Latin American Journal of Pharmacy
(formerly Acta Farmacéutica Bonaerense)
Trabajos originales
Recibido el 27 de enero de 2007
Aceptado el 17 de marzo de 2007
Lat. Am. J. Pharm. 26 (3): 394-8 (2007)
Estudos Preliminares da Atividade Antioxidante do Extrato
Hidroetanólico de Folhas Jovens e Adultas de Tabebuia heptaphylla
(Vell.) Toledo (ipê-roxo)
Patrícia BUDNI 1,3, Fabrícia Cardoso PETRONILHO 1, Vanilde CITADINI-ZANETTE 3,4,
Chaiana MARCONDES 5, Alana Neto ZOCH 5,
Flávio Henrique REGINATTO 5 & Felipe DAL-PIZZOL 1,2 *
1 Laboratório de Fisiopatologia Experimental,
Programa de Pós-graduação de Ciências da Saúde,
3 Programa de Pós-graduação em Ciências Ambientais ,
4 Herbário Pe. Dr. Raulino Reitz. Universidade do Extremo Sul Catarinense,
Av. Universitária, 1105 - Bairro Universitário - 88806-000 - Criciúma - SC, Brasil.
5 Laboratório de Farmacognosia, Universidade de Passo Fundo, 99010-080, Passo Fundo, RS, Brasil
2
RESUMO. A atividade antioxidante in vitro do extrato de folhas jovens e adultas de Tabebuia heptaphylla
(Vell.) Toledo (ipê-roxo) foi estimada pela prevenção de formação de espécies reativas do ácido tiobarbitúrico (TBARS) induzido por três geradores de radicais livres, H2O2, FeSO4 e AAPH, em um substrato rico
em lipídeos. A presença de diferentes constituintes do extrato bruto foi estabelecida por CCD, detectandose a presença de flavonóides sendo observado efeito inibidor na lipoperoxidação induzida por H2O2 e FeSO4 nas concentrações de 2, 20 e 200 μg/mL e 2, 20 mg/mL, respectivamente.
SUMMARY. “Preliminary studies of the antioxidant activity of adult and young leaf extract hydroetanolic of
Tabebuia heptaphylla (Vell.) Toledo (ipê-roxo)”. The in vitro antioxidant activity of adult and young leaf extracts of T. heptaphylla (Vell.) Toledo (“ipê-roxo”) were evaluated by the inhibition of thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) formation induced by three different free radical generators, H2O2, FeSO4 and AAPH,
on a lipid-rich substrate. The presence of different constituents in the crude extract was established by TLC,
showing the presence of flavonoids. Young and old leaves showed an inhibitor effect on lipid peroxidation induced by H2O2 and FeSO4 in concentrations of 2, 20 and 200 μg/mL and 2 and 20 mg/mL, respectively.
INTRODUÇÃO
Tabebuia spp. (Bignoniaceae) são espécies
nativas de floresta tropical úmida, gerando diversos produtos a partir de suas cascas os quais
são conhecidos popularmente como “taheebo”,
“lapacho”, “pau d´darco”, e no Brasil como “ipê
roxo” 1-3. Na medicina tradicional extratos de
Tabebuia ssp. são empregados para tratamento
de úlcera, sífilis, desordens gastrointestinais,
câncer e alergias 4-5. Na literatura, os principais
constituintes químicos relatados nas cascas são
as quinonas 6 e os flavonóides 7.
Os compostos fenólicos são protótipos de
substâncias antioxidantes que agem interrompendo a cadeia de autoxidação dos lipídeos das
membranas celulares, a qual pode ser iniciada
por radicais livres e causando dano celular. Os
danos celulares causados por estresse oxidativo
têm sido considerados um importante fator no
envelhecimento e no desenvolvimento de uma
ampla variedade de patologias, como câncer,
diabetes e aterosclerose 8. Dentre os compostos
fenólicos, os flavonóides tem demonstrado exercer efeitos benéficos frente a esta ampla variedade de doenças 9. Grande parte de suas ações
têm sido atribuídas a suas propriedades antioxidantes, quer seja pela sua capacidade redutora
em si ou por sua capacidade em influenciar o
estado redox intracelular 10. Contudo, os mecanismos pelos quais os flavonóides exercem seus
efeitos benéficos ou tóxicos, permanecem incertos. Recentes estudos têm especulado que a atividade antioxidante clássica, por sua capacidade
de doação de hidrogênio, pode não ser a única
explicação para seus efeitos celulares 11. Considerando o amplo emprego de plantas na medi-
PALAVRAS CHAVE: Antioxidante, Compostos fenólicos, Lipoperoxidação, Tabebuia heptaphylla (Vell). Toledo.
KEY WORDS: Antioxidant, Lipoperoxidation, Phenolic compounds, Tabebuia heptaphylla (Vell.) Toledo.
*
394
Autor a quem dirigir a correspondência. E-mail: [email protected]
ISSN 0326-2383
Latin American Journal of Pharmacy - 26 (3) - 2007
cina popular, a presença de altos teores de
compostos fenólicos na sua composição química e o baixo número de investigações a respeito
das propriedades biológicas das folhas de T.
heptaphylla (Vell.) Toledo (ipê-roxo), o presente
trabalho teve por objetivo avaliar a capacidade
do extrato hidroetanólico de T. heptaphylla na
prevenção de formação de espécies reativas do
ácido tiobarbitúrico (TBARS) induzido por três
geradores de radicais livres, H2O2, FeSO4 e 2,2’azobis (2-metilpropionamidina) dihidrocloreto
(AAPH), em um substrato rico em lipídeos.
MATERIAIS E MÉTODOS
Reagentes
Ácido tiobarbitúrico e sulfato ferroso (FeSO4) foram adquiridos da Sigma, St. Louis, MO.
2,2’-azobis (2-metilpropionamidina) dihidrocloreto (AAPH) foi adquirido da Aldrich Chemical
Co., Milwaukee, WI. Ácido tricloroacético e o
peróxido de hidrogênio (H2O2) foram adquiridos da Labsynth, São Paulo, Brasil.
Material vegetal
Folhas jovens e adultas de T. heptaphylla
(Vell.) Toledo (ipê-roxo) foram coletadas em
Criciúma, Estado de Santa Catarina, Brasil em
Dezembro 2004. A planta foi identificada pela
Dra. Vanilde Citadini-Zanette (Universidade do
Extremo Sul Catarinense) e uma amostra testemunho (CRI 7373) está depositada no Herbário
Pe. Dr. Raulino Reitz (Universidade do Extremo
Sul Catarinense).
Preparação dos extratos
Folhas jovens e adultas secas de T. heptaphylla (Vell.) Toledo (ipê-roxo), foram extraídas,
separadamente, por refluxo (90 °C - 30 min)
com EtOH 40 ºGL. Os extratos brutos etanólicos
foram filtrados e o solvente eliminado sob
pressão reduzida.
Caracterização fitoquímica
A análise fitoquímica preliminar foi realizada
de acordo com os métodos de WHO 12 e Andrighetti-Fröhner et al. 13. A confirmação da presença dos componentes verificados nos ensaios
clássicos foi estabelecida por CCD em placas de
sílica gel (Merck 60 F254) usando como fase móvel triclorometano:etanol:ácido acético (100:40:6
v/v/v) para triterpenóides, e acetato de etila:ácido acético:isopropanol:água (110:1:10:8 v/v/v/v)
para compostos fenólicos. Como agentes reveladores foram empregados anisaldeído
sulfúrico/aquecimento e reagente natural A/UV
365 nm.
Atividade antioxidante
A atividade antioxidante in vitro de T. heptaphylla foi estimada pela inibição de formação
de espécies reativas do ácido tiobarbitúrico
(TBARS) induzidas por três diferentes geradores
de radicais livres em um substrato rico em lipídeos (gema de ovo) 14. Inicialmente, 500 µL de
lipídeo a 0,1% (v:v) foram homogeneizados em
tampão fosfato (pH 7,4), misturados com 500 µL
de ácido tricloroacético (10%) e centrifugados a
1.200 rpm (10 min). O extrato hidroetanólico,
em diferentes concentrações (2, 20, 200 µg/mL e
2, 20 mg/mL), foi adicionado em um tubo teste
juntamente com soluções de 2,2’-azobis (2-amidino-propano) dicloreto (AAPH - 0.5M), FeSO4
(0,145 mM) ou H2O2 (0,4 M) para induzir lipoperoxidação. Os tubos foram incubados a temperatura ambiente por 15 min sendo a seguir
adicionado a estes, 500 µL de ácido tiobarbitúrico (TBA - 0.67%) e colocado sob aquecimento
(100 °C) por 30 min. Após arrefecimento foi medido, espectrofotometricamente, numa absorvância de 532 nm. Os resultados foram expressos como o equivalente de malondialdeído
formado em nmol (MDA)/mL de substrato. Os
grupos controles foram realizados simultaneamente aos grupos testes.
Análise estatística
Os resultados foram expressos como média
± DP e valores de p foram considerados significantes quando p<0.05. Diferenças entre os grupos foram determinadas por ANOVA. Comparação entre as médias foi realizada usando teste
o Newman-Keuls .
RESULTADOS
Análise fitoquímica preliminar
A análise fitoquímica indicou a presença de
antraquinonas livres nas folhas jovens e a
ausência destas substâncias nas folhas adultas. A
presença de compostos polifenólicos (especialmente flavonóides) foi confirmada através das
análises por CCD. Foi possível verificar que o
perfil químico de compostos fenólicos é diferenciado para folhas jovens e adultas.
Mudanças nos níveis de TBARS por
T. heptaphylla
A diminuição da oxidação lipídica por radicais livres induzidos pelos três geradores citados
foi avaliada pelos níveis de redução na formação de TBARS. As diferentes concentrações
de extratos de folhas jovens aplicados reduziram
os níveis de formação de TBARS, quando aplicados H2O2 e FeSO4, em todas as concentrações
395
BUDNI P., PETRONILHO F.C., CITADINI-ZANETTE V., MARCONDES C., ZOCH A.Z., REGINATTO F.H. & DAL-PIZZOL F.
Figura 1. Efeito do extrato de folhas jovens de T. heptaphylla na formação de TBARS induzido por H2O2.
(Valores expressos como MDA (nmol/mg) comparados com controle). * Estatística significante p<0,005
comparada com controle. **Estatística significante
p<0,005 comparada com indutor H2O2.
Figura 3. Efeito do extrato de folhas jovens de T. heptaphylla na formação de TBARS induzido por AAPH.
(Valores expressos como MDA (nmol/mg) comparados com controle). * Estatística significante p<0,005
comparada com controle. ** Estatística significante
p<0,005 comparada com AAPH.
Figura 2. Efeito do extrato de folhas jovens de T. heptaphylla na formação de TBARS induzido por FeSO4.
(Valores expressos como MDA (nmol/mg) comparados com controle). * Estatística significante p<0,005
comparada com controle. ** Estatística significante
p<0,005 comparada com FeSO4.
Figura 4. Efeito do extrato de folhas adultas de T.
em comparação com o indutor (Figs. 1 e 2).
Contudo, na indução de lipoperoxidação por
AAPH, este extrato revelou proteção apenas na
concentração de 200 µg/mL de extrato. Além
disso, quando submetido a radicais gerados por
AAPH (Fig. 3), o extrato demonstrou atividade
pró-oxidante na concentração de 2 µg/mL.
O extrato de folhas adultas apresentou perfil
semelhante ao das folhas jovens na redução da
lipoperoxidação quando aplicados os indutores
H2O2 e FeSO4, sendo efetivo em todas as concentrações aplicadas (Figs. 4 e 5). Diferentemente do observado nos extratos das folhas jovens,
os extratos de folhas adultas reduziram significantemente a lipoperoxidação induzida por
AAPH em três concentrações aplicadas (2, 20 e
200 µg/mL), não demonstrando atividade próoxidante em nenhuma concentração quando
comparados com o indutor (Fig. 6). Quando
comparada à capacidade de redução de for-
mação de TBARS entre folhas jovens e adultas
frente aos indutores H2O2 e AAPH, não observaronse diferenças estatisticamente significativas
nas diferentes concentrações usadas (dados não
mostrados). Contudo, quando o indutor utilizado foi FeSO4, observose uma proteção mais efetiva nas folhas adultas quando comparadas com
as folhas jovens, nas concentrações aplicadas de
2, 200 µg/mL e 2, 20 mg/mL (Fig.7).
396
heptaphylla na formação de TBARS induzido por
H 2 O 2 . (Valores expressos como MDA (nmol/mg)
comparados com controle). * Estatística significante
p<0,005 comparada com controle. ** Estatística significante p<0,005 comparada com indutor H2O2.
DISCUSSÃO DOS RESULTADOS
Segundo a literatura, diversos compostos fenólicos demonstram a possibilidade de inibição
de oxidação de lipoproteínas de baixa densidade (LDL), assim como também apresentam capacidade de capturarem radicais como hidroxila, peroxila, superóxido, óxido nítrico e DPPH
(1,1-difenil-2-picrilhidrazil) 15-16. Os efeitos protetores dos flavonóides em sistemas biológicos
são descritos pela sua capacidade de transferir
Latin American Journal of Pharmacy - 26 (3) - 2007
Figura 5. Efeito do extrato de folhas adultas de T.
Figure 7. Efeito de extrato de folhas jovens e adultas
heptaphylla na formação de TBARS induzido por FeSO4. (Valores expressos como MDA (nmol/mg) comparados com controle). * Estatística significante
p<0,005 comparada com controle. ** Estatística significante p<0,005 comparada com indutor FeSO4.
de T. heptaphylla na formação de TBARS induzido
por FeSO 4 . (Valores expressos como TBARS
(nmol/mg) comparados controle). * Estatística significante p<0,005 comparada controle. Diferentes letras
indicam diferença significante entre folhas jovens e
adultas.
Figura 6. Efeito do extrato de folhas adultas de T.
heptaphylla na formação de TBARS induzido por
AAPH. (Valores expressos como MDA (nmol/mg)
comparados com controle). * Estatística significante
p<0,005 comparada com controle. ** Estatística significante p<0,005 comparada com indutor AAPH.
elétrons dos radicais livres, quelar metais, ativar
enzimas antioxidantes e inibir oxidases 17. Os
flavonóides também demonstraram inibir enzimas como xantina oxidase e proteína C, in vitro, sendo estas responsáveis pela geração de
ERO 18. Quando sais de ferro são adicionados a
meio de cultura celular, podem reagir com
oxigênio e formar radical ânion superóxido que
ainda poderá sofrer dismutação à peróxido de
hidrogênio, podendo iniciar a peroxidação lipídica, o mesmo ocorrendo com a adição de
H2O2, levando indiretamente a oxidação de lipídeos e proteínas, pela ação de seus subprodutos
como o radical hidroxila 19. No presente trabalho esses efeitos, foram observados através dos
níveis de formação de TBARS, visto que estes
foram aumentados quando comparados ao controle. A indução de lipoperoxidação por azo-indicador, como o AAPH, apresenta como característica a geração de um carbono central radicalar
que reage prontamente com oxigênio para formar um radical peroxil 20, efeito esse também
encontrado em nosso experimento quando
comparados com o controle. Dados obtidos em
modelos in vitro, de diversos flavonóides estruturalmente diferentes, consistentemente demonstram a eficácia antioxidante em relação a
muitas circunstâncias de estresse oxidativo. A
avaliação da atividade antioxidante dos extratos
de folhas jovens e adultas, indicou redução na
formação de TBARS em todas as concentrações
testadas quando os indutores utilizados foram
FeSO4 e H2O2. Esses resultados vem em concordância ao previsto na literatura em outros
trabalhos que relatam a forte atividade antioxidante de flavonóides contra lipoperoxidação induzida por ferro 21. Contudo na indução de lipoperoxidação com AAPH, o extrato obtido a
partir das folhas jovens apresentou pequena redução de formação de TBARS na concentração
de 200 µg/mL, indicando ação pró-oxidante na
menor concentração aplicada. Isso pode ser relacionado a capacidade dos flavonóides em seqüestrar espécies radicalares, ou seja, flavonóides por possuírem potencial menor que os íons
Fe3+ e Cu2+, podem reduzir esses metais, sendo
potencialmente pró-oxidantes, tendo em vista
que esses metais participam da reação de Fenton, geradora de outras espécies radicalares 22.
Outra forma de explicar seria a relação direta
dos flavonóides e sua quantidade de grupos hidroxilas ligadas. Em um estudo feito por Hanasaki et al. (1994), uma série de mono e dihidroxifenóis não demonstraram atividade pró-oxidante, embora a presença de múltiplos grupos
hidroxilas ligados à estrutura dos flavonóides
tenham aumentado significantemente a pro397
BUDNI P., PETRONILHO F.C., CITADINI-ZANETTE V., MARCONDES C., ZOCH A.Z., REGINATTO F.H. & DAL-PIZZOL F.
dução do radical hidroxila 23,24. Contudo, nas
folhas adultas também houve redução na formação de TBARS, nas concentrações de 2, 20 e
200 µg/mL. Por existir uma sensibilidade diferenciada de alguns vegetais a depender da idade e também do teor e tipo de flavonóides presentes nas folhas, acreditamos que esta possa
ser uma das razões pelos quais as folhas adultas
se mostraram mais efetivas que as jovens. Além
disso, estudos que correlacionam a estrutura
química dos flavonóides e sua atividade, têm
demonstrado diferenças no seu potencial antioxidante, pois esta propriedade in vitro depende
do rearranjamento de grupos funcionais em torno da estrutura nuclear 25.
Contudo, considerando as análises fitoquímicas realizadas, os produtos radicalares gerados
pelo AAPH, FeSO4 e H2O2, ou seja, radicais peroxil, alcoxil e hidroxil, e os resultados obtidos
no presente trabalho, é possível afirmar que as
folhas adultas possuem composição flavonoídica
diferente das folhas jovens e que esta diferença
influencia o desempenho antioxidante frente esses radicais.
Agradecimentos. Este trabalho recebeu apoio da
Universidade do Extremo Sul Catarinense, FAPESC,
FAPERGS (PROADE-2). F. Dal-Pizzol agradece também ao CNPq.
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