA
NA
NA
NA
NA
38,83
NA
NA
38,83
NA
NA
38,61
38,72
38,78
38,33
NA
38,39
38,44
NA
Tabela III
Contagens
5
de Plaquetas no
Sangue,
10 3 /7aL
-
Pós-
desafiante
Dilui
£!c2
1:3
1:3
1:3
1:3
1:3
1:3
1:3
1:3
1:3
1:3
1:4
1:4
O
Di
a
40
7
30
1
49
7
53
4
30
8
30
O
39
8
46
4
28
1
26
3
34
3
41
12
Dias
14
Dias
19 Dias
21 Dias
26
Dias
28
Dia
s
s
s
155/
185
269
NA
NA
55,
5
120
,0
8,0
6
5,9
4
NA
329
360
221
413
306
51,4/41
,1
39,2/38
54,
3
5,7
8
38,
6
0,5
5
62
NA
374
225
342
139/1
43
161/1
62
378
1,9/1,4
1
0,446/0
,388
287
343
246
1,61/2,
48,7/5
0,5
107/10
5
14,6/3
1,6
6,13/1
,89
0/0,69
8
4,42/6
,21
55,3/3
9,3
5,5/3,
55
7,41/9
,23
2,71/4
,11
8,58/1
78,
3
163
205
0,599/1
,24
4,76/4,
9
53,8/56
,2
0,426/1
,87
9,59/7,
31
3,47/2,
84
50,3/49
,6
6,38/6,
56
0/0
NA
260
1,42/2,
95
3,3/1,1
6
57,7/41
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2,03/1,
29
33,2/20
,1
79,2/83
NA
458
101/9
1,4
164/1
26
135/1
64
293
56
Di
as
NA
321
400
0,612/0
,741
139/130
1,74/0,
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9
54,
6
58,
3
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1
1,5
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Dia
4
52
0,7
88
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1
97
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1
8,8
9
44,
9
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Dia
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7
4.2
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2
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NA
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30
6
31
5
29
6
31
7
1:4
1:4
1:4
1:4
1:4
1:4
1:4
1:4
434
452
19
172/193
795
109/122
289
269
156/1
52
207
98,1/10
6
63,9/63
609
490
165/190
284
231
146/1
41
204
249
380
73,8/54
,2
38,9/9,
96
296
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,6
13,6/11
,3
89,3/84
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30,2/21
,2
4,73/2,
34
228
281
153/1
82
2,07/0,
689
4,5/5,7
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6,25/3
,84
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,2
43,1/4
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,07
3,17/4
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1,1
8,58/8
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•
e
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7
55,
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9
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1
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1
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4
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3
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8
59
NA
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0
50
,8
68
,7
51
,3
NA
81
,1
93
,1
NA
Avaliação da Eficácia induzida por bacterina de
E. canis com o adjuvante BCG
BCG, uma preparação autoclavada de Mycobacterium
bovis atenuada é reconhecida como um potente indutor de
imunidade mediada por célula (CMI). Para determinar os
efeitos sinergísticos de CMI, a bacterina de E. canis foi
auxiliada com adjuvante BCG, em diferentes níveis de
concentração. Estudos prévios demonstraram que a bacterina
10 de
E. canis
auxiliada somente com adjuvantes caninos
convencionais (induzindo resposta de anticorpo) (tais como
EMA e Neocryl ® ) era somente capaz de induzir imunidade
protetora subpotente.
A. Materiais e Métodos
15
Três grupos de vacinação de 7 cães cada e um
grupo de controle de 6 cães foram usados. A vacina contém 5
log TCID 50 (título pré-inativado) de bacterina da cepa
canis
E.
Ebony auxiliada com as seguintes combinações de
adjuvantes. Vacina A continha bacterina de
20
burgdoferi
(BBB)
Borrelia
e EMA/Neocryl e. . Vacina B continha
bacterina de Borrelia burgdoferi
4
41,
•••
Exemplo 2
5
e*
111
CO
•
•
•
•• ••
••
..
•
•
*******
•
•e•
(BBB), EMA/Neocryl ! e 100
•
•
23
••
• •
•
*O*
• • • •
•"
• ••
•
• •
•• • •
."
** .
••
•
•
•
•
pg/dose de BCG. Vacina C continha bacterina de
burgdoferi
•
• •
•
•
•
* O e• lle
:* . ". ".
•
Borrelia
(BBB), EMA/Neocryl® e 1,0 mg/dose de BCG. Os
outros componentes das três vacinas eram idênticos. O grupo
de controle de cães não estava vacinado
Os 27 cães foram aleatorizados em 4 grupos. Os
5
primeiros três grupos de 7 cães cada foram vacinados duas
vezes com vacina A, B ou C, por via subcutânea, em um
intervalo de 21 dias. O quarto grupo de 6 cães serviu como
controle e não foi vacinado. Dezesseis dias depois da
10 segunda vacinação, todos os cães foram desafiados com
canis
E.
virulenta e observados quanto a sinais clínicos,
temperaturas retais e alterações de contagens de plaquetas
no sangue por um total de 56 dias.
B. Resultados e Discussões
15
Os resultados estão sumarizados na Tabela IV.
Cinqüenta e seis dias depois do desafiante com
E. canis
virulenta, quatro dos sete cães (57%) estavam
trombocitopênicos e tinham altas temperaturas retais no
grupo inoculado com vacina A. Os mesmos resultados foram
20 observados no grupo inoculado com vacina B. Dos cães do
grupo de vacina C, somente dois dos 7 cães vacinados
(28,5%) tinham trombocitopenia e alta temperatura retal
durante o estudo. Cinco de 6 cães de controle (83%) tinham
trombocitopenia e altas temperatura retais. Os sinais
25 clínicos de cada grupo foram misturados e não havia
diferença entre os grupos. As alterações nas temperaturas
corporais e contagens de trombócitos eram sinais típicos de
infecção por E. canis e erliquiose.
Grupo
Tabela IV
Componentes da
vacina
Número de cães
com
Número de
cães com
•
24
••
• •
••
•
•
Vacina A Bacterina de E.
canis + BBB' +
EMA2 /Neocryl ® A640 3
Vacina B Bacterina de E.
canis + BBB +
EMA/Neocryl ® A640
+ 100 pg/dose de
BCG4
Vacina C Bacterina de E.
canis + BBB +
EMA/Neocryl ® A640
+ 1,0 mg/dose de
BCG
Controle
Nenhum
BBB
bacterina
••••••••
•
••
• • • •
•
• • • • •
•• #• •• ••• • •• ••• •• •• ••••
*******
• •
•
•
•
•
trombocitOpenIa "Febre
4 dos 7 cães
4 dos 7 cães
(57%)
(57%)
4 dos 7 cães
(57%)
4 dos 7 cães
(57%)
2 dos 7 cães
(28,5%)
2 dos 7 cães
(28,5%)
5 dos 6 cães
(83%)
5 dos 6 cães
(83%)
de
Borrelia
burgdoferi
proveniente da produção em série de Fort Dodge Animal
Health.
2
Fabricado por Monsanto Co., St. Louis, MO.
3
Fabricado por AVECIA Neo Resius, Frankfort, IN.
4
BCG = Bacilo de Calmette-Guérin, que é
5
Mycobacterium bovis atenuada, proveniente de Calbiochem, La
Jolla, CA.
Os resultados desse estudo mostram claramente que
10 a vacina auxiliada somente com o adjuvante (indutor de
©
resposta de anticorpo) convencional (EMA+Neocryl ) não era
protetora. O mesmo é verdadeiro quando a vacina foi
auxiliada com dose inferior de BCG, tal como 100 pg/dose.
Contudo, a vacina se tornou protetora quando ela foi
15 auxiliada com 1 mg/dose de BCG. Assim, a imunidade
protetora induzida por um indutor de CMI, BCG, em uma
concentração suficiente para intensificar a imunorrespota,
resulta em eficácia da vacina de bacterina E. canis.
C. Conclusão
•
•
•
•
25
..
• •
• •
•
•
•
•
•
•
•
•
6
•
•
•
•
••
•
•
• ••
••
• •o
g
•
• •••
•
• •
. •
•
•
•
•
•
•
• • • •4
•
•
• •
••
•
•
••
•
A CMI é necessária para proteger cães de infecção
com E. canis. A bacterina de E. canis auxiliada somente com
um adjuvante canino convencional não é eficaz na indução de
imunidade protetora in vivo.
5
EXEMPLO 3
Preparação de Composição de Vacina de
E. canis
inativada
Duas cepas de bacterina de
E. canis,
Ebony e
Broadfoot, são, cada uma, cultivadas em células DH82
10 suportadas por um meio contendo RPMI1640 suplementado com
5% a 7% de soro fetal bovino, 2% de glicose e 2 mmols de
glutamina por 5 a 14 dias. As culturas resultantes são
colhidas em um título de 1x10 4 TCID50 . As colheitas são
tituladas, lisadas, e então inativadas por adição de uma
15 solução a 0,1% de formalina, incubação a 36+2 °C, por um
período de 24-48 horas, adição de uma outra porção de
formalina a 0,1% e incubação pela segunda vez a 36+2 °C, por
24-28 horas. As duas cepas inativadas de
E. canis
são
misturadas uma com a outra em uma dosagem igual de 1x10 4 ' s
20 TCID 50 como o sistema adjuvante descrito abaixo para dar
composição de vacina A
Composição de Vacina A
Descrição de Ingredientes
E. canis inativada, Ebony
E. canis inativada,
Broadfoot
EMA1 -31
NEOCRYL° 2 A-640
Emulsigen® 3 SA
MEM4
Quantidade por
mL
1x10 4 ' 5 TCIDso
1x10 4 ' 5 TCIDso
1%
3%
5%
QS
v/v
v/v
v/v
para 100%
1 Fabricada por Monasanto_ CO., St. Louis, MO_
2
Fabricada por AVECIA Neo Resius, Frankfort, IN
•
•• •
•
••
•
•
26
•• •
••
•
•
•
• • • • • •••
•
••• ••••• • • •• l•••••• •e. •• •. •• • • •• • • •• • •
• •
•
•
•
e
•
•
•
3
Fabricado por MVP Laboratories, Inc., Ralston,
4
Meio Mínimo Essencial (MEM) fabricado por LTI,
NE
Grand Island, NI.
5
EXEMPLO 4
Avaliação de Duração de Doze Meses de Imunidade
Induzida por Composição de Vacina A de E. canis
Nessa avaliação, beagles de 15 a 16 semanas de
idade são divididos em 2 grupos, um grupo de controle (não
10 vacinado) de 15 cães e um grupo vacinado de 27 cães. O
grupo vacinado recebe duas doses de 1 mL da composição de
vacina A, descrita no Exemplo 3, em um intervalo de 21
dias. Doze meses após vacinação, todos os animais de teste
são desafiados com uma diluição 1:3 de um grupo de
15 desafiante congelado estabelecido de células mononucleares
de sangue periférico infectadas de E.canis (pmbc), conforme
descrição no Exemplo 1, por via subcutânea. Os animais de
teste são observados 3 vezes por semana começando em 12
dias pós-desafiante (DPC). Em cumprimento com as diretrizes
20 para o bem-estar animal do Institutional Animal Care and
Use Committee (IACUC), qualquer animal de teste que está
moribundo ou em pobre condição física é rigorosamente
examinado por veterinários licenciados estaduais.
Amostras de soro são avaliadas quanto a
25 anticorpos de
E. canis
usando-se um K-Elisa para
quantificar a imunorresposta após vacinação. As amostras de
soro são adicionadas em duplicata a poços revestidos com
proteína de extrato de células integrais de
E. canis.
Imunoglobulina (IgG) de cabra anti-cão conjugada com
30 peroxidase é então adicionada a cada poço e as placas são
•
•
27
*
•
é•
• •
•
•
•
• * *e
•
►
•••
•••
•
•
•• ••
••
•
•
• • • • •
• • • •
• • •
• 4 • *0
C • • • 999999 •
•
•
•
•
•
incubadas a 36+2 °C, por 30 minutos. Após remoção de
conjugado não ligado, as placas são reveladas usando-se um
sistema de substituto de ATBS. As placas são lidas em 405490 pm por 25 minutos, em intervalos de 35 segundos,
5 usando-se um modo cinético. Os resultados sorológicos são
mostrados na Tabela V em que DPVI designa dias após a
primeira dose da vacina; DPV2 designa dias após a segunda
dose da vacina; MPV2 designa meses após segunda dose da
vacina e DPC designa dias pós-desafiante.
10
Observações
Como pode ser observado dos dados sorológicos na
Tabela V, o grupo vacinado mostrou um aumento significativo
de anticorpos em relação ao grupo de controle (não
vacinado). Uma diferença significante de anticorpos entre
15 os grupos vacinados e de controle é também observada pósdesafiante. Além dos dados sorológicos, valores de
hematócritos, contagens de plaquetas, temperaturas retais e
pesos corporais são registrados. A percentagem de
hematócritos foi significantemente menos reduzida no grupo
20 vacinado em comparação com o grupo de controle. As
contagens de plaquetas eram significantemente menos
reduzidas no grupo vacinado em comparação com o grupo de
controle em 44 dias pós-desafiante. A perda de peso foi
significantemente menor nos vacinados em comparação com os
25 controles. No grupo de controle, 87% se enquadraram na
definição de caso para erliquiose canina, incluindo
mortalidade. No grupo vacinado, 44% se enquadraram na
definição de caso para erliquiose canina durante o período
de observação clínica de 56 dias.
30
Conclusões
•
•
•
•
28
•
•
•• ••• •••
• e• • • • • •
MO • •• • •
•
•
• •
•
11. • * • • ••• • ••• •• •
• • •
•
•
• • • ••*
••
•
•
A composição de vacina de E.
• • •
•
• •
canis do Exemplo 3
reduz significantemente a erliquiose canina em cães.
Administração de duas doses de 1 mL da referida vacina
induz imunidade por um período de pelo menos 12 meses. Um
5 aumento significante em anticorpos contra E.
canis em cães
é obtido por administração da composição de vacina do
Exemplo 3.
TABELA V
Resposta de Anticorpos à Vacina de
E.
canis
10 inativada
Grupo de
Tratamento 12
DPV1
O
14
3
5
9
DPV2
DPV2
MPV2
MPV2
MPV2
Controle
Controle
Controle
Controle
Controle
Controle
Controle
Controle
Controle
Controle
Controle
Controle
Controle
Controle
Controle
Média
0.000
0.006
0.007
0.000
0.027
0.011
0.001
0.065
0.028
0.000
0.011
0.004
0.098
0.057
0.014
0.022
0.000
0.003
0.005
0.018
0.000
0.023
0.002
0.044
0.021
0.000
0.000
0.000
0.057
0.033
0.004
0.014
0.072
0.006
0.000
0.000
0.002
0.000
0.002
0.027
0.000
0.006
0.004
0.002
0.008
0.002
0.002
0.009
0.054
0.003
0.006
0.003
0.005
0.000
0.000
0.020
0.003
0.000
0.004
0.000
0.009
0.001
0.001
0.007
0.052
0.000
0.000
0.000
0.000
0.005
0.001
0.019
0.002
0.002
0.005
0.000
0.006
0.001
0.001
0.006
0.000
0.036
0.036
0.000
0.112
0.089
0.006
0.188
0.054
0.008
0.072
0.014
0.223
0.064
0.034
0.062
O DPC
0.030
0.007
0.004
0.000
0.000
0.003
0.002
0.015
0.000
0.000
0.000
0.000
0.022
0.003
0.000
0.006
14
DPC
1.024
0.773
0.899
0.800
0.916
0.426
0.186
0.426
0.915
0.442
0.364
0.536
0.675
0.168
0.068
0.574
TABELA V(Cont.)
Grupo de
14
O
O
14
3
5
9
BPV1
DPV2
DPV2
MPV2
-1,71PV2
-1,71PV2
Vacinado
Vacinado
0.022
0.028
0.825
0.533
0.976
0.951
0.503
0.245
0.422
0.113
0.349
0.118
0.294
0.121
DPC
1.016
0.859
Vacinado
0.074
0.810
0.966
0.361
0.216
0.236
0.159
0.964
Vacinado
0.035
0.307
0.924
0.246
0.146
0.137
0.091
0.947
Vacinado
0.052
0.377
0.636
0.070
0.034
0.034
0.036
0.663
Vacinado
0.000
0.303
0.889
0.143
0.107
0.067
0.077
0.768
Vacinado
0.061
0.335
0.740
0.097
0.122
0.084
0.061
0.831
Vacinado
0.005
0.403
0.949
0.224
0.191
0.227
0.172
0.772
Vacinado
0.038
0.477
0.885
0.122
0.097
0.158
0.124
0.599
Tratamento
O DPC
•
•
29
..
• •
••
•
•
•
•
•
••
•
11
•
• •
• e
•
4. 1,
•
•
• •
• • • •• •
•
•
.••
.. *CO G O*
•• • • •• • • •loa •
•
•
•
•
•
•
•
0.045
0.579
0.633
Vacinado
0.020
0.407
0.816
0.075
0.059
Vacinado
0.042
0.463
0.853
0.167
0.101
0.050
0.061
0.886
Vacinado
0.032
0.648
0.945
0.278
0.187
0.185
0.177
1.002
Vacinado
0.050
0.150
0.745
0.196
0.127
0.103
0.071
0.593
Vacinado
0.135
0.652
0.856
0.139
0.080
0.054
0.062
0.866
Vacinado
0.061
0.268
0.900
0.231
0.133
0.089
0.075
0.711
Vacinado
0.119
0.606
0.893
0.243
0.184
0.125
0.101
0.761
Vacinado
0.039
0.335
0.888
0.113
0.062
0.056
0.047
0.734
Vacinado
0.015
0.231
0.911
0.120
0.068
0.051
0.061
0.743
Vacinado
0.030
0.390
0.957
0.108
0.085
0.094
0.048
0.773
Vacinado
0.008
0.295
0.879
0.290
0.209
0.121
0.196
0.828
Vacinado
0.055
0.262
0.737
0.105
0.065
0.076
0.060
0.531
Vacinado
0.041
0.297
0.989
0.306
0.089
0.052
0.145
0.873
Vacinado
0.013
0.226
0.826
0.167
0.090
0.066
0.051
0.706
Vacinado
0.058
0.180
0.518
0.193
0.146
0.093
0.113
0.881
Vacinado
0.065
0.103
0.386
0.050
0.036
0.013
0.000
0.518
Vacinado
0.030
0.159
0.543
0.154
0.168
0.102
0.056
0.416
Vacinado
0.105
0.222
0.364
0.122
0.084
0.039
0.041
0.268
Média
0.046
0.380
0.812
0.188
0.127
0.106
0.094
0.746
EXEMPLO 5
Avaliação de Imunidade Mediada por Células em
Resposta à Vacina de E. canis Atenuada
5
Ensaios Elispot para IL-12 e IFN-y são usados
para avaliar os níveis de IL-12 e
IFN - y em cães vacinados
com bacterina de Ehrlichia canis (E. canis).
Em comparação
para controlar cães, o número mais alto de spots de 11-12 e
IFN-y produzido por células mononucleares de sangue
10 periférico isoladas de cães vacinados indica que uma
resposta a CMI desempenha uma fução na proteção contra
infecção por E. canis.
•
•
30
•
•
•
•
•
••
•
•
•
•
•
• • •• •• ••
••
••
••
•
•
•
•
•
•
• ••• • • • • •
• •• ••
Co •: • • • •• •
•
• • ••
•
•
A. MATERIAIS E MÉTODOS
Dois grupos de cães são usados neste estudo:
Vacinados que receberam a bacterina de E. canis e controles
que não receberam a bacterina. Sangue integral é retirado
5 de cães vacinados e de controle depois da primeira
vacinação com bacterina de
E.
canis.
Amostras de sangue
integral dos cães de controle e vacinados são coletadas via
venipuntura estéril em tubos de 10 mL com EDTA. Células
mononucleares de sangue periférico (PBMC) são isoladas por
10 centrifugação em um gradiente de Percoll. Após isolamento,
PBMC são contadas e a concentração de células é determinada
para cada amostra. PBMC isoladas são então usadas
imediatamente para ensaio Elispot.
O meio de cultura completo usado para cultivar
15 PBMC caninas consiste em volumes iguais de Aim V
(Invitrogen, Carlsbad, CA; Cat. # 12055-083) e Ex-Cell (JHR
Biosciences, Lenexa, KS; Cat. # 141610-500M), 10% de soro
eqüino inativado por calor (Hyclone, Logan, UT; Cat. #
SH30074.03) e 10 pg/mL de gentamicina.
20
Ensaio Elispot
Preparação de placas para Elispot
Placas de IL-12
Placas de Immobilon P (Millipore, Burlington, MA)
são pré-molhadas com metanol a 70%, lavadas com solução
25 salina tamponada de fosfato Dulbecco-Vogt (DPBS),
revestidas com 10 pL/poço de anticorpo IL-12 de camundongo
anti-humano (10 pg/mL; Mabtech, Suécia), diluídas em tampão
de carbonato, pH 9,6, e incubadas a 37 °C, CO 2 a 5±2% por
duas horas. As placas são então lavadas com DPBS + 0,1 % de
•
•
31
e 11,
•
••
•
.
41
•
O
•
•ga
•
41 CO
•
•
•• ••• •• 6 4:
•
•
.
•
•
CO
•
lb
•
41
Tween 20 e bloqueadas com meio completo de Aim V/ExCell, a
36 °C, CO2 a 5+2%, por um mínimo de 2 horas.
Placa de IFN-y
Placas de Elispot para detecção de IFN-7 canino
5 são preparadas em um modo similar às placas para IL-12
canina, usando-se um anticorpo específico para IFN-'y
canino. As placas usadas nesse estudo são adquiridas da R&D
Systems (Mieápolis, MN; Cat. # EL781) e preparadas de
acordo com a instrução do fabricante. Essas placas são pré10 revestidas com um anticorpo policlonal para IFN-y anticanino.
Preparação de antígenos
Seis diferentes preparações de células são
inicialmente usadas como antígenos para estimular produção
15 de IL-12 e IFN-7. Elas incluem:
1.
Células DH82 infectadas com E. canis vivas
2.
Lisado de células DH82 infectadas com E.
canis (células foram lisadas por homogeneização)
3.
20
Lisado de células DH82 infectadas com
E.
canis inativado por tratamento com formalina
4.
Células DH82 não infectadas vivas, sozinhas
5.
Lisado de células DH82 não infectadas.
6.
Lisado de células DH82 não infectadas
inativado por tratamento com formalina
25
As primeiras três preparações são usadas para
estimular produção de IL-12 e IFN-7. As segundas três
preparações são usadas como controles negativos no teste.
No dia do ensaio, células DH82 infectadas com
* O*
8 41 •
•
•
•
• • • •
• . • . •.• . ••
E. canis
vivas e não-infectadas são colhidas, contadas, e a
30 concentração de células determinada. O número desejado de
.
•
••
32
•
•••
•
•
• • • • • •• • •
• •• •• •
• . • • .
•
• •
• •
•
• •
•• •• •• •
•
• •
*******
•
•
•
•
••
•
•
•
•
•
•
•
••
células vivas e os números de células equivalentes de
lisado de células (tratado com ou sem formalina) são resuspensos no meio de cultura completo de Aim V/ExCell e
aplicados ao ensaio. Os mitógenos Concanavalin A (Con A)
5 Sigma Cat. # C0412 e Lectina de
Phaseolus vulgaris
(PHA)
Sigma Cat. # L-4144 são preparados no meio de cultura
completo e usados como controles positivos para o ensaio.
Incubação de E. canis e PBMC
As placas revestidas com anticorpos, seguinte a 2
10 horas de bloqueio do meio, são lavadas com solução salina
tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS) + 0,1% de Tween
20. Células DH82 infectadas com
E.
canis
vivas e não
infectadas, lisados de células, meio e controle positivo em
diluição apropriada são adicionados aos poços revestidos
15 com anticorpos em volumes de 150 pL por poço. PBMC diluídas
que foram diluídas a uma desejada concentração de células
no meio de cultura completo e 50 pL/poço de cultura de
células são adicionados aos poços apropriados. As placas
são então incubadas a 36±2 °C, CO2 a 5+2% de 20 a 50 horas,
20 dependendo do ensaio que está sendo realizado.
Revelação de Placa
Placas de IL-12
Após incubação, as células são removidas por
lavagem com DPBS + 0,1% de Tween 20. Anticorpo de detecção
25 biotinilado (Mabtech, Suécia; Cat # 3450-6) é diluído em
DPBS + 0,5% de albumina sérica bovina (BSA) em 1,0 pg/L e
filtrado através de um filtro de seringa de 0,2 vim, antes
de uso. 100 pL de anticorpo de detecção é adicionado a
poços apropriados. As placas são incubadas a 36+ 2 °C, CO 2 a
30 5+2%, por três horas. O anticorpo de detecção é removido e
•
• •
•
•
•
••
•
33
•
••
• • ••• ••• •••
••
• • •
••
•• •
•
as placas são lavadas com DPBS + 0,1% de Tween.
• • .. ••• •••
•••
•
••• o ••. •• •.•••*• Ir .• •• ••
• •
• • • • • •
As placas
são incubadas com 100 pL/poço Estreptavidina-HRP (KPLGaithersburg, MD; Cat. # 14-0-00) diluídas a 1:1000 em DPBS
+ 0,1% de Tween 20 a 36+2 °C, CO2 a 5+2%, por três horas.
5
Durante a incubação, a solução de substrato é
preparada. Um tablete de 20 mg de AEC (3-amino-9-etilcarbazol, Sigma, St. Louis, MO; Cat. # D4254) é dissolvido
em 2 mL de N,N-dimetilformamida (DNF) em um frasco
Erlenmeyer de vidro. Uma vez dissolvido, 58 mL de acetato
10 de sódio 0,1 M (pH 5,0) e 30 pL de peróxido de hidrogênio
(H2 02 ) são adicionados à solução de substrato, que é então
filtrada através de um filtro de 0,45 pm antes de uso.
As placas são lavadas com DPBS + 0,1% de Tween
20, seguido por uma lavagem com DPBS sozinho para remover
15 detergente residual. Cem microlitros de solução de
substrato são adicionados a cada poço e incubados à
temperatura ambiente, por no máximo 20 minutos. A reação é
interrompida por remoção da solução de substrato e enxágüe
com água destilada. As placas são secadas à temperatura
20 ambiente e as unidades produtoras de
spots
(SPC) são
avaliadas quanto à quantidade, área, e intensidade usandose uma Leitora de Elispot Zeiss (Cari Zeiss Vision,
Oberkochen, Alemanha) com um software 4.4 KS ELISPOT.
Placa de IFN-y
25
Após incubação, as células são removidas por
lavagem com tampão de lavagem (R&D Systems, Mineápolis,
MN). Anticorpo de detecção biotinaldo é diluído em tampão
de diluição 1 (R&D System, Mineápolis, MN), de acordo com
as instruções do fabricante e filtrado através de um filtro
30 de seringa de 0,2 pm, antes de uso. Cem microlitros de
34
•
G
10
A
e
G
G
G
G
A
II
g
"I■
g
A
g
G
G
g
G
anticorpo de detecção são adicionados a poços apropriados.
As placas são então incubadas a 36±2 °C, CO2 a 5+2%, por
três horas. O anticorpo de detecção é removido e as placas
são lavadas com tampão de lavagem. As placas são incubadas
5 com 100 pL/poço de Estreptavidina-AP diluídos de acordo a
instrução do fabricante (R&D System, Mineápolis) a 36±2 °C,
CO2 a 5+2%, por 1 hora.
Seguinte à incubação com Estreptavidina-AP, as
placas são lavadas com tampão de lavagem e incubadas com
10 100 pL por poço de BCIP/NBT (R&D System, Mineápolis, MN), à
temperatura ambiente, por 20 minutos. Remoção da solução de
substrato e lavagem da placa com água destila finaliza a
reação. As placas são secadas à temperatura ambiente e as
unidades produtoras de
spot
(SPC) são avaliadas quanto à
15 quantidade, área, e intensidade usando-se uma Leitora de
Elispot Zeiss (Carl Zeiss Vision, Oberkochen, Alemanha) com
um software 4.4 KS ELISPOT.
Análise dos Dados
Os resultados são lidos como células formadoras
20 de spot
(SFC) e expressos de forma diferente dependendo na
natureza dos experimentos. Existem três caminhos possíveis
para apresentar os dados: o número original de
cada poço, o número médio de
spots
spots
em
para cada amostra e
Índice de Estímulo. Índice de estímulo é calculado
25 dividindo-se o número médio de
spots
em células não
estimuladas (células + meio de cultura somente) pelo número
médio de spots em poços estimulados.
B. Resultados e Interpretação
g
AA
g
G
A
g
•
35
..
•
•
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• • • • • •
••
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•
•
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•
•
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. o fill :CO OCO
• • • * 66 O 66 11
•
•
•
•
Essa avaliação é realizada para determinar o
número de células secretoras de IL-12 e IFN-7 em PBMC
isoladas de cães vacinados com E. canis.
Nesse experimento, são usados um cão de controle
5 e três cães vacinados. Os resultados de experimento são
apresentados nas Tabelas VI e VII. Da Tabela VI, os dados
indicam que somente as células DH82 infectadas por E. canis
vivas estimularam a produção de IL-12 em PBMC nos três cães
vacinados em comparação com a não produção por PBMC do cão
10 de controle. A estimulação é assim dose-dependente de
células DH82 infectadas com
número de
spots
com o maior
na diluição 1:10 (equivalente a 1x10 4
células/poço) do estirpe de
E. canis vivas,
E. canis
que na diluição
1:1000. Lisado de células DH82 infectadas com E. canis com
15 ou sem tratamento com formalina, células DH82 não
infectadas vivas, lisado de células DH82 não infectadas, e
células DH82 de lisado tratado com formalina não resultaram
em qualquer resposta de IL-12 detectável. Dois dos cães
vacinados reagiram a um grau mais alto que o terceiro
20 vacinado. O cão de controle não mostrou uma resposta a
qualquer estimulação exceto por uma baixa resposta a
mitógeno positivo (PHA).
A Tabela VII mostra os resultados de Elispots
para IFN-1, para os mesmos quatro cães. Similarmente a IL25 12, células DH82 de E. canis vivas mostraram a mais alta
indução de spots de IFN-y em todos os três cães vacinados.
A indução é também dependente de número de células de E.
canis,
com o maior nível presente na diluição 1:10 e o
menor nível na diluição 1:1000. O lisado de células DH82
30 infectadas com E. canis resultou em menor número de spots
36
.• . •
•••
•
• •• ••• •••
••• • • • • • • •:• •••• •••
••• ••• • ••• ••
• •• • • •
• • • •
•
•
•
• •
•
para os cães vacinados. O lisado tratado com formalina
resultou em um resíduo na diluição 1:1000, mas sem spots na
diluições 1:10 ou 1:1000. Isso pode ser devido ao efeito
inibidor de formalina residual na atividade de células
5 mononucleares. Células de DH82 não infectadas para todas as
três preparações renderam somente
spotting
residual em
comparação com as células DH82 infectadas com E. canis. A
resposta do cão individual foi similar àquela no Elispot
para IL-12. Os mesmos dois cães vacinados mostraram uma
10 resposta maior que o terceiro e o cão de controle exibiu
uma baixa resposta à estimulação por mitógeno (Con A)
sozinho.
Os resultados desse experimento demonstram que
somente células DH82 infectadas com
E. canis vivas podem
15 induzir tanto produção de IL-12 como de IFN-ï por PBMC.
Lisado de células DH82 infectadas com E. canis ou lisado
tratado com formalina não puderam ser usados devido ao
baixo efeito de estimulação em célula T ou monócito na
atividade celular.
20
C. Sumário
Os dados mostrados na Tabelas VI e VII abaixo
demonstram que CMI pode desempenhar uma função na proteção
de cães vacinados com a bacterina de
aumentados de IL-12 e
IFN y
-
E. canis.
Números
para os cães vacinados
25 representam a ativação de célula T e de monócitos.
TABELA VI
Resposta a Elispot de IL-12 em Cães Induzida por
Bacterina de E. canis
37
C• O •
0
•••
•
•
•
•
••
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•
•* ••
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• • • • 41
• • •
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111
• •
• •
41
•
• *..•
•
•
•
Dilutição de Antígenos
1:10 1:100 1:1000 1:10 1:100 1:1000 1:10 1:100 1:1000 1:10 1:100 1:1000
Lisado de
Células
DH82
Infectada 0
s com
E. canis
Lisado
Inativado
de
Células
DH82
0
Infectada
s com
E. canis
Lisado de
Células
DH82 Não O
Infectada
s
Lisado
Inativado
de
Células
DH82 Não O
Infectada
s
Células
DH82
Infectada
O
s com E.
canis
vivas
Células
DH82 Não O
Infectada
s Vivas
Sem
Estimulaç °
ão
Controle
Positivo 3
O
O
0
O
O
0
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O
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O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
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2
76
24
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10
7
1
O
O
O
1
O
O
O
O
1
O
1
0
0
O
1
O
O
O
O
3
O
O
4
3
81
92
66
130
120
113
44
33
31
Tabela VII
Resposta a Elispot de IFN-g em Cães Induzida por
Bacterina de E. canis
Diluição de Antígenos
1:10 1:100 1:1000 1:10 1:100 1:1000 1:10 1:100 1:1000 1:10 1:100 1:1000
38
••
• •
4941
•
•
• •• ••
• .
•
• • •
••
•
•
• •
Lisado de
Células
DH82
Infectada O
s com E.
canis
•
• COO •
• •
•• •• •
•
•
•
•
O
O
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104
82
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1
Lisado
Inativado
de
Células
O
DH82
infectada
s com
E. canis
O
O
O
O
116
O
O
76
1
7
Lisado de
Células
DH82 Não O
Infectada
s
O
O
96
155
106
37
87
87
3
3
2
O
O
O
1
109
O
O
95
O
4
4
6
O
450
295
183
430
230
72
77
33
6
O
52
109
117
33
45
106
1
5
Sem
Estimulaç O
ão
O
O
77
52
64
90
76
68
3
1
1
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Positivo , '
44
61
270
305
262
210
187
186
281
303
255
Células
DH82 Não O
Infectada
s Vivas
Células
DH82
Infectada 16
s com E.
canis
Vivas
Células
DH82 Não 2
Infectada
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•
•
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•
•
•
•
REIVINDICAÇÕES
1. Composição de vacina CARACTERIZADA pelo fato
de que compreende: uma quantidade imunizante eficaz de uma
bacterina de
Ehrlichia canis
inativada, um veículo
5 farmacologicamente aceitável, e uma quantidade
imunogenicamente estimulante de um sistema adjuvante que
consiste essencialmente em um agente indutor de resposta de
anticorpo e um agente indutor de resposta imunitária
mediada por célula.
10
2.
Composição, de acordo com a reivindicação 1,
CARACTERIZADA pelo fato de que a dita bacterina inativada é
selecionada do grupo que consiste em uma ou mais cepas de
E. canis designadas como Ebony, Florida, Israel 611,
Kogashima 1, Louisiana, Oklahoma, Venezuela, a cepa Jake da
15 Universidade do Estado da Carolina do Norte (NCSU), os
isolados Demon, DJ e Fuzzy da NCSU, linhagens de células
infectadas com
E. canis
com qualquer uma das cepas
designadas, e linhagens de células DH82 infectadas com
E.
canis com qualquer uma das cepas designadas.
20
3. Composição, de acordo com a reivindicação 1,
CARACTERIZADA
pelo fato de que a bacterina inativada é
selecionada do grupo que consiste em Ehrlichia canis Ebony,
Ehrlichia canis Broadffot, e uma mistura destas.
4. Composição, de acordo com a reivindicação 1,
25
CARACTERIZADA pelo fato de que o agente indutor de resposta
de anticorpo é selecionado do grupo que consiste em etileno
anidrido maléico; copolímero acrílico estirenado; e uma
mistura destes.
5. Composição, de acordo com a reivindicação 1,
30
CARACTERIZADA pelo fato de que o agente indutor de resposta
2
..
••
•
•
. C
•
• •
• • •
O
•
O •
"• •
••
••
CO 64,•
•
•••
•
•
• •
•
•• •
•
imunitária mediada por célula é selecionado do grupo que
consiste em uma emulsão de óleo em água; uma citocina
relacionada a Thl; uma Mycobacterium bovis atenuada; e uma
mistura destas.
6. Composição, de acordo com a reivindicação 2,
5
CARACTERIZADA pelo fato de que a dita bacterina inativada
está presente em quantidade suficiente para proporcionar
pelo menos 1x10 4 TCID50 por dose unitária.
7. Composição, de acordo com a reivindicação 4,
10
CARACTERIZADA pelo fato de que o agente indutor de resposta
de anticorpo é uma mistura de etileno anidrido maléico e um
copolímero acrílico estirenado e está presente na
quantidade de cerca de 1% v/v de etileno anidrido maléico e
cerca de 3% v/v de copolímero acrílico estirenado.
15
8. Composição, de acordo com a reivindicação 5,
CARACTERIZADA pelo fato de que a dita emulsão de óleo em
água é selecionada do grupo que consiste em uma emulsão
parafínica de óleo em água; uma composição de esqualeno e
copolímeros em bloco de óxido de etileno e óxido de
20 propileno; Formulação-1 Adjuvante Syntex; e uma mistura
destes.
9. Composição, de acordo com a reivindicação 5,
CARACTERIZADA pelo fato de que a dita citocina relacionada
a Th-1 é selecionada do grupo que consiste em interleucina25
12; interleucina-18; interferon gama; e uma mistura destes.
10. Composição, de acordo com a reivindicação 5,
CARACTERIZADA
pelo fato de que o dito agente indutor de
resposta imunitária mediada por célula é uma emulsão de
óleo em água e está presente em uma faixa de cerca de 3% a
30
7% v/v.
•••
•
•• •• •
•
•
•
•
3
O C O* O C O
• • ,* • • • • •
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• • •• • di•• IMPO
• •
01,
•
.......
• • •
•
C
41.•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
11. Composição, de acordo com a reivindicação 5,
CARACTERIZADA pelo fato de que o dito agente de resposta à
imunidade mediada por célula é uma emulsão de óleo em água
e está presente em uma quantidade de cerca de 5% v/v.
5
12. Método para a prevenção ou atenuação de
erliquiose canina em um cão, CARACTERIZADO pelo fato de que
compreende administrar ao dito cão uma composição de
vacina, que compreende uma quantidade imunizante eficaz de
uma bacterina de
Ehrlichia canis
inativada; um veículo
10 farmacologicamente aceitável; e uma quantidade
imunogenicamente estimulante de um sistema adjuvante que
consiste essencialmente em um agente indutor de resposta de
anticorpo e um agente indutor de resposta imunitária
mediada por célula.
15
13. Método, de acordo com a reivindicação 12,
tendo uma composição de vacina,
CARACTERIZADO pelo fato de
que a dita bacterina inativada é selecionada do grupo que
consiste em uma ou mais cepas de E. canis designadas como
Ebony, Florida, Israel 611, Kogashima 1, Louisiana,
20 Oklahoma, Venezuela, a cepa Jake da Universidade do Estado
da Carolina do Norte (NCSU), os isolados Demon, DJ e Fuzzy
da NCSU, linhagens de células infectadas com E. canis com
qualquer uma das cepas designadas, e linhagens de células
DH82 infectadas com
E. canis com qualquer uma das cepas
25 designadas.
14. Método, de acordo com a reivindicação 12,
tendo uma composição de vacina
CARACTERIZADO pelo fato de
que a dita bacterina inativada é Ehrlichia canis Ebony ou
Ehrlichia canis Bradfoot ou uma mistura destas.
•
•
4
••• •
•e • •••• ••• W .
•• • •
•
••
•
•
•
15. Método, de acordo com a reivindicação
•
•
••
•
•
•
tendo uma composição de vacina,
•• ••
•
•• ••• ::• * ••
•
•
•
12,
CARACTERIZADO pelo fato de
que o agente indutor de resposta de anticorpo é uma mistura
de etileno anidrido maléico e um copolímero acrílico
5 estirenado.
16. Método, de acordo com a reivindicação 12,
tendo uma composição de vacina CARACTERIZADO pelo fato de
que o agente indutor de resposta imunitária mediada por
célula é selecionado do grupo que consiste em uma emulsão
10 parafínica de óleo em água; uma composição de esqualeno e
copolímeros em bloco de óxido de etileno e óxido de
propileno; Formulação-1 Adjuvante Syntex; e uma mistura
destes.
17. Método, de acordo com a reivindicação 12,
15 tendo uma composição de vacina
CARACTERIZADO pelo fato de
que a dita bacterina inativada está presente em quantidade
suficiente para proporcionar pelo menos 1x10 4 TCID50 por
dose unitária.
18. Método para a indução de erliquiose canina
20 clínica em um animal de teste CARACTERIZADO pelo fato de
que compreende administrar ao dito animal de teste uma
quantidade eficaz de um estirpe desafiante que consiste em
células mononucleares de sangue periférico infectadas com
um microrganismo virulento de Ehrlichia canis.
25
19. Método, de acordo com a reivindicação 18,
CARACTERIZADO
pelo fato de que a solução de estirpe é
administrada subcutaneamente.
20. Método, de acordo com a reivindicação 18,
CARACTERIZADO
pelo fato de que o dito microrganismo
•••
••
•
5
•• •
•
••
•
••
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•
•• • •• ••
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*
••
*
••
4
•
•
• O
•
•
•
virulento é produzido pela passagem repetida deste em um
animal de teste.
21. Método, de acordo com a reivindicação 20,
CARACTERIZADO
5
pelo fato de que o dito microrganismo é
Ehrlichia canis Ebony.
22.
CARACTERIZADO
Composição
de
estirpe
desafiante
pelo fato de que compreende células
mononucleares de sangue periférico infectadas com um
microrganismo virulento de Ehrlichia canis.
10
23. Composição, de acordo com a reivindicação 22,
CARACTERIZADO
virulento
pelo fato de que o dito microrganismo
é Ehrlichia canis
passada em um animal de teste.
Ebony que foi repetidamente
•
••
• •
••
•
•
•
•
•
•
•
••
•• ••• •••
•
•
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• • •
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• • •••
•
• •
•
•
•
•
•
RESUMO
"COMPOSIÇÃO DE VACINA; MÉTODO PARA A PREVENÇÃO OU
ATENUAÇÃO DE ERLIQUIOSE CANINA EM UM CÃO; E COMPOSIÇÃO DE
ESTIRPE DESAFIANTE".
5
A presente invenção proporciona uma composição de
vacina segura e eficaz que compreende: uma quantidade
imunizante eficaz de uma bacterina de Ehrlichia canis;
um
veículo farmacologicamente aceitável; e uma quantidade
imunogenicamente estimulante de um sistema adjuvante que
10 consiste essencialmente em um agente indutor de resposta de
anticorpo e um agente indutor de resposta imunitária
mediada por célula.
A presente invenção proporciona também um método
para a prevenção ou atenuação de erliquiose canina em cães.
•
•
•• •
•