UNIVERSIDADE DOS AÇORES
Departamento de Ciências Agrárias
ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE BACTÉRIAS DO
ÁCIDO LÁCTICO PRODUTORAS DE BACTERIOCINAS E
SUA APLICAÇÃO NO FABRICO DE QUEIJO FRESCO
Dissertação de Mestrado em Tecnologia e Segurança Alimentar
Márcia Costa Coelho
Orientadora: Professora Doutora Célia Costa Gomes da Silva
ANGRA DO HEROÍSMO
2013
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
AGRADECIMENTOS
Agradeço a todos aqueles que, de algum modo contribuíram para a realização
desta dissertação, nomeadamente:
À minha orientadora Doutora Célia Silva pela orientação, amizade, paciência,
disponibilidade, ensinamentos e dedicação prestada ao longo deste trabalho.
À Doutora Maria de Lurdes Dapkevicius pela disponibilidade, amizade e ajuda.
Ao Doutor Henrique Rosa pela disponibilidade e ajuda no tratamento estatístico
dos dados.
À Marina Lopes por ter feito a identificação genética das bactérias e pelo
companheirismo.
Ao Senhor Paulo Caetano pela sua disponibilidade de entregar o leite para o
fabrico do queijo fresco.
À empresa Chegalvorada (Granja Universitária) pela cedência do leite usado no
trabalho.
Às minhas colegas de trabalho Susana Ribeiro, Sandra Câmara e Cristina
Riquelme, pelo companheirismo e ajuda.
Às técnicas de laboratório, Berta Borges e Guida Pires, pelo companheirismo,
disponibilidade e ajuda.
Aos meus pais e ao meu irmão, por todo o amor, paciência, apoio e incentivo
demonstrado ao longo do mestrado.
Este trabalho foi financiado por Fundos Nacionais através da FCT – Fundação
para a Ciência e a Tecnologia, no âmbito do projecto PTDC/AGR-ALI/104385/2008.
I
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
RESUMO
Actualmente, tem merecido especial atenção a aplicação de compostos
antimicrobianos produzidos pelas bactérias do ácido láctico (BAL) como conservantes
naturais, impedindo o crescimento de patógenos nos alimentos.
O presente trabalho teve como objectivo a selecção de estirpes BAL previamente
isoladas do queijo do Pico (DOP), avaliando a actividade antimicrobiana e a sua eficácia
contra a Listeria monocytogenes no queijo fresco. As propriedades tecnológicas e
segurança das BAL produtoras de bacteriocinas foram igualmente investigadas para
avaliar a capacidade para serem utilizadas como culturas de arranque e/ou adjuntas no
fabrico do queijo. Os isolados foram caracterizados pelas suas propriedades
tecnológicas: produção de diacetilo, actividades enzimáticas, proteólise e lipólise. A sua
segurança foi avaliada através do estudo da actividade -hemolítica, produção de
DNase, gelatinase e histamina, e resistência aos antibióticos. Foi testada a produção de
bacteriocinas pelas BAL, bem como a cinética de crescimento, pH e produção de ácido
láctico no queijo fresco. Nestes queijos inoculados com as BAL produtoras de
bacteriocinas, foi ainda realizada uma avaliação sensorial por um painel de provadores
não treinados.
As propriedades antimicrobianas de 116 isolados BAL do queijo do Pico foram
avaliadas. Oito isolados apresentaram actividade contra a Listeria monocytogenes,
exibindo valores de concentração mínima inibitória que variaram entre 200 e 3200
UA ml-1. Destes isolados, três apresentaram igualmente actividade contra o Clostridium
perfringens. Os oito isolados produtores de bacteriocinas foram identificados por
sequenciação do gene 16S rRNA como Lactococcus lactis (1 isolado) e Enterococcus
faecalis (7 isolados).
Alguns isolados apresentaram actividades enzimáticas promissoras para a
formação do aroma no queijo. Apenas um isolado foi capaz de degradar a caseína,
testando positivo para a actividade proteolítica e dois isolados demonstraram actividade
lipolítica. No entanto, a maioria dos isolados produziu diacetilo a partir do citrato.
Nenhum dos isolados produziu histamina ou apresentou actividade β-hemolítica e de
DNase, mas alguns isolados testaram positivo para a produção de gelatinase. Não foi
também encontrada resistência a antibióticos clinicamente importantes.
No geral, os isolados produtores de bacteriocinas apresentaram um crescimento
moderado no queijo fresco a temperaturas de refrigeração (4 °C), aumentando uma
II
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
unidade log em 3 dias. Apresentaram baixa capacidade acidificante, apesar do aumento
da produção de ácido láctico exibido por alguns isolados após 24 h. A actividade das
bacteriocinas foi apenas detectada no soro do queijo fresco inoculado com dois isolados
de Enterococcus (L2B21K3 e L3A21K6). Contudo, todos os queijos inoculados com os
isolados produtores de bacteriocinas inibiram a L. monocytogenes no ensaio de difusão
em agar. Com excepção de um isolado (L3A21M3), não foram encontradas diferenças
significativas (P>0,05) na avaliação global dos queijos frescos inoculados com os
isolados produtores de bacteriocinas, realizada por um painel não treinado de 50-52
provadores. Na apreciação global, os queijos inoculados com os isolados produtores de
bacteriocinas obtiveram uma classificação de intermédio a elevado, semelhante ao
queijo fresco sem BAL. Observou-se ainda uma correlação positiva (P<0,05) entre a
apreciação global e a firmeza dos queijos.
Para testar o efeito in situ da produção de bacteriocinas contra a L.
monocytogenes, foram elaborados queijos frescos com leite de vaca pasteurizado,
inoculados
com
BAL
produtoras
de
bacteriocinas
e
contaminados
com
aproximadamente 106 ufc ml-1 de L. monocytogenes. As contagens de L. monocytogenes
foram monitorizadas durante o armazenamento do queijo fresco a temperaturas de
refrigeração (4 °C) durante 15 dias. Todos os isolados controlaram o crescimento da L.
monocytogenes, apesar de alguns Enterococcus terem sido mais eficazes na redução das
contagens do patógeno. A redução foi de aproximadamente de 4 unidades log em
comparação com o controlo positivo, após 7 dias de incubação. Pelo contrário, no
queijo sem BAL observou-se um aumento da listéria em 4 log ufc g-1. Duas
combinações de isolados Enterococcus (L3A21M3 e L3A21M8, ou L3B1K3 e
L3A21M3) apresentaram a maior redução nas contagens de L. monocytogenes no queijo
fresco, reduzindo aproximadamente 5 unidades log em 7 dias. A combinação de dois
isolados em particular (L3B1K3 e L3A21M3) poderá ter aplicação prática devido à
ausência de factores de virulência.
Em conclusão, a aplicação dos isolados produtores de bacteriocinas na produção
de queijo fresco pode contribuir para prevenir o crescimento de bactérias patogénicas
indesejáveis como a L. monocytogenes. Alguns isolados apresentaram um excelente
potencial para serem utilizados como culturas adjuntas/protectoras no fabrico do queijo.
PALAVRAS-CHAVE: Bactérias do ácido láctico, bacteriocinas, caracterização
tecnológica, critérios de segurança, queijo fresco, Listeria monocytogenes.
III
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
ABSTRACT
In recent years, there has been a particular focus on the application of
antimicrobial compounds produced by lactic acid bacteria (LAB) as natural
preservatives to control the growth of spoilage and pathogenic bacteria in foods.
The purpose of this study was to select LAB strains with antimicrobial activity,
previously isolated from Pico cheese, and evaluate their efficacy against Listeria
monocytogenes in fresh cheese. In addition, the technological and safety relevant
properties from bacteriocin-producing LAB were investigated in order to determine
their ability for the efficient use as starter/adjunct cultures in cheese making. Isolates
were characterised in terms of their main technological properties: diacetyl production,
enzymatic activities, proteolysis and lipolysis. Their safety was also evaluated by
studying their β-haemolytic activity, production of DNase, gelatinase and histamine,
and antibiotic resistance. Bacteriocin production by LAB was tested in fresh cheese,
including LAB growth kinetics, cheese pH and titratable acidity. Additionally, the
sensorial attributes of fresh cheeses made with these LAB as adjunct cultures were
evaluated by a non-trained panel.
A total of 116 LAB isolates from an artisanal cheese (Pico cheese) were screened
for antimicrobial properties. Eight isolates were found to produce bacteriocins against
Listeria monocytogenes with minimum inhibitory units ranging from 200 to 3200
AU ml-1. Three of the isolates were also active against Clostridium perfringens. The
bacteriocin-producing isolates were identified by 16S rRNA sequencing analysis as
Lactococcus lactis (1 isolate) and Enterococcus faecalis (7 isolates).
Some of the studied isolates displayed enzymatic activities with potential impact
on cheese flavour. Only one isolate was able to degrade casein, being positive for
proteolytic activity and two isolates showed lipolytic activity. Most of the isolates were
found to produce diacetyl from citrate. None of the isolates tested was found to produce
histamine or to possess -haemolytic and DNase activity, but some of the isolates were
positive for gelatinase production. No resistance to clinically relevant antibiotics was
also encountered.
In general, the bacteriocin-producing isolates presented a moderate growth in
fresh cheese at refrigeration temperatures (4 °C), increasing one log count in 3 days.
They presented slow acidifier capacity, despite the increasing production of lactic acid
displayed by some isolates after 24 h. Bacteriocin activity was only detected in the
IV
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
whey of fresh cheese inoculated with two Enterococcus isolates (L2B21K3 and
L3A21K6), but all cheeses made with bacteriocin-producing isolates inhibited L.
monocytogenes in the agar diffusion bioassay. No significant differences (P>0,05) were
found on sensory overall evaluation made by a non-trained panel of 50-52 tasters using
the isolates as adjunct culture in fresh cheese, with the exception of one isolate
(L3A21M3). Cheeses inoculated with bacteriocin-producing isolates were attributed an
overall appreciation of average to high, similar to the fresh cheese without any LAB. A
positive correlation (P<0,05) was also observed between overall appreciation and
cheese firmness.
To test the effect of in situ bacteriocin production against L. monocytogenes, fresh
cheese was made from pasteurised cow’s milk inoculated with bacteriocin-producing
BAL and artificially contaminated with approximately 106 cfu ml-1 of L.
monocytogenes. Numbers of L. monocytogenes were monitored during storage of fresh
cheese at refrigeration temperature (4 °C) for up to 15 days. All isolates controlled the
growth of L. monocytogenes, although some Enterococcus were more effective in
reducing the pathogen counts. The reduction was of approximately 4 log units compared
to the positive control after 7 days of incubation. In comparison, an increase of 4 log
cfu g-1 in pathogen numbers was detected at the same time point in the absence of
bacteriocin-producing LAB. The combination of bacteriocin producing Enterococcus
sp. L3A21M3 and L3A21M8, or L3B1K3 and L3A21M3, optimized the reduction of L.
monocytogenes counts in fresh cheese, reducing in approximately 5 log units after 7
days. The combination of two isolates in particular (L3B1K3 and L3A21M3) showed
promising results due to the absence of important virulence factors.
In conclusion, the present work demonstrates that using bacteriocin-producing
isolates in the manufacture of fresh cheese might contribute to prevent the growth of
undesirable pathogenic bacteria such as L. monocytogenes. Some isolates presented
excellent potential to be used as adjunct/protective cultures for cheese making.
KEYWORDS: Lactic acid bacteria, bacteriocins, technological characterization, safety
criteria, fresh cheese, Listeria monocytogenes.
V
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
ÍNDICE
RESUMO
II
ABSTRACT
IV
1. INTRODUÇÃO
1
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
4
2.1 O queijo
4
2.1.1 Perspectivas históricas
4
2.1.2 Queijo produzido em Portugal
4
2.1.2.1 Queijos Denominação de Origem Protegida (DOP)
5
2.1.3 Queijos DOP Açorianos
6
2.1.3.1 Queijo do Pico artesanal
6
2.1.3.2 Queijo de São Jorge
6
2.1.4 O queijo fresco
7
2.2 Microrganismos do queijo
8
2.2.1 Culturas de arranque
8
2.2.2 Culturas adjuntas
9
2.2.2.1 Culturas adjuntas de bactérias do ácido láctico
10
2.2.2.2 Bolores e leveduras
11
2.3 Caracterização das bactérias do ácido láctico
11
2.3.1 Classificação das BAL
14
2.3.2 Principais BAL presentes no queijo do Pico
16
2.3.2.1 Género Lactococcus
16
2.3.2.2 Género Lactobacillus
17
2.3.2.3 Género Enterococcus
17
2.3.2.4 Género Streptococcus
18
2.3.2.5 Género Leuconostoc
19
2.4 Bacteriocinas
20
2.4.1 Classificação das bacteriocinas das bactérias Gram-Positivas
20
2.4.1.1 Classe I ou Lantibióticos
21
2.4.1.2 Classe II
23
2.4.1.3 Classe III
24
2.4.1.4 Classe IV
24
2.4.2 Mecanismos de acção das bacteriocinas
25
2.4.3 Auto-imunidade
28
2.4.4 Factores que afectam a eficiência das bacteriocinas
28
VI
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
2.4.5 Aplicações das bacteriocinas na indústria alimentar
29
2.4.6 Aplicações das bacteriocinas nos lacticínios
31
2.4.6.1 Nisina
31
2.4.6.2 Lacticina 3147
32
2.4.6.3 Pediocina PA-1
32
3. MATERIAIS E MÉTODOS
34
3.1 Isolados em estudo
34
3.2 Screening das BAL produtoras de bacteriocinas
34
3.2.1 Actividade antimicrobiana
34
3.2.2 Concentração mínima inibitória
35
3.3 Identificação das BAL produtoras de bacteriocinas
35
3.3.1 Identificação fenotípica
35
3.3.2 Identificação genética
36
3.4 Caracterização tecnológica das BAL produtoras de bacteriocinas
36
3.4.1 Actividades enzimáticas
36
3.4.2 Produção de diacetilo a partir do citrato
38
3.4.3 Actividade proteolítica
38
3.4.4 Actividade lipolítica
38
3.5 Avaliação da segurança
39
3.5.1 Produção de histamina
39
3.5.2 Actividade hemolítica
39
3.5.3 DNase
40
3.5.4 Gelatinase
40
3.5.5 Resistência a antibióticos
40
3.6 Avaliação da produção de bacteriocinas em queijo fresco
43
3.6.1 Elaboração do queijo fresco com as BAL
43
3.6.2 Determinação do pH do queijo
43
3.6.3 Acidez titulável
43
3.6.4 Determinação da humidade
44
3.6.5 Contagens das BAL no queijo
44
3.6.6 Determinação da actividade antimicrobiana no queijo
44
3.6.7 Provas organolépticas
45
3.7 Avaliação do efeito das BAL no crescimento de L. monocytogenes em queijo fresco
45
3.7.1 Elaboração do queijo fresco com BAL e L. monocytogenes
45
3.7.2 Avaliação do crescimento de L.monocytogenes no queijo fresco
46
3.8 Análise estatística
46
VII
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
47
4.1 Actividade antimicrobiana
47
4.2 Identificação das BAL produtoras de bacteriocinas
49
4.3 Caracterização tecnológica das BAL produtoras de bacteriocinas
51
4.3.1 Actividades enzimáticas
51
4.3.2 Propriedades tecnológicas
53
4.4 Avaliação da segurança das BAL
55
4.4.1 Histamina, Hemólise, DNase e Gelatinase
55
4.4.2 Resistência a antibióticos
57
4.5 Aplicação das BAL como culturas de arranque/adjuntas no queijo fresco
59
4.5.1 Avaliação de parâmetros químicos, crescimento e actividade antimicrobiana
59
4.5.2 Avaliação organoléptica
66
4.6 Efeito das BAL no crescimento de Listeria monocytogenes em queijo fresco
69
4.6.1 Adição individual dos isolados
69
4.6.2 Efeito de culturas mistas
72
5. CONCLUSÃO
76
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
78
ANEXOS
97
VIII
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
1. INTRODUÇÃO
Actualmente, os consumidores estão cada vez mais atentos ao risco que constitui a
presença de microrganismos patogénicos e aditivos químicos nos alimentos, o que
conduz à pesquisa de conservantes naturais e eficazes para controlo microbiológico. A
descoberta que certos péptidos bacterianos possuem actividade inibitória contra outras
bactérias, fez despertar o interesse na descoberta e aplicação destes péptidos como
conservantes naturais. Estes péptidos designados por bacteriocinas, podem exibir um
espectro de actividade contra as espécies homólogas ou apresentar um amplo espectro
de acção contra uma variedade de microrganismos Gram-positivos e em particular,
contra certos patógenos. Alimentos tradicionais, como o queijo do Pico (DOP)
produzido com leite cru, possuem uma microflora própria que poderá ser explorada na
pesquisa de novas estirpes de bactérias do ácido láctico (BAL) produtoras de
bacteriocinas, e que podem apresentar elevada actividade contra bactérias indesejáveis
como a Listeria monocytogenes.
A Listeria monocytogenes apresenta-se como um dos patógenos com maior
impacto na indústria dos lacticínios e o seu controlo é muito importante, em particular,
nos queijos produzidos com leite cru (Wan et al., 1997; Gandhi e Chikindas, 2007).
Este microrganismo psicrotrófico está largamente distribuído no ambiente, é capaz de
crescer a temperaturas que variam desde 1 a 45 °C, em valores de pH relativamente
baixos e é altamente tolerante ao sal, o que torna difícil o seu controlo nos alimentos
(Bizani et al., 2008; Sip et al., 2012). A L. monocytogenes provoca assim uma grave
infecção alimentar que afecta essencialmente as mulheres grávidas, recém-nascidos,
idosos e adultos com o sistema imunitário comprometido (Gandhi e Chikindas, 2007).
Leite e queijos são considerados os alimentos de maior risco, embora possam ocorrer
surtos com outros tipos de alimentos como as saladas e vegetais prontos para o consumo
(Bello et al., 2012). O controlo ou mesmo a eliminação deste patógeno utilizando meios
naturais em substituição dos conservantes químicos, constitui uma tendência actual
imposta pelas preferências dos consumidores. Dessa forma, a aplicação de BAL
produtoras de bacteriocinas na indústria alimentar, nomeadamente no controlo da L.
monocytogenes no queijo, pode constituir uma vantagem a ser explorada pela indústria
de lacticínios.
1
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
Desta forma, o presente trabalho teve como objectivo pesquisar a presença de
bactérias produtoras de bacteriocinas em BAL isoladas no queijo do Pico e avaliar a
eficácia destas BAL produtoras de bacteriocinas no controlo da L. monocytogenes em
queijo fresco. Foi ainda objectivo do trabalho o estudo das características tecnológicas e
de segurança destas BAL, de modo a avaliar a sua aplicação potencial como culturas de
arranque e/ou adjuntas no fabrico de queijo. Finalmente pretendeu-se avaliar também o
efeito destas BAL na qualidade organoléptica do queijo fresco, realizando-se uma prova
com um painel de avaliadores não treinado.
A estrutura global da tese divide-se em 5 capítulos. No primeiro capítulo Introdução, é feito um enquadramento do estudo, apresentação dos objectivos e
explicação da estrutura da tese.
O segundo capítulo é constituído pela Revisão Bibliográfica, onde é feita uma
discussão actual da temática escolhida, com apresentação de bibliografia relacionada
com o estudo. É feita uma abordagem ao queijo produzido em Portugal e aos
microrganismos que funcionam como culturas de arranque e/ou adjuntas. As BAL são
caracterizadas, dando-se especial destaque à produção e actuação das bacteriocinas.
Finalmente é descrita a aplicação das bacteriocinas na indústria alimentar, com especial
destaque nos lacticínios.
O terceiro capítulo é constituído pelos Materiais e Métodos, onde são descritas as
metodologias aplicadas ao longo do trabalho experimental, nomeadamente para o
screening das BAL produtoras de bacteriocinas, sua identificação, caracterização
tecnológica e avaliação da segurança; avaliação da produção de bacteriocinas em queijo
fresco e avaliação do efeito destas BAL no crescimento de L. monocytogenes nos
mesmos queijos. Apresentam-se ainda as ferramentas estatísticas utilizadas no
tratamento de dados.
Os Resultados e Discussão são apresentados no quarto capítulo. Aqui são
apresentados os resultados obtidos na aplicação das metodologias, fazendo-se a sua
análise e discussão para cada um dos parâmetros estudados, face a outros estudos
publicados no âmbito deste tema.
2
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
No quinto capítulo - Conclusão, são expostas as conclusões gerais do trabalho e
apresentadas sugestões para futuros estudos, envolvendo a aplicação das bacteriocinas
na melhoria da qualidade dos produtos lácteos regionais.
3
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 O queijo
2.1.1 Perspectivas históricas
O queijo encontra-se em quase todas as culturas e é, provavelmente, um dos
alimentos processados mais antigo. No passado, o leite era um alimento sazonal e a sua
transformação em queijo seria uma forma de conservar e utilizar os seus nutrientes
durante o Inverno (Blom e Weréen, 2002; Oliveira, 2010).
A descoberta de resíduos de leite em recipientes de cerâmica de 7000 A.C.
fornece uma prova da utilização do leite pelos povos primitivos (Oliveira, 2010).
Notavelmente, a descoberta de recipientes de cerâmica com pequenos buracos datados
de 6000 A.C. pode ser associada à produção de queijo, fornecendo evidências diretas
para o fabrico do queijo no período neolítico (Salque et al., 2013).
A introdução da indústria leiteira foi um passo importante na agricultura
primitiva, com a rápida adopção dos produtos derivados do leite como componentes
principais da dieta dos agricultores pré-históricos (Salque et al., 2013).
O processamento do leite, particularmente a produção de queijo, constituíu um
importante passo no desenvolvimento porque, não só permitiu a conservação dos
produtos lácteos durante mais tempo e o seu transporte fácil, mas também tornou o leite
como mercadoria digestível para as novas gerações de agricultores (Salque et al., 2013).
2.1.2 Queijo produzido em Portugal
Antes dos anos 30 do século passado, em Portugal Continental, produziam-se
queijos apenas a partir do leite de ovelha e de cabra, estando o leite de vaca
direccionado para o consumo sem transformação (Oliveira, 2010). O leite desnatado e o
leitelho eram destinados à alimentação de animais e consumidos nos locais de produção.
No entanto nos Açores, especialmente nas ilhas de São Jorge, São Miguel e Terceira, a
produção queijeira de leite de vaca já estava bastante enraizada, tendo vindo a
desenvolver-se e a afirmar-se até aos nossos dias (Oliveira, 2010).
4
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
2.1.2.1 Queijos com Denominação de Origem Protegida (DOP)
De acordo com o Regulamento (CE) nº 510/2006 de 20 de Março a Denominação
de Origem Protegida representa o nome de uma região, de um local determinado ou, em
casos excepcionais, de um país, que serve para designar um produto agrícola ou um
género alimentício:

originário dessa região, desse local determinado ou desse país;

cuja qualidade ou características se devem essencial ou exclusivamente a um
meio geográfico específico, incluindo os factores naturais e humanos;

cuja produção, transformação e elaboração ocorrem na área geográfica
delimitada.
Os queijos DOP são obtidos seguindo métodos tradicionais bem estabelecidos, em
que os mais famosos são os queijos de ovelha Serra da Estrela, Azeitão, Serpa e Castelo
Branco e São Jorge. Estes queijos são tipicamente designados consoante a região onde
são manufacturados, e todos eles possuem características únicas associadas aos seus
modos de manufactura artesanais e de cura (Reis e Malcata, 2011). A maioria destes
queijos são manufacturados com leite cru de ovelha ou cabra, sem adição deliberada de
microflora starter ou não starter (Freitas e Malcata, 2000). São excepções os queijos de
São Jorge e do Pico, que são manufacturados com leite de vaca cru.
Apesar das muitas características distintas entre os queijos, estes partilham alguns
aspectos tecnológicos que englobam um número de etapas básicas: a coagulação, a
desidratação, a moldagem e a salga. Embora a textura e a qualidade dos queijos finais
sejam fortemente determinados pelas etapas de processamento anteriores, é durante a
cura que a maioria dos aspectos característicos da textura e do flavour se desenvolvem,
originando assim distintas variedades de queijo (Reis e Malcata, 2011)
Actualmente, são 11 os queijos portugueses com estatuto DOP: queijo do Pico,
queijo de São Jorge, queijo de cabra transmontano, queijo de Nisa, queijos da Beira
Baixa (queijo de Castelo Branco, queijo Amarelo da Beira Baixa, queijo Picante da
Beira Baixa), queijo de Azeitão, queijo Terrincho, queijo Rabaçal, queijo de Évora,
queijo Serpa e queijo Serra da Estrela (Comissão Europeia, 2013).
5
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
2.1.3 Queijos DOP Açorianos
2.1.3.1 Queijo do Pico artesanal
O queijo do Pico artesanal é um queijo curado, resultante do escoamento lento da
coalhada após coagulação do leite de vaca cru, com coalho de origem animal. Os seus
ingredientes são: leite de vaca cru, coalho animal e sal (Associação de Produtores de
Queijo do Pico, 1996).
O queijo do Pico constitui uma Denominação de Origem Protegida de acordo com
as normas da União Europeia desde Outubro de 1996 (Câmara, 2012). A área
geográfica de produção cinge-se à ilha do Pico, sendo a denominação de origem
protegida gerida pela Associação de Produtores de Queijo do Pico.
O queijo do Pico apresenta um formato cilíndrico, com um diâmetro
compreendido entre 16 e 17 cm, altura entre 2 e 3 cm, crosta amarela e um peso médio
entre 650 e 800 g. A pasta apresenta uma cor branca amarelada e tem uma textura
irregular, com olhos, pouco compacta e muito untuosa, sendo a consistência mole e
pastosa. Possui um sabor activo e salgado e tem um aroma característico, intenso e
agradável. O tempo mínimo de cura é de 20 dias (Associação de Produtores de Queijo
do Pico, 1996).
2.1.3.2 Queijo de São Jorge
De acordo com o Decreto Regulamentar Regional nº 24/86/A o queijo de São
Jorge é um queijo português curado de consistência firme, pasta amarelada, dura ou
semidura e que apresenta uma estrutura quebradiça.
Este queijo é manufacturado a partir de leite de vaca cru acidificado por uma
cultura starter obtida do soro do dia anterior. É produzido em fábricas de queijo de
pequena escala na ilha de São Jorge e obteve o estatuto DOP em 1986 (Kongo et al.,
2007) sendo a entidade certificadora do produto a Confraria do Queijo de São Jorge, e o
agrupamento gestor da DOP a UNIQUEIJO - União de Cooperativas Agrícolas da Ilha
de São Jorge.
A acidificação é feita a 30 °C, seguida pela cozedura da coalhada a 37 °C,
escorrimento do soro, moldagem da coalhada, salga e por fim o processo de cura que
6
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
tem uma duração mínima de 3 - 4 meses. No final da cura (tipicamente 4 - 6 meses) o
queijo de São Jorge apresenta olhos pequenos e irregulares disseminados na massa e o
seu flavour caracteriza-se por ser bouquet forte, limpo e ligeiramente picante,
particularidades que se acentuam com o seu envelhecimento (Kongo et al., 2007;
Kongo et al., 2009).
2.1.4 O queijo fresco
Segundo a Norma Portuguesa (NP - 1921, 1985), o queijo fresco tradicional
português é definido como um produto não maturado, obtido por dessoramento lento,
após a coagulação dos leites inteiro, total ou parcialmente desnatado. Este produto tem
como ingredientes essenciais o leite de vaca, cabra ou ovelha ou suas misturas, culturas
bacterianas lácticas específicas e coalho ou outras enzimas coagulantes, e como
ingredientes facultativos o leite em pó, nata, leitelho, proteínas do soro, sal e cloreto de
cálcio.
O queijo fresco apresenta uma forma cilíndrica, de dimensões variáveis entre os 5
e os 8 cm de diâmetro e os 3 e os 5 cm de altura e pesa cerca de 70 a 150 g (Oliveira,
2010). O seu aspecto é uniforme e sem crosta com uma cor branca ou branca amarelada
uniforme e de consistência mole. Os queijos frescos devem ser conservados em
refrigeração, a uma temperatura compreendida entre 0 e 5 °C, tendo nessas condições
um período de validade de 5 dias (Oliveira, 2010).
O queijo fresco apresenta uma elevada actividade da água, pH quase neutro, baixo
teor de sal e sem a adição de conservantes. Estas características proporcionam um
excelente substrato para o crescimento de microrganismos, resultando na redução da
vida de prateleira do queijo fresco (Pingitore et al., 2012). Em particular, a sua elevada
percentagem de água e a ausência de protecção que a crosta fornece aos queijos, torna o
queijo fresco frágil do ponto de vista da segurança do consumidor (Oliveira, 2010).
O consumo de queijo fresco pode assim envolver riscos para a saúde do
consumidor, podendo ser minimizados pela aplicação da Portaria nº 861/84. Esta
portaria fundamentalmente, proíbe a venda de queijo fresco feito a partir de leite cru,
pelo que o leite tem de ser submetido a pasteurização ou outro tratamento térmico
equivalente (Oliveira, 2010). Para além da utilização de leite pasteurizado no fabrico de
queijo fresco, é de crucial importância a utilização de boas práticas de higiene fabril, o
7
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
controlo sistemático dos processos envolvidos, o correcto funcionamento dos
equipamentos e a utilização de uma embalagem adequada, tendo em vista o controlo do
risco do consumo do queijo fresco (Oliveira, 2010).
2.2 Microrganismos do queijo
Os microrganismos são um componente essencial em todas as variedades de
queijo maturado e desempenham funções importantes durante a manufactura e
maturação deste. A sua microflora pode ser dividida em dois grupos principais: culturas
de arranque (starters) e flora secundária (Beresford et al., 2001).
As bactérias do ácido láctico (BAL) são utilizadas como culturas de arranque para
o fabrico do queijo, podendo ser adicionadas inicialmente ou fazerem parte da
microflora natural do leite. Na flora secundária estão presentes além das BAL, os
bolores e as leveduras que contribuem para a maturação do queijo, influenciando a
textura, sabor e aroma do produto final (Wouters et al., 2002).
2.2.1 Culturas de arranque
As culturas de arranque ou bactérias starter têm como função acidificar o leite e
como consequência inibir o crescimento de outras bactérias (Wouters et al., 2002;
Carminati et al., 2010). Estas podem ser definidas como bactérias que produzem ácido
suficiente para reduzir o pH do leite para menos de 5,3 em 6 horas a 30 - 37 °C
(Beresford et al., 2001).
O uso de culturas de arranque proporciona produtos seguros a nível
microbiológico com propriedades organolépticas e estruturais reproduzíveis (Wouters et
al., 2002; Carminati et al., 2010; Renault, 2010). Estas bactérias podem ser adicionadas
no início da manufactura ou podem surgir como contaminantes naturais do leite, como é
o caso de muitas variedades de queijo artesanais produzidos com leite cru (Beresford et
al., 2001). As bactérias de arranque mais comuns são membros dos géneros
Lactococcus, Lactobacillus, Streptococcus, Leuconostoc e Enterococcus (Beresford et
al., 2001). Os starters industriais para a maioria dos queijos têm por base espécies
individuais de Lactococcus lactis (Wouters et al., 2002).
8
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
A maioria das culturas de arranque mesofílicas inclui espécies como Lactococcus
lactis ssp. lactis e o Lactococcus lactis ssp. cremoris (von Wright, 2012). As culturas
termofílicas são compostas por estirpes individuais ou múltiplas de Streptococcus
thermophilus e de lactobacilos termófilos como o Lactobacillus delbrueckii ssp.
delbrueckii, Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus, Lb. delbrueckii ssp. lactis ou o Lb.
helveticus (Beresford et al., 2001).
As culturas de arranque de lactococos mesófilos são usadas na produção de uma
grande variedade de queijos, manteiga e leites fermentados. A selecção destas culturas
tem por base a sua acção na fermentação e nas propriedades pretendidas do produto.
Também as propriedades de manuseamento e estabilidade durante a produção têm
constituído um critério de selecção das culturas de arranque (Marshall, 1991).
Além da produção de ácido durante o processo de fermentação, as culturas de
arranque também contribuem para a maturação do queijo, estando as suas enzimas
envolvidas na proteólise e na conversão dos aminoácidos em compostos que contribuem
para o aroma do produto final (Beresford et al., 2001). Durante a maturação do queijo, a
proteólise é a primeira etapa bioquímica que contribui para o aroma e textura
pretendida. Os lactococos possuem um sistema proteolítico que juntamente com outras
enzimas como a quimosina, são responsáveis pela conversão das caseínas em péptidos e
aminoácidos (Wouters et al., 2002). Os aminoácidos são os precursores chave para o
aroma principal do queijo. Eles são metabolizados por acção de enzimas que convertem
os aminoácidos em aldeídos, álcoois, cetonas, aminas, ácidos, ésteres e compostos que
contêm enxofre, que contribuem para o aroma do queijo (Urbach, 1995; Yvon et al.,
1998).
2.2.2 Culturas adjuntas
As culturas adjuntas podem ser definidas como as que são adicionadas ao queijo
com outros objectivos para além da produção de acidez, embora frequentemente sejam
compostas por microrganismos provenientes dos ingredientes ou do ambiente de fabrico
do queijo (Beresford et al., 2001) As culturas adjuntas seleccionadas das BAL (non
starter lactic acid bacteria - NSLAB) podem ser adicionadas para a acelerar o processo
de maturação e para produção do aroma pretendido. Também podem eliminar defeitos
9
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
produzidos por NSLAB acidentais, visto que inibem o seu desenvolvimento (Wouters et
al., 2002).
2.2.2.1 Culturas adjuntas de bactérias do ácido láctico
Durante a maturação do queijo o número de bactérias da cultura de arranque
diminui e as culturas adjuntas adicionadas na forma de culturas definidas ou que
tiveram origem no leite e ambiente, crescem e atingem números superiores aos do
starter (Wouters et al., 2002). As culturas adjuntas de bactérias do ácido láctico
(NSLAB) não fazem parte da flora de arranque normal, têm geralmente dificuldade em
crescer no leite e não contribuem para a produção de ácido no queijo (Beresford et al.,
2001). Estas são essencialmente constituídas por lactobacilos e pediococos mesófilos,
correspondendo a uma porção considerável da flora microbiana da maioria dos queijos
durante a maturação.
Muitas espécies de lactobacilos mesófilos têm sido isolados dos queijos, mas os
mais comuns são o Lb. casei/paracasei, Lb. plantarum, Lb. rhamnosus e o Lb. curvatus.
O Pediococcus acidilactici e o Pe. pentosaceus são os pediococos mais frequentemente
encontrados no queijo (Fitzsimons et al., 1999; Beresford et al., 2001).
A composição de NSLAB varia com o dia de produção e com a idade do queijo
(Williams e Banks, 1997; Fitzsimons et al., 2001; Wouters et al., 2002). As NSLAB
têm a capacidade de crescer sob as elevadas condições selectivas existentes na
maturação do queijo. Nas primeiras horas da produção do queijo a lactose foi já
utilizada para a fermentação das culturas de arranque, o pH situa-se entre 4,9 e 5,3, a
temperatura é inferior a 13 °C, o teor de humidade é inferior a 50%, a concentração de
sal varia entre 4 - 6% e existe pouco oxigénio disponível, o que torna o queijo em
maturação num ambiente adverso para os microrganismos. Como as NSLAB possuem
uma grande variedade de enzimas hidrolíticas e são capazes de efectuar proteólise e
lipólise, conseguem crescer no queijo em maturação (Williams e Banks, 1997; Wouters
et al., 2002).
Como as NSLAB dominam a microflora de muitos queijos curados elas
desempenham um papel fundamental no desenvolvimento do sabor e aroma durante a
maturação. De facto, elas contribuem para a formação de pequenos péptidos e
aminoácidos, que convertem em álcoois, aldeídos, ácidos, ésteres e compostos
10
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
sulfurosos proporcionando os sabores aromas específicos dos queijos curados (Wouters
et al., 2002).
2.2.2.2 Bolores e leveduras
Os bolores são muito usados na produção de queijos semi-moles em conjunto com
as BAL acidificantes. O seu principal papel é o de realçar o sabor e aroma e de
modificar o corpo e a estrutura do queijo (Wouters et al., 2002).
O pH baixo, o baixo teor de humidade, a baixa temperatura e o elevado teor de sal
do queijo em maturação favorece também o crescimento das leveduras (Beresford et al.,
2001). Deste modo, as leveduras são encontradas numa grande variedade de queijos;
contudo, na maior parte dos casos, o seu papel na maturação é pouco conhecido
(Beresford et al., 2001; Wouters et al., 2002). Pensa-se que estão envolvidas com a
descida da acidez devido à sua capacidade de metabolizar o lactato, permitindo assim o
desenvolvimento da flora microbiana secundária (Wouters et al., 2002). Em alguns
queijos as leveduras contribuem para o desenvolvimento da textura e do aroma do
queijo durante a maturação (Beresford et al., 2001).
2.3 Caracterização das Bactérias do Ácido Láctico (BAL)
As BAL constituem um grupo heterogéneo de géneros que partilham muitas
características fisiológicas importantes (Quadro 1). As BAL devem a sua designação à
capacidade de fermentar glúcidos em ácido láctico por via de metabolismo homo- ou
heterofermentativo (Settanni e Moschetti, 2010).
As BAL subdividem-se em dois grupos segundo a natureza e a concentração dos
produtos finais produzidos a partir da glucose: as homofermentativas que produzem
quase exclusivamente lactato, pela via Embden-Meyerhof-Parnas (EMP) e as
heterofermentativas que produzem, para além de CO2, lactato e etanol, pela via hexosemonofosfato ou via 6P-gluconato/fosfocetolase (Inês et al., 2008).
As BAL são caracterizadas por serem Gram-positivas, não formadoras de esporos,
catalase negativas, desprovidas de citocromos, anaeróbias tolerantes, fastidiosas,
tolerantes aos ácidos, com metabolismo estritamente fermentativo sendo o ácido láctico
o principal produto final da fermentação do açúcar (Axelsson, 1998). Possuem baixo
11
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
teor molar de G + C, são oxidase negativas, não reduzem nitratos a nitritos (Carr, et al.,
2002) e crescem apenas em meios complexos (Schleifer e Ludwig, 1995). Elas
dependem da fermentação do açúcar para obter energia, e como não possuem
citocromos, obtêm energia por fosforilação a nível do substrato em vez da cadeia de
transporte de electrões e fosforilação oxidativa (Willey et al., 2009). As BAL também
são geralmente conhecidas por serem organismos não móveis, com excepção do
Lactobacillus agilis e das espécies descritas recentemente: Lactobacillus ghanensis
(Nielsen et al., 2007) e Lactobacillus capillatus (Chao et al., 2008). A heterogeneidade
deste grupo é bem expressa nos seus traços morfológicos, visto que são bacilos ou
cocos, apresentam-se como células individuais ou agrupadas, tétradas e de cadeia curta
ou longa (Settanni e Moschetti, 2010).
A característica chave deste grupo é a sua incapacidade para sintetizar grupos
porfirínicos (e.g. heme), o que explica o facto de nas condições de cultura utilizadas em
laboratório as BAL serem desprovidas de citocromos e de "verdadeira" catalase.
Contudo, podem ocorrer excepções a esta descrição geral, já que algumas estirpes de
BAL produzem peroxidases ou uma "pseudocatalase". Em meios contendo hematina ou
compostos similares, algumas estirpes podem produzir catalase ou mesmo citocromos, e
em alguns casos constituir uma cadeia de transporte electrónico funcional (Inês et al.,
2008).
Devido às capacidades biossintéticas limitadas e os seus elevados requisitos em
termos de fontes de carbono e azoto, o habitat natural das BAL é constituído por
ambientes nutricionalmente ricos (Salminen e von Wright, 1998). As BAL estão
presentes em ambientes muito diversos, como o leite e seus derivados, carne e seus
derivados, vegetais, bebidas, solo, águas residuais, fazendo também parte da microbiota
dos tractos respiratório, intestinal e genital do homem e de animais (Schleifer e Ludwig,
1995).
As bactérias lácticas são essencialmente mesófilas, com algumas linhagens
termófilas, sendo capazes de crescer num intervalo de temperaturas de 5 a 45 °C. Têm a
capacidade de crescer a pH 3,8 e são proteolíticas fastidiosas em relação a alguns
aminoácidos. Produzem um grande número de enzimas glicolíticas, lipolíticas e
proteolíticas, que transformam os nutrientes fundamentais do leite e do queijo em
compostos com propriedades sensoriais desejáveis (Silva, 2011).
12
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
Quadro 1. Géneros comuns das BAL e suas características diferenciais (Wright e Axelsson, 2012).
Características
Forma
CO2 a
partir
da
glucose
Crescimento
a 10 °C
Crescimento
a 45 °C
Crescimento
em 6,5% de
NaCl
Crescimento
em 18% de
NaCl
Crescimento
a pH 4,4
Crescimento
a pH 9,6
Tipo de
ácido
láctico
Aerococcus
Cocos
(tétradas)
-
+
-
+
-
-
+
L
Carnobacterium
Bacilos
-
+
-
ND*
-
ND
-
L
Enterococcus
Cocos
-
+
+
+
-
+
+
L
Tetrageonococcus
Cocos
(Tétradas)
+
-
+
+
- Variável
+
Vagococcus
Cocos
+
-
-
-
Lactobacillus
Bacilos
Variável
Variável
Variável
Variável
-
Variável
-
D, L, DL
Pediococcus
Cocos
(tétradas)
-
Variável
Variável
Variável
-
+
-
L, DL
Leuconostoc
Cocosa
+
+
-
Variável
-
Variável
-
D
Oenococcus
+
+
-
Variável
-
Variável
-
D
Weissella
+
+
-
Variável
-
Variável
-
D, DL
-
+
-
-
-
Variável
-
L
-
-
Variável
-
-
-
-
L
Família
Género
Aerococcaceae
Carnobacteriaceae
Enterococcaceae
Lactobacillaceae
Leuconostocaceae
Streptococcaceae
Lactococcus
b
Cocos
Streptococcus
-
*ND - não determinado
a
Algumas estirpes de Weissella têm forma de bacilos.
b
Na literatura antiga os lactococos são referidos como estreptococos do Grupo N.
13
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
Genericamente as BAL são usadas na indústria alimentar com fins tecnológicos,
sendo acidificantes, tolerantes aos sais biliares, com capacidade de adesão ao tecido
epitelial do intestino (Gonçalves, 2009) e produtoras de substâncias antimicrobianas
designadamente ácidos orgânicos, peróxido de hidrogénio, enzimas, metabolitos de
baixo peso molecular e bacteriocinas (Piard e Desmazeaud, 1991; Holzapfel et al.,
1995; Kucerova et al., 2007; Mirhosseini et al., 2008; Ahmadova et al., 2013).
Devido a algumas das suas propriedades metabólicas, as BAL são geralmente
empregues pelo seu elevado contributo no flavour, textura, valor nutritivo, segurança
microbiológica e prolongamento da vida de prateleira dos produtos fermentados
(Caplice e Fitzgerald, 1999; Leroy e De Vuyst, 2004; Topisirovic et al., 2006; Settanni
e Corsetti, 2008; Settanni e Moschetti, 2010). Dada a sua vasta utilização em produtos
fermentados tradicionais, e como resultado desta situação, a maioria das BAL, como os
Lactococcus,
Oenococcus,
Lactobacillus,
Leuconostoc,
Pedicoccus
e
alguns
Streptococcus sp., possuem o estatuto GRAS, ou seja, considerados em geral como
seguros (Generally Regarded As Safe) concedido pela American Food and Drug Agency
(FDA) (Collins et al., 2010; Balciunas et al., 2013). Na Comunidade Europeia o
estatuto QPS, Qualified Presumption of Safety é concedido pela Autoridade Europeia de
Segurança Alimentar (EFSA; Câmara, 2012).
As espécies do género Enterococcus e algumas espécies de Streptococcus são
patogénicas na natureza e por esse motivo não possuem estatuto GRAS (Collins et al.,
2010). Devido a preocupações com a segurança, nenhum membro do género
Enterococcus pode ser proposto para estatuto QPS. As preocupações relacionadas com
estas bactérias devem-se aos factores de virulência que estas possuem e à resistência
que apresentam a uma variedade de antibióticos (EFSA, 2007; Franz et al., 2010).
2.3.1 Classificação das BAL
A primeira classificação das BAL foi efectuada por Orla-Jensen em 1919, que
agrupou as BAL nos géneros Betabacterium, Thermobacterium, Streptobacterium,
Streptococcus, Betacoccus, Tetracoccus e Microbacterium (Axelsson, 2004). As
alterações consideráveis ocorridas na taxonomia das BAL, com a criação de novos
géneros, espécies e sua reclassificação e reorganização, conduziram a que destes
14
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
géneros apenas persista actualmente o género Streptococcus (Inês et al., 2008;
Axelsson, 2004).
Na taxonomia actual, as BAL fazem parte do Filo Firmicutes, da Classe Bacillus,
da Ordem Lactobacilae e das Famílias Aerococcaceae, Carnobacteriaceae,
Enterobacteriaceae, Lactobacillaceae, Leuconostocaceae e Streptococcaceae (Wright e
Axelsson, 2012).
As BAL incluem os géneros Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus,
Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus,
Tetragenococcus, Vagococcus e Weissella (Axelsson, 2004; Holzapfel et al., 2001;
Wright e Axelsson, 2012). O género Bifidobacterium frequentemente considerado no
mesmo contexto das BAL genuínas, partilha algumas características típicas importantes,
mas não está filogeneticamente relacionado e possui um modo de fermentação do
açúcar único (Axelsson, 1998).
A abordagem tradicional na classificação das BAL em diferentes géneros
baseava-se
fundamentalmente
em
caracteres
fenotípicos,
nomeadamente:
(i)
morfológicos (forma das células, endósporos, flagelos, reacção de Gram) e das colónias
(cor, dimensões, forma); (ii) bioquímicos - modo de fermentação da glucose,
configuração do ácido láctico produzido e (iii) fisiológicos - crescimento a diferentes
temperaturas, capacidade de crescer em elevadas concentrações de sal e tolerância a pH
ácido e alcalino (Axelsson, 1998; Axelsson, 2004; Inês et al., 2008). Ainda que estas
características continuem a ser usadas como diferenciais a nível de alguns géneros de
BAL, outros métodos fenotípicos foram introduzidos na classificação das BAL, tais
como os perfis metabólicos e enzimáticos, a tipagem fágica e bacteriocínica e a
serotipagem. Com o desenvolvimento dos métodos quimiotaxonómicos surgiu também
a análise de perfis de ácidos gordos, de perfis de proteínas celulares totais ou a análise
de constituintes da parede celular (Inês et al., 2008).
A aplicação de técnicas moleculares na classificação e identificação das BAL
permitiu substituir e/ou complementar as metodologias clássicas baseadas nas
características fenotípicas. Dos métodos moleculares destacam-se, entre outros, a
sequenciação do gene 16S rRNA e de outros genes, a determinação do teor molar de
Guanina + Citosina, as hibridações DNA-DNA e DNA-RNA, a análise de
polimorfismos dos fragmentos de restrição (Restriction Fragment Lenght Polymorphism
15
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
- RFLP), a eletroforese em campo pulsado (Pulsed Field Gel Electrophoresis - PFGE) e
diversas técnicas baseadas na reacção em cadeia da polimerase (PCR) tais como
Random Amplification of Polymorphic DNA (RAPD), Amplified Ribossomal DNA
Restriction Analysis (ARDRA) e Amplified Fragment Lenght Polymorphism (AFLP)
(Gonçalves, 2009).
As BAL típicas como Carnobacterium, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc,
Pediococcus e Streptococcus, têm um teor molar de G + C inferior a 50% e pertencem
ao ramo Clostridium. As que apresentam um teor molar de G + C superior a 50% estão
incluídas no ramo Actinomycetes, da qual faz parte o género Bifidobacterium, assim
como outros géneros como por exemplo Brevibacterium, Corynebacterium,
Microbacterium e Propionibacterium que também são importantes na indústria
alimentar (Schleifer e Ludwig, 1995).
2.3.2 Principais BAL presentes no queijo do Pico
2.3.2.1 Género Lactococcus
O género Lactococcus caracteriza-se por serem cocos Gram-positivos que
aparecem individuais, aos pares ou em cadeia, não formadores de esporos, sem
mobilidade, anaeróbios facultativos, não β-hemolíticos, catalase negativos e com
crescimento a 10 °C mas não a 45 °C. Geralmente crescem a 4% (p/v) de NaCl com
excepção do Lc. lactis subsp. cremoris que apenas tolera 2% (p/v) de NaCl. Apresentam
metabolismo fermentativo, sendo o ácido láctico L(+) o produto final predominante da
fermentação da glucose. Quanto ao teor molar de G + C do DNA situa-se no intervalo
de 34 a 43% (Teuber, 1995).
Este género é composto por sete espécies: Lc. lactis, Lc. garvieae, Lc. plantarum,
Lc. raffinolactis, Lc. piscium, Lc. chungangensis e o Lc. fujiensis (von Wright, 2012).
Os lactococos isolados a partir de produtos lácteos fermentados artesanais sem
aplicação de culturas starter industriais, e a partir de ambientes não lácteos são
geralmente referidos como lactococos "selvagens". Os lactococos selvagens
desempenham um papel importante na produção de aroma no queijo e outros produtos
lácteos (Wouters et al., 2002).
16
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
2.3.2.2 Género Lactobacillus
O género Lactobacillus caracteriza-se por serem Gram-positivos, não formadores
de esporos, bacilos ou cocobacilos com um teor molar de G + C inferior a 50%. São
estritamente fermentativos, aerotolerantes ou anaeróbios, acidúricos ou acidófilos e têm
necessidades nutricionais complexas (e.g. para os glúcidos, aminoácidos, péptidos,
ésteres de ácidos gordos, sais, derivados dos ácidos nucleicos e vitaminas) (Hammes e
Vogel, 1995).
Com a glucose como fonte de carbono os lactobacilos podem ser
homofermentativos produzindo mais de 85% de ácido láctico, ou heterofermentativos
produzindo ácido láctico, CO2, etanol e/ou ácido acético em quantidades equimolares
(Hammes e Vogel, 1995).
Os lactobacilos dividem-se em três grupos (Hammes e Vogel, 1995; Barrangou et
al., 2012):
Grupo A: lactobacilos homofermentativos obrigatórios. As hexoses são quase
exclusivamente (> 85%) fermentadas em ácido láctico pela via de Embden-MeyerhofParnas (EMP). Os organismos possuem a frutose-1,6-bifosfato-aldolase mas não
possuem a fosfocetolase, e por isso, as pentoses e o gluconato não são fermentados.
Grupo B: lactobacilos heterofermentativos facultativos. As hexoses são quase
exclusivamente fermentadas em ácido láctico pela via de Embden-Meyerhof-Parnas
(EMP). Os organismos possuem a aldolase e a fosfocetolase, e por isso, não só
fermentam a hexose mas também as pentoses. Na presença de glucose, as enzimas da
via do fosfogluconato são inibidas.
Grupo C: lactobacilos heterofermentativos obrigatórios. As hexoses são
fermentadas pela via do fosfogluconato produzindo lactato, etanol (ácido acético) e CO2
em quantidades equimolares. As pentoses entram nesta via e podem ser fermentadas.
2.3.2.3 Género Enterococcus
Os enterococos são cocos Gram-positivos que se apresentam de forma individual,
em pares ou em cadeia curta. Não esporulados, podem ser móveis, anaeróbios
facultativos, com metabolismo homofermentativo, onde o produto final predominante
17
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
da fermentação da glucose é o ácido láctico L (+), geralmente são catalase negativos,
mas algumas estirpes produzem uma pseudocatalase, e possuem elevados requisitos
nutricionais (Devriese e Pot, 1995).
Os enterococos, aparecem frequentemente em grande número nos lacticínios,
sendo as espécies predominantes o Enterococcus faecalis e o Enterococcus faecium
(Giraffa, 2003). A presença destes tem sido geralmente considerado como uma
consequência das condições sanitárias insuficientes durante o processamento. No
entanto, várias estirpes apresentam propriedades bioquímicas que as tornam
possivelmente úteis para serem usadas como starters para aplicação tecnológica na
fermentação dos alimentos. Desde que as estirpes de enterococos têm sido reconhecidas
como potenciais patógenos, a selecção deve ter em consideração os factores de
virulência (Sarantinopoulos et al., 2001a; Wouters et al., 2002; Giraffa, 2003; Cocolin
et al., 2007)
2.3.2.4 Género Streptococcus
Todas as espécies do género Streptococcus são cocos Gram-positivos, que podem
ter forma esférica ou ovalada e estão tipicamente organizados em cadeias ou pares. São
imóveis e não produzem esporos. A maioria é anaeróbia facultativa, mas algumas
estirpes necessitam de CO2 para o crescimento. São quimoorganotróficos, fermentam os
glúcidos com a produção de ácido láctico e outros ácidos, possuem requisitos
nutricionais complexos e são catalase negativos. O teor molar do DNA de G + C é de 34
- 46% (Hardie e Whiley, 1995, Willey et al., 2009; Tagg et al., 2012).
Uma das principais características dos estreptococos é a sua capacidade de
produzir diferentes tipos de hemólise em meios que contêm sangue. Os diferentes tipos
de hemólise que podem ser observados, são nomeadamente completa (β), parcial (α) ou
nenhuma (γ). Em algumas espécies, o aparecimento de zonas α-hemolíticas em torno
das colónias que cresceram aerobicamente pode ser devido à produção de peróxido de
hidrogénio (Hardie e Whiley, 1995; Willey et al., 2009).
Os estreptococos abrangem um componente significativo da flora comensal do
homem e animais, colonizando as membranas das mucosas da boca, tracto respiratório,
tracto alimentar e o tracto urogenital. Algumas espécies também são encontradas na
18
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
pele, e outras podem ser isoladas a partir de produtos alimentares como o leite e
lacticínios (Hardie e Whiley, 1995).
2.3.2.5 Género Leuconostoc
O género Leuconostoc é constituído por cocos Gram-positivos que apresentam
morfologia irregular, podendo ser alongada ou elíptica. A morfologia celular varia com
as condições de crescimento: quando as bactérias crescem num meio de glucose são
alongadas, enquanto que a maioria das estirpes formam células ovóides quando são
cultivadas em leite. Estas são agrupadas aos pares ou em cadeias curtas (Dellaglio et al.,
1995; Huys et al., 2012).
As espécies de leuconostoc são anaeróbias facultativas, resistentes à vancomicina
e não hidrolisam a arginina (Hemme e Foucaud-Scheunemann, 2004). Todas as espécies
requerem um meio rico em factores de crescimento complexos e aminoácidos,
apresentam um crescimento lento e baixa propriedade acidificante (Dellaglio et al.,
1995; Liu et al., 1997; Huys et al., 2012). Crescem a 8 °C mas não a 45 °C, não crescem
a pH 4,8 e a 7% de NaCl e não produzem H2S (Hemme e Foucaud-Scheunemann,
2004). Os leuconostoc são imóveis, não formadores de esporos, apresentam um teor
molar de G + C de 38 - 44%. Não possuem catalase e citocromos, são
heterofermentativos produzindo assim CO2 a partir do metabolismo da glucose junto
com D-lactato e etanol ou acetato por meio da via da fosfocetolase (Villani et al., 1997;
Hemme e Foucaud-Scheunemann, 2004; Willey et al., 2009). Algumas estirpes são
produtoras de exopolissacáridos como o dextrano (Maina et al., 2008).
Os leuconostocs têm requisitos nutricionais complexos e são encontrados em
plantas, lacticínios, carne e vários produtos alimentares fermentados (Dellaglio et al.,
1995). O Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides e o Leuconostoc lactis são
os leuconostocs dominantes no leite e produtos de lacticínios fermentados. O
Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris e o Leuconostoc paramesenteroides são
menos representados no leite, provavelmente devido ao seu crescimento lento sob
condições psicrotróficas (Dellaglio et al., 1995).
Os leuconostoc têm um papel importante na alteração da qualidade organoléptica
e textura de produtos alimentares como o leite, manteiga, queijo e carne (Dellaglio et
al., 1995; Hemme e Foucaud-Scheunemann, 2004). Porque são heterofermentativos
19
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
obrigatórios produzem dióxido de carbono, podem provocar o flato de certos queijos e
modificar a textura de produtos fermentados (Dellaglio et al., 1995). No queijo, os
leuconostoc são frequentemente usados como produtores de flavour em culturas de
arranque mistas. Certas estirpes produzem diacetilo e acetoína a partir do citrato e
contribuem para o aroma e sabor típico de muitos alimentos, especialmente os produtos
lácteos (Dellaglio et al., 1995; Villani et al., 1997; Liu et al., 1997).
2.4 Bacteriocinas
As bacteriocinas são péptidos com acção antimicrobiana, sintetizados nos
ribossomas e geralmente estáveis ao calor, sendo produzidos por uma grande variedade
de bactérias. Estes péptidos podem ter um espectro de inibição pequeno - inibindo
bactérias taxonomicamente próximas, ou um espectro de inibição elevado - inibindo
uma grande variedade de bactérias (Cotter et al., 2005; Mirhosseini et al., 2010; Mills et
al., 2011a).
Algumas bacteriocinas produzidas pelas BAL, inibem não só espécies
taxonomicamente próximas como também são eficazes contra patógenos alimentares
importantes como a Listeria monocytogenes e o Staphylococcus aureus, assim como
outros microrganismos patogénicos Gram-positivos (Piard e Desmazeaud, 1992;
O´Sullivan et al., 2002; Ghrairi et al., 2008; Sobrino-López e Martín-Belloso, 2008).
Nos últimos anos, as bacteriocinas têm atraído um interesse considerável para o
seu uso como conservantes naturais dos alimentos em substituição dos conservantes
químicos, pois estas são rapidamente digeridas no tracto gastrointestinal dos humanos
(O´Sullivan et al., 2002; Settanni e Corsetti, 2008; Mills et al., 2011a; Mills et al.,
2011b).
2.4.1 Classificação das bacteriocinas
As bacteriocinas representam um grupo heterogéneo de péptidos, tendo sido
propostos diferentes sistemas de classificação.
Em 1993, Klaenhammer propôs um sistema de classificação que diferenciava as
bacteriocinas em quatro classes principais (Heng et al., 2007):
20
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
Classe I - Péptidos de pequena dimensão (< 5 kDa) modificados póstranscricionalmente,
Classe II - Péptidos de pequena dimensão (< 10 kDa) não modificados,
Classe III - Proteínas de cadeia longa (> 30 kDa) termo lábeis,
Classe IV - Proteínas complexas conjugadas com lípidos ou glúcidos.
Esta separação em quatro classes tem servido de base para a maioria das propostas
posteriores de classificação das bacteriocinas. Contudo, existe uma falta de consenso na
diferenciação de vários sub-grupos, particularmente na classe II, além de vários autores
proporem a retirada da classe IV por falta de caracterização das moléculas a nível
bioquímico (Cotter et al., 2005). Além disso, a descoberta crescente de uma grande
variedade de bacteriocinas, resultou num panorama confuso fazendo com que diferentes
investigadores propusessem novos esquemas de classificação. Como consequência desta
situação, vários critérios têm sido utilizados, incluindo a família a que pertencem as
bactérias produtoras, o peso molecular, as homologias das sequências de aminoácidos
e/ou a organização em cluster dos genes. Apesar de todos os esforços, a classificação
das bacteriocinas ainda não está bem estabelecida e continua a ser assunto de debate.
Nesta tese, adoptou-se a classificação baseada nas sugestões mais recentes de
Montalbán-López et al. (2011).
2.4.1.1 Classe I ou Lantibióticos
As bacteriocinas pertencentes à classe I são frequentemente designadas como
lantibióticos. Os lantibióticos são péptidos pequenos com 19 - 38 aminoácidos, estáveis
ao calor e com peso molecular inferior a 5 kDa (Deegan et al., 2006; Montalbán-López
et al., 2011; Hassan et al., 2012; Balciunas et al., 2013). São produzidos por um elevado
número de bactérias Gram-positivas que sofrem uma grande modificação após a sua
síntese ribossomal (Montalbán-López et al., 2011; Hassan et al., 2012), resultando na
formação de aminoácidos tioéter característicos como a lantionina (Lan) e
metilantionina (MeLan) (Jack e Sahl, 1995; Ouwehand, 1998; Zacharof e Lovitt, 2012).
Esta modificação surge por via de um processo de duas etapas: primeiro, os
aminoácidos serina e treonina são sujeitos a desidratação enzimática para dar origem a
dehidroalanina (Dha) e dehidrobutirina (Dhb) respectivamente. Posteriormente, os
21
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
grupos tiol das cisteínas próximas atacam a dupla ligação do Dha ou Dhb, o que origina
Lan ou MeLan, respectivamente. Esta condensação entre dois resíduos próximos resulta
na formação de anéis fechados covalentes com o péptido linear inicial conferindo uma
estrutura e funcionalidade específicos (Deegan et al., 2006; Zacharof e Lovitt, 2012). A
nisina é um exemplo de um lantibiótico cuja estrutura primária é ilustrada na figura 1.
Figura 1. Estrutura primária da nisina. Os resíduos de lantionina característicos (Ala-S-Ala) e βmetilantionina (Abu-S-Ala) que formam os anéis de lantionina estão coloridos a vermelho; os
aminoácidos desidratados Dhb (dehidrobutirina) e Dha (dehidroalanina) estão coloridos a laranja (Kruijff
et al., 2008).
A classe dos lantibióticos é ainda dividida em três subclasses de acordo com a
estrutura química e actividade antimicrobiana (Chen e Hoover, 2003).
A subclasse Ia contém péptidos lineares flexíveis modificados por duas enzimas
diferentes, a enzima de desidratação LanB e a ciclase LanC (Montalbán-López et al.,
2011). São péptidos catiónicos e hidrofóbicos que actuam formando poros nas
membranas citoplasmáticas das espécies alvo sensíveis (Cleveland et al., 2001; Deegan
et al., 2006).
Os membros da subclasse Ib são caracteristicamente globulares, possuem uma
estrutura mais rígida e são de carga negativa ou sem carga (Cleveland et al., 2001; Chen
e Hoover, 2003; Stoyanova et al., 2012). A principal diferença em relação aos
lantibióticos da subclasse Ia é a maturação ser feita apenas com uma enzima (LanM)
que está envolvida na sua desidratação e ciclização (Montalbán-López et al., 2011).
Estas bacteriocinas exercem a sua função interferindo com as reacções enzimáticas
essenciais das bactérias sensíveis (Chen e Hoover, 2003; Ross et al., 2002; Deegan et
al., 2006).
A última subclasse de péptidos que contêm lantionina é a subclasse Ic, que é
composta por péptidos com baixa actividade inibidora. As enzimas envolvidas na sua
maturação não partilham grande homologia com as descritas anteriormente (MontalbánLópez et al., 2011).
22
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
2.4.1.2 Classe II
As bacteriocinas da classe II são péptidos pequenos (25 - 60 aminoácidos), com
peso molecular inferior a 10 kDa, catiónicos, hidrofóbicos e estáveis ao calor (Chen e
Hoover, 2003; Guinane et al., 2005; Deegan et al., 2006; Hassan et al., 2012). As
bacteriocinas desta classe não possuem resíduos Lan e têm uma estrutura helicoidal
anfifílica que permite a sua inserção na membrana citoplasmática da célula alvo,
promovendo assim a despolarização da membrana e a morte da célula (Balciunas et al.,
2013). As BAL são frequentemente encontradas como produtoras de bacteriocinas de
classe II (Heng et al., 2007; Hassan et al., 2012). Um grande número de subclasses já
foram sugeridas, mas a sua natureza heterogénea faz com que a subclassificação seja
difícil (Montalbán-López et al., 2011). Duas subclasses são comuns a todos os sistemas
de classificação: a subclasse IIa tipo pediocina (ou activo para Listeria) e a subclasse IIb
que corresponde às bacteriocinas formadas por dois componentes (Deegan et al., 2006).
A subclasse IIa é também designada como bacteriocinas tipo pediocina. Estas
bacteriocinas têm geralmente um espectro limitado de actuação, mas apresentam
elevada actividade contra a Listeria monocytogenes, característica que constituiu um
potencial importante como bioconservante num elevado número de alimentos (Ennahar
et al., 1999; Heng et al., 2007; Montalbán-López et al., 2011; Hassan et al., 2012).
A subclasse IIb refere-se às bacteriocinas de dois componentes, ou seja,
bacteriocinas compostas por dois péptidos diferentes cuja actividade inibitória é
dependente da acção complementar dos dois péptidos (Cleveland et al., 2001; Chen e
Hoover, 2003; Deegan et al., 2006, Heng et al., 2007; Hassan et al., 2012). Estas
bacteriocinas têm pouca ou nenhuma actividade quando cada péptido é utilizado
individualmente (Deegan et al., 2006; Balciunas et al., 2013).
As bacteriocinas da subclasse IIc não possuem um péptido sinal (sequência
leader), não sofrem modificações pós-transcricionais e têm uma estrutura cíclica devido
à ligação covalente entre o C e N terminais (Kawai et al., 2004; Montalbán-López et al.,
2011; Hassan et al., 2012; Balciunas et al., 2013).
A subclasse IId inclui outras bacteriocinas lineares não modificadas (MontalbánLópez et al., 2011; Hassan et al., 2012).
23
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
2.4.1.3 Classe III
Esta classe é composta por bacteriocinas termolábeis de maiores dimensões (> 30
kDa) (Chen e Hoover, 2003; Balciunas et al., 2013). Esta classe também é dividida em
duas subclasses: IIIa e IIIb.
A subclasse IIIa designada por bacteriolisinas consiste em enzimas bacteriolíticas
que facilitam a morte de estirpes sensíveis a partir da lise celular. Pelo contrário, a
subclasse IIIb inclui as bacteriocinas não líticas (Heng et al., 2007; Montalbán-López et
al., 2011).
2.4.1.4 Classe IV
Esta classe é constituída por péptidos circulares originados pela ligação peptídica
das duas extremidades (N e C) e que formam grandes complexos com outras
macromoléculas (Cleveland et al., 2001 Montalbán-López et al., 2011). Este tipo de
bacteriocinas eram antes incluídas na classe II mas passaram depois para uma nova
classe, devido às modificações mais complexas que sofrem em relação às bacteriocinas
da classe II. Além disso, os membros desta classe não partilham grandes semelhanças
com os membros das outras classes (Montalbán-López et al., 2011).
Uma classificação esquemática das classes das bacteriocinas está descrita no
quadro 2.
24
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
Quadro 2. Classificação esquemática das bacteriocinas (Adaptado de Montalbán-López et al., 2011).
Classe
Classe I: Lantibióticos
Subclasse / Características
Exemplos
Ia: Modificados por LanB (desidratação)
e LanC (formação de anel).
Exportada pela LanT e libertada do
péptido sinal pelo LanP.
Nisina
Subtilina
Ib: Modificadas pelo LanM (desidratação
e formação de anel). Transportado e
processado pelo LanT.
Mersacidina
Lacticina 3147
Cinamicina
Ic: Lantibióticos não activos
Classe II: Pequenas
proteínas termoestáveis
IIa: Grupo tipo pediocina
Pediocina PA-1
Ubericina A
IIb: Bacteriocinas com dois componentes
Lactococina G
IIc: Bacteriocinas sem péptido sinal
Classe III: Grandes
proteínas termolábeis
Classe IV:
Bacteriocinas circulares
SapB
Enterocina EJ97
IId: Outras bacteriocinas
Enterocina B
IIIa: Bacteriolíticas
Enterolisina A
IIIb: Não bacteriolíticas
Enterocina Bc-48
Estrutura circular
Enterocina AS-48
Gassericina A
2.4.2 Mecanismos de acção das bacteriocinas
Os mecanismos mais comuns utilizados pelas bacteriocinas para eliminar outros
microrganismos consistem na destruição de células alvo através da formação de poros
ou na inibição da síntese da parede celular (Hassan et al., 2012).
As bacteriocinas, e em particular os lantibióticos, inibem as células alvo por
formação de poros na membrana, esgotando o potencial transmembranar (∆ψ) e/ou o
gradiente de pH, resultando na perda de matéria celular (Cleveland et al., 2001). A
natureza dos poros, em termos de tamanho, estabilidade e condutividade de compostos
diferentes, podem diferir consideravelmente entre bacteriocinas (Eijsink et al. 2002;
Hassan et al., 2012). As bacteriocinas possuem frequentemente carga positiva com
zonas hidrofóbicas, pelo que as interacções electrostáticas com os grupos fosfato de
carga negativa das membranas contribuem para a ligação inicial com a célula alvo
25
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
(Cleveland et al., 2001; Chen e Hoover, 2003; Deegan et al., 2006; Hassan et al., 2012).
A porção hidrofóbica insere-se em direcção ao interior da membrana e origina a
formação de poros (Cleveland et al., 2001).
A condutividade e estabilidade dos poros induzidos pelos lantibióticos podem ser
aumentadas por moléculas de ligação, nomeadamente o lípido II (Chen e Hoover,
2003). O lípido II é um precursor peptidoglicano da parede celular e alguns lantibióticos
ligam-se a esta molécula inibindo a síntese da parede celular (Figura 2). Alguns
lantibióticos como a nisina possuem ambos os mecanismos de acção (formação de
poros e ligação ao lípido II), enquanto que a maioria apresenta apenas um mecanismo
de acção, como a lacticina 3147 com formação de poros e a mersacidina que actua
exclusivamente por ligação ao lípido II (Deegan et al., 2006).
Figura 2. Estrutura do complexo nisina-lípido II. (A) Interacção da nisina (verde) com o pirofosfato do
lípido II. (B) Pontes de hidrogénio (ponteado amarelo) entre a nisina e o pirofosfato do lípido II (esferas)
(adaptado de Kruijff et al., 2008).
As bacteriocinas da classe II actuam predominantemente através da formação de
poros, causando a dissipação do potencial de membrana, redução do ATP intracelular e
perda de aminoácidos e iões (Deegan et al., 2006). O sistema manose-fosfotransferase
(Man-PTS) é um tipo de receptor alvo usado por muitas bacteriocinas da classe IIa (e.g.
pediocina PA-1, enterocina P, enterocina A e sacacina P) e por algumas bacteriocinas da
classe IId (e.g. lactococina A e lactococina B). O sistema Man-PTS pertence a um grupo
de sistemas de transporte conhecidos como sistemas de fosfoenolpuruvato/carbohidrato
26
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
fosfotransferase (PTSs), que são caracterizados pela sua capacidade de fosforilar os
monossacáridos para o seu transporte transmembranar (Hassan et al., 2012).
Os principais constituintes do sistema PTS são: a enzima (EI), a proteína HPr, e
um complexo proteico carbohidrato específico conhecido como enzima II (EII) que é o
alvo das bacteriocinas da classe IIa. O complexo Man-PTS EII consiste em quatro
subunidades IIA, IIB, IIC e IID (Postma et al., 1993; Hassan et al., 2012). As
subunidades IIC e IID juntas formam um complexo localizado a nível trans-membranar,
enquanto que as subunidades IIA e IIB se situam na parte citoplasmática e são
indispensáveis para a função de receptor (Diep et al., 2007; Hassan et al., 2012).
As bacteriocinas da classe IIa ligam-se às proteínas do transportador Man-PTS
localizadas na membrana (IIC e IID). A ligação resultante provoca alterações na
conformação no sistema Man-PTS, que faz com que o transportador fique
irreversivelmente aberto, e desse modo provoca a perda de solutos celulares e
eventualmente a morte celular (Hassan et al., 2012).
A figura 3 ilustra o mecanismo de acção das bacteriocinas da classe I e II (nisina e
sacacina, respectivamente).
Figura 3. Modo de acção das bacteriocinas da classe I e II. A nisina interage com o lípido II, enquanto
que a sacacina liga-se ao sistema Man-PTS (Hill et al., 2011).
27
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
2.4.3 Auto-imunidade
Para se protegerem a si mesmas das suas próprias bacteriocinas, as estirpes
produtoras possuem genes que conferem auto-imunidade (Hassan et al., 2012). Dois
tipos de imunidade têm sido descritos para os lantibióticos: um tipo consiste na
expressão de uma proteína específica de imunidade, LanI, enquanto que o segundo tipo
depende de um transportador ABC (LanFEG). Alguns lantibióticos têm apenas a
proteína de imunidade única, embora outros possuam ambos mecanismos (Chen e
Hoover, 2003; Deegan et al., 2006).
Estes dois sistemas de imunidade trabalham sinergicamente para proteger as
células produtoras das suas próprias bacteriocinas. A proteína LanI, que está ligada à
parte exterior da membrana citoplasmática, confere imunidade às células produtoras
através do bloqueio da formação de poros pelas bacteriocinas. O LanFEG (transportador
ABC) actua transportando as moléculas das bacteriocinas que foram inseridas na
membrana citoplasmática de volta ao meio circundante e deste modo mantém a
concentração da bacteriocina na membrana abaixo do nível crítico (Chen e Hoover,
2003).
As bacteriocinas de classe II possuem geralmente uma proteína de imunidade
associada à membrana que proporciona uma imunidade completa (Deegan et al., 2006).
A interacção da proteína de imunidade com a membrana citoplasmática protege o
produtor contra a sua própria bacteriocina (Chen e Hoover, 2003).
2.4.4 Factores que afectam a eficiência das bacteriocinas
A actividade das bacteriocinas produzidas por diferentes BAL não é uniforme e
constante, dependendo da composição química e das condições físicas do alimento
(Cleveland et al., 2001; Balciunas et al., 2013). Esta actividade pode ser reduzida pela
ligação das bacteriocinas a componentes dos alimentos, adsorção às células ou
proteínas, actividade das proteases e/ou outras enzimas (Schillinger et al., 1996;
Balciunas et al., 2013).
Para além das interacções com os componentes dos alimentos, as bacteriocinas
podem ser afectadas pelas condições de processamento e de armazenamento do produto
como o pH e a temperatura (Deegan et al., 2006).
28
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
A eficiência inibitória das bacteriocinas também está relacionada com o nível de
contaminação do alimento com o organismo alvo. Se a contaminação inicial é muito
alta, a actividade da bacteriocina é incapaz de prevenir o desenvolvimento de
microrganismos contaminantes (Balciunas et al., 2013).
2.4.5 Aplicações das bacteriocinas na indústria alimentar
Actualmente os consumidores estão cada vez mais atentos ao risco que constitui a
presença de aditivos químicos e de microrganismos patogénicos nos alimentos,
estimulando-se assim o interesse pela procura de conservantes naturais (Balciunas et al.,
2013). Como resultado, os consumidores preferem alimentos naturais e frescos sem
conservantes químicos adicionados. Esta percepção, em conjunto com a exigência
crescente de alimentos minimamente processados com vida de prateleira prolongada,
tem estimulado a pesquisa para encontrar conservantes naturais e eficazes (Schillinger
et al., 1996; Chen e Hoover, 2003; Reis et al., 2012).
A bioconservação refere-se ao uso de microrganismos antagonistas, ou dos seus
produtos metabólicos, para inibir ou destruir microrganismos indesejáveis nos
alimentos, aumentar a segurança alimentar e prolongar a vida de prateleira (Abee et al.,
1995; Schillinger et al., 1996; Chen e Hoover, 2003). As bacteriocinas produzidas pelas
BAL, podem ser consideradas conservantes naturais que preenchem estes requisitos,
pois têm a capacidade de aumentar a segurança alimentar, reduzindo a prevalência de
doenças associadas à contaminação dos alimentos (Chen e Hoover, 2003; Deegan et al.,
2006).
Presentemente, a nisina e a pediocina PA-1 são as únicas bacteriocinas licenciadas
para utilização como conservantes alimentares (Martín-Belloso e Sobrino-López, 2008;
Balciunas et al., 2013).
É sugerido frequentemente que as bacteriocinas não devem ser usadas como a
primeira etapa de processamento ou barreira para prevenir o crescimento ou a
sobrevivência dos patógenos, mas certamente elas podem fornecer uma barreira
adicional para reduzir a possibilidade de doenças de origem alimentar (Deegan et al.,
2006).
29
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
Diferentes estratégias têm sido propostas para a aplicação das bacteriocinas nos
alimentos, baseadas na adição de preparações produzidas ex situ ou na produção in situ
pelas estirpes bacteriocinogénicas (Gálvez et al., 2008).
São usadas geralmente 3 formas de aplicação das bacteriocinas para a
bioconservação dos alimentos (Schillinger et al., 1996; Chen e Hoover, 2003):

Inoculação dos alimentos com BAL produtoras de bacteriocinas nos produtos. A
capacidade das BAL para crescer e produzir bacteriocinas nos produtos é crucial
para o seu uso com sucesso.

Adição de bacteriocinas purificadas ou semi-purificadas como conservantes
alimentares.

Uso de um produto previamente fermentado com uma estirpe produtora de
bacteriocinas como ingrediente do alimento.
As bacteriocinas produzidas ex situ podem também ser adicionadas como
preparações imobilizadas e incorporadas em embalagens bioactivas, proporcionando
novas formas de bioconservação (Chen e Hoover, 2003; Gálvez et al., 2007). Muitas
vezes as bacteriocinas são adicionadas com outras barreiras antimicrobianas para
aumentar os seus efeitos bactericidas (Leistner, 2000; Gálvez et al., 2007). Uma
alternativa à adição de bacteriocinas é a inoculação dos alimentos com uma estirpe
bacteriocinogénica apropriada para a produção de bacteriocinas in situ. Deste modo, as
estirpes bacteriocinogénicas podem ser usadas como culturas starter, adjuntas ou
protectoras, dependendo do tipo de alimento e objectivo (Holzapfel et al., 1995;
Rodgers, 2001; Deegan et al., 2006; Gálvez et al., 2008; Beshkova e Frengova, 2012).
Em alguns casos, a eficiência das bacteriocinas nos sistemas alimentares é
aparentemente limitado, actuando apenas com redução parcial nas contagens viáveis ou
na inibição do crescimento da bactéria alvo. Todavia, uma inibição parcial pode ser
suficiente para prolongar o tempo de prateleira dos alimentos sem comprometer as suas
propriedades organolépticas. Contudo, isto pode não ser suficiente para patógenos
alimentares, especialmente quando os limites exigidos por lei são tolerância zero, como
é o caso da L. monocytogenes. Nestes casos, as bacteriocinas podem ser muito úteis se
forem usadas em combinação com barreiras adicionais e se forem implementadas as
boas práticas de modo a manter os níveis de patógenos em valores suficientemente
baixos (Gálvez et al., 2008).
30
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
A produção de bacteriocinas in situ oferece mais vantagens quando comparada
com as preparações produzidas ex situ (Gálvez et al., 2008; Balciunas et al., 2013). No
entanto, é necessária uma selecção cuidadosa das estirpes de modo a garantir a sua
adaptação ao ecossistema particular do alimento (Reis et al., 2012). Devido ao aumento
da quantidade de alimentos conservados a temperaturas de refrigeração, é necessário o
uso de estirpes psicrotróficas produtoras de bacteriocinas, apresentando estas uma
grande vantagem durante o armazenamento refrigerado do alimento. A produção de
bacteriocinas in situ pode ainda contribuir para o domínio das estirpes produtoras sobre
outras BAL durante a fermentação do alimento, sendo muito importante, em particular
no caso das estirpes probióticas, para aumentar a sua prevalência nos alimentos
funcionais fermentados (Gálvez et al., 2008).
2.4.6 Aplicação das bacteriocinas nos lacticínios
No caso da indústria dos lacticínios, os principais patógenes bacterianos a
controlar são aqueles capazes de sobreviver e multiplicarem-se nos produtos crus e em
certos tipos de queijo, como a Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus,
Escherichia coli e a Salmonella spp. (De Buyser et al., 2001; Gálvez et al., 2008; Pinto
et al., 2009). No quadro 3 estão indicadas as principais aplicações potenciais das
bacteriocinas no leite e produtos lácteos.
Os produtos lácteos constituem uma das principais aplicações de algumas das
bacteriocinas já isoladas e identificadas, como a nisina, lacticina 3147 e pediocina PA-1.
2.4.6.1 Nisina
A nisina é um péptido antimicrobiano natural produzido pelo Lactococcus lactis
subsp. lactis que, além de inibir o crescimento de bactérias Gram-positivas, inibe
também o crescimento de esporos de bacilos e clostrídios (Black et al., 2005; Arauz et
al., 2009). A nisina é uma das duas únicas bacteriocinas aprovadas para aplicação nos
alimentos e tem sido muito usada na indústria alimentar (Arauz et al., 2009).
A nisina está disponível num concentrado seco em pó designado de Nisaplin
(Danisco), tendo sido aprovada para a lista de aditivos alimentares Europeia no início
dos anos 80, tendo sido atribuído o número E234. Desde então recebeu o estatuto
GRAS pela FDA (Food and Drug Administration), e é a única bacteriocina que foi
31
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
aprovada pela organização mundial de saúde para uso como conservante alimentar
(Sobrino-López e Martín-Belloso 2008; Mills et al., 2011b).
Uma das primeiras aplicações da nisina consistiu no controlo da formação de gás
no queijo causada pelo Clostridium tyrobutyricum. Outras aplicações da nisina incluem
a sua utilização em queijos processados e seus derivados para prevenir a proliferação de
formadores de esporos sobreviventes à pasteurização, assim como o controlo de outras
bactérias contaminantes pós-processamento como a Listeria monocytogenes (Gálvez et
al., 2008).
2.4.6.2 Lacticina 3147
A lacticina 3147 é uma bacteriocina com grande potencial para aplicação na
conservação dos produtos lácteos. A aplicação de starters produtores de lacticina 3147
tem sido proposta para aumentar a qualidade do queijo através da inibição da flora
NSLAB durante a maturação, inibir as bactérias patogénicas em alimentos fermentados
e não fermentados e prolongar a vida de prateleira de alguns produtos alimentares
(Guinane et al., 2005; Gálvez et al., 2008).
2.4.6.3 Pediocina PA-1
A pediocina PA-1 é uma bacteriocina com elevada actividade anti-listéria e é
produzida por algumas estirpes de pediococos. A aplicação de pediococos em
fermentações do leite é limitada devido à sua incapacidade de fermentar rapidamente a
lactose, que resulta em crescimento lento no leite e nos produtos lácteos (Rodríguez et
al., 2005; Renye Jr. et al., 2011). Deste modo, as BAL têm sido consideradas como
potenciais hospedeiras para a produção heteróloga da pediocina (Renye Jr. et al., 2011).
32
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
Quadro 3. Aplicações potenciais das bacteriocinas no leite e produtos lácteos (Gálvez et al., 2008).
Produtos/matéria crua

redução do crescimento microbiano em leite cru

inactivação das bactérias mesofílicas no leite em combinação com campos
eléctricos pulsados (Pulsed Electric Fields - PEFs) ou com pressão hidroestática
elevada (High Hidrostatic Pressure - HHP)
Produtos fermentados

inibição da formação de gás pelo C. tyrobutyricum em queijos duros e semiduros

inibição as bactérias patogénicas e tóxicas (L. monocytogenes, B. cereus, S.
aureus) nos queijos e na superfície do queijo

Inactivação das bactérias mesofílicas e da formação de endosporos em queijo
em combinação com pressão hidroestática elevada (High Hidrostatic Pressure HHP)

controlo da acidificação no iogurte e outros produtos fermentados

uso de estirpes produtoras de bacteriocinas como culturas starter ou adjuntas
para inibir as bactérias patogénicas e deteriorantes no queijo e em outros
produtos lácteos fermentados

acelerar a cura dos queijos através da libertação de enzimas intracelulares
bacterianas

uso de culturas starter produtoras de bacteriocinas para inibir a microflora das
BAL não starter adventícias/acidentais no queijo
Produtos processados

inibição dos produtores de endosporos em queijo processado e noutros produtos
lácteos processados

inibir a L. monocytogenes nos produtos lácteos após contaminação pósprocessamento
33
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Isolados em estudo
A amostra global consistiu em 116 isolados de bactérias do ácido láctico do queijo
do Pico. As amostras foram colhidas em 3 locais de produção (A, B e C), em dois
períodos diferentes (lotes), e correspondem ao 1º e 21º dia de maturação.
3.2 Screening das BAL produtoras de bacteriocinas
3.2.1 Actividade antimicrobiana
A actividade antimicrobiana das BAL foi determinada pelo método de difusão em
agar - técnica dos poços, segundo a metodologia de Tagg e McGiven (1971). Este
estudo foi realizado com as seguintes bactérias de referência: Listeria monocytogenes
ATCC 7466, Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 29523,
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 e Clostridium perfringens ATCC 8357.
As bactérias de referência (culturas alvo) foram inoculadas em Nutrient Broth
(AES, França) e incubadas durante 18 horas a 37 °C.
As BAL foram inoculadas em MRS Broth (AES, França) e incubadas durante 72
horas a 30 °C. Após este período centrifugou-se (Centrifuge 5804R, Eppendorf,
Alemanha) a 4000 × g durante 10 minutos a 4 °C, de modo a obter o sobrenadante. De
seguida foram filtrados com filtros de 0,20 μm (Sartorius Stedim Biotech, Alemanha).
Os sobrenadantes foram neutralizados com NaOH 1N ajustando o pH para 6,5 7,0. Destes sobrenadantes retirou-se uma alíquota de 1 ml e adicionou-se de seguida
catalase de origem bovina (EC 1.11.1.6, 5 mg/ml) deixando actuar durante 1 hora a
37 °C.
As culturas dos microrganismos alvo foram diluídas em Nutrient Broth (AES,
França) de modo a atingir o valor de 0,5 na escala de McFarland. De seguida, pipetouse 100 μl da cultura diluída para 200 ml de Plate Count Agar (AES, França). Distribuise o meio por placas de Petri e deixou-se solidificar. Foram feitos os poços com 6 mm
de diâmetro e selou-se o fundo destes com Pastagar B (AES, França). Para cada BAL
foram testados a cultura pura sem tratamento, o sobrenadante, o sobrenadante
34
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
neutralizado e o sobrenadante neutralizado com adição de catalase. O meio de MRS
Broth foi usado como controlo negativo. Pipetou-se 60 μl de amostra em cada poço.
As placas foram mantidas em refrigeração (4 °C) durante 4 horas e de seguida
incubadas a 37 °C durante 12 horas. A leitura dos resultados foi feita com o auxílio de
uma craveira digital (Absolute Digimatic, Mitutoyo, Inglaterra) para medir os halos de
inibição. Este teste foi realizado em duplicado.
3.2.2 Concentração mínima inibitória
A concentração mínima inibitória (CMI) das BAL foi determinada segundo o
método "spot-on-lawn" adaptado de Mills et al. (2011a). A determinação da CMI foi
realizada com a Listeria monocytogenes ATCC 7466 plaqueada de acordo com a
descrição anterior (secção 3.2.1). Para a determinação da CMI foram feitas várias
diluições do sobrenadante neutralizado e filtrado em Buffered Peptone Water (AES,
França). De seguida pipetou-se 5 μl de cada diluição directamente nas placas.
A CMI também foi realizada pela técnica dos poços descrita na secção 3.2.1.
Foram feitas várias diluições do sobrenadante neutralizado e livre de células em
Buffered Peptone Water (AES, França) e pipetou-se 60 μl de cada diluição nos poços.
As placas foram mantidas em refrigeração (4 °C) durante 4 horas e de seguida
incubadas a 37 °C durante 12 horas. A actividade das bacteriocinas foi definida como o
recíproco da maior diluição onde se observou uma zona de inibição distinta, e foi
expressa em unidades arbitrárias (UA) por mililitro (Ghalfi et al., 2010). Este teste foi
realizado em duplicado.
3.3 Identificação das BAL produtoras de bacteriocinas
3.3.1 Identificação fenotípica
Para a identificação fenotípica das BAL foi utilizado o kit API 50 CH (bioMérieux SA).
O API 50 CH é um sistema padronizado que associa 50 testes bioquímicos para o
estudo da fermentação de substratos pertencentes à família dos glúcidos e derivados
(heterósidos, polialcoois, ácidos urónicos).
35
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
Cada isolado foi previamente inoculado em MRS Broth (AES, França) durante 24
horas a 30 °C. Para cada isolado foi feita uma suspensão em API 50 CHL Medium (2
ml) para uma densidade óptica de 5 na escala de McFarland. De seguida, foi feita a
preparação das galerias colocando cerca de 10 ml de água destilada nos álveolos do
fundo e depois colocou-se as tiras no fundo da caixa de incubação. Distribui-se a
suspensão bacteriana pelas 50 cúpulas. As galerias foram incubadas durante 48 horas a
30 °C. Por fim anotou-se o resultado das reacções consoante a cor da cúpula e foi feita a
leitura com recurso ao api web.
3.3.2 Identificação genética
As BAL produtoras de bacteriocinas foram identificadas por biologia molecular sequenciação do gene 16S rRNA. O DNA genómico total foi extraído e purificado
usando o UltraClean® Microbial DNA Isolation Kit (MoBio, Carlsbad, CA). Os
fragmentos de aproximadamente 1388 pares de bases da região 16S rRNA foram
amplificados por reacção em cadeia da polimerase (PCR) utilizando primers universais
46F
(5´-GCYTAAYACATGCAAGTCG-3´)
e
1409R
(5´-
GTGACGGGCRGTGTGTRCAA-3´).
As sequências do gene 16S rRNA foram analisadas e determinadas pelo programa
BLAST no website NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
3.4 Caracterização tecnológica das BAL produtoras de bacteriocinas
3.4.1 Actividades enzimáticas
Para a determinação das actividades enzimáticas presentes nas BAL foi utilizado o
kit APIZYM (bio-Mérieux SA) que é um micro-método semi-quantitativo de detecção
de enzimas activos (Quadro 4).
Cada isolado foi previamente inoculado em MRS Broth (AES, França) durante 24
horas a 30 °C. Para cada isolado foi feita uma suspensão em API Suspension Medium (2
ml) de modo a ajustar-se a densidade óptica para valores 5 - 6 na escala de McFarland.
De seguida, foi feita a preparação das galerias colocando cerca de 5 ml de água
destilada nos alvéolos do fundo, colocando-se depois a galeria no fundo da caixa de
incubação. Com o auxílio de uma micropipeta pipetou-se 65µl de suspensão bacteriana
36
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
pelas 20 cúpulas. As galerias foram incubadas durante 4 horas e 30 minutos a 37 °C.
Passado o período de incubação, adicionou-se a cada uma das cúpulas 1 gota de
reagente ZYM A e 1 gota de reagente ZYM B. Deixou-se as colorações desenvolveremse durante 5 minutos e em seguida expôs-se a galeria durante 10 segundos a uma
lâmpada de 1000W. Por fim, realizou-se o registo dos resultados consoante a
intensidade da cor obtida, tendo sido usado um quadro de leitura que tinha uma escala
de 0 a 5 em que 0, 1 e 2 são reacções negativas sendo os números 3, 4 e 5 para as
reacções positivas.
Quadro 4. Enzimas e substratos do kit APIZYM.
Cúpula
Enzima detectada
Substrato
1
Fosfatase alcalina
2-naftil fosfato
2
Esterase (C4)
2-naftil butirato
3
Esterase Lipase (C8)
2-naftil caprilato
4
Lipase (C14)
2-naftil miristato
5
Leucina arilamidase
L-leucil-2-naftilamida
6
Valina arilamidase
L-valil-2-naftilamida
7
Cistina arilamidase
L-cistil-2-naftilamida
8
Tripsina
N-benzoil- DL-arginina-2-naftilamida
9
α-quimotripsina
N-glutaril-fenilalanina-2-naftilamida
10
Fosfatase ácida
2-naftil fosfato
11
Naftol-AS-BI-fosfohidrolase
Naftol-AS-BI-fosfato
12
α-galactosidase
6-Br-2-naftil-αD-galactopiranosida
13
β-galactosidase
2-naftil-βD-galactopiranosida
14
β-glucuronidase
Naftol-AS-BI-βD-glucuronida
15
α-glucosidase
2-naftil-αD-glucopiranosida
16
Β-glucosidase
6-Br-2-naftil-βD-glucopiranosida
17
N-acetil-β-glucosaminidase
1-naftil-N-acetil-βD-glucosaminida
18
α-manosidase
6-BR-2-naftil-αD-manopiranosida
19
α-fucosidase
2-naftil-αL-fucopiranosida
37
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
3.4.2 Produção de diacetilo a partir do citrato
Foi determinada a produção de diacetilo a partir do citrato segundo a metodologia
de King (1948). As bactérias do ácido láctico foram inoculadas em MRS Broth (AES,
França) e foram colocadas numa estufa a 30 °C durante 24 horas. Foram depois
centrifugadas a 2300 × g durante 5 minutos (Centrifuge 5415 D, Eppendorf, Alemanha).
O precipitado (BAL) foi lavado com Buffered Peptone Water (AES, França),
novamente centrifugado a 2300 × g durante 5 minutos e por fim ressuspendido em
Buffered Peptone Water (AES, França). De seguida as BAL foram inoculadas (1% v/v)
em 5 ml de leite gordo UHT. Após uma incubação de 24 horas a 30 °C, retirou-se 1 ml
da suspensão de BAL, adicionando-se 0,5 ml de uma solução de α-naftol (1% v/v) e 0,5
ml de KOH (16% v/v). Esta mistura foi a incubar a 30 °C durante 10 minutos.
A formação de um anel vermelho/rosa no topo dos tubos de ensaio demonstra que
existe produção de diacetilo a partir do citrato. O teste foi feito em duplicado.
3.4.3 Actividade proteolítica
Para determinação da actividade proteolítica, as BAL foram inoculadas em MRS
Broth (AES, França) durante 24 horas a 30 °C. Preparou-se o meio de Plate Count Agar
(AES, França) e adicionou-se 10% de Skim Milk (Oxoid, Inglaterra). Com o auxílio de
uma zaragatoa inoculou-se o meio à superfície e de seguida as placas foram a incubar
durante 72 horas a 30 °C. Para a leitura dos resultados inundou-se as placas com HCl a
1% durante 1 minuto e depois escorreu-se o líquido. A presença de um halo transparente
em torno das colónias significa que existe actividade proteolítica (Franciosi et al.,
2009). O teste foi feito em duplicado.
3.4.4 Actividade lipolítica
Para avaliar a actividade lipolítica, as BAL foram inoculadas em MRS Broth
(AES, França) durante 24 horas a 30 °C. Preparou-se o meio de Tributyrin agar (Merck,
Alemanha) e com o auxílio de uma zaragatoa semeou-se a superfície do meio, levandose de seguida as placas a incubar durante 72 horas a 30 °C. Foi usado como controlo
positivo a Pseudomonas aeruginosa. A presença de um halo transparente em torno das
colónias indica que existe actividade lipolítica (Hantsis-Zacharov e Halpern, 2007). O
teste foi feito em duplicado.
38
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
3.5 Avaliação da segurança
3.5.1 Produção de histamina
A produção de histamina foi determinada segundo a metodologia de Joosten e
Northolt (1989), onde se utilizou um meio diferencial com a seguinte composição: 0,5%
de triptona (AES, França), 0,5% de extracto de levedura (AES, França), 0,5% de NaCl
(Merck, Alemanha), 0,1% de glucose (Merck, Alemanha), 0,05% de tween 80 (VWR,
EUA), 0,02% de MgSO4.7H2O (Merck, Alemanha), 0,01% de CaCO3 (Merck,
Alemanha), 0,006% de púrpura de bromocresol (Merck, Alemanha), 0,005% de
MnSO4.4H2O (Merck, Alemanha), 0,004% de FeSO4.7H2O (Merck, Alemanha) e 2%
de histidina (Merck, Alemanha). A única diferença na composição deste meio em
relação ao original, foi a ausência de agar pois foi feito em meio líquido. Acertou-se o
pH para 5,0 ± 0,1 e de seguida o meio foi esterilizado durante 10 minutos a 121 °C.
Também foi feito do mesmo modo um meio sem histidina. Colocou-se as BAL a crescer
em MRS Agar (Biokar) durante 24 horas a 30 °C. Procedeu-se depois à inoculação das
BAL em tubos contendo 2 ml de meio (para cada BAL 2 tubos com histidina e 2 tubos
sem histidina). De seguida cobriu-se com óleo de parafina e incubou-se as BAL a 30 °C
durante 48 horas. Nos casos em que se obtiveram resultados negativos, prolongou-se o
tempo de incubação até aos 7 dias a 30 °C. Após a incubação registou-se a cor do meio.
O meio de cor amarela significa que as bactérias não são produtoras de histamina e o
meio roxo significa que as bactérias são produtoras de histamina. O teste foi feito em
duplicado.
3.5.2 Actividade hemolítica
Para avaliar a actividade hemolítica, as BAL foram inoculadas em MRS Broth
(AES, França) durante 24 horas a 30 °C. Preparou-se o meio de agar-sangue a partir de
Tryptose Blood Agar Base (Merck, Alemanha) com adição de 7% de sangue de bovino
e distribui-se por placas de petri. Com o auxílio de uma zaragatoa semeou-se a
superfície do meio e de seguida incubou-se as placas durante 48 horas a 37 °C. A
presença de um halo transparente em torno das colónias corresponde a uma hemólise β,
quando existe um halo esverdeado em torno das colónias significa que é hemólise α e
por fim se não existe halo em torno das colónias trata-se de uma hemólise γ (Asteri et
39
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
al., 2009). Foi usado como controlo positivo a estirpe Staphylococcus aureus ATCC
29523 que é β-hemolítica. O teste foi realizado em duplicado.
3.5.3 DNase
A produção da enzima DNase foi determinada em meio de DNase Test Agar
(Sigma-Aldrich, EUA). As BAL foram inoculadas em meio de MRS Broth (AES,
França) durante 24 horas a 30 °C. Com o auxílio de uma zaragatoa semeou-se a
superfície do meio e de seguida incubou-se as placas durante 48 horas a 37 °C. Foi
usado como controlo positivo a estirpe Staphylococcus aureus ATCC 29523. A
presença de um halo rosado em torno das colónias significa que existe produção da
enzima (Gupta e Malik, 2007). O teste foi feito em duplicado.
3.5.4 Gelatinase
A pesquisa da produção da enzima gelatinase foi realizada segundo a metodologia
de Terzic-Vidojevic et al. (2009). Preparou-se um meio de cultura com 5 g de peptona
(Fluka, EUA), 3 g de extracto de levedura (AES, França), 30 g de gelatina (Biolife,
Itália), 17 g de agar (AES, França) e 1000 ml de água destilada. Acertou-se o pH para
7,0 e de seguida foi feita a esterilização em autoclave (121 °C, 15 minutos),
distribuindo-se depois o meio em placas de Petri. As BAL foram inoculadas em meio de
MRS Broth (AES, França) durante 24 horas a 30 °C. Com o auxílio de uma zaragatoa
semeou-se a superfície do meio com cada BAL e de seguida incubou-se as placas
durante 48 horas a 37 °C. Foi usado como controlo positivo a estirpe Staphylococcus
aureus ATCC 29523. Após este tempo, as placas foram inundadas com uma solução
saturada de sulfato de amónio (Merck, Alemanha). A existência de um halo transparente
em torno das colónias foi considerado uma reacção positiva. O teste foi realizado em
duplicado.
3.5.5 Resistência a antibióticos
A resistência aos antibióticos foi feita segundo o método de difusão em agar de
Kirby-Bauer. Inoculou-se 100 µl de BAL em 5 ml de MRS Broth (AES, França) e
incubou-se a 30 °C durante 24 - 48 horas. Ao fim desse tempo, fez-se o acerto da
turvação para 5 na escala de McFarland e retirou-se 200 µl para um novo tubo com 5
40
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
ml de MRS Broth (AES, França). Desse tubo pipetaram-se 400 μl para três tubos que
continham 5 ml de MRS Broth (AES, França). Em seguida, dividiu-se o conteúdo de
cada um dos tubos por 2 placas contendo Müller-Hinton Agar (AES, França). Esperouse cerca de 25 minutos para que o agar absorvesse algum do líquido. Deitou-se fora o
excesso e deixou-se secar bem as placas durante 1 hora na câmara de fluxo laminar. Por
último, com o auxílio de uma pinça estéril, aplicou-se sobre o meio os discos com os
antibióticos.
Foram testados 22 antibióticos (Oxoid, Inglaterra): ácido nalidíxico, ofloxacina,
amoxicilina/ácido clavulânico 2:1, carbenicilina, penicilina, piperacilina, canamicina,
estreptomicina,
gentamicina,
netilmicina,
tobramicina,
cefalotina,
cefotaxima,
ceftazidima, ceftriaxona, clindamicina, cloranfenicol, eritromicina, rifampicina,
sulfametoxazol/trimetoprim, tetraciclina e vancomicina.
Os discos foram colocados de modo a que não existisse sobreposição das zonas de
inibição. Incubou-se a 30 °C por 24 - 48 horas. Por fim, mediram-se as zonas de
inibição por meio de uma craveira digital, incluindo o diâmetro do disco. Os testes
foram feitos em duplicado.
Para a interpretação dos resultados, consultaram-se os valores de referência
(Quadro 5). As BAL foram classificadas em 3 categorias consoante o diâmetro do halo
de inibição: Resistente (R), Sensibilidade Intermédia (I) e Sensível (S).
41
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
Quadro 5. Valores de referência para as leituras dos antibiogramas (Adaptado de CLSI, 2010, 2011 e
CSFM, 2010)
Diâmetros críticos
Código
Nome
Família/Grupo
Quantidade
Por disco
(mm)
R
I
S
NA30
Àcido Nalidíxico
Quinolonas
30 µg
<15
15-19
≥20
OFX5
Ofloxacina
Fluoroquinolonas
5 µg
<22
22-24
≥25
Penicilinas
20/10 µg
<16
16-22
≥23
AMC30
Amoxicilina/Ácido
Clavulânico 2:1
CAR100
Carbenicilina
Penicilinas
100 µg
<18
18-21
≥22
P10
Penicilina
Penicilinas
10 UI
≤14
-
≥15
PRL100
Piperacilina
Penicilinas
100 µg
≤14
-
≥15
K30
Canamicina
Aminoglicosídeos
30 µg
<15
15-16
≥17
S10
Estreptomicina
Aminoglicosídeos
10 µg
<13
13-14
≥15
CN10
Gentamicina
Aminoglicosídeos
10 µg
<16
16-17
≥18
NET30
Netilmicina
Aminoglicosídeos
30 µg
<19
19-20
≥21
TOB10
Tobramicina
Aminoglicosídeos
10 µg
<16
16-19
≥18
KF30
Cefalotina
Cefalosporinas
30 µg
<12
12-17
≥18
CTX30
Cefotaxima
Cefalosporinas
30 µg
<23
23-27
≥26
CAZ30
Ceftazidima
Cefalosporinas
30 µg
<19
19-20
≥21
CRO30
Ceftriaxona
Cefalosporinas
30 µg
<23
23-25
≥26
DA2
Clindamicina
Lincosamidas
2 µg
<15
-
≥15
C30
Cloranfenicol
Fenicóis
30 µg
≤12
13-17
≥18
E15
Eritromicina
Macrólidos
15 µg
≤13
14-22
≥23
RD5
Rifampicina
Ansamicinas
5 µg
≤16
17-19
≥20
<10
10-17
≥16
SXT25
Sulfametoxazol/
Trimetoprim
Sulfamidas
1,25/23,75µ
g
TE30
Tetraciclina
Tetraciclinas
30 µg
≤14
15-18
≥19
VA30
Vancomicina
Glicopéptideos
30 µg
≤14
15-16
≥17
42
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
3.6 Avaliação da produção de bacteriocinas em queijo fresco
3.6.1 Elaboração do queijo fresco com as BAL
Procedeu-se inicialmente ao crescimento das BAL em MRS Broth (AES, França)
durante 24 horas a 30 °C. De seguida pipetou-se 100 μl de BAL para 100 ml de leite
magro UHT e incubou-se a 30 °C durante 48 horas.
Para a elaboração do queijo fresco utilizou-se leite gordo obtido na empresa
Chegalvorada (granja da Universidade). Este leite foi pasteurizado no laboratório da
seguinte forma: aqueceu-se o leite a 73 °C durante 16 s, passando-se imediatamente
para um banho com gelo. Após arrefecimento, adicionou-se 0,02% de CaCl2 e 1% de
NaCl ao leite. Após aquecimento a 32 °C, o leite foi inoculado com as culturas BAL
(1%) e foi adicionado o coalho (LMF 1/15,000; 0,2g/L). Após 40 minutos cortou-se a
coalhada em cubos de 2 cm, e aumentou-se a temperatura para 37 °C durante 25
minutos. Passado este tempo escorreu-se o soro e colocou-se a coalhada em cinchos de
6,5 cm de diâmetro. Os queijos foram armazenados à temperatura de 4 °C.
3.6.2 Determinação do pH do queijo
A determinação do pH foi realizada com o auxílio de um potenciómetro (WTW
Inolab pH Level 1, Alemanha), por penetração do eléctrodo directamente no queijo. As
leituras do pH foram feitas às 0, 6, 24, 48 e 72 horas.
3.6.3 Acidez titulável
Para determinação da acidez titulável retirou-se uma amostra de 4 g de queijo e
adicionou-se água destilada morna (40 °C) até perfazer o volume final de 42 ml,
agitando-se muito bem de modo a ficar bem misturado. De seguida filtrou-se em papel
de filtro, retirou-se 25 ml do filtrado e adicionou-se 500 μl de solução de fenolftaleína.
Por fim, foi feita a titulação com NaOH 0,1M até se observar uma cor rosada. A acidez
titulável foi realizada às 0, 6, 24, 48 e 72 horas. A acidez titulável foi calculada do
seguinte modo: 1 ml de NaOH 0,1M corresponde a 0,0090 g de ácido láctico (Kirk e
Sawyer, 1991).
43
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
3.6.4 Determinação da humidade
Para a determinação da humidade pesou-se 3 g de queijo em recipientes apropriados e
colocou-se numa estufa a 103 °C durante 24 horas. Passado esse tempo, colocaram-se as
amostras num excicador durante 30 minutos para arrefecerem e pesaram-se novamente.
A análise foi feita em triplicado.
3.6.5 Contagens das BAL no queijo
As contagens das BAL no queijo fresco foram feitas por plaqueamento no meio
KF (Biokar, França) para os isolados (L2B21K3, L3A21K6, L3A21K7 e L3B1K3) e
M17 (Biokar, França) para os isolados (L3A1M6, L3A21M1, L3A21M3 e L3A21M8),
às 0, 6, 24, 48 e 72 horas.
Retirou-se uma amostra de 25g de queijo e adicionou-se 225 ml de Buffered
Peptone Water (AES, França), misturando-se no Stomacher (400 Circulator) durante 2
minutos a 230 rpm. Foram feitas diluições decimais e procedeu-se ao plaqueamento por
incorporação no meio KF (Biokar, França) e M17 (Biokar, França) conforme os
isolados. As placas com KF (Biokar, França) foram a incubar a 30 °C durante 48 horas,
enquanto que as placas com M17 (Biokar, França) foram a incubar a 30 °C durante 72
horas. Passado este tempo foram feitas as contagens. As contagens foram realizadas em
duplicado.
3.6.6 Determinação da actividade antimicrobiana no queijo
A cultura da bactéria alvo de referência foi inoculada em Nutrient Broth (AES,
França) e incubada durante 18 horas a 37 °C.
As amostras de queijo foram centrifugadas (Centrifuge 5415D, Eppendorf,
Alemanha) a 4500 × g durante 10 minutos, de modo a obter-se o sobrenadante. De
seguida, os sobrenadantes foram neutralizados com a adição de tampão fosfato 0,5 M a
pH 7,0 e passados por filtros de 0,20 μm (Sartorius Stedim Biotech, Alemanha).
A actividade antimicrobiana (anti-listéria) destes sobrenadantes foi determinada
pelo método de difusão em agar em poços, conforme referido na secção 3.2.1. Este teste
foi realizado em duplicado.
44
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
A concentração mínima inibitória (CMI) dos sobrenadantes do queijo fresco foi
realizada de acordo com a secção 3.2.2, excepto na preparação da amostra.
A actividade antimicrobiana das BAL no queijo fresco foi ainda determinada
introduzido directamente uma alíquota de queijo fresco nos poços, seguindo-se o
procedimento descrito na secção 3.2.1.
3.6.7 Provas organolépticas
Foram realizadas provas organolépticas dos queijos preparados com as BAL
produtoras de bacteriocinas. Utilizou-se um painel de 50 a 52 provadores não treinados
(duas sessões) que realizaram as provas organolépticas cegas em dois dias distintos,
testando em cada sessão, um total de 5 queijos (4 queijos com BAL e um controlo).
Foram avaliados 5 parâmetros: acidez, teor de sal, firmeza, cheiro e apreciação global
dos queijos, numa escala de 1 a 5, em que 1 indica a pontuação mais baixa para os
diferentes critérios: o queijo menos ácido, menos salgado, mais mole, menos aroma e
menos apreciado; e o 5 indica a pontuação mais elevada para os mesmos parâmetros: o
queijo muito ácido, muito salgado, muito firme, aroma muito intenso e muito apreciado.
No anexo I encontra-se um exemplar da folha preenchida por cada provador. De modo a
facilitar o tratamento de dados, a pontuação atribuída por cada provador foi
posteriormente classificada em três níveis: nível inferior I (pontuações 1 e 2), nível
médio II (pontuação 3) e nível superior III (pontuações 4 e 5).
3.7 Avaliação do efeito das BAL no crescimento de Listeria monocytogenes em
queijo fresco
3.7.1 Elaboração do queijo fresco com BAL e Listeria monocytogenes
Procedeu-se inicialmente ao crescimento das BAL em MRS Broth (AES, França)
durante 24 horas a 30 °C. De seguida, pipetou-se 100 μl de BAL para 100 ml de leite
magro UHT e colocou-se a incubar a 30 °C durante 48 horas.
A Listeria monocytogenes ATCC 7466 foi inoculada em Nutrient Broth (AES,
França) e incubada durante 18 horas a 37 °C.
A L. monocytogenes foi centrifugada (Centrifuge 5415D, Eppendorf, Alemanha)
durante 10 minutos a 5900 × g, lavada duas vezes com água peptonada (Buffered
45
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
Peptone Water, AES, França) e ressuspensa em água peptonada. De seguida foram
feitas diluições decimais de modo a obter-se 106 ufc ml-1 (1,0 na escala de McFarland).
Para a elaboração do queijo fresco utilizou-se leite de vaca pasteurizado (leite da
empresa Chegalvorada - granja Universitária pasteurizado a 73 °C/16 s) contendo
0,02% de CaCl2 e 1% de NaCl. Aqueceu-se o leite a 32 ºC e de seguida este foi
inoculado com as culturas BAL (1%) e a Listeria monocytogenes (1% ou 0,1%).
Passados 20 minutos foi adicionado o coalho (LMF 1/15,000; 0,2g/L). Após 40 minutos
cortou-se a coalhada em cubos de 2 cm, e aumentou-se a temperatura para 37 °C
durante 25 minutos. Passado este tempo escorreu-se o soro e colocou-se a coalhada em
cinchos. Os queijos foram armazenados à temperatura de 4 °C.
3.7.2 Avaliação do crescimento de listéria no queijo fresco
As contagens de L. monocytogenes foram feitas por plaqueamento em meio de
Palcam (AES, França), às 0, 6, 24, 48, 72 e 168 horas (no primeiro ensaio),
prolongando-se até às 360 horas nos ensaios posteriores. Retirou-se uma amostra de 25
g de queijo e adicionou-se 225 ml de água peptonada (AES, França), misturado-se no
Stomacher (400 Circulator) durante 2 minutos a 230 rpm. Foram feitas diluições
decimais e procedeu-se ao plaqueamento por incorporação no meio de Palcam (AES,
França). De seguida as placas foram a incubar a 37 °C durante 48 horas. Após este
tempo foram realizadas as contagens em duplicado.
3.8 Análise estatística
A análise estatística das provas organolépticas foi realizada pelo teste do Quiquadrado. Nos casos em que mais de 20% das células apresentaram uma frequência
esperada inferior a 5% utilizou-se o Fisher Exact Test. Foi também realizada a
correlação não paramétrica de Spearman entre a firmeza e apreciação global. Todas as
análises estatísticas foram realizadas com o programa IBM SPSS Statistics 20.
46
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Actividade antimicrobiana das BAL
Os sobrenadantes neutralizados de oito isolados produziram zonas de inibição
contra a Listeria monocytogenes e destas, três produziram também zonas de inibição
contra o Clostridium perfringens (Quadro 6). Não foi observada actividade
antimicrobiana contra as outras bactérias testadas.
Quadro 6. Detecção da actividade antimicrobiana contra a L. monocytogenes e C. perfringens.
Estirpes de referência
Isolados
L. monocytogenes
C. perfringens
L2B21K3
+
+
L3A1M6
+
+
L3A21M1
+
-
L3A21M3
+
-
L3A21M8
+
-
L3A21K6
+
+
L3A21K7
+
-
L3B1K3
+
-
(+) com zona de inibição, (-) sem zona de inibição
De um modo geral, as bacteriocinas produzidas pelas BAL actuam contra
bactérias Gram-positivas, taxonomicamente próximas, e não apresentam actividade
contra bactérias Gram-negativas (Collins et al., 2010). Neste estudo, este facto foi
confirmado pois ambas as bactérias Gram-negativas testadas, Escherichia coli e
Pseudomonas aeruginosa, não foram sensíveis à produção de bacteriocinas.
Analogamente, não se observou actividade antimicrobiana contra o Staphylococcus
aureus apesar de este microrganismo ser Gram-positivo.
A actividade antimicrobiana verificada nos sobrenadantes neutralizados livres de
células e com adição de catalase, significa que a actividade observada é devida às
bacteriocinas e não a outros mecanismos de inibição como a produção de ácido e de
peróxido de hidrogénio. A actividade dos sobrenadantes neutralizados manteve-se a
47
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
temperaturas elevadas (100 °C durante 60 min.) e foi eliminada na presença de
proteases (testes não apresentados), confirmando a identidade proteica do/s agente/s
antimicrobiano/s.
Cinco isolados apresentaram o valor mais elevado para a concentração mínima
inibitória (CMI) pela técnica spot-on-lawn que corresponde a 3200 UA ml-1. Um dos
isolados (L3A21M3) apresentou um valor baixo de CMI de 200 UA ml-1 (Quadro 7).
Pela técnica dos poços o valor mais elevado de CMI foi detectado nos mesmos quatro
isolados da técnica anterior, mas correspondendo ao valor de 533 UA ml-1 (Quadro 7).
O valor mais baixo de CMI obtido pela técnica dos poços (33 UA ml-1) foi igualmente
observado no mesmo isolado (L3A21M3).
Quadro 7. Valores da CMI dos isolados produtores debacteriocinas contra a L. monocytogenes.
Técnica spot-on-lawn
Técnica dos poços
Isolados
Diluição
UA ml-1
Diluição
UA ml-1
L2B21K3
1:16
3200
1:32
533
L3A1M6
1:16
3200
1:16
267
L3A21M1
1:4
800
1:8
133
L3A21M3
1
200
1:2
33
L3A21M8
1:8
1600
1:16
267
L3A21K6
1:16
3200
1:32
533
L3A21K7
1:16
3200
1:32
533
L3B1K3
1:16
3200
1:32
533
Apesar de na técnica dos poços a maioria dos isolados apresentarem halos de
inibição em diluições mais altas, os respectivos valores de CMI foram inferiores aos da
técnica spot-on-lawn. Isto deve-se ao volume de amostra pipetado, pois na técnica spoton-lawn o volume foi de 5 μl quando na outra técnica foi de 60 μl. Na técnica dos
poços, como o volume foi maior, está presente uma maior quantidade de bacteriocinas a
actuar e deste modo surgem halos de inibição em diluições mais altas. No entanto, como
as unidades arbitrárias (UA) são calculadas com base no volume aplicado, constatou-se
que o volume de amostra foi determinante para os valores de CMI.
48
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
Os resultados de CMI deste trabalho são comparáveis aos obtidos por outros
estudos (CMI de 3200 UA ml-1; Sip et al, 2012) e superiores aos obtidos por Mills et al.
(2011a) para a plantaricina 423 (40 UA ml-1). Salum et al. (2012) apresenta um valor de
CMI de 320 UA ml-1 para a bacteriocina produzida pelo Bacillus subtilis. Comparando
com o presente estudo, apenas um isolado (L3A21M3) apresentou uma CMI inferior a
este valor. Outros autores apresentam igualmente valores relativamente baixos (800
UA ml-1) para enterocinas produzidas por estirpes de Enterococcus faecalis (Isleroglu et
al., 2012; Huang et al., 2013). No entanto, outros autores apresentam actividades
superiores para bacteriocinas produzidas pelo Lactobacillus plantarum (6400 UA ml-1;
Martínez et al., 2013) ou Lactococcus garvieae (12800 UA ml-1; Sip et al, 2012).
Schirru et al. (2012) observaram que bacteriocinas produzidas por diferentes estirpes de
Enterococcus
faecium
apresentavam
actividades
anti-listéria
que
variavam
consideravelmente (de 800 a 51200 UA ml-1). Estes autores referiram ainda que a
actividade máxima dos sobrenadantes neutralizados era atingida após 21 h de cultura,
diminuindo depois deste período. Vários autores referem que o máximo de produção de
bacteriocinas é atingido no final da fase exponencial e início da fase estacionária
(Tolinački et al., 2010; Benkerroum et al., 2012; Sip et al,, 2012; Schirru et al., 2012;
Han et al., 2013). No presente trabalho, a actividade dos sobrenadantes foi medida após
72 h de cultura, pelo que não podemos excluir a possibilidade de se poder obter
actividades superiores diminuindo-se o tempo de cultura em meio.
4.2 Identificação das BAL produtoras de bacteriocinas
Através dos testes API, das oito BAL testadas foram identificadas quatro espécies,
nomeadamente Enterococcus faecalis, Lactococcus lactis ssp. lactis 1, Lactobacillus
paracasei ssp. paracasei 1 e Streptococcus uberis (Quadro 8).
49
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
Quadro 8. Identificação fenotípica dos isolados com o sistema API 50 CH.
*
Isolados
Identificação fenotípica
% ID*
L2B21K3
Enterococcus faecalis
99.7
L3A1M6
Lactococcus lactis ssp. lactis 1
97.0
L3A21M1
Lactobacillus paracasei ssp. paracasei 1
99.4
L3A21M3
Lactobacillus paracasei ssp. paracasei 1
99.9
L3A21M8
Lactobacillus paracasei ssp. paracasei 1
99.9
L3A21K6
Enterococcus faecalis
99.7
L3A21K7
Streptococcus uberis
96.3
L3B1K3
Enterococcus faecalis
99.2
% ID - grau de certeza da identificação em percentagem
Através da sequenciação genética, foram identificadas apenas duas espécies
diferentes nos oito isolados, sete Enterococcus faecalis e apenas um isolado
correspondeu à espécie Lactococcus lactis (Quadro 9).
Deste modo, apenas três isolados (L2B21K3, L3A21K6 e L3B1K3) mantiveram a
mesma identificação pelos dois métodos de identificação (Enterococcus faecalis). Dos
restantes isolados, quatro alteraram a sua identificação após sequenciação do gene 16S
rRNA para Enterococcus faecalis e apenas um isolado foi identificado como
Lactococcus lactis (L3A21M1), identificado pelo teste API como Lactobacillus
paracasei ssp. paracasei 1.
Quadro 9. Identificação dos isolados por sequenciação do gene 16S rRNA.
Isolados
Identificação genética
L2B21K3
Enterococcus faecalis
L3A1M6
Enterococcus faecalis
L3A21M1
Lactococcus lactis
L3A21M3
Enterococcus faecalis
L3A21M8
Enterococcus faecalis
L3A21K6
Enterococcus faecalis
L3A21K7
Enterococcus faecalis
L3B1K3
Enterococcus faecalis
50
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
Neste estudo, sete das oito bactérias produtoras de bacteriocinas foram
identificadas geneticamente como E. faecalis, o que não é surpreendente visto que esta
espécie produz frequentemente enterocinas e é prevalente nos queijos artesanais
(Coppola et al., 2003; Gálvez et al., 2008; Nieto-Arribas et al., 2011). Segundo
Edalatian et al. (2012), o género Enterococcus é dominante em muitos produtos
alimentares, incluindo os queijos feitos a partir de leite cru.
Estes resultados vão também de encontro ao trabalho realizado por Bello et al.
(2010) em produtos artesanais italianos (queijo e produtos cárneos), onde se observou
uma elevada incidência de Lactococcus e Enterococcus em isolados produtores de
bacteriocinas.
4.3 Caracterização tecnológica das BAL produtoras de bacteriocinas
4.3.1 Actividades enzimáticas
O padrão de actividades enzimáticas dos isolados produtores de bacteriocinas é
apresentado no Quadro 10.
A maioria dos isolados apresentou uma elevada actividade para a leucina
arilamidase. Todavia, as actividades para a valina arilamidase e cistina arilamidase
apresentaram-se
muito
baixas
ou
inexistentes
em
alguns
isolados.
Estas
aminopeptidases são importantes na libertação de aminoácidos que podem favorecer o
desenvolvimento de flavours indesejáveis no queijo (Herreros et al., 2003).
A maioria dos isolados, incluindo o L. lactis, exibiu também actividade das
esterases C4 e C8 (20 - 30 nmol de substrato hidrolisado), enquanto que se observaram
actividades muito baixas para a lipase C14 (Quadro 10). Apenas um isolado (L3A1M6)
não apresentou qualquer actividade nas lipases testadas. Baixas concentrações de ácidos
gordos livres contribuem para o flavour do queijo, quando estão em equilíbrio com os
produtos da proteólise (McSweeney e Sousa, 2000). As BAL apresentam geralmente
uma fraca capacidade lipolítica quando comparadas com outros grupos de
microrganismos (Foulquié Moreno et al., 2006). Contudo, as actividades lipolíticas e
esterolíticas podem variar consideravelmente entre espécies e estirpes. Os enterococos
em geral, exibem actividades esterolíticas mais elevadas do que outras espécies de BAL
e, entre os enterococos, o E. faecalis é a espécie mais lipolítica e esterolítica (Tavaria e
51
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
Malcata, 1998; Sarantinopoulos et al., 2001a; Foulquié Moreno et al., 2006; NietoArribas et al., 2011). Neste estudo, confirmou-se a heterogeneidade entre enterococos,
uma vez que as actividades mais elevadas da esterase (C4 e C8) foram observadas em
quatro isolados de E. faecalis, enquanto que num dos isolados (L3A1M6) não se
observou qualquer actividade das esterases e lipase.
A fosfatase alcalina apresentou uma actividade muito fraca ou não detectada em
todos os isolados (Quadro 10). Estes resultados estão de acordo com outros autores que
confirmaram a fraca ou não detectável actividade da fosfatase alcalina entre lactococos
e enterococos (Herreros et al., 2003; Serio et al., 2010). Pelo contrário, todos os
isolados apresentaram actividade da fosfatase ácida, que é uma enzima essencial para a
hidrólise dos fosfopéptidos e que já foi detectada em isolados de enterococos (NietoArribas et al., 2011) e de lactococos (Herreros et al., 2003). Também se verificou uma
elevada actividade da naftol-AS-BI-fosfohidrolase em todos os isolados, o que está de
acordo com os resultados obtidos por outros autores (Herreros et al., 2003; Serio et al.,
2010; Nieto-Arribas et al., 2011).
A actividade da α-quimotripsina foi também detectada na maioria dos isolados,
enquanto que a actividade da tripsina apresentou-se muito baixa ou inexistente.
Igualmente, não foram detectadas actividades enzimáticas para as enzimas /galactosidase, -glucuronidase, -glucosidase, -manosidase e -fucosidase (Quadro
10). Algumas destas enzimas, nomeadamente a -galactosidase e -glucuronidase,
podem estar associadas ao cancro do cólon, pelo que a ausência destas actividades
enzimáticas pode constituir um factor positivo na utilização destes isolados em produtos
alimentares.
No estudo de Arizcun et al. (1997), as estirpes analisadas apresentaram variações
consideráveis nas actividades enzimáticas apesar destas pertencerem à mesma espécie
(Enterococcus faecalis). Os resultados obtidos no presente trabalho também
demonstraram variações consideráveis entre os isolados de Enterococcus faecalis.
52
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
Quadro 10. Actividade enzimática das BAL detectada com o sistema APIZYM. A actividade enzimática
(valores aproximados) é expressa em nmol de substrato hidrolisado.
Enzimas†
BAL*
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
L2B21K3
5
20
30
5
30
5
5
5
20
30
30
0
0
0
5
0
0
0
0
L3A1M6
0
0
0
0
0
0
0
0
0
30
20
0
0
0
0
0
0
0
0
L3A21M1
5
20
10
5
10
5
5
5
5
20
20
0
0
0
0
0
0
0
0
L3A21M3
10
20
30
10
20
5
10
5
10
20
10
5
5
5
5
5
5
5
0
L3A21M8
5
20
20
5
30
10
10
5
10
10
20
0
0
0
5
0
0
0
0
L3A21K6
5
5
20
5
30
5
10
5
20
20
20
5
5
5
10
5
5
5
5
L3A21K7
5
5
20
5
20
5
10
5
10
10
10
5
5
5
10
5
10
5
5
L3B1K3
0
30
30
0
10
0
0
0
10
20
20
0
0
0
0
0
0
0
0
* L. lactis corresponde à L3A21M1; todas as restantes BAL identificadas como E. faecalis
†1- Fosfatase alcalina, 2- Esterase (C4), 3- Esterase lipase (C8), 4- Lipase (C14), 5- Leucina arilamidase,
6- Valina arilamidase, 7- Cistina arilamidase, 8- Tripsina, 9- -quimotripsina, 10- Fosfatase ácida, 11Naftol-AS-BI-fosfohidrolase, 12- -galactosidase, 13- -galactosidase, 14- -glucoronidase, 15- glucosidase, 16- -glucosidase, 17- N-acetil--glucosaminidase, 18- -manosidase, 19- -fucosidase.
4.3.2 Propriedades tecnológicas
As propriedades tecnológicas das BAL foram estudadas através da avaliação das
actividades proteolítica, lipolítica e produção de diacetilo (Quadro 11).
Os isolados apresentaram fraca actividade proteolítica e lipolítica. Apenas um
isolado (L3A1M6) foi capaz de degradar a caseína e dois (L3B1K3 e L3A21M3)
exibiram actividade lipolítica. A baixa actividade proteolítica observada nestes isolados
está de acordo com os resultados obtidos por Sarantinopoulos et al. (2001a).
Curiosamente, as actividades da tripsina e -quimotripsina estão ausentes no isolado
L3A1M6 (Quadro 10), apesar deste ser o único isolado a apresentar actividade
proteolítica. Esta actividade será pois devida à produção de uma diferente protease ou
proteases.
As BAL são geralmente consideradas por apresentarem também uma fraca
capacidade lipolítica, quando comparadas com outros grupos de microrganismos
(Foulquié Moreno et al., 2006). Vários autores caracterizam os enterococos como tendo
fraca actividade proteolítica e lipolítica, sendo contudo o E. faecalis a espécie mais
53
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
proteolítica (Dovat et al., 1970; Arizcun et al., 1997; Suzzi et al., 2000; González et al.,
2010).
O único isolado L. lactis (L3A21M1) foi o que apresentou o nível mais elevado de
produção de diacetilo. Quatro isolados E. faecalis (L3A21M3, L3A21M8, L3A21K6,
L3A21K7) produziram níveis médios de diacetilo e apenas um isolado (L3A1M6) não
produziu diacetilo a partir do citrato (Quadro 11).
Quadro 11. Propriedades tecnológicas das BAL produtoras de bacteriocinas.
Actividade
Actividade
Produção de
proteolítica†
lipolítica†
diacetilo††
L2B21K3
-
-
+
L3A1M6
+
-
-
L3A21M1
-
-
+++
L3A21M3
-
+
++
L3A21M8
-
-
++
L3A21K6
-
-
++
L3A21K7
-
-
++
L3B1K3
-
+
+
Isolados*
* L. lactis corresponde à L3A21M1; todas as restantes BAL identificadas como E. faecalis
† Resultados expressos como (+) positivo e (-) negativo
†† Produção de diacetilo alto (+++), médio (++), baixo (+) e negativo (-)
Nem todas as BAL têm a capacidade de metabolizar o citrato. A degradação do
citrato resulta na formação de produtos finais metabólicos como o diacetilo, acetaldeído,
acetoína, 2,3-butanodiol e dióxido de carbono, que influenciam significativamente o
aroma e textura dos alimentos fermentados (Hugenholtz et al., 1993; Foulquié Moreno
et al., 2006). O L. lactis exibiu um nível alto de produção de diacetilo sendo esta uma
característica importante para uma potencial utilização como cultura de arranque.
Os enterococos também produziram diacetilo a partir do citrato mas com níveis de
produção mais baixos, com excepção de um isolado que não produziu diacetilo
(L3A1M6). Estes resultados estão de acordo com outros estudos que revelam que as
estirpes de enterococos têm potencial metabólico para metabolizar o citrato e deste
54
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
modo contribuir para o desenvolvimento do flavour em produtos lácteos
(Sarantinopoulos et al., 2001b; Franciosi et al., 2009).
4.4 Avaliação da segurança das BAL
4.4.1 Histamina, Hemólise, DNase e Gelatinase
Os testes para os factores de virulência revelaram que nenhum dos isolados
produziu histamina ou DNase (Quadro 12). Pela análise do quadro 12 podemos observar
também a ocorrência de hemólise α em todos os isolados, não se observando a
ocorrência das hemólises β. Metade dos isolados (L3A21M1, L3A21M3, L3A21M8 e
L3A1M6) apresentou resultados positivos na produção de gelatinase (Quadro 12).
Quadro 12. Resultados dos testes para a produção de histamina, actividade hemolítica, produção de
DNase e gelatinase das BAL produtoras de bacteriocinas.
Produção de
Actividade
Produção de
Produção de
histamina†
hemolítica
DNase†
Gelatinase†
L2B21K3
-
α
-
-
L3A1M6
-
α
-
+
L3A21M1
-
α
-
+
L3A21M3
-
α
-
+
L3A21M8
-
α
-
+
L3A21K6
-
α
-
-
L3A21K7
-
α
-
-
L3B1K3
-
α
-
-
Isolados*
* L. lactis corresponde à L3A21M1; todas as restantes BAL identificadas como E. faecalis
†
(-) Negativo, (+) Positivo
As hemolisinas desempenham um papel importante na virulência dos enterococos,
visto que provocam a lise dos eritrócitos podendo aumentar a severidade da infecção
(Franz et al., 2001). A produção de hemólise β tem sido detectada em isolados de
enterococos (Franz et al., 2001; Gupta e Malik, 2007).
No presente estudo, os resultados da actividade hemolítica dos enterococos estão
de acordo com os trabalhos realizados por Omar et al. (2004) e Barbosa et al (2010),
55
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
onde nenhum dos isolados apresentou actividade hemolítica  ou . Mesmo assim, a
ausência de actividade hemolítica nos enterococos não significa necessariamente que
estas bactérias não possuam os genes de virulência (Barbosa et al., 2010).
A DNase é um factor de virulência visto que é uma enzima extracelular que
possui a capacidade de digerir DNA (Câmara, 2012). No estudo de Moraes et al. (2012)
e de Omar et al. (2004) todos os Enterococcus faecalis testados não produziram a
enzima DNase, resultados que coincidem com os obtidos neste trabalho.
A gelatinase também desempenha um papel importante na patogenicidade visto
que é uma protease que está envolvida na hidrólise do colagénio, caseína, hemoglobina
e pequenas proteínas bioactivas. A produção de gelatinase está geralmente associada aos
enterococos de amostras clínicas, mas também tem sido detectada em enterococos
isolados de produtos lácteos (Moraes et al., 2012; Morandi et al., 2013). No presente
trabalho, três isolados E. faecalis apresentaram produção de gelatinase o que vai de
encontro aos resultados obtidos nos estudos de Moraes et al. (2012) e de Franz et al.
(2001). No entanto, a gelatinase constitui um factor virulência que impede a atribuição
do estatuto QPS para estes isolados. O facto dos outros enterococos não terem produzido
gelatinase constitui um factor positivo, mas que deverá ser confirmado pela pesquisa
dos genes (Lopes et al., 2006).
As aminas biogénicas são produzidas no queijo por descarboxilação enzimática
dos aminoácidos pelos microrganismos (Valsamaki et al., 2000). Na maioria dos
queijos as principais aminas são a tiramina e a histamina produzidas pela
descarboxilação da tirosina e da histidina, respectivamente (Loizzo et al., 2013). O
queijo é um dos alimentos fermentados que tem sido frequentemente associado a
intoxicações por histamina (Ladero et al., 2008). Os resultados da produção de
histamina estão de acordo com os obtidos por Suzzi et al. (2000) e Sarantinopoulos et
al. (2001a), em que nenhum dos isolados de enterococos produziu histamina em meio.
Os resultados negativos para a hemólise, histamina e produção de DNase,
adicionando ao estatuto GRAS do L. lactis, faz deste isolado (L3A21M1) um candidato
seguro para desenvolvimento como cultura adjunta e/ou protectora em alimentos.
Eaton e Gasson (2001) demonstraram que a incidência de factores de virulência
nos enterococos é mais elevada nas amostras clínicas em comparação com as de origem
56
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
alimentar, sugerindo assim que e as estirpes isoladas de alimentos possuem um baixo
potencial de patogenicidade.
4.4.2 Resistência a antibióticos
Os resultados obtidos para a resistência aos antibióticos dos oito isolados são
apresentados no Quadro 13. Nenhum dos isolados foi classificado como resistente à
amoxicilina/ácido clavulânico, carbenicilina, penicilina, cloranfenicol e vancomicina.
Por outro lado, foi detectada a resistência à piperacilina, estreptomicina,
trimetoprim/sulfametoxazol e ácido nalidíxico em todos os isolados. A canamicina,
gentamicina, netilmicina, tobramicina, ceftazidima, ceftriaxona e clindamicina
exerceram um efeito inibitório numa grande percentagem de isolados de Enterococcus
faecalis. Três isolados de E. faecalis (L3A21M3, L3A21M8, L3A1M6) também foram
resistentes à tetraciclina, enquanto que a resistência intermédia foi detectada para a
eritromicina em todos os enterococos. O L. lactis foi sensível à maioria dos antibióticos
testados (16 de 22), sendo resistente à piperacilina, estreptomicina, rifampicina,
trimetoprim/sulfametoxazol e ácido nalidíxico.
57
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
Quadro 13. Resultados dos testes de resistência/sensibilidade das BAL produtoras de bacteriocinas a 22 antibióticos.
Antibióticos
Amoxicilina/Ácido Clavulânico
Cloranfenicol
Carbenicilina
Ceftazidima
Gentamicina
Ceftriaxona
Cefotaxima
Clindamicina
Eritromicina
Canamicina
Cefalotina
Ácido Nalidíxico
Netilmicina
Ofloxacina
Penicilina
Piperacilina
Rifampicina
Estreptomicina
Sulfametoxazol/Trimetoprim
Tetraciclina
Tobramicina
Vancomicina
L2B21K3
S
S
S
R
R
R
R
R
I
R
S
R
R
R
S
R
S
R
R
S
R
S
L3A1M6
S
S
S
R
R
R
R
R
I
R
S
R
R
R
S
R
R
R
R
R
R
S
BAL
L3A21M1 L3A21M3 L3A21M8
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
R
R
S
R
R
S
R
R
S
R
I
S
R
R
S
I
I
S
R
R
S
S
S
R
R
R
S
R
R
R
R
R
S
S
S
R
R
R
R
I
I
R
R
R
R
R
R
S
R
R
S
R
R
S
S
S
L3A21K6
S
S
S
R
R
R
R
R
I
R
S
R
R
R
S
R
S
R
R
S
R
S
L3A21K7
S
S
S
R
R
I
R
R
I
R
S
R
R
R
S
R
I
R
R
S
R
S
L3B1K3
S
S
S
R
R
R
I
R
I
R
I
R
R
R
S
R
S
R
R
S
R
S
R - Resistente, I - Intermédio e S - Sensível
58
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
Neste trabalho, os isolados de enterococos foram resistentes aos aminoglicosídeos
como a gentamicina, estreptomicina, canamicina, netilmicina, tobramicina, e βlactâmicos como a ceftazidima e piperacilina. Estas observações estão de acordo com
outros estudos que mostram que os enterococos apresentam resistência intrínseca a uma
variedade de antibióticos, como os aminoglicosídeos e os β-lactâmicos (Mathur e Singh,
2005). A maioria dos enterococos apresentou resistência às cefalosporinas, bem como
aos antibióticos sulfamidas e quinolonas, o que pode ser consequência do uso local de
agentes antimicrobianos para o tratamento e controlo de doenças infecciosas em
animais.
Uma das principais preocupações de segurança para os enterococos é a resistência
adquirida para glicopéptidos como a vancomicina (Courvalin, 2006; Morandi et al.,
2013). Todavia, todas as estirpes produtoras de bacteriocinas testadas no presente
estudo demonstraram ser sensíveis à vancomicina e a outros antibióticos clinicamente
importantes como a carbenicilina, penicilina, cloranfenicol e amoxicilina/ácido
clavulânico (Quadro 13).
4.5 Aplicação das BAL como culturas de arranque/adjuntas no queijo fresco
4.5.1 Avaliação de parâmetros químicos, crescimento e actividade antimicrobiana
Os resultados obtidos para a determinação do pH, acidez titulável, crescimento
das BAL e actividade antimicrobiana no queijo fresco inoculado com os oito isolados
são apresentados nas Figuras 4 e 5.
Os queijos inoculados com as BAL apresentaram valores iniciais de pH entre 6,4
e 6,5 baixando ligeiramente até 6,4 - 6,0 ao fim de 72 horas. Pelo contrário, o queijo
preparado sem qualquer inóculo (controlo) não apresentou qualquer descida de pH. A
maior redução de pH foi observada nos isolados L3A21M3 e L3A21M8. Estes isolados
foram também os que apresentaram valores mais elevados de produção de ácido láctico
(acidez titulável), o que explica a redução de pH observada. No entanto, nem sempre se
observa uma correlação estreita entre os valores de pH e a produção de ácido láctico.
Por exemplo, o isolado L2B21K3 apresentou uma produção de ácido láctico (passando
de 0,04 g/100g para 0,10 g/100g) que não foi observada por uma redução
correspondente no pH.
59
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
Não se observaram alterações na acidez nos queijos controlo e produzidos com os
isolados L3A21K6 e L3A21K7 (0,05 g/100g). No único isolado identificado como L.
lactis (L3A21M1), foram observados valores muito baixos de produção de ácido
pH
láctico, confirmados pela reduzida descida de pH.
6,8
6,7
6,6
6,5
6,4
6,3
6,2
6,1
6,0
5,9
0
6
12
18
24
30
36
42
48
54
60
66
72
Tempo (horas)
Controlo
L3A21K6
L3A21K7
L3B1K3
L3A21M8
L3A1M6
L3A21M1
L3A21M3
L2B21K3
Figura 4. Evolução do pH no queijo conservado a 4 °C durante 72 horas. Cada valor representa a média
Acidez titulável (g/100g)
de duas réplicas e as barras de erro representam o respectivo desvio padrão.
0,2
0,18
0,16
0,14
0,12
0,1
0,08
0,06
0,04
0,02
0
6
12
18
24
30
36
42
48
54
60
66
72
Tempo (horas)
Controlo
L3A21K6
L3A21K7
L3B1K3
L3A21M8
L3A1M6
L3A21M1
L3A21M3
L2B21K3
Figura 5. Evolução da acidez titulável no queijo conservado a 4 °C durante 72 horas. Cada valor
representa a média de duas réplicas e as barras de erro representam o respectivo desvio padrão.
60
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
Na manufactura do queijo um decréscimo rápido do pH é considerado crucial
visto que é essencial para a coagulação, firmeza da coalhada e controlo dos
microrganismos indesejáveis. De acordo com Beresford et al. (2001), as bactérias
starter poderiam ser definidas como isolados que produzem ácido suficiente para
reduzir o pH do leite para 5,3 em 6 horas a 30 - 37 °C. No presente trabalho, nenhum
dos isolados apresentou uma redução de pH tão acentuada, pelo que não podem ser
qualificados como boas culturas de arranque (starters).
As BAL englobam um grupo heterogéneo de microrganismos cuja principal
característica é a produção de ácido láctico (Mayo et al., 2010). Todos os isolados em
estudo produziram ácido láctico no queijo fresco. No entanto, noutros estudos
realizados com BAL em leite foram obtidos valores de acidez titulável superiores aos
observados neste trabalho (Herreros et al., 2003; Badis et al., 2004; González et al.,
2010). Contudo, a reduzida capacidade de acidificação apresentada pela maioria dos E.
faecalis está de acordo com outros trabalhos, onde se verifica que as estirpes de
Enterococcus são produtores de ácido lentos, uma vez que degradam a lactose no leite
mais lentamente do que o Lactobacillus paracasei, que é considerado um baixo
acidificante (Sarantinopoulos et al. 2001a). O L. lactis também foi um baixo
acidificante, o que está de acordo com a baixa capacidade acidificante dos lactococos
isolados a partir de produtos artesanais referida por outros autores (Ayad et al., 2004).
Mesmo assim, os isolados com propriedades acidificantes baixas podem ser usados
como culturas adjuntas, dependendo das suas características. Em relação ao crescimento
no queijo a 4 °C, observou-se um crescimento razoável a esta temperatura, atingindo-se
a fase estacionária às 48 horas na maioria dos isolados, com excepção do isolado
L3A1M6 que continuou em fase exponencial (Figura 6). Ao fim de 72 horas todos os
isolados apresentaram o aumento de 1 unidade log no crescimento. No que concerne à
actividade antimicrobiana, todas as amostras de queijo, com excepção do controlo,
apresentaram halos de inibição da listéria desde o início. Contudo, a actividade antilistéria nos sobrenadantes neutralizados só foi detectada com os isolados L2B21K3 e
L3A21K6. O isolado L2B21K3 apresentou actividade anti-listéria desde a introdução da
coalhada nos cinchos (0 horas), enquanto que o isolado L3A21K6 apresentou actividade
anti-listéria detectável no sobrenadante neutralizado após 48 horas de armazenamento (4
°C). Relativamente à CMI dos sobrenadantes neutralizados, nenhum dos isolados
apresentou actividade anti-listéria pela técnica "spot-on-lawn"
61
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
20
12
8
6,0
4
Log ufc g-1
16
8,0
10,0
D
0
20
16
8,0
12
8
6,0
4
4,0
0
0 12 24 36 48 60 72
0 12 24 36 48 60 72
Tempo (horas)
Tempo (horas)
20
12
8
6,0
4
4,0
Log ufc g-1
16
8,0
10,0
F
0
20
16
8,0
12
8
6,0
4
4,0
0
0 12 24 36 48 60 72
0 12 24 36 48 60 72
Tempo (horas)
Tempo (horas)
20
16
8,0
12
8
6,0
4
4,0
0
10,0
H
Log ufc g-1
10,0
Diâmetro (mm)
0
Tempo (horas)
Diâmetro (mm)
Log ufc g-1
Log ufc g-1
4,0
Tempo (horas)
10,0
Log ufc g-1
4
0 12 24 36 48 60 72
4,0
G
8
6,0
0 12 24 36 48 60 72
10,0
E
12
Diâmetro (mm)
0
16
8,0
Diâmetro (mm)
4
20
20
16
8,0
12
8
6,0
4
4,0
Diâmetro (mm)
8
6,0
10,0
Log ufc g-1
12
Diâmetro (mm)
16
8,0
4,0
C
B
20
Diâmetro (mm)
Log ufc g-1
10,0
Diâmetro (mm)
A
0
0 12 24 36 48 60 72
0 12 24 36 48 60 72
Tempo (horas)
Tempo (horas)
Figura 6. Cinética do crescimento das estirpes no queijo a 4 °C (●) e produção de bacteriocinas (diâmetro
dos halos de inibição do crescimento de listéria) do extracto neutralizado (■) e do queijo (▲). Cada valor
representa a média de três réplicas e as barras de erro representam o respectivo desvio padrão. AL2B21K3, B- L3A1M6, C- L3A21M1, D- L3A21M3, E- L3A21M8, F- L3A21K6, G- L3A21K7 e HL3B1K3 (L. lactis corresponde à L3A21M1; todas as restantes BAL identificadas como E. faecalis).
62
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
A elevada actividade antimicrobiana nos queijos detectada desde o início do
armazenamento a 4 °C não poderá ser atribuída à redução de pH ou produção de ácido
láctico pois, na maioria dos isolados, estes valores são idênticos ao do controlo, onde
não se detectou qualquer inibição da listéria. Acresce ainda que apenas se observa um
ligeiro aumento dos halos de inibição nas primeiras 6 horas, período que corresponde ao
crescimento exponencial das BAL. Para períodos posteriores, onde se regista a
diminuição do pH e aumento da produção de ácido láctico, não se observa um aumento
correspondente dos halos de inibição. Estes resultados sugerem que a produção de
bacteriocinas pelas BAL em estudo é realizada num período inicial de crescimento (fase
exponencial). Tendo em conta que o tempo zero corresponde à altura em que a coalhada
foi colocada nos cinchos, regista-se um tempo de incubação prévio de cerca de 65 min.,
que corresponde à formação da coalhada e dessoramento, durante o qual as BAL
poderão iniciar a produção de bacteriocinas. Embora não tenha sido realizado o estudo
da cinética de produção de bacteriocinas por estes isolados, outros autores referem que a
sua produção aumenta durante a fase exponencial de crescimento bacteriano,
estabilizando durante a fase estacionária (Benkerroum et al., 2012; Han et al., 2013;
Martinez et al., 2013). Observando os resultados obtidos pelos dois isolados que
apresentaram actividade anti-listéria nos sobrenadantes (soro do queijo), confirma-se a
presença de bacteriocinas desde o início (tempo 0) para o isolado L2B21K3. Nos
queijos inoculados com este isolado pode-se ainda detectar um ligeiro aumento dos
halos de inibição ao longo do tempo, enquanto que no caso do isolado L3A21K6,
apenas se começa a detectar actividade no sobrenadante e aumento dos halos de inibição
após 48 h. A determinação dos diâmetros dos halos não reflecte correctamente a
quantidade/actividade de bacteriocina produzida, pelo que a medida da concentração
mínima inibitória (CMI) se torna no método mais adequado e reprodutível para análise
da actividade das bacteriocinas. No entanto, no presente estudo não foi possível detectar
a CMI nos sobrenadantes produzidos por estes dois isolados, talvez devido à menor
quantidade de bacteriocinas presentes nos sobrenadantes que, no volume testado (5 l),
não foram suficientes para inibir a listéria pela técnica spot-on-lawn.
A inexistência de actividade anti-listéria observada na maioria dos sobrenadantes
testados pode indicar a ocorrência de adsorção das bacteriocinas às células produtoras
ou às micelas de caseína. Resultados semelhantes foram obtidos por vários autores que
não conseguem detectar a presença de diversas bacteriocinas nos extractos de queijo,
63
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
embora essa actividade seja detectada quando as amostras de queijo são colocadas
directamente nos poços de agar contendo a bactéria indicadora (Sarantinopoulos et al.,
2002; Foulquié Moreno et al., 2003; Rodríguez et al., 2005). No presente caso, apenas
dois isolados produzem bacteriocinas detectáveis nos sobrenadantes do queijo. Estas
bacteriocinas possuem propriedades químicas diferentes das restantes bacteriocinas, em
particular uma carga global positiva (resultados não apresentados), ao contrário da
maioria das bacteriocinas que são aniónicas e que dessa forma poderão ligar-se
fortemente aos grupos fosfato da caseína.
Os isolados com produção de bacteriocinas inicial elevada, e que apresentaram
igualmente alguma capacidade de acidificação, poderão ser assim utilizados como
culturas de arranque/adjuntas no fabrico de queijos maturados. Já os isolados com uma
produção não detectada de ácido láctico durante a refrigeração a 4 °C têm um elevado
potencial para ser utilizados na produção de queijo fresco, pois neste caso o aumento de
acidez não é desejável. No entanto, dado que existem reservas em relação à aplicação de
E. faecalis nos alimentos, foi escolhido o único isolado produtor de bacteriocinas com
estatuto GRAS, (L. lactis, L3A21M1) para avaliação de alguns parâmetros no queijo
fresco ao longo de 30 dias. Deste modo, os parâmetros pH, acidez titulável, humidade,
0,16
6,7
0,14
6,6
0,12
6,5
0,10
6,4
0,08
6,3
0,06
6,2
0,04
6,1
0,02
6,0
0,00
0
5 10 15 20 25 30
Tempo (dias)
B
pH
6,8
Acidez titulável (g/100g)
pH
A
6,8
0,16
6,7
0,14
6,6
0,12
6,5
0,10
6,4
0,08
6,3
0,06
6,2
0,04
6,1
0,02
6,0
Acidez titulável (g/100g)
bem como crescimento total são apresentados nas Figuras 7 e 8.
0,00
0
5 10 15 20 25 30
Tempo (dias)
Figura 7. Evolução do pH (■) e da acidez titulável (●) no queijo conservado a 4 °C durante 30 dias. Cada
valor representa a média de três réplicas e as barras de erro representam o respectivo desvio padrão. AControlo, B- L3A21M1 (L. lactis).
64
100
8,0
80
6,0
60
4,0
40
2,0
0,0
0
10,0
100
8,0
80
6,0
60
4,0
40
20
2,0
20
0
0,0
B
Log ufc g-1
10,0
Humidade (%)
Log ufc g-1
A
5 10 15 20 25 30
Tempo (dias)
Humidade (%)
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
0
0
5 10 15 20 25 30
Tempo (dias)
Figura 8. Evolução do crescimento – contagens totais (■) e da humidade (●) no queijo fresco conservado
a 4 °C durante 30 dias. Cada valor representa a média de três réplicas e as barras de erro representam o
respectivo desvio padrão. A- Controlo, B- L3A21M1 (L. lactis).
Tanto o queijo controlo como o inoculado com o L. lactis (isolado L3A21M1) não
apresentaram grandes descidas de pH, embora se tenha registado a maior descida no
queijo com o isolado (atingindo o valor de 6,2). Como seria de esperar, o queijo com a
láctica produziu a maior quantidade de ácido láctico (0,15 g/100g aos 30 dias), embora
se tenha registado alguma produção de ácido láctico ao fim de 30 dias no queijo
controlo. Em ambos os queijos a percentagem de humidade foi muito semelhante,
registando-se uma perda superior a 20% no último dia de análise. No entanto, houve
uma descida mais acentuada na humidade nos primeiros dias (Figura 7). Relativamente
ao crescimento microbiano, o queijo com inóculo apresentou um aumento de 2 unidades
log ao longo dos primeiros 15 dias de refrigeração a 4 °C. No queijo controlo
(produzido com leite pasteurizado) não se detectaram contagens de microrganismos nos
primeiros 10 dias de refrigeração. No entanto, com o decorrer do tempo surgiu flora
adventícia, detectando-se as primeiras colónias após 15 dias de refrigeração (Figura 8).
A principal característica de uma cultura starter é a rapidez de acidificação com a
produção de ácidos orgânicos, principalmente o ácido láctico (Wouters et al., 2002;
Leroy e De Vuyst, 2004). Neste estudo verificou-se que os valores de pH desceram
pouco apesar de existir um aumento da quantidade de ácido láctico produzido. Deste
modo, este isolado poderá ser usado como cultura adjunta ou protectora.
65
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
O queijo fresco é um produto com humidade elevada que favorece o crescimento
dos microrganismos (Cunha et al., 2006; Pingitore et al., 2012). Ao longo do tempo de
refrigeração verificou-se um aumento do crescimento do L. lactis no queijo inoculado
com este isolado, assim como surgiu flora adventícia no queijo controlo. Isto deve-se
principalmente à humidade elevada e baixa acidez dos queijos que permitem o
desenvolvimento dos microrganismos. Estes resultados estão de acordo com os obtidos
no estudo de Oliveira et al. (2012) em queijo fresco de cabra onde foi utilizada uma
cultura mista de Lactococcus lactis subsp. lactis e Lactococcus lactis subsp. cremoris.
Num outro estudo realizado no queijo fresco Minas, foi utilizada uma cultura mista de
Lactococcus lactis subsp. lactis e Lactococcus lactis subsp. cremoris, tendo-se obtido
uma maior acidificação (Buriti et al., 2005). Este queijo apresentou também uma
humidade inicial inferior (67,5%), o que corresponde ao teor nos queijos testados no
presente estudo, após 20 dias de refrigeração.
4.5.2 Avaliação organoléptica
No primeiro lote de queijos testados (L2B21K3, L3B1K3, L3A21K6, L3A21K7 e
controlo) não se observaram diferenças significativas (P>0,05) entre os queijos para os
parâmetros avaliados, com excepção da firmeza (Quadro 14) (Anexo II). O queijo com
o isolado L3B1K3 foi considerado mais firme que o controlo pelo painel de provadores
não treinados (50 provadores). De um modo geral, os provadores atribuíram uma
pontuação baixa (nível I) para a acidez, teor de sal e aroma dos queijos. Este não é um
resultado surpreendente, pois o queijo fresco produzido com leite de vaca possui em
geral um aroma pouco acentuado e reduzida acidez. Em relação ao teor em sal, é usual a
adição deste na altura do seu consumo, pelo que irá ser ajustado à medida de cada
consumidor. Os queijos com as BAL mereceram uma apreciação global média (II) a
elevada (III), comparável com o queijo sem qualquer cultura (controlo).
No segundo lote de queijos testados (L3A1M6, L3A21M1, L3A21M3,
L3A21M8) o painel de provadores (52 provadores) atribuiu igualmente uma pontuação
baixa (nível I) para a acidez e aroma dos queijos, comparável com o queijo controlo
(Quadro 15). No entanto, observaram-se diferenças significativas (P<0,05) nos
parâmetros acidez, firmeza e apreciação global (Quadro 15) (Anexo III). Na acidez,
estas diferenças foram observadas entre o controlo (ausência de BAL) e os queijos
inoculados com os isolados L3A1M6 e L3A21M3 (P<0,05), sendo os queijos
66
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
inoculados com as BAL considerados mais ácidos que o controlo. Estes resultados vêm
confirmar a maior produção de ácido láctico (acidez titulável) detectada nestes queijos
(secção 4.5.1). No entanto, o queijo inoculado com o isolado L3A21M8, tendo
apresentado a maior produção de ácido láctico (secção 4.5.1), não foi considerado ácido
pelo painel de provadores (P=0,776). É assim possível que a acidez percepcionada pelos
provadores seja resultado não só da quantidade de ácido láctico produzido, como
também resulte das actividades proteolíticas e lipolíticas dos isolados (secção 4.3.2).
Desta forma, a ausência de actividade proteolítica e lipolítica apresentada pelo isolado
L3A21M8 terá contribuído decisivamente para a reduzida acidez avaliada pelo painel de
provadores. Pelo contrário, os isolados L3A1M6 e L3A21M3 apresentaram actividade
proteolítica e lipolítica, respectivamente, o que, em conjunto com a produção de ácido
láctico, terá contribuído para a atribuição de uma pontuação mais elevada por uma
percentagem mais elevada de provadores (Quadro 15). Em relação à firmeza, os queijos
inoculados com os isolados L3A21M1 e L3A21M8 foram considerados menos firmes
que o controlo (P<0,05). O queijo produzido com o isolado L3A21M3 foi o menos
apreciado, com 39% dos provadores a atribuírem uma classificação baixa (I),
apresentando uma diferença significativa (P<0,05) em relação ao controlo. Este
resultado na apreciação global poderá estar relacionado com o facto de uma maior
percentagem de provadores (23%) ter classificado este queijo como muito ácido. Notouse igualmente uma tendência para uma melhor apreciação global quando se tratava de
um queijo mais firme. A correlação entre a apreciação global e a firmeza foi
significativa (P<0,05) em ambos os lotes de queijos testados.
Num estudo realizado em queijo fresco de cabra, (Oliveira et al., 2012), foram
observadas diferenças significativas em alguns queijos na apreciação global e na
firmeza, o que vai de encontro aos resultados obtidos neste trabalho. No entanto,
tratando-se de um queijo de cabra, também foram obtidas diferenças significativas em
relação ao aroma, enquanto que no presente trabalho não se registaram diferenças ao
nível do aroma. Segundo Pereira et al., (2011) os microrganismos inoculados nos
queijos produzidos com leite de vaca não exercem qualquer influência no aroma do
queijo nos primeiros dias de maturação, o que vai de encontro aos resultados obtidos no
presente estudo.
67
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
Quadro 14. Avaliação da acidez, teor de sal, firmeza, aroma e apreciação global do primeiro lote de queijos testados (L2B21K3, L3B1K3, L3A21K6 e L3A21K7). São
indicadas as percentagens de provadores que atribuíram a classificação I, II e III e respectivos valores de P.
Acidez
Queijo
b
Firmeza
Pa
II
III
I
II
III
I
II
III
L2B21K3
82
14
4
68
18
14
52
36
12
L3B1K3
L3A21K6
82
76
14
18
4
6
58
58
28
34
14
8
10
42
48
36
L3A21K7
74
24
2
50
32
18
24
42
80
14
0,880
6
76
16
0,173
8
32
46
Aroma
Pb
I
Controlo
a
Teor de sal
Pa
I
II
0,107
82
42
22
0,012
0,526
64
76
34
0,378
22
-
Pa
Apreciação global
III
I
II
III
14
4
26
32
42
26
22
10
2
12
18
32
38
56
44
70
20
10
24
30
46
74
20
6
22
38
40
0,533
Pa
0,698
Valor de P obtido na comparação entre queijos.
Valor de P em comparação com o queijo controlo.
Quadro 15. Avaliação da acidez, teor de sal, firmeza, aroma e apreciação global do segundo lote de queijos testados (L3A1M6, L3A21M1, L3A21M3 e L3A21M8). São
indicadas as percentagens de provadores que atribuíram a classificação I, II e III respectivos valores de P.
Acidez
Queijo
a
b
Teor de sal
Pa
I
II
III
L3A1M6
56
29
15
L3A21M1
90
9,6
0
Firmeza
Pb
I
II
III
I
II
III
0,003
48
31
21
28
36
36
0,555
61
29
10
54
33
13
L3A21M3
62
15
23
0,004
39
46
15
L3A21M8
81
13
6
0,776
48
44
Controlo
85
13
2
-
50
35
0,224
Aroma
Pa
Pb
Apreciação global
Pa
I
II
III
I
II
III
0,761
58
27
15
31
25
44
0,054
0,042
73
21
6
14
44
42
0,978
39
25
36
0,011
0,160
37
38
25
0,800
60
25
15
8
61
29
10
0,004
81
11
8
23
31
46
0,319
15
33
36
31
-
75
19
6
14
42
44
-
Valor de P em comparação com o queijo controlo.
Valor de P obtido na comparação entre queijos.
68
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
4.6 Efeito das BAL no crescimento de Listeria monocytogenes em queijo fresco
4.6.1 Adição individual dos isolados
Para avaliar o efeito das diferentes BAL produtoras de bacteriocinas no controlo
de listeria in situ, procedeu-se à adição de um inóculo com L. monocytogenes a estes
queijos. Num primeiro ensaio, foram realizadas contagens até ao 7º dia (Figuras 9 e 10).
Apesar da conservação a 4 °C, observou-se um aumento das contagens de L.
monocytogenes nos queijos controlo (sem adição de BAL), atingindo-se cerca de 8,5 log
ufc g-1 aos 7 dias (Figuras 9 e 10). No entanto, todas as 8 BAL testadas reduziram a
contagem de L. monocytogenes no início e durante o tempo de armazenamento. A maior
redução da presença de L. monocytogenes foi obtida nos queijos inoculados com o
isolado L3A21K7 (Figura 9) e com os isolados L3A21M3 e L3A21M8 (Figura 10),
obtendo-se uma diminuição de aproximadamente 4 unidades log em comparação com o
queijo controlo, após 7 dias. Em contraste, o isolado que exerceu o menor efeito na
redução do crescimento da listéria foi o L. lactis (L3A21M1), reduzindo em cerca de 2
unidades log após 7 dias (Figura 10).
9,0
8,0
Log ufc g-1
7,0
6,0
5,0
4,0
3,0
0
1
2
3
4
5
6
7
Tempo (dias)
Controlo
L2B21K3
L3B1K3
L3A21K7
L3A21K6
Figura 9. Inibição da Listeria monocytogenes em queijo fresco inoculado com bactérias produtoras de
bacteriocinas (L3A21K6, L3A21K7, L3B1K3 e L2B21K3) durante 7 dias. Cada valor representa a média
de três réplicas e as barras de erro representam o respectivo desvio padrão.
69
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
9,0
Log ufc g-1
8,0
7,0
6,0
5,0
4,0
0
1
2
3
4
5
6
7
Tempo (dias)
Controlo
L3A21M3
L3A21M1
L3A1M6
L3A21M8
Figura 10. Inibição da Listeria monocytogenes em queijo fresco inoculado com bactérias produtoras de
bacteriocinas (L3A21M8, L3A1M6, L3A21M1 e L3A21M3) durante 7 dias. Cada valor representa a
média de três réplicas e as barras de erro representam o desvio padrão.
No sentido de estudar o efeito de redução da listéria para além do tempo
inicialmente estudado (7 dias), foi realizado um novo ensaio com os isolados que
apresentaram uma maior redução da listéria (L3A21M8, L3A21M3, L3A21K7 e
L3B1K3), prolongando-se as análises até aos 15 dias (Figura 11).
Nos queijos conservados a 4 °C durante 15 dias, a maior redução da L.
monocytogenes foi verificada no queijo inoculado com o isolado L3A21M8, com uma
diminuição de aproximadamente 4 unidades log em comparação com o queijo controlo.
Esta redução da listéria foi observada até ao 6º dia, mantendo-se as contagens sem
alteração até ao 15º dia (Figura 11). Ao contrário do que tinha sido observado no
primeiro ensaio (7 dias), o isolado L3A21K7 não foi capaz de reduzir a contagem de
listéria para valores inferiores a 106 ufc g-1, o que sugere que terá havido um erro na
contagem no dia 7, no primeiro ensaio. Para os restantes isolados testados, não houve
grandes alterações das contagens de listeria com o prolongamento do tempo de análise.
Em relação ao queijo controle, observou-se um contínuo crescimento de L.
monocytogenes até ao dia 9, atingindo a fase estacionária (até aos 15 dias) com
contagens superiores a 108 ufc g-1 (8,5 log ufc g-1). Este crescimento da listéria é
favorecido pelo pH próximo da neutralidade (pH = 6,5, ver secção 4.5.1), o que torna o
70
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
queijo fresco um alimento muito susceptível para contaminação e crescimento da
listéria (Kabuki et al., 2004).
9,0
Log ufc g-1
8,0
7,0
6,0
5,0
4,0
3,0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Tempo (dias)
Controlo
L3B1K3
L3A21K7
L3A21M3
L3A21M8
Figura 11. Inibição da Listeria monocytogenes em queijo fresco inoculado com bactérias produtoras de
bacteriocinas (L3A21M8, L3A21M3, L3A21K7 e L3B1K3) durante 15 dias. Cada valor representa a
média de três réplicas e as barras de erro representam o respectivo desvio padrão.
Os resultados evidenciaram uma produção de bacteriocinas desde o início do
ensaio, pois observou-se uma redução da listéria logo nas primeiras horas após a
produção do queijo. A partir das 72 horas, nos queijos inoculados com BAL as
contagens de listéria mantiveram-se estáveis até aos 7 dias, com excepção do isolado
L3A21K7 no primeiro ensaio (Figura 9). Quando se prolongou o tempo de
armazenamento também se constatou não existirem diferenças entre os 7 e 15 dias
(Figura 11).
Estes resultados estão de acordo com outros estudos realizados em queijo fresco
ou cottage cheese. Pingitore et al. (2012) testaram várias estirpes de Enterococcus spp
produtoras de bacteriocinas em queijo fresco de Minas, tendo detectado uma redução da
L. monocytogenes em 3 unidades log após 12 dias. No entanto, as bacteriocinas
produzidas pelas estirpes testadas tinham um efeito bacteriostático, não se observando
uma redução das contagens iniciais de L. monocytogenes. Em cottage cheese, Bello et
71
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
al. (2012) observaram igualmente uma diminuição da L. monocytogenes em 3 unidades
log após 6 horas de incubação com uma estirpe L. lactis produtora de lacticina 481.
Contudo, após esse período inicial, as contagens de L. monocytogenes voltavam a
aumentar para valores próximos do controlo, sendo este aumento justificado pelo facto
do queijo apresentar pouca acidificação (pH = 6,5) e deste modo não inibir o
crescimento do patógeno. Num outro estudo realizado também com cottage cheese,
Ross et al. (2000) observaram, após uma semana de maturação, uma redução nas
contagens de listéria de 1000 vezes, provocada pela adição de um starter produtor de
lacticina 3147. Em leite inoculado com L. lactis produtora de pediocina, Rodríguez et
al. (2005) relatam igualmente uma redução de 2,97 unidades log da L. monocytogenes.
Em queijo fabricado com leite de ovelha cru (queijo Manchego), a adição de um starter
produtor de nisina conduziu a uma redução da L. innocua em 4,08 unidades log, após 60
dias de maturação (Rodríguez et al., 1998).
4.6.2 Efeito de culturas mistas
O possível efeito sinergístico das bacteriocinas produzidas pelos isolados na
redução de listéria no queijo fresco foi testado para cinco isolados que apresentaram os
melhores resultados nos ensaios anteriores: L3B1K3, L3A21K6, L3A21K7, L3A21M3
e L3A21M8 (Figura 12). Todos os queijos inoculados com cultura mista reduziram a
contagem de L. monocytogenes no início e durante o tempo de armazenamento. A maior
redução da presença de L. monocytogenes, após 7 dias foi obtida pela utilização de duas
combinações (L3B1K3/L3A21M3 e L3A21M3/L3A21M8) com uma diminuição de
aproximadamente 5 unidades log em comparação com o controlo positivo.
Curiosamente, estes últimos isolados, L3A21M3 e L3A21M8, apresentaram valores
relativamente baixos de CMI, com 200 e 1600 UA ml-1, respectivamente (ver secção
4.1). Deste modo, a produção e actuação das bacteriocinas nos alimentos nem sempre
reflecte os resultados obtidos em meio de cultura. A produção de bacteriocinas pelas
BAL depende diferentes factores ambientais (pH, presença de outras bactérias,
nutrientes) e embora os valores de CMI sejam muito utilizados para avaliar a actividade
das bacteriocinas, é de extrema importância a sua avaliação no local de actuação
(alimentos).
72
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
9,0
8,0
Log ufc g-1
7,0
6,0
5,0
4,0
3,0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14 15
Tempo (dias)
Controlo
L3A21M3 + L3A21M8
L3B1K3 + L3A21M3
L3A21K6 + L3A21K7
Figura 12. Inibição da Listeria monocytogenes em queijo fresco inoculado com dois isolados produtores
de bacteriocinas (L3A21M3+L3A21M8, L3A21K6+L3A21K7 e L3B1K3+L3A21M3) durante 15 dias.
Cada valor representa a média de três réplicas e as barras de erro representam o respectivo desvio padrão.
O elevado inóculo de L. monocytogenes adicionado ao queijo no presente trabalho
(6,1 log ufc ml-1) foi responsável pelas contagens elevadas detectadas ao longo do
tempo. Foi assim realizado um segundo ensaio com um inóculo mais baixo de L.
monocytogenes, tendo-se observado uma redução equivalente provocada pelo efeito
sinergístico dos isolados L3B1K3/L3A21M3 (Figura 13).
73
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
9,0
8,0
7,0
Log ufc g-1
6,0
5,0
4,0
3,0
2,0
1,0
0,0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Tempo (dias)
Controlo
L3B1K3 + L3A21M3
Figura 13. Inibição da Listeria monocytogenes em queijo fresco inoculado com dois isolados produtores
de bacteriocinas (L3B1K3+L3A21M3) com inóculo menor de patógene durante 15 dias. Cada valor
representa a média de três réplicas e as barras de erro representam o desvio padrão.
Apesar do inóculo ser um pouco mais baixo (4,8 log ufc ml-1) as bacteriocinas não
inibiram na totalidade o crescimento da listéria. Estes resultados estão de acordo com o
trabalho de Liu et al. (2008) onde também foi observada uma redução do crescimento
da L. monocytogenes sem eliminar completamente a presença do patógeno.
Embora sejam escassos os estudos realizados em queijos, e em particular no
queijo fresco, nenhum dos trabalhos publicados até ao presente apresenta uma redução
da L. monocytogenes tão elevada como no estudo actual.
A utilização de BAL produtoras de bacteriocinas em produtos lácteos tem sido
advogada por vários autores, pois permite resolver os problemas associados à adição de
bacteriocinas como ingredientes (Gálvez et al., 2008). Deste modo, algumas das BAL
testadas apresentam um grande potencial para aplicação no fabrico de queijo fresco ao
reduzir possíveis contaminações com a L. monocytogenes. Em particular, a utilização
em conjunto dos isolados L3B1K3 e L3A21M3 poderá constituir uma mais valia no
controlo da L. monocytogenes em queijos. Embora estes dois isolados tenham sido
identificados como Enterococcus faecalis, levantando algumas questões de segurança
74
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
em relação à sua aplicação nos alimentos, estes apresentam um número reduzido de
factores de virulência (Ribeiro et al., 2013). Muitas bacteriocinas com elevado potencial
para controlo de patógenos nos alimentos são produzidas por enterococci (FoulquiéMoreno et al., 2006). Os enterococci são prevalentes nos lacticínios e em especial, nos
queijos tradicionais (Rivas et al., 2012). Muitos dos enterococci bacteriocinogénicos
podem crescer e produzir bacteriocinas no leite e queijos, o que os torna em bons
candidatos para utilização como culturas protectoras contra patógenos. Deste modo,
várias estirpes de enterococcus produtoras de enterocinas foram testadas no leite e
queijos com bons resultados (Giraffa et al.,1995; Nuñez et al., 1997).
75
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
5. CONCLUSÃO
Com a realização da presente trabalho foi possível detectar oito BAL produtoras
de bacteriocinas isoladas a partir do queijo do Pico. Todos estes isolados mostraram ter
actividade inibitória contra um importante patógeno alimentar como a Listeria
monocytogenes e três apresentaram ainda actividade inibitória contra o Clostridium
perfringens. Embora os testes API tenham identificado quatro espécies, pelos métodos
genéticos foram identificadas apenas duas espécies diferentes, sete Enterococcus
faecalis e um Lactococcus lactis.
O L. lactis apresentou características tecnológicas favoráveis como uma produção
elevada de diacetilo e um perfil enzimático promissor do ponto de vista da formação de
aroma. Do ponto de vista da segurança, este isolado apresentou resultados negativos
para a hemólise, produção de histamina e DNase. Não apresentou resistência aos
antibióticos clinicamente importantes o que, adicionado ao estatuto GRAS desta
espécie, faz deste isolado um candidato seguro para desenvolvimento como cultura
adjunta
e/ou
protectora
para
a
indústria
dos
lacticínios,
influenciando
o
desenvolvimento do flavour e melhorando a segurança do produto final. No entanto, foi
com a utilização dos isolados E. faecalis que se observou a maior redução da L.
monocytogenes no queijo fresco. O maior efeito sinergístico foi obtido com a utilização
de duas combinações de isolados (L3B1K3/L3A21M3 e L3A21M3/L3A21M8)
atingindo-se uma diminuição de aproximadamente 5 unidades log em comparação com
o controlo positivo (queijo inoculado com L monocytogenes na ausência de BAL).
A utilização destes isolados no fabrico de queijo fresco foi ainda testada em
provas organolépticas, realizadas por um painel de provadores não treinados. Em geral,
os queijos com as BAL, com excepção do isolado L3A21M3, mereceram uma
apreciação global média (II) a elevada (III), comparável com o queijo sem qualquer
cultura (controlo). Observou-se ainda uma correlação significativa (P<0,05) entre a
apreciação global e a firmeza dos queijos testados.
A ausência de estatuto GRAS do E. faecalis, devido à resistência a alguns
antibióticos e presença de factores de virulência em algumas estirpes, levanta
preocupações relativamente à sua aplicação nos alimentos. Os isolados estudados não se
revelaram hemolíticos, nem produziram histamina ou DNase, embora três dos isolados
76
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
tenham testado positivo para a produção de gelatinase. Acresce ainda que estes isolados
não se revelaram resistentes a antibióticos clinicamente importantes, sendo assim
possível a sua utilização em aplicações biotecnológicas.
Deste modo, alguns isolados BAL, em particular a combinação dos isolados
L3B1K3 e L3A21M3, poderão ser utilizados na produção de bacteriocinas in situ para o
controle do crescimento da L. monocytogenes. Em alternativa, as bacteriocinas
produzidas pelas espécies de E. faecalis poderão ser isoladas e purificadas para serem
adicionadas como conservantes aos alimentos. A descoberta de novas bacteriocinas com
elevada actividade contra bactérias indesejáveis pode assim constituir uma vantagem a
ser explorada pela indústria alimentar na criação de produtos seguros e livres de
conservantes artificiais.
Como estudos futuros sugere-se a purificação e identificação das bacteriocinas
produzidas por estes isolados e o isolamento dos respectivos genes para uma aplicação
na produção heteróloga das enterocinas por BAL com estatuto GRAS.
77
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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96
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
ANEXOS
97
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
ANEXO I
Exemplar dos parâmetros avaliados na avaliação organoléptica
98
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
99
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
ANEXO II
Análise estatística dos dados relativos aos queijos do lote 1
100
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
Queijos: 1- L2B21K3, 2- L3B1K3, 3- L3A21K6, 4- L3A21K7, 5- Controlo.
Lote 1 - 50 provadores
Teste comparações globais entre os vários queijos relativamente aos parâmetros
acidez, teor de sal, firmeza, aroma e apreciação global (N = 250).
Quadro 1. Tabela de frequências da conjugação do tipo de queijo com a acidez.
Acidez
1
Queijo
Total
2
3
1
41
7
2
50
2
41
7
2
50
3
38
9
3
50
4
37
12
1
50
5
40
7
3
50
197
42
11
250
Total
Quadro 2. Fisher´s Exact Test relativo ao quadro 1.
Chi-Square Tests
Value
df
Asymp. Sig.
Exact Sig.
Exact Sig.
Point
(2-sided)
(2-sided)
(1-sided)
Probability
a
8
,867
,877
Likelihood Ratio
3,864
8
,869
,887
Fisher's Exact Test
3,907
Pearson Chi-Square
Linear-by-Linear
Association
N of Valid Cases
3,893
,351
b
,880
1
,554
,584
,292
,028
250
a. 5 cells (33,3%) have expected count less than 5. The minimum expected count is 2,20.
b. The standardized statistic is ,592.
101
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
Quadro 3. Tabela de frequências da conjugação do tipo de queijo com o teor de sal.
sal
1
Queijo
Total
2
3
1
34
9
7
50
2
29
14
7
50
3
29
17
4
50
4
25
16
9
50
5
38
155
8
64
4
31
50
250
Total
Quadro 4. Teste do qui-quadrado relativo ao quadro 3.
Chi-Square Tests
Value
df
Asymp. Sig. (2sided)
Pearson Chi-Square
a
8
,173
11,795
8
,161
,256
1
,613
11,541
Likelihood Ratio
Linear-by-Linear
Association
N of Valid Cases
250
a. 0 cells (,0%) have expected count less than 5. The minimum
expected count is 6,20.
Quadro 5. Tabela de frequências da conjugação do tipo de queijo com a firmeza.
Firmeza
1
Queijo
Total
2
Total
3
1
26
18
6
50
2
5
24
21
50
3
21
18
11
50
4
12
21
17
50
5
16
23
11
50
80
104
66
250
102
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
Quadro 6. Teste do qui-quadrado relativo ao quadro 5.
Chi-Square Tests
Value
df
Asymp. Sig. (2sided)
Pearson Chi-Square
a
8
,000
30,237
8
,000
1,238
1
,266
28,219
Likelihood Ratio
Linear-by-Linear
Association
N of Valid Cases
250
a. 0 cells (,0%) have expected count less than 5. The minimum
expected count is 13,20.
Quadro 7. Tabela de frequências da conjugação do tipo de queijo com o aroma.
Aroma
1
Queijo
Total
2
3
1
41
7
2
50
2
32
13
5
50
3
38
11
1
50
4
35
10
5
50
5
37
10
3
50
183
51
16
250
Total
Quadro 8. Fisher´s Exact Test relativo ao quadro 7.
Chi-Square Tests
Value
df
Asymp. Sig.
Exact Sig.
Exact Sig.
Point
(2-sided)
(2-sided)
(1-sided)
Probability
a
8
,528
,537
Likelihood Ratio
7,478
8
,486
,523
Fisher's Exact Test
7,002
Pearson Chi-Square
Linear-by-Linear
Association
N of Valid Cases
7,078
,279
b
,533
1
,597
,625
,312
,026
250
a. 5 cells (33,3%) have expected count less than 5. The minimum expected count is 3,20.
b. The standardized statistic is ,528.
103
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
Quadro 9. Tabela de frequências da conjugação do tipo de queijo com a apreciação
global.
Apreciação
1
Queijo
Total
2
3
1
13
16
21
50
2
6
16
28
50
3
9
19
22
50
4
12
15
23
50
5
11
19
20
50
51
85
114
250
Total
Quadro 10. Teste do qui-quadrado relativo ao quadro 9.
Chi-Square Tests
Value
df
Asymp. Sig. (2sided)
Pearson Chi-Square
a
8
,698
5,706
8
,680
,270
1
,603
5,545
Likelihood Ratio
Linear-by-Linear
Association
N of Valid Cases
250
a. 0 cells (,0%) have expected count less than 5. The minimum
expected count is 10,20.
Teste comparações múltiplas entre os vários queijos relativamente à firmeza (N =
100)
Quadro 11. Tabela de frequências da conjugação do queijo 1 e 5 com a firmeza.
Firmeza
1
2
Total
3
1
26
18
6
50
5
16
23
11
50
42
41
17
100
Queijo
Total
104
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
Quadro 12. Fisher´s Exact Test relativo ao quadro 11.
Chi-Square Tests
Value
df
Asymp. Sig.
Exact Sig.
Exact Sig.
Point
(2-sided)
(2-sided)
(1-sided)
Probability
a
2
,107
,101
Likelihood Ratio
4,508
2
,105
,110
Fisher's Exact Test
4,397
Pearson Chi-Square
Linear-by-Linear
4,461
4,223
Association
N of Valid Cases
,101
b
1
,040
,054
,027
,013
100
a. 0 cells (,0%) have expected count less than 5. The minimum expected count is 8,50.
b. The standardized statistic is 2,055.
Quadro 13. Tabela de frequências da conjugação do queijo 2 e 5 com a firmeza.
Firmeza
1
Total
2
3
2
5
24
21
50
5
16
23
11
50
21
47
32
100
Queijo
Total
Quadro 14. Fisher´s Exact Test relativo ao quadro 13.
Chi-Square Tests
Value
df
Asymp. Sig.
Exact Sig.
Exact Sig.
Point
(2-sided)
(2-sided)
(1-sided)
Probability
a
2
,012
,013
Likelihood Ratio
9,259
2
,010
,012
Fisher's Exact Test
8,894
Pearson Chi-Square
Linear-by-Linear
Association
N of Valid Cases
8,908
8,430
b
,013
1
,004
,005
,003
,002
100
a. 0 cells (,0%) have expected count less than 5. The minimum expected count is 10,50.
b. The standardized statistic is -2,903.
105
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
Quadro 15. Tabela de frequências da conjugação do queijo 3 e 5 com a firmeza.
Firmeza
1
Total
2
3
3
21
18
11
50
5
16
23
11
50
37
41
22
100
Queijo
Total
Quadro 16. Fisher´s Exact Test relativo ao quadro 15.
Chi-Square Tests
Value
df
Asymp. Sig.
Exact Sig.
Exact Sig.
Point
(2-sided)
(2-sided)
(1-sided)
Probability
a
2
,526
,541
Likelihood Ratio
1,289
2
,525
,541
Fisher's Exact Test
1,300
Pearson Chi-Square
Linear-by-Linear
1,285
,436
Association
N of Valid Cases
b
,541
1
,509
,598
,299
,085
100
a. 0 cells (,0%) have expected count less than 5. The minimum expected count is 11,00.
b. The standardized statistic is ,660.
Quadro 17. Tabela de frequências da conjugação do queijo 4 e 5 com a firmeza.
Firmeza
1
2
Total
3
4
12
21
17
50
5
16
23
11
50
28
44
28
100
Queijo
Total
106
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
Quadro 18. Fisher´s Exact Test relativo ao quadro 17.
Chi-Square Tests
Value
df
Asymp. Sig.
Exact Sig.
Exact Sig.
Point
(2-sided)
(2-sided)
(1-sided)
Probability
a
2
,378
,405
Likelihood Ratio
1,960
2
,375
,405
Fisher's Exact Test
1,934
Pearson Chi-Square
Linear-by-Linear
Association
N of Valid Cases
1,948
1,768
b
,405
1
,184
,231
,116
,044
100
a. 0 cells (,0%) have expected count less than 5. The minimum expected count is 14,00.
b. The standardized statistic is -1,330.
Correlação não paramétrica (Spearman) entre a firmeza e a apreciação global
(N=250)
Quadro 19. Correlação não paramétrica entre firmeza e a apreciação global.
Firmeza
Correlation Coefficient
Firmeza
Sig. (2-tailed)
N
Apreciação
,152
.
,016
250
250
Spearman's rho
Apreciação
*
1,000
Correlation Coefficient
,152
*
1,000
Sig. (2-tailed)
,016
.
N
250
250
*. Correlation is significant at the 0.05 level (2-tailed).
107
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
ANEXO III
Análise estatística dos dados relativos aos queijos do lote 2
108
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
Queijos: 1- L3A1M6, 2- L3A21M1, 3- L3A21M3, 4- L3A21M8, 5- Controlo.
Lote 2 - 52 provadores
Teste comparações globais entre os vários queijos relativamente aos parâmetros
acidez, teor de sal, firmeza, aroma e apreciação global (N = 260).
Quadro 1. Tabela de frequências da conjugação do tipo de queijo com a acidez.
Acidez
1
Queijo
Total
2
3
1
29
15
8
52
2
47
5
0
52
3
32
8
12
52
4
42
7
3
52
5
44
7
1
52
194
42
24
260
Total
Quadro 2. Teste do qui-quadrado relativo ao quadro 1.
Chi-Square Tests
Value
df
Asymp. Sig. (2sided)
Pearson Chi-Square
Likelihood Ratio
Linear-by-Linear
Association
N of Valid Cases
a
8
,000
37,058
8
,000
6,041
1
,014
34,825
260
a. 5 cells (33,3%) have expected count less than 5. The minimum
expected count is 4,80.
109
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
Quadro 3. Tabela de frequências da conjugação do tipo de queijo com o teor de sal.
Sal
1
Queijo
Total
2
3
1
25
16
11
52
2
32
15
5
52
3
20
24
8
52
4
25
23
4
52
5
26
18
8
52
128
96
36
260
Total
Quadro 4. Teste do qui-quadrado relativo ao quadro 3.
Chi-Square Tests
Value
df
Asymp. Sig. (2sided)
Pearson Chi-Square
a
8
,224
10,642
8
,223
,015
1
,902
10,616
Likelihood Ratio
Linear-by-Linear
Association
N of Valid Cases
260
a. 0 cells (,0%) have expected count less than 5. The minimum
expected count is 7,20.
Quadro 5. Tabela de frequências da conjugação do tipo de queijo com a firmeza.
Firmeza
1
Queijo
Total
2
Total
3
1
14
19
19
52
2
28
17
7
52
3
19
20
13
52
4
32
15
5
52
5
17
19
16
52
110
90
60
260
110
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
Quadro 6. Teste do qui-quadrado relativo ao quadro 5.
Chi-Square Tests
Value
df
Asymp. Sig. (2sided)
Pearson Chi-Square
a
8
,003
23,852
8
,002
1,006
1
,316
23,192
Likelihood Ratio
Linear-by-Linear
Association
N of Valid Cases
260
a. 0 cells (,0%) have expected count less than 5. The minimum
expected count is 12,00.
Quadro 7. Tabela de frequências da conjugação do tipo de queijo com o aroma.
Aroma
1
Queijo
Total
2
3
1
30
14
8
52
2
38
11
3
52
3
31
13
8
52
4
42
6
4
52
5
39
10
3
52
180
54
26
260
Total
Quadro 8. Teste do qui-quadrado relativo ao quadro 7.
Chi-Square Tests
Value
df
Asymp. Sig. (2sided)
Pearson Chi-Square
Likelihood Ratio
Linear-by-Linear
Association
N of Valid Cases
a
8
,160
12,074
8
,148
4,170
1
,041
11,802
260
a. 0 cells (,0%) have expected count less than 5. The minimum
expected count is 5,20.
111
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
Quadro 9. Tabela de frequências da conjugação do tipo de queijo com a apreciação
global.
Apreciação
1
Queijo
Total
2
3
1
16
13
23
52
2
7
23
22
52
3
20
13
19
52
4
12
16
24
52
5
7
22
23
52
62
87
111
260
Total
Quadro 10. Teste do qui-quadrado relativo ao quadro 9.
Chi-Square Tests
Value
df
Asymp. Sig. (2sided)
Pearson Chi-Square
a
8
,036
16,480
8
,036
,684
1
,408
16,442
Likelihood Ratio
Linear-by-Linear
Association
N of Valid Cases
260
a. 0 cells (,0%) have expected count less than 5. The minimum
expected count is 12,40.
Teste comparações múltiplas entre os vários queijos relativamente à acidez (N =
104)
Quadro 11. Tabela de frequências da conjugação do queijo 1 e 5 com a acidez.
Acidez
1
Total
2
3
1
29
15
8
52
5
44
7
1
52
73
22
9
104
Queijo
Total
112
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
Quadro 12. Fisher´s Exact Test relativo ao quadro 11.
Chi-Square Tests
Value
df
Asymp. Sig.
Exact Sig.
Exact Sig.
Point
(2-sided)
(2-sided)
(1-sided)
Probability
a
2
,003
,003
Likelihood Ratio
12,279
2
,002
,005
Fisher's Exact Test
11,359
Pearson Chi-Square
Linear-by-Linear
11,436
11,248
Association
N of Valid Cases
,003
b
1
,001
,001
,000
,000
104
a. 2 cells (33,3%) have expected count less than 5. The minimum expected count is 4,50.
b. The standardized statistic is -3,354.
Quadro 13. Tabela de frequências da conjugação do queijo 2 e 5 com a acidez.
Acidez
1
Total
2
3
2
47
5
0
52
5
44
7
1
52
91
12
1
104
Queijo
Total
Quadro 14. Fisher´s Exact Test relativo ao quadro 13.
Chi-Square Tests
Value
df
Asymp. Sig.
Exact Sig.
Exact Sig.
Point
(2-sided)
(2-sided)
(1-sided)
Probability
a
2
,489
,555
Likelihood Ratio
1,820
2
,403
,555
Fisher's Exact Test
1,383
Pearson Chi-Square
Linear-by-Linear
Association
N of Valid Cases
1,432
1,123
b
,555
1
,289
,432
,216
,123
104
a. 2 cells (33,3%) have expected count less than 5. The minimum expected count is ,50.
b. The standardized statistic is 1,060.
113
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
Quadro 15. Tabela de frequências da conjugação do queijo 3 e 5 com a acidez.
Acidez
1
Total
2
3
3
32
8
12
52
5
44
7
1
52
76
15
13
104
Queijo
Total
Quadro 16. Fisher´s Exact Test relativo ao quadro 15.
Chi-Square Tests
Value
df
Asymp. Sig.
Exact Sig.
Exact Sig.
Point
(2-sided)
(2-sided)
(1-sided)
Probability
a
2
,004
,003
Likelihood Ratio
12,940
2
,002
,002
Fisher's Exact Test
11,851
Pearson Chi-Square
Linear-by-Linear
11,269
10,306
Association
N of Valid Cases
b
,002
1
,001
,002
,001
,001
104
a. 0 cells (,0%) have expected count less than 5. The minimum expected count is 6,50.
b. The standardized statistic is -3,210.
Quadro 17. Tabela de frequências da conjugação do queijo 4 e 5 com a acidez.
Acidez
1
Total
2
3
4
42
7
3
52
5
44
7
1
52
86
14
4
104
Queijo
Total
114
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
Quadro 18. Fisher´s Exact Test relativo ao quadro 17.
Chi-Square Tests
Value
df
Asymp. Sig.
Exact Sig.
Exact Sig.
Point
(2-sided)
(2-sided)
(1-sided)
Probability
a
2
,593
,766
Likelihood Ratio
1,093
2
,579
,766
Fisher's Exact Test
1,017
Pearson Chi-Square
Linear-by-Linear
1,047
,625
Association
N of Valid Cases
,766
b
1
,429
,557
,279
,116
104
a. 2 cells (33,3%) have expected count less than 5. The minimum expected count is 2,00.
b. The standardized statistic is -,791.
Teste comparações múltiplas entre os vários queijos relativamente à firmeza (N =
104)
Quadro 19. Tabela de frequências da conjugação do queijo 1 e 5 com a firmeza.
Firmeza
1
Total
2
3
1
14
19
19
52
5
17
19
16
52
31
38
35
104
Queijo
Total
Quadro 20. Fisher´s Exact Test relativo ao quadro 19.
Chi-Square Tests
Value
df
Asymp. Sig.
Exact Sig.
Exact Sig.
Point
(2-sided)
(2-sided)
(1-sided)
Probability
a
2
,761
,778
Likelihood Ratio
,548
2
,760
,778
Fisher's Exact Test
,571
Pearson Chi-Square
Linear-by-Linear
Association
N of Valid Cases
,547
,541
b
,778
1
,462
,540
,270
,075
104
a. 0 cells (,0%) have expected count less than 5. The minimum expected count is 15,50.
b. The standardized statistic is -,736.
115
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
Quadro 21. Tabela de frequências da conjugação do queijo 2 e 5 com a firmeza.
Firmeza
1
Total
2
3
2
28
17
7
52
5
17
19
16
52
45
36
23
104
Queijo
Total
Quadro 22. Fisher´s Exact Test relativo ao quadro 21.
Chi-Square Tests
Value
df
Asymp. Sig.
Exact Sig.
Exact Sig.
Point
(2-sided)
(2-sided)
(1-sided)
Probability
a
2
,042
,049
Likelihood Ratio
6,445
2
,040
,049
Fisher's Exact Test
6,262
Pearson Chi-Square
Linear-by-Linear
6,322
6,254
Association
N of Valid Cases
b
,046
1
,012
,017
,008
,004
104
a. 0 cells (,0%) have expected count less than 5. The minimum expected count is 11,50.
b. The standardized statistic is 2,501.
Quadro 23. Tabela de frequências da conjugação do queijo 3 e 5 com a firmeza.
Firmeza
1
2
Total
3
3
19
20
13
52
5
17
19
16
52
36
39
29
104
Queijo
Total
116
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
Quadro 24. Fisher´s Exact Test relativo ao quadro 23.
Chi-Square Tests
Value
df
Asymp. Sig.
Exact Sig.
Exact Sig.
Point
(2-sided)
(2-sided)
(1-sided)
Probability
a
2
,800
,828
Likelihood Ratio
,448
2
,799
,828
Fisher's Exact Test
,473
Pearson Chi-Square
Linear-by-Linear
,447
,384
Association
N of Valid Cases
,828
b
1
,536
,621
,310
,082
104
a. 0 cells (,0%) have expected count less than 5. The minimum expected count is 14,50.
b. The standardized statistic is ,619.
Quadro 25. Tabela de frequências da conjugação do queijo 4 e 5 com a firmeza.
Firmeza
1
Total
2
3
4
32
15
5
52
5
17
19
16
52
49
34
21
104
Queijo
Total
Quadro 26. Fisher´s Exact Test relativo ao quadro 25.
Chi-Square Tests
Value
df
Asymp. Sig.
Exact Sig.
Exact Sig.
Point
(2-sided)
(2-sided)
(1-sided)
Probability
a
2
,004
,005
Likelihood Ratio
11,198
2
,004
,005
Fisher's Exact Test
10,822
Pearson Chi-Square
Linear-by-Linear
Association
N of Valid Cases
10,824
10,719
b
,005
1
,001
,001
,001
,000
104
a. 0 cells (,0%) have expected count less than 5. The minimum expected count is 10,50.
b. The standardized statistic is 3,274.
117
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
Teste comparações múltiplas entre os vários queijos relativamente à apreciação
global (N = 104)
Quadro 27. Tabela de frequências da conjugação do queijo 1 e 5 com a apreciação
global.
Apreciação
1
Total
2
3
1
16
13
23
52
5
7
22
23
52
23
35
46
104
Queijo
Total
Quadro 28. Fisher´s Exact Test relativo ao quadro 27.
Chi-Square Tests
Value
df
Asymp. Sig.
Exact Sig.
Exact Sig.
Point
(2-sided)
(2-sided)
(1-sided)
Probability
a
2
,054
,056
Likelihood Ratio
5,958
2
,051
,052
Fisher's Exact Test
5,772
Pearson Chi-Square
Linear-by-Linear
5,836
1,255
Association
N of Valid Cases
b
,056
1
,263
,319
,160
,053
104
a. 0 cells (,0%) have expected count less than 5. The minimum expected count is 11,50.
b. The standardized statistic is 1,120.
Quadro 29. Tabela de frequências da conjugação do queijo 2 e 5 com a apreciação
global.
Apreciação
1
2
Total
3
2
7
23
22
52
5
7
22
23
52
14
45
45
104
Queijo
Total
118
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
Quadro 30. Fisher´s Exact Test relativo ao quadro 29.
Chi-Square Tests
Value
df
Asymp. Sig.
Exact Sig.
Exact Sig.
Point
(2-sided)
(2-sided)
(1-sided)
Probability
a
2
,978
1,000
Likelihood Ratio
,044
2
,978
1,000
Fisher's Exact Test
,097
Pearson Chi-Square
Linear-by-Linear
,044
,020
Association
N of Valid Cases
1,000
b
1
,888
1,000
,500
,111
104
a. 0 cells (,0%) have expected count less than 5. The minimum expected count is 7,00.
b. The standardized statistic is ,141.
Quadro 31. Tabela de frequências da conjugação do queijo 3 e 5 com a apreciação
global.
Apreciação
1
Total
2
3
3
20
13
19
52
5
7
22
23
52
27
35
42
104
Queijo
Total
Quadro 32. Fisher´s Exact Test relativo ao quadro 31.
Chi-Square Tests
Value
df
Asymp. Sig.
Exact Sig.
Exact Sig.
Point
(2-sided)
(2-sided)
(1-sided)
Probability
a
2
,011
,011
Likelihood Ratio
9,249
2
,010
,011
Fisher's Exact Test
8,956
Pearson Chi-Square
Linear-by-Linear
Association
N of Valid Cases
8,954
4,282
b
,011
1
,039
,051
,025
,011
104
a. 0 cells (,0%) have expected count less than 5. The minimum expected count is 13,50.
b. The standardized statistic is 2,069.
119
Isolamento e caracterização de bactérias do ácido láctico produtoras de bacteriocinas e sua aplicação no fabrico de queijo fresco
Quadro 33. Tabela de frequências da conjugação do queijo 4 e 5 com a apreciação
global.
Apreciação
1
Total
2
3
4
12
16
24
52
5
7
22
23
52
19
38
47
104
Queijo
Total
Quadro 34. Fisher´s Exact Test relativo ao quadro 33.
Chi-Square Tests
Value
df
Asymp. Sig.
Exact Sig.
Exact Sig.
Point
(2-sided)
(2-sided)
(1-sided)
Probability
a
2
,319
,328
Likelihood Ratio
2,304
2
,316
,328
Fisher's Exact Test
2,255
Pearson Chi-Square
Linear-by-Linear
Association
N of Valid Cases
2,284
,271
b
,328
1
,603
,697
,348
,090
104
a. 0 cells (,0%) have expected count less than 5. The minimum expected count is 9,50.
b. The standardized statistic is ,521.
Correlação não paramétrica (Spearman) entre a firmeza e a apreciação global
(N=260)
Quadro 35. Correlação não paramétrica entre a firmeza e a apreciação global.
Firmeza2
Correlation Coefficient
Firmeza
,179
**
.
,004
260
260
**
1,000
Sig. (2-tailed)
,004
.
N
260
260
Correlation Coefficient
Apreciação
1,000
Sig. (2-tailed)
N
Spearman's rho
Apreciação2
,179
**. Correlation is significant at the 0.01 level (2-tailed).
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