IGOR ANTÔNIO DE ARAÚJO PINTO
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL CARCINOGÊNICO DO DIBENZOTIOFENO E
DIBENZOTIOFENO SULFONA EM RATOS WISTAR
Ouro Preto – MG, Outubro de 2012
UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO
INSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATAS E BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL CARCINOGÊNICO DO DIBENZOTIOFENO E
DIBENZOTIOFENO SULFONA EM RATOS WISTAR
AUTOR: Igor Antônio de Araújo Pinto
ORIENTADOR: Prof. Dr. Milton Hércules Guerra de Andrade
COORIENTADOR: Profª. Drª. Cibele Velloso Rodrigues
Dissertação submetida ao programa de PósGraduação do Núcleo de Pesquisas em
Ciências Biológicas da Universidade
Federal de Ouro Preto, como parte
integrante dos requisitos para obtenção do
título de Mestre em Ciências Biológicas,
área de concentração: Biologia Molecular.
Ouro Preto – MG, Outubro de 2012
A663a
Pinto, Igor Antônio de Araújo.
Avaliação do potencial carcinogênico do dibenzotiofeno e
dibenzotiofeno sulfona em ratos wistar [manuscrito] / Igor Antônio de
Araújo Pinto. - 2012.
xix, 90f.: il., color; graf.; tabs.; mapas.
Orientador: Prof. Dr. Milton Hércules Guerra de Andrade.
Coorientadora: Profª. Drª. Cibele Velloso Rodrigues.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Ouro Preto.
Instituto de Ciências Exatas e Biológicas. Núcleo de Pesquisas em
Ciências Biológicas (NUPEB).
Área de concentração: Biologia Molecular.
1. Dibenzotiofeno (DBT) - Teses. 2. Dibenzotiofeno sulfona
(DBTO2) - Teses. 3. Câncer - Teses. 4. Marcadores biológicos de tumor Teses. 5. Proteinase - Inibidores, Bowman-Birk (BBI) - Teses. I.
Universidade Federal de Ouro Preto. II. Título.
CDU: 577.112:616-006
Catalogação: [email protected]
iii
iv
COLABORADORES
Prof. Dr. Wanderson Geraldo de Lima
Profª. Dra. Renata Guerra de Sá Cota
v
Este trabalho foi realizado no LABORATÓRIO DE ENZIMOLOGIA E
PROTEÔMICA – ICEB/NUPEB/UFOP, com auxílio da Coordenadoria de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e Universidade Federal de
Ouro Preto (UFOP).
vi
Dedico esta dissertação aos meus pais e
familiares, incentivadores e cúmplices
do meu aprendizado.
vii
“O sucesso é ir de fracasso em fracasso sem
perder o entusiasmo”
Winston Churchill
viii
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus pela força e serenidade para trilhar meus caminhos.
À minha mãe, sinônimo de amor, força e inspiração. Obrigado por acreditar em
mim e abrir mão de tanto pela minha felicidade. Ao meu pai, pela torcida e exemplos de
vida.
Aos meus irmãos pela amizade, cumplicidade e por sempre estimularem meu
crescimento pessoal e profissional.
À Célia, por todos esses anos de carinho e apoio incondicional.
Ao Prof. Dr. Milton Hércules Guerra de Andrade, pela oportunidade, orientação
e aprendizado. Agradeço pela grande amizade criada nesses anos de convívio.
À Profª. Drª. Cibele Velloso Rodrigues pela cooperação ao longo do trabalho.
Ao Prof. Dr. William de Castro Borges, pela amizade e ensinamentos.
Ao Técnico José Henrique Braga Fortes, pela amizade, piadas e pelos
importantes conselhos durante esses anos de laboratório.
Ao Prof. Dr. Wanderson Geraldo de Lima, pelo aprendizado e colaboração.
À Profª. Drª. Renata Guerra de Sá Cota, pelo aprendizado e colaboração.
Aos alunos da pós-graduação do laboratório, Karina, Marina, Jonathan, Gustavo,
Lorran, Leandro, André, Fernanda e demais alunos do LEP, Aline, Vinícius e Simone.
“Hoje, cheguei ao LEP, peguei meu jaleco e fui trabalhar...”
Às pessoas que me auxiliaram durante a execução do projeto, Karina, Roberta,
Leandro, Victor, Prof. Dr. Laser e Prof. Dr. Leandro.
Aos diversos laboratórios do NUPEB por permitirem o uso de equipamentos e
dependências para realização de parte deste trabalho.
Aos demais professores do NUPEB que contribuíram de maneira construtiva
para a realização deste trabalho.
Enfim, agradeço a todos que direta ou indiretamente contribuíram para a
realização deste trabalho.
ix
ÍNDICE
Resumo...........................................................................................................................xii
Abstract.........................................................................................................................xiv
Lista de Abreviaturas...................................................................................................xvi
Lista de Figuras..........................................................................................................xviii
Lista de Tabelas.............................................................................................................xx
1. Introdução....................................................................................................................2
1.1. Epidemiologia do Câncer................................................................................2
1.2. Biologia do Câncer.........................................................................................3
1.3. Câncer Colorretal............................................................................................5
1.3.1. Carcinogênese Intestinal..................................................................9
1.4. Carcinogênese Química................................................................................11
1.4.1. Dibenzotiofeno (DBT) e seu metabólito Dibenzotiofeno Sulfona
(DBTO2)...................................................................................................13
1.4.2. 1,2-Dimetilhidrazina (DMH) - Indutor Clássico de Câncer..........14
1.5. Marcadores Moleculares do Câncer.............................................................16
1.5.1. O Antígeno Carcinoembrionário (CEA)........................................16
1.5.2. Importância da Molécula CD44.....................................................18
1.6. Importância das Proteases no Desenvolvimento de Neoplasias...................20
1.6.1. Inibidores de Proteases do Tipo Bowman-Birk (BBI)...................22
2. Justificativa e Objetivos............................................................................................27
2.1. Justificativa...................................................................................................27
2.2. Objetivo Geral...............................................................................................27
2.3. Objetivos Específicos...................................................................................27
3. Materiais e Métodos..................................................................................................30
3.1. Indução de Câncer em ratos Wistar tratados com DMH, DBT e DBTO2....30
3.2. Avaliação Morfológica Microscópica (Histologia)......................................31
3.3. Imunohistoquímica.......................................................................................32
3.4. Análise por Fluorescência Direta (FA).........................................................33
3.4.1. Conjugação BBI-FITC...................................................................33
3.4.2. Preparação dos Cortes Histológicos para FA.................................33
3.5. Captura e Análise de Imagens......................................................................34
x
3.6. Análise da Expressão Gênica por qPCR (Real Time)...................................35
3.6.1. Oligonucleotídeos Iniciadores (Primers).......................................35
3.6.2. Extração de RNA Total..................................................................36
3.6.3. RT-PCR e Obtenção dos cDNA’s..................................................37
3.6.4. Reação da PCR Quantitativa em Tempo Real (qPCR)..................38
3.6.5. Curva de Eficiência dos Primers...................................................39
3.6.6. Curva de Dissociação dos Amplicons............................................41
3.7. Análise Estatística.........................................................................................42
4. Resultados e Discussão..............................................................................................44
4.1. Efeitos Biológicos da Indução Química por DBT, DBTO2 e DMH em Ratos
Wistar...................................................................................................................44
4.1.1. Variação Massa Corporal dos Animais Associada aos
Carcinógenos Durante Tratamento..........................................................44
4.1.2. Avaliação das Alterações de Peso do Fígado e do Baço................45
4.2. Avaliações Morfológicas Macroscópicas.....................................................46
4.3. Avaliações Morfológicas Microscópicas (Histologia).................................47
4.4. Imunohistoquímica.......................................................................................54
4.5. Ensaios de Fluorescência com BBI – FITC..................................................58
4.6. Expressão Gênica Relativa dos Transcritos Avaliados.................................60
5. Conclusão...................................................................................................................67
6. Perspectivas................................................................................................................70
7. Referências Bibliográficas…………………………………………………………71
8. Anexos.........................................................................................................................88
xi
RESUMO
O elevado nível de compostos sulfurados em derivados do petróleo é
considerado prejudicial à qualidade de combustíveis, sendo sua remoção, mesmo que
parcial uma das exigências no processo de refino. Além disso, legislações específicas
delimitam sua concentração máxima em combustíveis fósseis, a fim de minimizar
efeitos negativos dos compostos organossulfurados no ambiente. Dentre tais compostos,
o dibenzotiofeno (DBT) é um hidrocarboneto policíclico aromático sulfurado, referência
em trabalhos de remediação ambiental e com atividade carcinogênica. Considerando a
importância dessa classe de substâncias na oncogênese e a escassez de estudos
toxicológicos relacionados ao DBT, essa dissertação apresenta como objetivo, uma
avaliação dos efeitos tóxicos provocados pelo tratamento crônico de ratos Wistar com
doses sub-letais de DBT e de seu derivado oxidado DBTO2 (dibenzotiofeno sulfona), e
compara o potencial toxicológico dessas substâncias com o agente mutagênico clássico
1,2-dimetilhidrazina (DMH). Esse trabalho permitiu uma avaliação do tratamento
crônico com a dose de 30 mg/Kg de DBT e DBTO2 em ratos Wistar, sendo observadas
lesões pré-neoplásicas nos intestinos delgado e grosso dos animais tratados, com
intensidade e características semelhantes às lesões observadas no cólon de ratos tratados
com DMH. As lesões, identificadas pelas análises histopatológicas, indicaram a
ocorrência de um processo neoplásico em fase inicial de desenvolvimento. Além disso,
verificou-se a marcação de células empregando-se técnicas imunohistoquímicas com
anticorpos para o antígeno carcinoembrionário (CEA) e CD44, para os grupos DMH,
DBT e DBTO2, com intensidades semelhantes. Através dessa avaliação, tais resultados
indicam que a capacidade de induzir neoplasias do DBT e do DBTO2, se assemelha ao
DMH, que é considerado um potente carcinógeno. Além disso, foi realizada análise da
expressão gênica, por meio de qPCR, de transcritos de Cd44, c-Myc, c-Jun, Stat3,
Psma6, Mapk3 e Sulf1, que são genes conhecidos como bons indicadores de câncer em
fase avançada. Esses resultados apontaram que não ocorreram alterações nos níveis de
expressão desses genes suficientes para a detecção em extratos de pólipos intestinais.
Paralelamente, investigando-se a possibilidade de utilizar o inibidor Bowman-Birk
como ligante específico de proteases usualmente superexpressas em tumores, cortes
xii
frescos de pólipos intestinais foram incubados com um conjugado BBI-FITC.
Verificou-se uma marcação do conjugado BBI-FITC mais intensa em todos os grupos
submetidos aos tratamentos com os agentes químicos. O aumento da fluorescência nos
grupos testes foi em torno de 1,7 vezes maior em relação aos controles, e de maneira
semelhante entre os grupos DMH, DBT e DBTO2. Sendo assim, verificou-se que o
conjugado BBI-FITC, proposto como um ligante específico de proteases tripsina e
quimotripsina símiles, indicou ser satisfatório para detecção do aumento da
concentração de proteases-alvo do BBI, em animais tratados com agentes carcinógenos
em estágio neoplásico inicial de desenvolvimento. Esses resultados demonstram que os
inibidores de Bowman-Birk podem ser úteis no diagnóstico precoce de análises
histopatológicas de animais submetidos à exposição a agentes químicos como DMH e
também para os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos sulfurados como o DBT e
DBTO2.
xiii
ABSTRACT
The high level of sulfur compounds in petroleum is detrimental to the quality of
fuels, and its removal, even partially, is one of the requirements in the refining process.
Furthermore, specific laws delimit its maximum concentration in fossil fuels, in order to
minimize negative effects of organosulfur compounds in the environment. Among such
compounds, dibenzothiophene (DBT) is a polycyclic aromatic hydrocarbon sulphide, a
reference in environmental remediation works and with carcinogenic activity.
Considering the importance of this class of substances in oncogenesis and the lack of
toxicological studies related to DBT, this dissertation presents the objective, an
assessment of the toxic effects caused by chronic treatment of rats with sub lethal doses
of DBT and its oxidized derivative DBTO2 (dibenzothiophene sulfone), as well as
compares the toxicological potential of these substances with the classic mutagen 1,2dimethylhydrazine (DMH). This work performed an assessment of chronic treatment at
the dose of 30 mg/kg of DBT and DBTO2 in Wistar rats, precancerous lesions in small
and large intestines of the treated animals were observed, with intensity and
characteristics similar to those reported lesions in the colon of rats treated with DMH.
The lesions identified by histopathological analysis indicated the occurrence of a
neoplastic process in early development. Furthermore, there was labeling of cells
employing immunohistochemical techniques with antibodies to carcinoembryonic
antigen (CEA) and CD44, for groups DMH, DBT and DBTO2 with similar intensity.
Through this assessment, these results indicate that the ability to induce tumors of DBT
and DBTO2 resembles the DMH, which is considered a potent carcinogen. Furthermore,
analysis was performed of gene expression by qPCR of transcripts Cd44, c-Myc, c-Jun,
Stat3, Psma6, Mapk3 e Sulf1, which are known genes to be good indicators of advanced
cancer. These results indicated that no changes in expression levels of these genes
sufficient for detection in extracts of intestinal polyps. In parallel, investigating the
possibility of using the Bowman-Birk inhibitor as a specific ligand of proteases usually
over expresses tumors, fresh cuts of polyps were incubated with a FITC-BBI
conjugated. There was a labeling FITC-BBI conjugated more intense in all groups
submitted to treatment with chemical agents. The increase in fluorescence in the test
groups was around 1.7 times higher than in controls, and similarly between groups
xiv
DMH, DBT and DBTO2. Thus, it was found that the BBI-FITC conjugate, proposed as
a specific binder of proteases trypsin and chymotrypsin similes, indicated to be
satisfactory for detection of increased concentrations of the BBI target proteases in
animals treated with carcinogens at the initial stage of neoplastic development. These
results demonstrate that the Bowman-Birk inhibitors may be useful in the early
diagnosis of pathological examinations of animals subjected to exposure to chemical
agents such as DMH and polycyclic aromatics sulphides as DBT and DBTO2.
xv
LISTA DE ABREVIATURAS
A - Adenina
ACF - Focos de criptas aberrantes
Actb - Actina β
ANOVA - Análise de variância
Apc - Adenomatous polyposis coli
BBI - Inibidores tipo Bowman-Birk
CcnD1 - Ciclina D1
CCR - Câncer colorretal
CD44 - Cluster of differentiation 44
Cd44 - Gene que codifica a proteína CD44
cDNA - DNA complementar
CEA - Carcinoembrionic antigen
CEUA - Comissão de ética no uso de animais
c-Jun - Proto-oncogene que codifica a proteína JUN
c-Myc - Myelocytomatosis proto-oncogene
Ctnnb1 - β-catenina
DBT - Dibenzotiofeno
DBTO2 - Dibenzotiofeno sulfona
Dcc - Deleted in colorectal carcinoma
DL50 - Dose Letal 50%
DMH - 1,2-Dimetilhidrazina
DMSO - Dimetilsulfóxido
DNA - Ácido desoxirribonucleico
F’ - Primer forward
FA - Fluorescência direta
FITC - Isotiocianato de fluoresceína
G - Guanina
HE - Hematoxilina/Eosina
HPAs - Hidrocarbonetos policíclicos aromáticos
HRP - Horseradish peroxidase
IARC - Agência internacional para pesquisa em câncer
xvi
IHQ - Imunohistoquímica
INCA - Instituto Nacional do Câncer
kDa - KiloDalton
K-ras - Rat sarcoma gene
KTI - Inibidores do tipo Kunitz
Mapk3 - Mitogen activated protein kinase 3
nm - Nanômetro
ng/mL - Nanogramas por mililitros
O6-MeG - Oxigênio ligado ao carbono seis da guanina
p185HER2 - Human epidermal growth factor receptor 2 gene
P450 - Família de proteínas celulares com um pigmento característico a 450 nm
p53 - Proteína 53
PCR - Reação em cadeia da polimerase
Psma6 - Proteasome subunit alpha type 6
qPCR - Quantitative polymerase chain reaction
R’ - Primer reverse
R2 - Coeficiente de correlação dos genes
RGD - Rat genome database
RNA - Ácido ribonucleico
RNAm - Ácido ribonucleico mensageiro
Stat3 - Signal transducer and activator of transcription 3
Sulf1 - Sulfatase 1
TCF - T-cell family
Tm - Melting temperature
WHO - World Health Organization
Wnt - Wingless tail, via sinalizadora celular que controla a comunicação célula-célula.
xvii
Lista de Figuras
Figura 01: Distribuição proporcional dos dez tipos de câncer mais incidentes por sexo,
estimados para 2012 no Brasil, exceto pele não melanoma............................................02
Figura 02: Sequência adenoma-carcinoma em câncer colorretal...................................07
Figura 03: Modelo da via sinalizadora Wnt...................................................................10
Figura 04: Esquema de acumulação de alterações genéticas em células susceptíveis...11
Figura 05: Modelo da via 4S de oxidação do DBT........................................................14
Figura 06: Modelo de metilação do oxigênio ligado ao carbono seis da guanina causado
pela DMH........................................................................................................................16
Figura 07: Esquema de interação de uma isoforma de CD44 na sinalização oncogênica
e progressão tumoral........................................................................................................17
Figura 08: Modelo estrutural para o antígeno carcinoembrionário................................19
Figura 09: Esquema das etapas de progressão tumoral e do envolvimento das proteases
no desenvolvimento do câncer........................................................................................21
Figura 10: Estrutura do BBI da soja, como determinado por Odani e Ikenaka (1973)..23
Figura 11: Esquema representativo do tempo de tratamento e de espera para o
desenvolvimento de alterações patológicas nos animais tratados com DMH, DBT e
DBTO2.............................................................................................................................31
Figura 12: Análise da qualidade das extrações de RNA total........................................37
Figura 13: Gráfico de amplificação referente à curva de eficiência do gene c-Myc
utilizando diluição seriada de 5x de cDNA de pólipos intestinais..................................39
Figura 14: Curva padrão referente ao gene c-Myc utilizando diluição seriada de 5x de
cDNA de pólipos intestinais............................................................................................40
Figura 15: Curva de dissociação referente ao amplicon do primer c-Myc.....................41
Figura 16: Gráfico de acompanhamento de peso dos animais pertencentes aos grupos
controles e testes ao longo de 10 semanas de tratamento................................................45
Figura 17: Relações Peso Fígado/Peso Animal provenientes dos grupos controles e
testes ao final do período de tratamento/latência.............................................................45
Figura 18: Relações Peso Baço/Peso Animal provenientes dos grupos controles e testes
ao final do período de tratamento/latência......................................................................46
Figura 19: Fotografias de pólipos intestinais (grosso e delgado) induzidos por
tratamento químico em ratos Wistar................................................................................47
xviii
Figura 20: Fotomicrografias de cortes histológicos de intestino delgado (4µm) coradas
pela técnica de HE...........................................................................................................52
Figura 21: Fotomicrografias de cortes histológicos de intestino grosso (4µm) coradas
pela técnica de HE...........................................................................................................53
Figura 22: Gráfico com os resultados obtidos da quantificação de células marcadas pelo
anticorpo para CEA nos cinco grupos avaliados.............................................................55
Figura 23: Gráfico com os resultados obtidos da quantificação de células marcadas pelo
anticorpo para CD44 nos cinco grupos avaliados...........................................................56
Figura 24: Fotomicrografias de cortes histológicos de intestino delgado (4µm)
marcados pela técnica de imunohistoquímica para os anticorpos CD44 e CEA, nos cinco
grupos avaliados..............................................................................................................57
Figura 25: Gráfico com os resultados obtidos da quantificação média da intensidade de
fluorescência (UA) de regiões marcadas por fluorescência direta, pelo conjugado BBIFITC, em intestinos delgados dos cinco grupos avaliados.............................................59
Figura 26: Fotomicrografias de cortes histológicos de intestino delgado (20µm)
marcados pela técnica de fluorescência direta, pelo conjugado BBI-FITC, nos cinco
grupos avaliados..............................................................................................................60
Figura 27: Gráficos da expressão gênica dos transcritos selecionados nos pólipos de
intestino delgado nos grupos controle óleo, DBT, DBTO2 e DMH................................63
xix
Lista de Tabelas
Tabela 01: Número de acesso ao RGD das sequências de primers forward (F’) e
reverse (R’), referentes aos genes avaliados, temperatura de melting (Tm) e tamanho do
amplicon gerado..............................................................................................................34
Tabela 02: Sequências de primers forward (F’) e reverse (R’), slope, eficiência de
reação e coeficiente de correlação (R2) referentes aos genes avaliados..........................39
Tabela 03: Comparação de frequência das lesões observadas no Fígado para os grupos
Controle Óleo, Controle Salina, Teste DBT, Teste DBTO2 e Teste DMH.....................47
Tabela 04: Comparação de frequência das lesões observadas no Intestino Delgado para
os grupos Controle Óleo e Controle Salina.....................................................................47
Tabela 05: Comparação de frequência das lesões observadas no Intestino Grosso para
os grupos Controle Óleo e Controle Salina.....................................................................48
Tabela 06: Frequência das lesões observadas no Intestino Delgado para os grupos
Controle Salina e Teste DMH 30 mg/Kg........................................................................48
Tabela 07: Frequência das lesões observadas no Intestino Grosso para os grupos
Controle Salina e Teste DMH 30 mg/Kg........................................................................49
Tabela 08: Frequência das lesões observadas no Intestino Delgado para os grupos
Controle Óleo, Teste DBT 30 mg/Kg e Teste DBTO2 30 mg/Kg...................................49
Tabela 09: Frequência das lesões observadas no Intestino Grosso para os grupos
Controle Óleo, Teste DBT 30 mg/Kg e Teste DBTO2 30 mg/Kg...................................50
xx
1. Introdução
1
1. Introdução
1.1. Epidemiologia do Câncer
De acordo com a Agência Internacional para Pesquisa em Câncer (IARC) e a
Organização Mundial de Saúde (WHO), o câncer é a principal causa de mortes no
mundo, respondendo por 7,6 milhões em 2008 (cerca de 13% de todos óbitos). Isso
corresponde a uma porcentagem maior do que a mortalidade causada por HIV,
tuberculose e malária juntas. Os principais tipos de cânceres são: pulmonar (1,37
milhões de mortes), estômago (736.000), fígado (695.000) e colorretal (608.000).
Mesmo com o desenvolvimento de novas estratégias de prevenção e combate a esta
doença, a projeção de falecimentos por sua decorrência continua a crescer, com uma
estimativa de 13,1 milhões de óbitos em 2030 (WHO, 2010; IARC, 2010).
No Brasil, um estudo do Ministério da Saúde indica que serão diagnosticados
518.510 novos casos de câncer em 2012. Tal projeção foi estimada pelo Instituto
Nacional de Câncer (INCA). Segundo a entidade, as estimativas são a principal
ferramenta de planejamento da saúde pública na área oncológica, porque fornecem
informações para a criação de políticas públicas de atendimento (Fig. 01).
Figura 01: Distribuição proporcional dos dez tipos de câncer mais incidentes por sexo, estimados para
2012 no Brasil, exceto pele não melanoma. (Números arredondados para 10 ou múltiplos de 10).
Fonte: INCA, 2012.
Embora a incidência de alguns cânceres seja comparável em todo mundo, muitos
variam drasticamente por país e, por isso, não podem ser justificados por apenas um
processo biológico anormal ao acaso. Diferenças de hereditariedade ou ambientais
2
podem explicar essas variações. Estudos epidemiológicos mostraram que o ambiente é
determinante nas variações entre países na incidência do câncer (PETO, 2001).
O aumento da expectativa de vida, juntamente com a maior exposição a fatores
cancerígenos aumenta a ocorrência de casos de câncer, levando a idade a ser
considerada o seu maior fator de risco para ambos os sexos. A redefinição dos padrões
de vida, a partir da uniformização das condições de trabalho, nutrição e consumo
desencadeados pelo processo global de industrialização, refletem no perfil
epidemiológico das populações (MONTESANO et al, 2001). Tais modificações,
caracterizada pela redução das taxas de mortalidade e natalidade, provocaram o
aumento da expectativa de vida e envelhecimento populacional no Brasil, levando ao
aumento
da
incidência
de
doenças
crônico-degenerativas,
especialmente
as
cardiovasculares e o câncer (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2006).
Apesar do crescente aumento no número de casos novos de câncer no Brasil e no
mundo observa-se uma redução na taxa de mortalidade, fato este que pode ser atribuído
às constantes e incessantes pesquisas nas áreas de diagnóstico e tratamento dessa doença
(IARC, 2010).
Diante das taxas de incidência e estimativas futuras podemos perceber que o
câncer representa um verdadeiro problema de saúde pública em todo o mundo. A partir
desse panorama é fundamental a manutenção de investimentos no desenvolvimento de
ações e pesquisas relacionadas ao controle do câncer.
1.2. Biologia do Câncer
O câncer é uma doença complexa e multicausal que ocorre como consequência
do acúmulo progressivo de mutações no genoma de uma célula (WHO, 2010). Essas
sucessivas alterações genéticas podem converter uma célula normal em uma célula
alterada, afetando seu funcionamento e capacidade de resposta aos sinais no controle da
proliferação, diferenciação celular e na apoptose. Normalmente, diversos fatores
promotores atuam anteriormente ao desenvolvimento neoplásico, sendo que em poucos
casos, uma mutação única seja suficiente para o estabelecimento da doença.
Os danos genéticos responsáveis pelo surgimento do câncer ocorrem
preferencialmente em genes que regulam o crescimento, diferenciação e proliferação
celular, como os proto-oncogenes, anti-oncogenes (supressores de tumor) e genes de
3
microRNA’s. Os proto-oncogenes são genes normais do organismo que têm o potencial
intrínseco de induzir neoplasias, porém necessitam ser ativados em oncogenes. Sua
ativação é desencadeada através de alterações genéticas que potenciam suas atividades
convertendo-os em oncogenes (BUTEL, 2000).
Inversamente, os genes supressores de tumor são elementos genéticos cuja perda
ou inativação permitem às células apresentarem algum dos vários fenótipos da
transformação neoplásica. Esta inativação poderia ser causada por disfunções, como
uma metilação do gene ou deleção deste (LI, 2009a). Os produtos desses anti-oncogenes
são componentes das vias de sinalização intercelular que permitem à célula receber e
processar sinais inibidores do seu redor. Quando a célula perde componentes críticos
desta rede de sinalização, perde a capacidade de responder a certos sinais extracelulares
inibidores da proliferação, mesmo que estes sinais ainda estejam presentes no meio
celular (CROCE, 2008).
Os genes de microRNA’s, ao contrário dos genes supressores de tumor e
oncogenes, não codificam proteínas. O produto desses genes consiste em moléculas de
RNA de 19-25 nucleotídeos, que atuam como potentes reguladores pós-transcricionais
da expressão gênica (CROCE, 2008). Tal regulação pós-transcricional exercidas pelos
microRNA’s depende do grau de complementaridade com o RNA mensageiro (RNAm)
alvo, podendo ocorrer por inibição traducional ou degradação do RNAm. O pareamento
de modo imperfeito com o RNAm acarreta a inibição traducional do alvo, sendo o
mecanismo principal de atuação dos microRNA’s em mamíferos (BRENNECKE et al,
2005).
Apesar de agirem inicialmente de forma distinta, todos os agentes oncogênicos
têm a mesma via final: transformação de proto-oncogenes em oncogenes e/ou inibição
de supressores de tumor. Em diferentes tipos de tumores, mutações em um gene
específico parecem preceder as mutações em outros. Pelo fato dos oncogenes e genes
supressores de tumor controlarem o crescimento celular de formas diferentes, talvez a
ordem na qual, tais controles são interrompidos, não seja importante, mas sim que um
número suficiente de vias críticas tenha sido desregulada para que o crescimento do
tumor ocorra (BUTEL, 2000).
Usualmente, tumores possuem clones diferentes que surgem a partir de uma
célula inicial transformada através de alterações genéticas. Esta heterogeneidade
contribui para as diferenças no comportamento clínico e respostas ao tratamento de
tumores do mesmo tipo de diagnóstico. Estas populações podem diferir na sensibilidade
4
à quimioterapia, radioterapia e outros tratamentos, tornando difícil o manejo clínico. Por
estas razões, as etapas iniciais do desenvolvimento cancerígeno são de considerável
importância clínica e uma prioridade no desenvolvimento de seu tratamento (CROCE,
2008).
O sucesso da terapia e consequente redução na mortalidade dos pacientes
acometidos por essa doença baseiam-se principalmente na detecção precoce e na
evolução das técnicas utilizadas para o tratamento dessa doença. As terapias no caso do
câncer colorretal (CCR), apesar dos relevantes avanços nas técnicas tradicionais de
cirurgia (ressecções clássicas, ampliadas e laparoscópicas), quimioterapia e radioterapia
(ou até mesmo terapia combinada), ainda são técnicas que apresentam eficiência
limitada. Além disso, apresentam graves complicações pós-operatórias como infecções,
deiscência da anastomose e recaídas. Tais enfermidades aumentam substancialmente o
custo do tratamento, tempo de internação, perpetuam sequelas funcionais e contribuem
para indesejável índice de mortalidade (SANTOS JR., 2011).
1.3. Câncer Colorretal
O Câncer Colorretal (CCR) constitui atualmente uma neoplasia de ocorrência
universal e de importância crescente como problema de saúde pública. Sua incidência
varia de maneira diferente entre países, representando a terceira causa de câncer no
mundo entre ambos os sexos e a segunda em países desenvolvidos (LOPEZ et al, 1993;
JEMAL et al, 2005).
O desenvolvimento de várias formas comuns de câncer colorretal é resultado da
interação entre fatores endógenos (histórico familiar e doenças crônicas intestinais) e
ambientais (dieta, tabagismo, obesidade e ingestão de hidrocarbonetos aromáticos),
sendo o mais notável dentre tais fatores, a dieta. Uma dieta com base em um alto
consumo de frutas, vegetais frescos, cereais e peixes, bem como a prática de atividade
física, estão associados a um baixo risco de desenvolvimento do câncer do cólon e reto.
Por outro lado, o consumo excessivo de carne vermelha, embutidos e bebidas
alcoólicas, o tabagismo e a obesidade ou o sobrepeso favorecem o desenvolvimento
desse tipo de câncer. Mas os fatores de risco mais relevantes são os fatores genéticos
como, a história familiar de câncer colorretal e a predisposição ao desenvolvimento de
doenças crônicas do intestino, como a retocolite ulcerativa e a doença de Crohn, que
5
causam inflamação em graus variados na mucosa do intestino grosso. As doenças
inflamatórias intestinais estão associadas ao maior risco de câncer colorretal,
especialmente em indivíduos com doença com mais de oito anos de evolução. A idade
também é considerada um fator de risco, uma vez que tanto a incidência como a
mortalidade aumentam com a idade (DOLL and PETO, 1981; PLATZ et al, 2000;
FERRARI et al, 2007).
A incidência de CCR tem aumentado no âmbito geral devido, possivelmente, ao
envelhecimento das populações, bem como à adoção de estilo de vida sedentária e a
adoção de hábitos alimentares pouco saudáveis, como a dieta baseada em gorduras
animais, baixa ingestão de frutas, vegetais e cereais, assim como consumo excessivo de
tabaco e álcool (FRANCO et al, 2004; FERRARI et al, 2007). Como fatores protetores
são citados o cálcio, a vitamina D, os folatos, o selênio e os antioxidantes (MARQUESVIDAL, 2006).
Essa neoplasia é considerada de bom prognóstico se a doença for diagnosticada
em estádios iniciais. A sobrevida média global em cinco anos se encontra em torno de
55% nos países desenvolvidos e 40% para países em desenvolvimento. Assemelhandose à incidência, as taxas de mortalidade são mais baixas em mulheres do que nos
homens (WHO, 2007). Para seu diagnóstico precoce podem ser utilizados os exames de:
toque retal, pesquisa de sangue oculto nas fezes, enema opaco, retossigmoidoscopia e
colonoscopia. Em casos de descoberta de tecidos suspeitos são realizadas biópsias para
verificação da presença de células malignas, já que a biópsia é o único exame que pode
determinar a presença de câncer.
A dosagem sérica de marcadores tumorais, como o antígeno carcinoembrionário
(CEA), tem valor principalmente no controle pós-operatório da doença e não para o
diagnóstico do câncer colorretal, devido à sua baixa sensibilidade e especificidade no
sangue para este marcador. Sua simples detecção pode indicar a presença de recidiva da
doença durante o período de seguimento (MITCHELL et al, 2001).
Os adenomas constituem os tipos de pólipos mais frequentemente encontrados
no intestino delgado, possuindo predileção pelo duodeno distal embora possam ser
encontrados em toda a sua extensão. Histologicamente, eles são similares aos adenomas
encontrados na região colorretal tendendo a apresentar uma arquitetura de vilos mais
pronunciada. Embora os adenomas sejam benignos, eles têm o potencial para causar
sérias complicações, comprimindo outras estruturas (efeito de massa) e levando a
desregulação hormonal. Normalmente são removidos por causa da tendência de ficarem
6
malignos, sendo o risco de tal progressão aumenta quanto maior for o pólipo
(BROSENS et al, 2010).
A transformação de células epiteliais normais em adenomas e carcinomas segue,
usualmente, um modelo de progressão de estágios histológicos e alterações genéticas e
epigenéticas simultâneas (ex. metilação do DNA, acetilação de histonas) (FEARON et
al, 1990) (Fig. 02). Tais alterações fornecem às células neoplásicas vantagens sob sua
expansão clonal e levam à perda da inibição por contato celular, evasão de mecanismos
apoptóticos e de interrupção do ciclo celular, aquisição de características do tipo célula
tronco, entre outros (CARDOSO et al, 2007).
Figura 02: Sequência adenoma-carcinoma em câncer colorretal. A iniciação e progressão da
tumorogênese de uma mucosa normal até carcinoma e metástase é geralmente associada a características
morfológicas (colonoscopia) e histopatológicas (fotomicrografias de cortes histológicos).
Fonte: Adaptado de CARDOSO et al, 2007.
Consequentemente ao longo dessa via adenoma-carcinoma-metástase, estágios
mais histologicamente avançados de CCR terão acumulado maior quantidade de
alterações genéticas que estágios precoces de adenoma. Porém sob uma perspectiva
histológica, esta sequência é iniciada quando surgem pequenas lesões na arquitetura
glandular do epitélio intestinal, chamadas focos de criptas aberrantes (ACF). Os ACF
são agregados de criptas anormais caracterizados por hiperproliferação, tamanho
aumentado, zonas pericrípticas expandidas e fendas alongadas (ROSENBERG, 1995).
Tais focos de criptas são lesões pré-neoplásicas consideradas marcadores do câncer de
cólon e muito utilizados em estudos experimentais de quimioprevenção. São lesões
7
encontradas tanto no cólon de roedores tratados com cancerígenos químicos, quanto em
seres humanos acometidos por polipose ou propriamente câncer de cólon (ALRAWI et
al, 2006).
Na maioria dos casos, os ACF têm como origem mutações em enterócitos,
ocasionando a não migração correta destas células para fora da cripta colônica,
acumulando-se. O acúmulo destas populações de células e suas descendentes, que
sustentam tais mutações, permanecem retidas nas criptas, cada vez mais propensas a
novas alterações, ao invés de serem destruídas por apoptose (PAPANIKOLAOU et al,
1998, 2000).
A descoberta de mudanças genéticas restritas às células neoplásicas demonstra
que a detecção em estágio inicial de tumores colorretais é possível através de
identificação de produtos de genes alterados secretados no sangue ou nas fezes, ou pela
detecção de anticorpos do paciente contra tais produtos. A identificação dessas
mudanças genéticas é o principal objetivo atual da pesquisa em câncer. Desde o início
da década de 90 é relatada uma importante correlação entre a incidência de danos ao
DNA no âmbito molecular e uma maior frequência do fenótipo neoplásico (FEARON
and VOGELSTEIN, 1990; LIOTTA et al, 1991). Alterações na expressão gênica são
diretamente responsáveis pela progressão ao fenótipo maligno, então se faz necessária à
busca de marcadores tumorais envolvidos nas mudanças fenotípicas (proteínas, RNAm)
e genotípicas (mutações, deleções, translocações cromossomais).
Já foram descritos genes envolvidos na carcinogênese colorretal que estão
significativamente alterados, entretanto, métodos de classificação e estadiamento do
tumor e realização de prognósticos mais robustos e menos invasivos continuam sendo
necessidades médicas ainda não atendidas (HOOPS et al, 1997; NAMBIAR et al,
2010).
Embora as alterações moleculares relacionadas ao CCR tenham sido
extensivamente investigadas, poucos pesquisadores têm descrito as aplicações desses
biomarcadores na detecção de estágios primários de diagnóstico e prevenção do câncer
colorretal. Considerando que o CCR pode ser prevenido se o adenoma for diagnosticado
e removido, torna-se necessária a identificação de marcadores capazes de diagnosticar
de maneira tecido-específica e precoce as alterações iniciais que ocorrem durante o
desenvolvimento desta doença (CHANG et al, 2005).
8
1.3.1. Carcinogênese Intestinal
A carcinogênese é um complexo processo envolvendo diversas mudanças
genéticas e epigenéticas, ocorrendo em níveis moleculares, celulares e morfológicos,
que pode ser dividida em três estágios principais: iniciação, promoção e progressão
(PITOT, 2001).
A iniciação pode ser caracterizada por alterações na sequência do DNA celular
provocada pela exposição a um agente cancerígeno químico, físico ou biológico. Esta
interação pode levar às células iniciadas, responsividade alterada ao microambiente e
vantagem proliferativa. Na etapa de promoção, as células iniciadas se multiplicam
formando lesões pré-neoplásicas (displasias e anaplasias) sob estímulos promotores. O
agente cancerígeno promotor age de forma a selecionar as células iniciadas e dessa
forma ocorre a expansão clonal das mesmas, levando a um acúmulo de mutações e
aumentando a instabilidade genética. Já no estágio de progressão tumoral ocorre a
aquisição de múltiplas alterações genéticas que desencadeiam multiplicação
descontrolada e irreversível das células alteradas. Quando tais células invadem vasos
sanguíneos e/ou linfáticos, alcançam tecidos distantes do hospedeiro formando sítios de
metástases (PAPANIKOLAOU et al, 2000; PITOT, 2001).
Segundo o modelo da sequência adenoma-adenocarcinoma colorretal de Fearon
e Vogelstein (1990), os genes que são mutados nos estágios iniciais do câncer de cólon
são o Apc (transição epitélio normal para adenoma) e o K-ras (presente em adenomas),
e logo em seguida os supressores de tumorais Dcc e p53 (na transição adenoma para
carcinoma) (NAMBIAR et al, 2010).
De acordo com a literatura, mutações em Apc ou β-catenina estão relacionadas
com a maioria dos tumores de cólon humanos e em roedores. Acredita-se que a primeira
alteração que ocorre é a mutação do gene Apc, envolvido com a regulação da proteína
β-catenina, organização do citoesqueleto, apoptose, controle do ciclo celular e adesão
celular. Mutações no gene Apc são consideradas os principais fatos responsáveis e
causadores da Polipose Adenomatosa Familiar (TAKAHASHI et al, 2004; TANAKA,
2009).
A proteína APC é o principal fator de sinalização da via Wnt (mais conhecida
por seu papel na embriogênese e desenvolvimento de câncer), que regula a ligação e
degradação da β-catenina pelo proteassoma. A β-catenina, por sua vez, é uma proteína
que está relacionada com a adesão célula-célula encontrada normalmente conjugada
9
com a e-caderina, importante proteína do controle da arquitetura tecidual. Quando os
genes Apc e Ctnnb1 (codifica β-catenina) são mutados ou a via sinalizadora Wnt é
ativada, a β-catenina deixa de ser degradada e acumula-se no citoplasma, liga-se a
fatores de transcrição TCF e move-se para o núcleo, resultando no aumento da
expressão de genes ligados a proliferação celular como c-Myc e CcnD1 (que codifica
ciclina D1 - inibidor de supressores de tumor), importantes na carcinogênese (Fig. 03)
(TAKAHASHI et al, 2004; TANAKA, 2009). Outros importantes genes no
desenvolvimento tumoral que são regulados pela via β-catenina/TCF são c-Jun e Cd44
(NARAYAN et al, 2003).
Figura 03: Modelo da via sinalizadora Wnt. (A) Retrata a regulação diminuída da ativação transcricional
da β-catenina em células epiteliais normais do cólon. Na ausência da sinalização Wnt, a proteína APC
auxilia na fosforilação da β-catenina que seguirá a via de degradação pelo proteassoma. Dessa forma a
expressão dos genes c-Myc e ciclina D1 é reprimida para o controle da progressão do ciclo celular. (B)
Demonstra o papel das mutações das proteínas β-catenina ou APC nos níveis de β-catenina e sua ativação
transcricional em células neoplásicas. Ao não ser degradada a β-catenina se acumula no citoplasma e
conjuga-se com o fator de transcrição TCF e se desloca para o núcleo onde potenciam a transcrição em
direção à proliferação celular.
Fonte: Adaptado de NARAYAN et al, 2003.
10
O gene mutado k-ras identificado em vários adenomas, favorece o aumento da
proliferação celular, anaplasia e consequente crescimento tumoral (TAKAHASHI et al,
2004). Presume-se que em sequência ocorrem as mutações dos genes supressores de
tumor Dcc, que codifica uma proteína homóloga a de adesão celular, e o p53, que é um
fator de transcrição que regula o ciclo celular e apoptose. Tais mutações são denotadas
de adenomas tardios e adenocarcinomas (POZZA et al, 2011).
Além disso, outros genes estão envolvidos na carcinogênese colorretal e
significativamente alterados em diferentes classes de tumores, no entanto, métodos de
classificação e estadiamento de tumores e realização de prognósticos mais robustos e
menos invasivos continuam sendo necessidades médicas ainda não atendidas (HOOPS
et al, 1997; NAMBIAR et al, 2010).
1.4. Carcinogênese Química
É fato que cânceres causados por agentes ambientais frequentemente tendem a
ocorrer em regiões como pulmão, trato gastrointestinal e pele, porque normalmente os
tecidos desses órgãos estão mais expostos ao ambiente (SHUBIK et al, 1956).
Atualmente, pesquisas que envolvem a carcinogênese química têm sido feitas atentando
as diversas alterações celulares inerentes às células cancerígenas, possibilitando assim, a
busca por marcadores biológicos e vias metabólicas alteradas.
A carcinogênese química causa anomalias genéticas e epigenéticas em células
susceptíveis que acumulam mutações no genoma e sofrem uma expansão clonal, que
são condições prévias para o desenvolvimento neoplásico (Fig. 04).
Figura 04: Esquema de acumulação de alterações genéticas em células susceptíveis.
Fonte: Adaptado do Ministério da Saúde, 2006.
11
O campo de estudos sobre a carcinogênese química provavelmente teve início
com as associações epidemiológicas de ocorrência de tumores com a exposição à
fumaça do tabaco, realizadas por Hill e Pott no início do século XIX. A partir disso,
seguiram-se as observações de tumores no trato urinário de trabalhadores que
mantinham contato com arilaminas nas fábricas europeias no final do século 19. Além
destes, diversos trabalhos começaram a dar ênfase aos carcinógenos hidrocarbonetos
policíclicos aromáticos (HPA) no século 20. Os principais estudos sobre o metabolismo
dos HPA foram relatados na década de 30 com Kennaway (1930) e Kinosita (1936),
entre outros. Em 1940, químicos britânicos purificaram vários componentes do piche de
carvão, o qual era particularmente carcinogênico. Compostos como os HPA
benzo[a]pireno e 1,2,4,5-dibenz[a,h]antraceno eram produtos comuns da combustões
incompletas de compostos orgânicos e também encontrados em fumaça de cigarro
(MILLER, 1978).
Os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos representam uma importante classe
de poluentes ambientais que têm recebido atenção especial pelo fato de alguns de seus
componentes demonstrarem forte potencial mutagênico e carcinogênico. Além disso,
emissões antropogênicas destes compostos desempenham papéis cruciais em três
problemas ambientais importantes: poluição do ar, chuva ácida e mudança climática
global. Esses compostos estão presentes nos combustíveis fósseis e são formados
durante a combustão incompleta e pirólise de matéria orgânica. Os HPA podem, por
exemplo, ser gerados durante incêndios florestais e erupções vulcânicas além de serem
constituintes naturais de alguns tipos de alimentos e produtos petroquímicos.
Consequentemente, podem ser formados pelo gás de cozinha e no tráfego de
automotores sendo, também, uma das diversas classes de carcinogênicos químicos
presentes na fumaça de cigarro (HONER, 2001; MEIRE et al, 2007). Além disso, uma
vez que diversas classes de HPA são agentes promotores, bem como iniciadores de
neoplasias, uma devida atenção deve ser dada às possíveis atividades de seus
metabólitos (VAN DUUREN, 1976; HONER, 2001).
A absorção dos hidrocarbonetos policíclicos através do trato pulmonar,
gastrointestinal e da pele ocorre de maneira dependente do tipo de HPA, do tamanho
das partículas onde estão adsorvidos, da composição do adsorvente, e da sua afinidade
por gordura (KAWAMURA et al, 1988). Em roedores, a absorção no trato
gastrointestinal ocorre rapidamente e picos destes compostos podem ser identificados
no sangue após 1-2 horas da administração (LIPNIAK et al, 1993).
12
Um dos principais vilões da poluição ambiental é o gás dióxido de enxofre
(SO2), um dos causadores do efeito estufa. Sua fonte de geração mais comum é pela
combustão do enxofre contido em combustíveis fósseis, o que conduziu a criação de
regulamentos ambientais estritos para produção de baixas concentrações desses
compostos orgânicos sulfurados em combustíveis (SWATY, 2005).
1.4.1. Dibenzotiofeno (DBT) e seu metabólito Dibenzotiofeno Sulfona
(DBTO2)
Atualmente, uma das estratégias para diminuir os níveis de emissão de
compostos sulfurados consiste na remoção do enxofre antes da combustão do carvão,
petróleo e seus derivados por processos químicos e biológicos (hidrodessulfurização e
biodessulfurização). Entretanto a remoção é complicada, devido à sua difícil
biodegradabilidade e são considerados compostos recalcitrantes (KROPP et al, 1997;
VAN HAMME et al, 2006). Estudos de biodessulfurização tiveram início nas décadas
de 50 e 60 por serem extremamente importantes para o meio ambiente em geral, e ainda
de importância econômica uma vez que a presença de organossulfurados na gasolina
causa a diminuição do poder de combustão com consequente perda econômica para a
indústria petroquímica. No entanto, apenas nas últimas décadas, com o auxílio da
biotecnologia, esta área passou a apresentar desenvolvimento significativo.
Técnicas de dessulfurização, geralmente, utilizam o dibenzotiofeno (DBT), que
é um composto organossulfurado heterocíclico utilizado como fonte de carbono e
energia principal ou secundária (co-substrato) por microorganismos, como composto
modelo para avaliar a eficiência nestes processos de biorremediação (VAN HAMME et
al., 2003). A biodessulfurização do DBT requer uma série de enzimas e pode ocorrer
por três vias: a de Kodama, na qual, apesar da quebra do DBT, o enxofre não é
removido (KODAMA et al., 1973), a de van Afferden a qual proporciona a remoção do
enxofre, no entanto ocorre a quebra da estrutura de carbono (VAN AFFERDEN et al.,
1993) e a via 4S, na qual o esqueleto de carbono permanece intacto e o enxofre é
retirado através de enzimas monoxigenases (Fig. 05) A ação inicial dessas enzimas
transforma o DBT em DBTO e DBTO2. Porém, tais métodos, oxidam o DBT e
acumulam o DBTO2 em combustíveis (KILBANE et al, 1992).
13
Figura 05: Via 4S. O enxofre é removido na forma de sulfito, permanecendo intacta a estrutura
carbonilada.
Fonte: Adaptado de SILVA, 2007.
O DBT também é conhecido como uma das substâncias responsáveis pela queda
da octanagem da gasolina e pela corrosão de partes de motores a combustão
(MONTICELLO, 1985; INOUE et al, 2005). No entanto, poucos relatos sobre sua ação
tóxica em mamíferos têm sido apresentados (LEIGHTON, 1989).
Trabalhos anteriores utilizaram animais experimentais empregando doses
maciças de DBT e derivados por via oral e subcutânea na expectativa de demonstrar
efeitos tóxicos. Tais trabalhos estabeleceram a dose letal (DL50) de 470 mg/Kg para
camundongos e demonstraram alterações de caráter neoplásico nos linfonodos
mesentéricos e necrose das células do timo em ratos (LEVINE et al, 1977; LEIGHTON,
1989). Dessa forma, tornam-se necessários estudos minuciosos sobre a toxicologia
dessa importante classe de compostos. A exposição crônica a pequenas doses
representaria melhor a situação real da exposição cotidiana a seres vivos às essas
substâncias.
Como a dieta é uma das principais fontes de exposição humana e animal a HPA,
as células epiteliais intestinais constituem os alvos primários a entrarem em contato com
os contaminantes. O metabolismo de HPA pelos citocromos P450 é bem caracterizado
e, embora exista evidência considerável de que o fígado de mamíferos pode metabolizar
14
tais substâncias, o metabolismo em tecidos extra-hepáticos como o intestino pode ser de
grande importância (CAVRET et al, 2005). Por outro lado, a investigação bioquímica
que pretendemos realizar não se limitou às abordagens do ponto de vista de medida de
indicadores usuais de função hepática, pancreática e proteômica, anteriormente
executadas em nosso laboratório. Esse projeto propôs a investigação de marcadores
bioquímicos sensíveis para a exposição ao DBT e DBTO2, empregando-se técnicas de
imunohistoquímica e análise de expressão gênica.
O fato de agentes químicos promoverem alterações randômicas no genoma
justifica o direcionamento de esforços para a quantificação dessas mudanças,
diminuição da exposição a esses agentes e desenvolvimento de alternativas para a
quimioprevenção.
1.4.2. 1,2-Dimetilhidrazina (DMH) - Indutor Clássico de Câncer
Nas últimas décadas diversos modelos experimentais têm sido desenvolvidos em
animais utilizando-se compostos químicos indutores da formação e desenvolvimento de
tumores colorretais (LARANGEIRA et al, 1998), muitos com características
semelhantes àqueles de ocorrência natural visando à obtenção de informações sobre a
gênese, evolução, bem como métodos de diagnóstico e terapias mais eficazes frente a
essas neoplasias (SHETYE et al, 1990). Dentre os compostos químicos, um dos mais
utilizados em estudos experimentais é a 1,2-dimetilhidrazina (DMH), uma vez que
induz carcinomas com semelhança morfológica e histológica daqueles tumores de
ocorrência natural em humanos e, em razão de sua estabilidade química e alta taxa de
obtenção de tumores após um determinado período de latência (LARANGEIRA et al,
1998).
A 1,2 dimetilhidrazina é um carcinógeno químico indireto, que resulta na
metilação do oxigênio ligado ao carbono seis da guanina (O6-MeG) no DNA alterando a
ligação de hidrogênio, o que leva a um erro de leitura pela DNA polimerase e resulta na
transição G:A (Fig. 06) (LEVI et al, 2009). A DMH induz a proliferação de tumores no
cólon acentuadamente, observando-se diferentes padrões de apoptose nas criptas do
intestino grosso e delgado o que tem sido proposto como um possível fator de
especificidade do órgão pela carcinogênese promovida pela DMH, embora este fator
15
ainda não esteja claramente elucidado (LARANGEIRA et al, 1998; COLUSSI et al,
2001).
Figura 06: Modelo da metilação do oxigênio ligado ao carbono seis da guanina causado pela DMH. Tal
metilação resulta na alteração da ligação de hidrogênio entre nucleotídeos, no caso o que seria uma
ligação entre G:C se torna uma ligação A:T.
Fonte: Adaptado de foto retirada no site http://flipper.diff.org/app/pathways/info/4645, 22/08/2012.
1.5. Marcadores Moleculares do Câncer
1.5.1. O Antígeno Carcinoembrionário (CEA)
Marcadores tumorais são substâncias que podem ser encontradas em
concentrações alteradas em amostras biológicas de pacientes com certos tipos de câncer.
Podem ser produzidos pelo próprio tumor ou pelo corpo, em resposta à presença do
câncer. Testes para marcadores tumorais auxiliam no diagnóstico do câncer, entretanto
raramente são usados prova definitiva para a constatação da enfermidade (RUBIE et al,
2005; YANG et al, 2009). Além disso, nem todos pacientes diagnosticados com câncer
possuem um nível alterado destes marcadores, principalmente em estágios iniciais da
doença (DUFFY et al, 2003).
Como o uso de tais marcadores em diagnósticos para o câncer ainda seja
limitado, pesquisadores buscam marcadores que sejam específicos para um determinado
tipo de câncer e que possam ser usados para detectar a presença da doença antes que
seus sintomas apareçam. Médicos podem usar as mudanças nos níveis do marcador
16
tumoral para seguir o curso da doença, para medir o efeito do tratamento e para verificar
sua reincidência. Em alguns casos, o nível do marcador tumoral reflete a extensão da
doença (estágio) ou indica o quão rápido a doença parece progredir (prognóstico)
(DUFFY et al, 2003). Um marcador clínico, de suma importância é o antígeno
carcinoembrionário (CEA) característico de cânceres colorretais, de bexiga, mama,
pancreático e de pulmão (ZHAO et al, 2008). Tal antígeno é uma proteína de membrana
de alto peso molecular pertencente à família das imunoglobulinas (Fig. 07). Tal
molécula desempenha papéis na adesão celular, imunidade, apoptose e está relacionada
à ocorrência de metástase em mamíferos (THOMAS et al, 2004; YANG et al, 2009). O
CEA é o protótipo dos marcadores tumorais e tem sido intensivamente investigado
desde sua primeira identificação, em 1965, por Gold e Freedman. Estes autores
identificaram o antígeno em extratos de adenocarcinoma de cólon de humanos e em
células de cólon fetais, porém em baixos níveis na mucosa de cólons normais.
Figura 07: Modelo estrutural para o antígeno carcinoembrionário.
Fonte: Adaptado de BOEHM et al, 2000.
Cerca de 63% de pacientes com câncer de colorretal têm elevações de CEA.
Além disso, é importante ressaltar que as concentrações de CEA correlacionam-se
histologicamente com estadiamento do CCR e que elevados níveis pré-operatórios deste
sugerem maior probabilidade de retorno da doença e baixas taxas de sobrevivência do
paciente (KAHLENBERG et al, 2003). Atualmente o CEA é o marcador mais utilizado
17
na definição do prognóstico, no acompanhamento do tratamento de CCR, já que é
detectado apenas em baixas concentrações no sangue de pessoas saudáveis, e em
elevadas concentrações em pessoas portadoras deste câncer (COBBEN-BELD et al,
1996). Considera-se que a existência de uma concentração sérica acima de 5 ng/mL, em
indivíduos já submetidos ao tratamento, está associada com a recorrência de câncer e
metástase. Todavia pacientes com outros tipos de câncer ou com desordens como
infecção pulmonar, colite ulcerativa e doença inflamatória intestinal também podem ter
níveis elevados de CEA (KAHLENBERG et al, 2003; ZHAO et al, 2008).
1.5.2. Importância da Molécula CD44
As moléculas de adesão constituem um grupo heterogêneo de proteínas
transmembrana que regulam as interações adesivas célula-célula e célula-matriz
extracelular (HYNES, 2009). O CD44 é uma molécula de adesão receptora de ácido
hialurônico, que por sua vez, é um dos principais componentes da matriz extracelular.
Estudos demonstraram a interação da matriz extracelular com células tumorais através
da via do CD44, estabelecendo-a como um dos principais mecanismos para a
progressão do tumor e metástase (Fig. 08). Alterações na expressão e na função das
moléculas de adesão de variadas classes e funções relacionam-se com o
desenvolvimento tumoral, a diferenciação das células neoplásicas, a invasão e metástase
(CHRISTOFORI, 2003; HYNES, 2009).
Interações entre as células mesenquimais e epiteliais são consideradas
fundamentais para o mecanismo de oncogênese, sendo apontado que o processo de
invasão tumoral e metástase requerem alterações complexas nas interações célula-célula
e célula-matriz extracelular, as quais refletem numa hiper-expressão de proteínas, entre
elas o CD44 (HANLEY et al., 2006). Especificamente no câncer colorretal, a
transformação adenoma-carcinoma ocorre em consequência às alterações genéticas que
incluem algumas moléculas já identificadas, dentre elas a proteína CD44 (MIKAMI et
al, 2000).
18
Figura 08: Esquema de interação de uma isoforma de CD44 na sinalização oncogênica e progressão
tumoral. A ligação do ácido hialurônico (HA) ao CD44 estimula a ativação de RAS, a cascata quinase e
ao crescimento da célula tumoral. Sendo assim, o CD44 desempenha um papel central na regulação de
duas diferentes vias de sinalização (proliferativa X motilidade/invasão) durante a progressão tumoral.
Fonte: Adaptado de BOURGUIGNON et al, 1998.
O Cd44 é um gene que codifica uma ampla variedade de proteínas de superfície
celular, através do processamento alternativo de seus éxons. Este gene é composto por
20 éxons, dos quais 10 são chamados éxons constantes, sendo expressos juntos em
todos os tipos celulares sob a forma padrão. Os éxons remanescentes podem sofrer
processamento alternativo e serem incorporados aos éxons padrões, gerando um número
variado de isoformas proteicas (GOODISON et al, 1998). O gene Cd44 representa uma
família de isoformas que, em certos tumores, têm expressão elevada nos tecidos.
Estudos imunohistoquímicos também demonstraram que a expressão da proteína CD44
é alterada em diferentes tipos de neoplasias, sendo observado um padrão de expressão
com notável diversidade molecular, indicando que essas moléculas apresentem grande
valor para prognósticos de carcinomas (BÁNKFALVI et al., 2002). Estudos de casos de
CCR em seres humanos, utilizando metodologias como qPCR e imunohistoquímica, já
demonstraram que diferentes isoformas da molécula CD44 são super expressas, tanto no
âmbito gênico (CHUN et al, 2000) quanto no proteico (ZAVRIDES et al, 2005).
19
Além disso, Franzmann e colaboradores (2005) avaliaram que a proteína CD44
solúvel na saliva como um potencial marcador molecular para câncer na região da
cabeça e concluíram que o exame pode ser efetivo para detectar esse tipo de câncer em
todos seus estágios. Dessa forma, acredita-se que esse marcador de células possa ser
usado no acompanhamento terapêutico avaliando a progressão do tumor (Fig. 08).
1.6. Importância das Proteases no Desenvolvimento de Neoplasias
Durante a década de 40 que foram feitas as primeiras associações entre proteases
e o câncer, nas quais foi proposto que a atividade proteolítica poderia ser responsável
por degradação da matriz extracelular de células tumorais e subsequente invasão de
tecidos normais (FISHER et al, 1946). Até então acreditava-se que as enzimas
proteolíticas contribuíam para o desenvolvimento do câncer apenas em etapas de
metástase, no entanto, estudos mais recentes indicaram que as proteases participam de
praticamente todos os passos do crescimento tumoral (KOBLINSKI et al, 2000;
NYBERG et al, 2006).
A homeostase celular requer a existência de um equilíbrio entre as proteases e
seus inibidores endógenos. Caso esse equilíbrio seja perdido a favor das proteases, pode
haver uma desregulação das proteólises que desencadeariam processos tais como,
inflamação, artrites reumatóides, angiogênese patológica e crescimento tumoral
(KENNEDY et al, 2008). Sabe-se que proteases participam de todas as etapas de
progressão do tumor, incluindo os processos de proliferação, adesão, migração,
angiogênese, apoptose e evasão do sistema imune (Fig. 09) (LAUFS et al, 2006;
NYBERG et al, 2006).
20
Figura 09: Esquema das etapas de progressão tumoral e do envolvimento das proteases no
desenvolvimento do câncer. MMPs: metalo-proteases; BM: membrana basal; ECM: matriz extracelular.
Fonte: Adaptado de NYBERG et al, 2006.
As serino-proteases são exemplo de família envolvida nos processos fisiológicos
e patológicos de degradação da membrana basal e matriz extracelular. Tal família
representa quase um terço de todas as proteases (GETTINS et al, 2002). Entre as
principais enzimas pertencentes a esse grupo estão quimotripsina e tripsina, que apesar
de apresentarem alta similaridade estrutural, reconhecem substratos diferentes. A
tripsina hidrolisa, de maneira específica, as ligações peptídicas no lado carboxila dos
aminoácidos arginina e lisina, enquanto a quimotripsina catalisa a hidrólise de ligações
após resíduos de leucina, fenilalanina e tirosina (LOSSO et al, 2008). Certos estudos já
demonstraram que a expressão e a atividade de serino-proteases, como da tripsina, estão
associadas a várias fases de progressão do tumor (KATO et al, 1998; BORGONO et al,
2007; AFFARA et al, 2009).
Diante da
grande relevância das
proteases
em
diversas
etapas
do
desenvolvimento tumoral, o Instituto Nacional do Câncer dos Estados Unidos
recomendou que as pesquisas para a cura dessa patologia deveriam envolver (LOSSO et
al, 2008):
21
I)
identificação de fontes de inibidores de proteases;
II)
determinação da concentração de inibidores de proteases em alimentos;
III)
determinação da relação entre a concentração de inibidores de proteases
na dieta e prevalência de câncer na população humana;
IV)
determinação da eficácia dos inibidores de proteases em modelos
animais;
V)
investigação do mecanismo de ação dos inibidores de proteases.
Em concordância com tais recomendações, temos os inibidores de serinoproteases sendo a classe mais bem estudada e caracterizada dos inibidores. Tal classe
apresenta uma inibição estritamente competitiva, como inibidores de tripsina do tipo
Kunitz (KTI) e inibidores Bowman-Birk (BBI) (RICHARDSON, 1991; KENNEDY,
1998a).
1.6.1. Inibidores de Proteases do Tipo Bowman-Birk (BBI)
Os BBI foram isolados pela primeira vez em sementes de soja (Glycine max) por
Bowman, em 1946 e caracterizados por Birk em 1961, sendo posteriormente
identificados em outras leguminosas (NORIOKA et al, 1982) e gramíneas (ODANI et
al, 1986).
Os BBI são proteínas de baixa massa molecular, aproximadamente 8 kDa,
apresentam estrutura em cadeia única (Fig. 10), rica em resíduos de cisteína que lhes
confere uma estrutura rígida e bastante conservada nas diferentes espécies do reino
vegetal (MORHY et al, 1987), do qual são exclusivas.
22
Figura 10: Estrutura do BBI da soja, como determinado por Odani e Ikenaka (1973). A) Em cinza, do
lado direito, o sítio inibitório para a quimotripsina (Leu – Ser), e do lado esquerdo o sítio inibitório para a
tripsina (Lys – Ser). B) Estrutura tridimensional do BBI. O BBI isolado de soja é uma proteína de 71
aminoácidos (AA). A região carboxi-terminal da proteína está representada em roxo (AA71), a região
N-terminal representada em amarelo. O sítio inibitório para a quimotripsina está representado em verde e
o para tripsina está mostrado em azul.
Fonte: Adaptado de Kennedy, 1998a.
A interação do BBI com a tripsina ou com a quimotripsina é capaz de inibir
fortemente a atividade dessas serino-proteases. A conformação do loop do sitio reativo
do BBI é complementar ao sítio ativo da proteína a ser inibida, permitindo uma ligação
firme do inibidor à protease (CHEN et al, 2005). Essa ligação do tipo reversível ocorre
com elevada afinidade, semelhante à afinidade pelos substratos proteicos.
Nesse contexto, os inibidores de proteases do tipo Bowman-Birk surgiram como
um dos mais potentes agentes quimiopreventivos do câncer, sendo capaz de prevenir ou
23
suprimir os processos carcinogênicos em vários modelos in vitro e in vivo (YAVELOW
et al, 1985; ARMSTRONG et al, 2000). Inclusive St. Clair e colaboradores (1990) já
haviam verificado que aproximadamente 0,1% do BBI adicionado às dietas de
camundongos foram suficientes para inibir a indução de câncer hepático por 1,2dimetilhidrazina.
Yavelow e colaboradores (1985) demonstraram que moléculas de BBI
modificadas enzimaticamente, com atividade inibitória apenas para quimotripsina,
foram completamente eficazes como supressores da transformação maligna de células in
vitro induzida por radiação. Neste mesmo trabalho, tais atividades anti-tumorais não
foram observadas em moléculas de BBI modificadas com atividade inibitória apenas
para tripsina. Apesar disso, proteases tripsina-símile envolvidas na carcinogênese
devem ser consideradas alvos potenciais de proteínas relacionadas ao BBI
(CLEMENTEA and DOMONEY, 2006). Dessa forma alguns estudos revelaram que a
atividade proteolítica da tripsina correlaciona-se com a agressividade do tumor, pois
está intimamente ligada à ativação de receptores envolvidos com processos de adesão e
proliferação de células tumorais (MIYATA et al, 1998; MIYATA et al, 1999).
Embora os mecanismos pelos quais o BBI exerça suas funções anticarcinogênicas ainda não sejam completamente conhecidas, várias hipóteses têm sido
discutidas. Estudos demonstraram a capacidade deste inibidor em impedir a ativação de
outras proteases envolvidas na degradação da membrana basal e matriz extracelular,
além de prevenir processos angiogênicos necessários para a progressão tumoral. Assim
sendo o inibidor de Bowman-Birk mostra-se capaz em reduzir o processo metastático
(LOSSO et al, 2008). Recentemente seu efeito quimiopreventivo foi ainda associado à
inibição do proteassoma (CHEN et al, 2005; SAITO et al, 2007).
Foi demonstrada também atividade desse inibidor de proteases na redução do
processo inflamatório. Como tal processo está intimamente associado à carcinogênese,
acredita-se que a atividade antiinflamatória do BBI poderia ser o principal mecanismo
pelo qual possa ser revertido o estágio inicial da carcinogênese, assim como afetar seu
estágio promocional (KENNEDY, 1998a; KENNEDY, 1998b).
A importância carcinogênica das proteases-alvo do inibidor de Bowman-Birk foi
descrita em um estudo elaborado por Billings e colaboradores (1988), no qual
investigaram os possíveis alvos do BBI como substância preventiva de neoplasias
induzidas por DMH. Para tal, utilizaram colunas de afinidade de BBI identificando três
enzimas similares tanto em células de camundongos induzidas com DMH, quanto em
24
fibroblastos de seres humanos portadores de Síndrome de Bloom. Dessa forma,
demonstraram que proteases lisossomais ligantes em colunas de afinidade de BBI
possivelmente estão intimamente relacionadas desenvolvimento neoplásico (BOND and
BUTLER, 1987; BILLINGS et al, 1987).
Recentemente, em nosso grupo de pesquisas, Carli e colaboradores (2012)
confirmaram o efeito preventivo do BBI na indução de neoplasias por DMH em
camundongos. Além disso, demonstraram que a expressão de CD44 e da atividade de
proteases lisossomais associadas à coluna de afinidade de BBI são úteis no
monitoramento desse modelo experimental.
Nesse sentido, o atual trabalho tem como preocupação avaliar diferentes tipos de
técnicas em busca de biomarcadores relacionados à indução crônica de câncer
promovida por DBT, DBTO2 e DMH, enfatizando-se a expressão de proteínas e de
genes relacionados ao câncer.
25
2. Justificativa e Objetivos
26
2. Justificativa e Objetivos
2.1. Justificativa
A relevância ambiental dos Hidrocarbonetos Polícíclicos Aromáticos Sulfurados
(HPA) não condiz com a escassez de informações toxicológicas, relacionadas às
consequentes contaminações acarretadas pelos agentes DBT e DBTO2. Em
consequência a isso, essas substâncias constituem importantes objetos de investigação
científica na área da toxicologia voltada para a carcinogênese.
Trabalhos prévios demonstraram que tais agentes são indutores de neoplasias em
ratos, de potência similar ao DMH. Entretanto torna-se necessário maior confirmação
molecular da indução do câncer promovido por esses agentes. Nesse sentido, o trabalho
atual teve como proposta, avaliar a expressão gênica de proto-oncogenes específicos de
amostras de pólipos intestinais de ratos tratados com esses agentes, a fim de demonstrar
por meio de evidências moleculares manifestações da carcinogênese química. Além
disso, torna-se necessário o emprego de técnicas de imunohistoquímica e
imunofluorescência referente aos resultados histopatológicos obtidos anteriormente,
visto que a comprovação molecular proporcionaria maior consistência às evidências já
encontradas.
27
2.2. Objetivo Geral
Realizar um estudo toxicológico em ratos Wistar submetidos a um regime
crônico de administração de DBT, DBTO2 e DMH com ênfase no potencial
carcinogênico desses compostos, por meio de técnicas moleculares.
2.3. Objetivos Específicos
A) Comparação da potência de indução do DBT e DBTO2 como carcinógenos
frente ao indutor clássico DMH.
B) Realizar estudos histopatológicos no baço, fígado e intestinos dos animais
submetidos à indução química da oncogênese.
C) Analisar a expressão gênica relativa dos genes Cd44, c-Myc, c-Jun, Stat3,
Psma6, Mapk3 e Sulf1 em pólipos intestinais pelo método de qPCR.
D) Avaliar os pólipos intestinais por meio de ensaios de imunohistoquímica
utilizando marcadores moleculares CD44 e o antígeno carcinoembrionário
(CEA).
E) Empregar o BBI marcado com Isotiocianato de Fluoresceína (FITC) como
possível instrumento de avaliação de alterações teciduais de animais tratados
com DBT, DBTO2 e DMH.
28
3. Materiais e Métodos
29
3. Materiais e Métodos
Este trabalho foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA)
da Universidade Federal de Ouro Preto catalogado sob o protocolo de número 2011/11.
Para a realização do mesmo, o número de animais utilizados assim como o tratamento
aplicado restringiu-se ao estabelecido pelos objetivos delineados.
3.1. Indução de câncer em ratos Wistar tratados com DMH, DBT e DBTO2
Ratos da linhagem Wistar, machos, com aproximadamente 90 dias de idade,
foram obtidos no Centro de Ciência Animal (CCA) da Universidade Federal de Ouro
Preto sendo mantidos à temperatura ambiente com ração e água ad libitum e ciclo
claro/escuro de 12 horas.
Os animais foram divididos em sete grupos, a saber:
Grupo I: Controle Salina (DMH) (n=5);
Grupo II: Controle Óleo (DBT’s) (n=5);
Grupo III: Teste DMH 30 mg/Kg (n=15) (NEWELL and HEDDLE, 2004);
Grupo IV: Teste DBT 30 mg/Kg (n=15);
Grupo V: Teste DBTO2 30 mg/Kg (n=15).
Nos grupos I e II foram administradas, respectivamente, injeções intraperitoniais
semanais de solução salina 0,9 % e óleo vegetal industrializado durante 10 semanas, os
grupos III, IV e V receberam injeções de soluções de DMH (Sigma-Aldrich) em solução
salina 0,9 %; DBT e DBTO2 (Sigma-Aldrich) em óleo vegetal industrializado, na dose
de 30 mg/Kg no mesmo regime de tempo dos grupos anteriores.
Todos os grupos passaram por um período de latência de 154 dias (22 semanas)
após a última injeção (Fig. 10) para o desenvolvimento das alterações patológicas.
Houve um aumento no período de latência em relação ao estudo de Newell e Heddle
(2004) que utilizou da substância de referência DMH, já que resultados anteriores do
nosso grupo de pesquisa demonstraram que induções com compostos organossulfurados
precisaram de ao menos 14 semanas de latência para desenvolverem lesões pré-
30
neoplásicas em ratos. Após esse período, realizou-se a necrópsia dos animais para coleta
de parte do pulmão e órgãos como, estômago, baço, fígado, intestinos grosso e delgado.
Figura 11: Esquema representativo do tempo de tratamento e de espera para o desenvolvimento de
alterações patológicas nos animais tratados com DMH, DBT e DBTO2.
3.2. Avaliação Morfológica Microscópica (Histologia)
Para realizar as análises histológicas e imunohistoquímicas, os segmentos de
tecidos, provenientes da necrópsia dos animais, foram fixados em formol tamponado,
posteriormente processados e incluídos em blocos de parafina. Então foram realizadas
secções de 4,0 μm em micrótomo. As lâminas relativas à análise histológica foram
diafanizadas, hidratadas e submetidas aos corantes Hematoxilina e Eosina (HE),
desidratadas,
e então montadas em
Entellan® sintético. Dessas, avaliou-se
qualitativamente os seguintes parâmetros: presença/ausência de atipias celulares nas
camadas mucosa e média, inflamação na mucosa, presença de necrose, atipias
estruturais
e
hiperplasia
de
nódulos
linfóides
na
análise
dos
intestinos;
presença/ausência de inflamações parenquimais e portais, degeneração e necrose
celular,
hemossiderina,
granuloma
e
hiperemia
na
avaliação
do
fígado;
presença/ausência de hiperplasia de polpa branca, necrose, alterações capsulares e na
polpa vermelha no baço dos animais.
31
3.3. Imunohistoquímica
Para a realização das reações imunohistoquímicas, foram utilizados cortes
histológicos provenientes dos mesmos blocos usados na análise histopatológica. Os
ensaios de IHQ foram realizados utilizando os anticorpos primários CD44 (anti-rat - BD
Biosciences) e CEA (anti-human com reação cruzada para rato - Sigma) na
concentração de 1:1000 (PBS 0,01M e BSA 0,1%), e o sistema estreptavidina-biotina
peroxidase (método LSAB - DAKO®), revelado com solução DAB (Diaminobenzidina).
O protocolo utilizado teve as seguintes etapas:
- diafanização dos tecidos em xilol (2 lavagens de 15 minutos), seguida de
hidratação em soluções de álcoois decrescentes (absoluto, 90⁰, 80⁰, 70⁰) e água, durante
5 minutos em cada;
- ativação antigênica com tampão citrato 0,01M, pH 6.0 e 5 ciclos, de 3 minutos
cada, em potência máxima no microondas;
- lavagem 3 vezes, de 5 minutos cada, com tampão PBS 0,01M, pH 7.4;
- inibição da peroxidase endógena com solução de H2O2 3,5% em PBS durante
30 minutos;
- lavagem 2 vezes, de 5 minutos cada, com tampão PBS 0,01M, pH 7.4;
- bloqueio de reações não específicas com solução de leite em pó 14% em PBS
por 30 minutos;
- incubação com anticorpo primário em quantidade suficiente para cobrir os
fragmentos, sendo as lâminas incubadas por 16 horas em câmara úmida a 4ºC;
- lavagem 3 vezes, de 5 minutos cada, com tampão PBS 0,01M, pH 7.4;
- incubação com anticorpo secundário biotinilado (link do kit LSAB DAKO)
durante 30 minutos em câmara úmida, a temperatura ambiente;
- lavagem 2 vezes, de 5 minutos cada, com tampão PBS 0,01M, pH 7.4;
- adição do conjugado estreptavidina-HRP (peroxidases horseradish) e mantido
durante 30 minutos em câmara úmida, a temperatura ambiente;
- lavagem 2 vezes, de 5 minutos cada, com tampão PBS 0,01M, pH 7.4;
- revelação com solução de DAB 0,05% com substrato (H2O2) por 5 minutos;
- última lavagem de 5 minutos cada com tampão PBS 0,01M, pH 7.4;
- contracoloração rápida (5 segundos) com hematoxilina e lavagem com água
corrente a fim de retirar excesso de corante;
- desidratação e montagem com Entellan® sintético.
32
Nos controles negativos, as lâminas foram incubadas com tampão PBS 0,01M,
pH 7.4 ao invés do anticorpo primário.
3.4. Análise por Fluorescência Direta (FA)
Nos ensaios de fluorescência direta elaborados neste estudo, o ligante primário
utilizado foi um inibidor de Bowman-Birk (BBI), previamente enriquecido e purificado
em nosso laboratório. Já o composto fluorescente utilizado na conjugação ao anticorpo,
foi o isotiocianato de fluoresceína (FITC - Sigma), que emite luz verde brilhante ao ser
estimulado por luz filtrada até 520 nm (filtro verde).
3.4.1. Conjugação BBI-FITC
A conjugação entre o BBI e o FITC foi padronizada de acordo com manual
adaptado do fabricante do composto fluorescente (Biorad). Para tal padronização
utilizou-se solução estoque 10 mg/mL de FITC dissolvido em dimetilsulfóxido anidro
(DMSO - Sigma) para estabelecer uma proporção de 80 µg de FITC por miligrama de
BBI. O BBI foi diluído no tampão de reação (500 mM carbonato/bicarbonato, pH 9.5) e
prontamente misturado a solução de FITC. Foi incubado sob agitação leve durante 60
minutos, a temperatura ambiente ao abrigo da luz. O FITC não conjugado foi retirado
através de coluna exclusão molecular (Sephadex G-25M - Pharmacia Biotech) e o
conjugado foi eluído em tampão de armazenamento (10 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.1%
NaN3, pH 8.2) e estocado a 4ºC no escuro. A concentração foi aferida pela medida da
absorbância a 280 e 520 nm.
3.4.2. Preparação dos Cortes Histológicos para FA
Os segmentos de tecidos obtidos em necropsia que foram fixados em solução
crioprotetora
(Tissue-Tek®-SakuraTM)
e
imediatamente
congelados
a
-80ºC.
Posteriormente, seccionados em criostato em slides de aproximadamente 20 µm,
33
fixados em lâminas de vidro e mantidos a -20ºC. A fluorescência para detecção em
tecidos criopreservados foi processada pelas seguintes etapas:
- os cortes histológicos foram inicialmente hidratados em soluções de álcoois
decrescentes (absoluto, 90⁰, 80⁰, 70⁰) durante 5 minutos em cada;
- seguiu-se a incubação com o conjugado BBI-FITC na concentração de 1:5000
(diluição no tampão de armazenamento), em quantidade suficiente para cobrir os
fragmentos, sendo as lâminas incubadas por 60 minutos, em câmara escura úmida e a
temperatura ambiente;
- lavagem das lâminas em tampão PBS (NaCl 137mM; Fosfato 10 mM; KCl 2,7
mM; pH 7.4) e contracoloração com hematoxilina por três segundos;
- lavagem, desidratação em álcoois crescentes, secagem e montagem com
Entellan® sintético (Merck) e lamínula e guardadas ao abrigo da luz.
No controle negativo, as lâminas foram incubadas apenas com o composto
fluorescente FITC diluído em PBS.
3.5. Captura e Análise de Imagens
As imagens, das lâminas de imunohistoquímica e dos ensaios de fluorescência
direta, foram digitalizadas utilizando-se o microscópio Leica DM5000B com câmera
acoplada, através do programa Leica Application Suite (versão 2.4.0 R1, Leica
Microsystems).
Para a captura de imagens de FA, foi utilizado o filtro verde e a captura feita no
aumento de 110x. Para sua quantificação foi utilizado o programa de análises de
imagens Image Tool 3.0 (UTHSCSA - University of Texas Health Science Center at
San Antonio) para medir a intensidade de fluorescência de imagens aleatoriamente
selecionadas. As imagens foram capturadas em 12 bits e analisadas em escala de cinza
de 0 a 255. A intensidade de fluorescência foi medida através da média da área, isto é, a
soma dos valores de tons cinza de todos os pixels dividida pelo número de pixels
presentes na área. Os valores foram registrados em unidades arbitrárias (UA). A
fluorescência de fundo foi medida e subtraída da região de interesse (GAVA et al,
2012).
Para a quantificação das imagens dos ensaios imunohistoquímicos foi utilizado o
programa ImageJ 1.45s (National Institute of Health, USA) para contagem total de
34
núcleos celulares marcados. Foram utilizadas as médias de 20 campos visuais
sucessivos para cada animal, no aumento de 440x, para quantificação da marcação
imunohistoquímica de cada grupo. Foram consideradas imagens com mais de 90% de
tecido para a contagem nuclear.
3.6. Análise da Expressão Gênica por qPCR (Real Time)
3.6.1. Oligonucleotídeos Iniciadores (Primers)
Os oligonucleotídeos iniciadores específicos para os genes em estudo foram
baseados nas sequências de mRNA depositadas no banco de dados RGD (Rat Genome
Database, disponível em http://rgd.mcw.edu) e idealizados com auxílio do programa
Gene Runner (Versão 3.05). As sequências dos primers utilizados, bem como número
de acesso no RGD e tamanho dos amplicons estão listados na Tabela 01:
Tabela 01: Número de acesso ao RGD das sequências de primers forward (F’) e reverse (R’), referentes
aos genes avaliados, temperatura de melting (Tm) e tamanho do amplicon gerado.
Tamanho do
Genes
Nº de Acesso
Primers
Tm (ºC)
Amplicon (pb)
TGTGTTGTCCCTGTATGC
NM_031144.3
43.5
96
Actb-F’
GCGTAACCCTCATAGATG
42.2
Actb-R’
GGCTCCAGTCATAGTACAAC
NM_012924.2
43.4
80
Cd44-F’
GGTCCTGTCCTGTTCAAG
44.0
Cd44-R’
AAAGCCACCGCCTACATC
NM_012603.2
49.9
80
c-Myc-F’
CGCCGTTTCCTCAGTAAG
48.1
c-Myc-R’
CAGCAATGGGCACATCAC
NM_021835.3
49.8
141
c-Jun-F’
ACACTGGGCAGCGTATTC
48.0
c-Jun-R’
CAACCCAAGACCCAAGAG
NM_134378.1
47.2
85
Sulf1-F’
CCATCCATCCCATAACTG
45.0
Sulf1-R’
GCCCGAAACTACCTACAG
NM_017347.2
44.4
145
Mapk3-F’
GTGCTTCCTCTACTGTGATG
44.1
Mapk3-R’
AAGAGGCGGCAGCAGATAG
NM_012747.2
52.2
107
Stat3-F’
TGGCGGGTCTGAAGTTGAG
53.3
Stat3-R’
CATGCCTGTCTACTGTTCTG
NM_017283.3
45.1
119
Psma6-F’
AAGGTGAGCGTCAATCTC
44.0
Psma6-R’
35
3.6.2. Extração de RNA Total
Cerca de 100 mg de pólipos do intestino delgado, obtidos após a necrópsia dos
animais, foram utilizados para obtenção do RNA total utilizando o Kit SV Total RNA
Isolation System (Promega
TM
) seguindo as recomendações do fabricante. Brevemente:
100 mg de tecido foram homogeneizados com auxílio de um homogeneizador do tipo
politron (Ultra 80) em 1mL de Trizol® Reagent (InvitrogenTM) em 3 pulsos de 30
segundos cada, seguidos de 1 minuto em banho de gelo. A seguir as amostras foram
incubadas, durante 20 minutos, a temperatura ambiente e posteriormente foram
adicionados 0,4 mL de clorofórmio (Sigma) e novamente homogeneizados durante 1
minuto com auxílio de um agitador tipo vórtex, seguido de uma incubação a
temperatura ambiente por 25 minutos.
A seguir, as amostras foram centrifugadas
durante 15 minutos a 12.000 G. A fase aquosa foi recuperada, transferida para um novo
tubo e adicionados mais 0,4 mL de clorofórmio (Sigma), seguido de nova
homogeneização por 1 minuto com auxílio de um agitador tipo vórtex e por
centrifugação durante 2 minutos a 12.000 G.
Após recuperar a fase aquosa, foram adicionados 0,6 mL de etanol 95% v/v
(preparado com água livre de RNAses) para precipitar os ácidos nucléicos, e
transferidos para a coluna de ligação que acompanha o kit. Em seguida, o RNA total foi
purificado utilizando o Kit SV Total RNA Isolation System (PromegaTM) conforme
instruções do protocolo técnico. O controle de qualidade do RNA foi realizado a partir
da utilização de DNAses do próprio kit e suas confirmações através da quantificação e
avaliação do grau de pureza do mesmo pelo aparelho NanoVue® (General Eletrics),
seguidas da análise das preparações em gel de agarose 1,2% TBE-formamida (Fig. 12) a
90V durante 40 minutos e visualizado com auxílio de um transiluminador UV (modelo
TFP-M/WL, Biosystems). A densidade óptica (quantificação) do RNA extraído foi
avaliada no comprimento de onda a 260 nm. As razões para serem aceitas como
adequadas para a quantificação da expressão gênica seguem certas condições. A razão
260/280 próxima a 1,8 indica baixa contaminação por proteínas, já as razões 260/230
maiores que 2,0 indicam uma baixa contaminação por isotiocianato de guanidina
(MANCHESTER, 1996; GALLAGHER et al, 2006; BECKER et al, 2010).
36
Figura 12: Análise da qualidade das extrações de RNA total. Cerca de 10 μg de RNA total foram
analisados em gel de agarose TBE-formamida 1,2%. O RNA total foi obtido a partir dos pólipos
intestinais delgado de animais pertencentes aos grupos Controle Óleo (1), DBT (2), DBTO 2 (3) e DMH
(4).
3.6.3. RT-PCR e Obtenção dos cDNA’s
A primeira fita do cDNA foi sintetizada utilizando 1 µg de RNA total extraído e
o Kit High Capacity RT-PCR System (Applied Biosystems), seguindo as recomendações
dadas pelo fabricante. Para cada 1 µg de RNA total, foram utilizados 2 μL de tampão
(10x RT Buffer), 2 μL de primers randômicos (10x RT Random Primer), 0,8 μL de
dNTP’s [25x dNTP Mix (100 mM)] 1 μL de transcriptase reversa (Multi ScribeTM
Reverse Transcriptase) e água livre de RNAse para um volume final de 10 μL. A
mistura de reação foi preparada e adicionados o volume de RNA (10 μL), foi mantida
em gelo até a programação do termociclador (Biocycler, versão 3.2).
A mistura foi incubada durante 10 minutos a 25°C, seguidos de 120 minutos a
37°C, então 5 minutos a 85°C e até o momento do uso, a amostra permaneceu estocada
a -20°C.
37
3.6.4. Reação da PCR Quantitativa em Tempo Real (qPCR)
Para análise da expressão dos genes em estudo foi utilizada a técnica de PCR em
tempo real. As reações foram realizadas pelo Kit SYBR® Green PCR Master Mix
(Applied Biosystems) em placas de 96 poços (MicroAmp® Optical 96 Well Reaction
Plate – Applied Biosystems) e seladas com adesivo óptico (MicroAmpTM Optical
Adhesive Film – Applied Biosystems) ao final do procedimento. Foram pipetados 3 μL
dos iniciadores (na concentração de 2,5 μM) em triplicata e 7 μL de um mix de reação
contendo 2 μL de cDNA diluído 5x (com água livre de DNAse) e 5 μL de SYBR® Green
Master Mix, totalizando um volume de reação em cada poço de 10 μL. Os ensaios
foram realizados em triplicatas biológicas para todos os genes avaliados, com o gene de
referência
(β-actina) presente em todas as placas. Os valores de baseline foram
ajustados para 3-15 ciclos. O threshold foi ajustado à região associada ao crescimento
exponencial do produto da PCR e, portanto, fixado em 0,2 para todas as amostras, uma
vez que se comparou o mesmo gene em diferentes grupos.
As análises foram feitas pelo método do 2-ΔCq de quantificação relativa da
expressão gênica (ΔCq), que permite quantificar diferenças no nível de expressão de um
alvo específico entre as diferentes amostras. Os níveis dos genes alvos foram
normalizados pelos níveis do gene de referência (β-actina). Os resultados foram
alcançados por uma fórmula aritmética que considera a quantidade do alvo, normalizado
para o gene de referência, dada por 2-∆Cq. A reação de qPCR foi conduzida conforme
programação contida no aparelho ABI 7300 (Applied Biosystems).
38
3.6.5. Curva de Eficiência dos Primers
Para determinar as eficiências relativas da amplificação dos alvos e do gene de
referência foram construídas curvas padrões para cada amplicon a partir de uma mesma
amostra. O ensaio foi realizado em triplicata e a concentração dos iniciadores foi de 2,5
μM. A curva padrão foi representada por um gráfico de regressão linear semi-log do
valor de Cq (eixo Y) em comparação ao log da quantidade inicial do ácido nucleico
(eixo X). Foram utilizadas 5 diluições seriadas de 5 vezes de cDNA (até 1:3125). A
Figura 13 ilustra o gráfico de amplificação do gene c-Myc e a Figura 14 a curva padrão
do mesmo gene, indicando um resultado esperado de um primer com eficiência próxima
a 100%.
Figura 13: Gráfico de amplificação referente à curva de eficiência do gene c-Myc utilizando diluição
seriada de 5x de cDNA de pólipos intestinais. Em X estão demonstrados os valores dos ciclos de PCR e
em Y os valores de ∆Rn. As interseções da linha verde com as curvas indicam os Cq’s das curvas de
amplificação.
39
Figura 14: Curva padrão referente ao gene c-Myc utilizando diluição seriada de 5x de cDNA de pólipos
intestinais. Em X estão demonstrados os valores de Log da concentração de cDNA e em Y os valores de
Cq correspondentes a cada diluição.
O slope da curva padrão foi usado para estimar a eficiência de amplificação.
Uma reação 100% eficiente produzirá um aumento de 10 vezes no amplicon da PCR a
cada 3,32 ciclos durante a fase exponencial de amplificação (log2 10 = 3,3219), ou seja,
o amplicon dobra em quantidade durante a fase geométrica. O cálculo da estimativa da
eficiência (E) foi calculado pela fórmula: E = (10-1/slope – 1) x 100. Os primers foram
considerados apropriados para avaliar a expressão gênica pelo sistema SYBR® Green
quando apresentaram eficiência de reação acima de 80% e abaixo de 120%. Os valores
de baseline foram ajustados para 3-15 ciclos e o threshold fixado em 0,2 para todas as
amostras. A Tabela 02 mostra os valores de slope e as eficiências dos primers avaliados.
Tabela 02: Sequências de primers forward (F’) e reverse (R’), slope, eficiência de reação e coeficiente de
correlação (R2) referentes aos genes avaliados.
Gene
Slope
Eficiência do Primer
R2
(%)
-3,17
107
0,9989
Actb
-3,57
98
0,9653
Cd44
-3,19
106
0,9897
c-Myc
-2,59
117
0,8840
c-Jun
-3,32
100
0,9848
Sulf1
-3,23
84
0,9766
Mapk3
-3,09
105
0,9918
Stat3
-3,96
92
0,9827
Psma6
40
3.6.6. Curva de Dissociação dos Amplicons
Foi realizada a análise da curva de dissociação dos amplicons, conforme os
guidelines para real time (MIQE) (BUSTIN et al, 2009; BUSTIN, 2010; TAYLOR et
al, 2010), para identificar a formação de produtos inespecíficos no final de cada corrida,
possivelmente gerados a partir de excesso de primers ou falha no desenho dos mesmos.
A Figura 15 ilustra a curva de dissociação do gene c-Myc, indicando a ocorrência de um
único pico à temperatura próxima de 80°C, mostrando não haver contaminação ou
formação de produtos inespecíficos.
Ao final dos 40 ciclos da qPCR, a temperatura foi elevada gradualmente de 60 à
95ºC, mantendo-se por 15 segundos em cada grau Celsius. Na medida em que os
amplicons desnaturaram, o sinal fluorescente emitido pelo SYBR® Green foi reduzido e
a temperatura em que metade do produto da PCR estava dissociada medida. O gráfico
resultante permitiu verificar se houve um ou mais produtos de PCR presentes em cada
reação devido a diferenças de temperatura de melting (Tm), específicas e dependentes
do tamanho do fragmento e do conteúdo de GC (%GC). O Tm desejado foi em torno de
80°C.
Figura 15: Curva de dissociação referente ao amplicon do primer c-Myc. No eixo x está representada a
temperatura de dissociação do amplicon gerado pela reação de PCR e no eixo Y a derivada do valor de
emissão de fluorescência.
41
3.7. Análise Estatística
A análise estatística dos resultados foi realizada com o software Prism (Versão
5.0). Para análise das diferenças entre os parâmetros histológicos observados,
utilizaram-se os testes Exato de Fisher e Qui-quadrado. Para os demais resultados
utilizou-se a análise de variância (ANOVA) ONE-WAY para testar as diferenças entre os
tratamentos, seguido de pós-teste de Tukey para determinação das diferenças
significativas entre os grupos expostos aos agentes químicos e os grupos controle.
Adotou-se o nível de significância p < 0,05 para todas as análises.
42
4.Resultados e Discussão
43
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Levando em consideração a importância toxicológica dos organossulfurados
DBT e DBTO2, e devido à escassez de estudos nesse sentido, foram realizados
experimentos aplicando-se doses subletais destas substâncias de forma crônica por via
intraperitoneal de ratos Wistar, no intuito de observar lesões de caráter neoplásico
consequentes da exposição a esses compostos. Dessa maneira, utilizou-se a dose de 30
mg/Kg tanto para o DBT, DBTO2 quanto para a DMH, substância de referência na
indução de câncer. Os animais foram tratados semanalmente durante o período de 10
semanas (tratamento) e mantidos em espera por 22 semanas adicionais (latência) com a
expectativa de observar uma evolução da gravidade das lesões causadas por tais
cancerígenos.
4.1. Efeitos Biológicos da Indução Química por DBT, DBTO2 e DMH em Ratos
Wistar
4.1.1. Avaliação da Massa Corporal dos Animais Durante o Tratamento
com os Agentes Químicos
A figura 16 demonstra o acompanhamento do peso dos animais durante as
semanas em que se realizaram o tratamento com os agentes químicos DBT, DBTO2 e
DMH. Como pode ser observado, não houve variação significativa de peso entre os
diversos grupos, demonstrando que a inoculação dessas substâncias, de acordo com
regime proposto, não interferiu no crescimento normal dos animais. Além disso, não
foram observadas alterações macroscópicas na superfície corporal externa dos animais
tratados.
44
Massa Corporal (g)
350
Controle DBT
Controle DMH
DBT
DBTO2
DMH
300
250
200
150
50
0
0
2
4
6
8
10
Semanas
Figura 16: Gráfico de acompanhamento de peso dos animais pertencentes aos grupos controles e testes
ao longo de 10 semanas de tratamento.
4.1.2. Avaliação das Alterações de Peso do Fígado e do Baço
As avaliações dos pesos relativos à massa corporal dos fígados e baços dos
grupos experimentais não mostrou diferenças significativas (Fig. 17 e 18). Esses
resultados mostram por meio de apreciação superficial de possíveis efeitos desses
agentes nesses órgãos, que não ocorreram variações nas massas teciduais analisadas.
Peso Fígado/Peso Animal
15
10
5
H
D
M
2
D
B
TO
B
T
D
Sa
on
tr
ol
e
C
C
on
tr
ol
e
Ó
le
o
lin
a
0
Grupos
Figura 17: Relações Peso Fígado/Peso Animal provenientes dos grupos controles e testes ao final do
período de tratamento/latência.
45
Peso Baço/Peso Animal
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
H
D
M
2
D
B
TO
B
T
D
Sa
on
tr
ol
e
C
C
on
tr
ol
e
Ó
le
o
lin
a
0.0
Grupos
Figura 18: Relações Peso Baço/Peso Animal provenientes dos grupos controles e testes ao final do
período de tratamento/latência.
4.2. Avaliações Morfológicas Macroscópicas
Ao se observar macroscopicamente o fígado, baço, estômago e parte do pulmão
concluiu-se que esses órgãos apresentaram aspecto e coloração compatíveis com
normalidade nos diversos grupos avaliados.
No caso dos intestinos delgado e grosso, o quadro de aparente normalidade foi
observado apenas em animais dos grupos controle salina e controle óleo. No grupo teste
DMH observou-se a presença de projeções papiliformes na mucosa voltada para a luz
do intestino grosso na maioria dos animais deste grupo. Verificaram-se lesões também
no intestino delgado, porém em menor quantidade e intensidade (Fig. 19, A e B).
Simultaneamente, para os animais pertencentes aos grupos testes DBT e DBTO2
foram visualizadas projeções mais frequentes ao longo do intestino delgado em relação
ao intestino grosso (Fig. 19; C, D e E). Na maioria dos animais pertencentes aos grupos
testes foi verificada a presença de pequenas ulcerações, superfície irregular de aspecto
avermelhado e consistência rígida típicas de pólipos.
46
Figura 19: A, B - Fotografia de parte do intestino grosso de animal pertencente ao grupo III (Teste DMH
30 mg/Kg) onde podem ser observadas as formações de pólipos. C, D, E - Fotografias de partes do
intestino delgado de animais pertencentes aos grupos IV (acima) e V (abaixo) (Testes DBT 30 mg/Kg e
DBTO2 30 mg/Kg, respectivamente) onde podem ser observados diversos pólipos.
4.3. Avaliações Morfológicas Microscópicas (Histologia)
Para a avaliação microscópica das lesões, realizou-se a análise histológica dos
intestinos, fígado e baço avaliando-se a ocorrência de alterações celulares, estruturais e
inflamatórias nos grupos controles e testes avaliados. As lâminas coradas pela técnica
Hematoxilina e Eosina (HE) foram analisadas sob microscopia ótica de maneira
quantitativa. As alterações histopatológicas consideradas neste trabalho foram as mais
frequentes para cada órgão.
O delineamento experimental incluiu grupos de ratos tratados com os solventes
salina e óleo para descartar qualquer possibilidade de indução de efeitos biológicos
decorrentes da administração crônica desses veículos. A análise do baço não revelou
qualquer alteração histológica em todos os grupos experimentais. No fígado, observouse um aumento significativo da ocorrência de inflamação parenquimal e hiperemia dos
animais tratados com os três agentes em relação aos seus respectivos controles (Tab.
03).
47
Tabela 03: Comparação de frequência das lesões observadas no Fígado para os grupos Controle Óleo,
Controle Salina, Teste DBT, Teste DBTO2 e Teste DMH
Lesões Observadas
Controle
Óleo
% (n)
Controle
Salina
% (n)
Teste
DBT
% (n)
Teste
DBTO2
% (n)
Teste
DMH
% (n)
p
Inflamação Portal
0 (0/4)a
0 (0/4)a
0 (0/15)a
0 (0/14)a
0 (0/14)a
-
Inflamação Parênquimal
0 (0/4)a
25 (1/4)c
20(3/15)c
14(2/14)b; c
50 (7/14)d
<0,0001
Degeneração Celular
0 (0/4)a
25 (1/4)c
0(0/15)a
0 (0/14)a
7 (1/14)b
<0,0001
Necrose
0 (0/4)a
0 (0/4)a
0 (0/15)a
0 (0/14)a
0 (0/14)a
-
Hemossiderina
0 (0/4)a
0 (0/4)a
0 (0/15)a
0 (0/14)a
0 (0/14)a
-
Granuloma
0 (0/4)a
0 (0/4)a
0 (0/15)a
0 (0/14)a
0 (0/14)a
-
Hiperemia
100 (4/4)g
100 (4/4)g
93(13/14)f
71 (10/14)e
79(11/14)e
<0,0001
# Letras diferentes indicam diferenças estatísticas na avaliação em linha (Teste de Exato de Fisher)
Nos intestinos dos animais dos grupos controles foi possível a observação de
todas as estruturas histológicas características da normalidade desse órgão. No grupo
óleo não foram observadas lesões em ambos os intestinos (Tab. 04 e 05). Por outro
lado, em apenas um em quatro animais do grupo controle salina, foi verificado aumento
de células inflamatórias de maneira difusa e de baixa intensidade nos intestinos grosso e
delgado. Neste mesmo animal, também foram observadas reações hiperplásicas de
nódulos linfóides (Tab. 04 e 05). Entretanto, considerando o tratamento invasivo de
injeções intraperitoneais ao qual os animais foram submetidos, e a diferença estatística
encontrada confrontando-se os animais testes, tratados com DMH, DBT e DBTO2,
pode-se afirmar que o quadro geral observado dos grupos controles representa,
praticamente, a normalidade histológica.
Tabela 04: Comparação de frequência das lesões observadas no Intestino Delgado para os grupos
Controle Óleo e Controle Salina.
Controle Óleo
% (n)
Controle Salina
% (n)
p
Atipias Celulares na Mucosa
0 (0/4)a
0 (0/4) a
-
Atipias Celulares na Média
0 (0/4) a
0 (0/4) a
-
Inflamação na Mucosa
0 (0/4) a
25 (1/4) b
<0.0001
Necrose
0 (0/4) a
0 (0/4) a
-
Atipias Estruturais
0 (0/4) a
0 (0/4) a
-
Hiperplasia de Nódulos Linfóides
0 (0/4) a
25 (1/4) b
<0,0001
Lesões Observadas
# Letras diferentes indicam diferenças estatísticas na avaliação em linha (Teste de Exato de Fisher)
48
Tabela 05: Comparação de frequência das lesões observadas no Intestino Grosso para os grupos Controle
Óleo e Controle Salina.
Controle Óleo
% (n)
Controle Salina
% (n)
p
Atipias Celulares na Mucosa
0 (0/4) a
0 (0/4) a
-
Atipias Celulares na Média
0 (0/4) a
0 (0/4) a
-
Inflamação na Mucosa
0 (0/4) a
25 (1/4) b
<0.0001
Necrose
0 (0/4) a
0 (0/4) a
-
Atipias Estruturais
0 (0/4) a
0 (0/4) a
-
Hiperplasia de Nódulos Linfóides
0 (0/4) a
25 (1/4) b
<0.0001
Lesões Observadas
# Letras diferentes indicam diferenças estatísticas na avaliação em linha (Teste de Exato de Fisher)
Ao comparar os resultados das análises histológicas dos grupos controle salina e
teste DMH 30 mg/Kg nos intestinos delgado e grosso (Tab. 06 e 07) nota-se o aumento
significativo para todas as alterações avaliadas, porém mais acentuado no intestino
grosso dos animais teste DMH. Verificou-se a presença frequente e intensa de células
inflamatórias ao longo do tecido tanto em intestinos grosso quanto delgado. As
principais atipias observadas foram alterações na morfologia das mucosas, presença de
glândulas irregulares e de células com morfologia irregular de difícil identificação (Fig.
20, G e H; e Fig. 21, G e H). Grande parte dos tecidos de intestino delgado e grosso
apresentaram áreas de necrose, atingindo predominantemente as túnicas mucosas de
forma consistente com a presença de nódulos linfóides pouco frequentes,
principalmente na região do cólon dos animais (Fig. 20 e 21, G).
Tabela 06: Frequência das lesões observadas no Intestino Delgado para os grupos Controle Salina e Teste
DMH 30 mg/Kg.
Controle Salina
%(n)
Teste DMH 30 mg/Kg
% (n)
P
Atipias Celulares na Mucosa
0 (0/4) a
57 (8/14) b
< 0,0001
Atipias Celulares na Média
0 (0/4) a
7 (1/14) b
0,0140
Inflamação na Mucosa
25 (1/4) a
100 (14/14) b
< 0,0001
Necrose
0 (0/4) a
92 (13/14) b
< 0,0001
Atipias Estruturais
0 (0/4) a
57 (8/14) b
< 0,0001
Hiperplasia de Nódulos Linfóides
25 (1/4) a
50 (7/14) b
0,0004
Lesões Observadas
# Letras diferentes indicam diferenças estatísticas na avaliação em linha (Teste de Exato de Fisher)
49
Tabela 07: Frequência das lesões observadas no Intestino Grosso para os grupos Controle Salina e Teste
DMH 30 mg/Kg.
Controle Salina
% (n)
Teste DMH 30 mg/Kg
% (n)
P
Atipias Celulares na Mucosa
0 (0/4) a
79 (11/14) b
< 0,0001
Atipias Celulares na Média
0 (0/4) a
57 (8/14) b
< 0,0001
Inflamação na Mucosa
25 (1/4) a
93 (13/14) b
< 0,0001
Necrose
0 (0/4) a
86 (12/14) b
< 0,0001
Atipias Estruturais
0 (0/4) a
79 (11/14) b
< 0,0001
Hiperplasia de Nódulos Linfóides
25 (1/4) a
21 (3/14) a
0,6145
Lesões Observadas
# Letras diferentes indicam diferenças estatísticas na avaliação em linha (Teste de Exato de Fisher)
As análises histopatológicas envolvendo os grupos teste DBT 30 mg/Kg e teste
DBTO2 30 mg/Kg (Tab. 08 e 09), revelaram um aumento significativo para todas as
alterações avaliadas. Da mesma forma, foi verificado aumento da intensidade
inflamatória na mucosa de ambos os intestinos. As hiperplasias das regiões nodulares
eram caracterizadas pelo aumento concêntrico de linfócitos e macrófagos,
possivelmente
relacionadas
com
as
projeções
papiliformes
observadas
macroscopicamente (Fig. 20; C e E). Nesses grupos observou-se um menor índice de
necrose e de atipias de maneira similar ao encontrado nos animais tratados com DMH.
Sendo assim, esses resultados se mostram consistentes com a expectativa da indução
química de lesões de caráter neoplásico com organossulfurados, corroborando com as
evidências anteriores verificadas em trabalhos do nosso grupo de pesquisas em
protocolos similares de tratamento.
Tabela 08: Frequência das lesões observadas no Intestino Delgado para os grupos Controle Óleo, Teste
DBT 30 mg/Kg e Teste DBTO2 30 mg/Kg.
Lesões Observadas
Controle
Óléo
% (n)
Teste DBT
30 mg/Kg
% (n)
Teste DBTO2
30 mg/Kg
% (n)
P
Atipias Celulares na Mucosa
0 (0/4) a
20 (3/15) b
0 (0/14) a
<0,0001
Atipias Celulares na Média
0 (0/4) a
7 (1/15) b
0 (0/14) a
0,0008
Inflamação na Mucosa
0 (0/4) a
93 (14/15) b
71 (10/14) c
<0,0001
Necrose
0 (0/4) a
33 (5/15) b
7 (1/14) c
< 0,0001
Atipias Estruturais
0 (0/4) a
20 (3/15) b
0 (0/14) a
< 0,0001
Hiperplasia de Nódulos Linfóides
0 (0/4)a
53 (8/15) b
64 (9/14) b
<0,0001
# Letras diferentes indicam diferenças estatísticas na avaliação em linha (Teste de Exato de Fisher)
50
Tabela 09: Frequência das lesões observadas no Intestino Grosso para os grupos Controle Óleo, Teste
DBT 30 mg/Kg e Teste DBTO2 30 mg/Kg.
Controle
Óléo
% (n)
Teste DBT
30 mg/Kg
% (n)
Teste DBTO2
30 mg/Kg
% (n)
p
Atipias Celulares na Mucosa
0 (0/4) a
13 (2/15) b
0 (0/14) a
<0,0001
Atipias Celulares na Média
0 (0/4) a
0 (0/15) a
0 (0/14) a
-
Inflamação na Mucosa
0 (0/4) a
93 (14/15) b
79 (11/14) c
<0,0001
Necrose
0 (0/4) a
33 (5/15) b
21 (3/14) b
< 0,0001
Atipias Estruturais
0 (0/4) a
20 (3/15) b
0 (0/14) a
< 0,0001
Hiperplasia de Nódulos Linfóides
0 (0/4)a
40 (6/15) b
50 (7/14) b
<0,0001
Lesões Observadas
# Letras diferentes indicam diferenças estatísticas na avaliação em linha (Teste de Exato de Fisher)
A presença de inflamação e necrose aumentadas nos grupos testes indicou o
potencial irritativo e lesivo das drogas utilizadas em órgãos como fígados e,
principalmente, intestinos. Todavia, as observações de crescimento celular aumentado e
alterações nas estruturas teciduais correspondem a um estágio inicial de displasia
característico de lesões pré-neoplásicas (KIM et al, 2006).
Diante da constatação de indução de lesões de natureza neoplásica nos animais
tratados com DBT e DBTO2 em intensidade similar àquelas provocadas pela
administração crônica de mesma dose de DMH, fica clara a importância desses
resultados para contribuir para a avaliação toxicológica dessas substâncias de irrefutável
relevância ambiental.
51
Figura 20: Fotomicrografias de cortes histológicos de intestino delgado (4µm) coradas pela técnica de
HE. a, c, e, g 110x. b, d, f, h 220x. a, b) Detalhes da túnica mucosa apresentando aspecto histológico
normal. c, e) Notar presença de diversas hiperplasias de nódulos linfoides na região da mucosa (setas). d)
Observar área de necrose (estrela) e aumento de células inflamatórias na mucosa (seta). f) Observar
aumento de células inflamatórias na região glandular (setas). g) Observar área de necrose (estrela)
associada à atrofia mucosa e atipias celulares, determinando a formação de estruturas irregulares e de
difícil identificação e processo inflamatório associado (setas). h) Detalhes de células atípicas (setas).
52
Figura 21: Fotomicrografias de cortes histológicos de intestino grosso (4µm) coradas pela técnica de HE.
a, c, e, g 110x. b, d, f, h 220x. a, b) Detalhes da túnica mucosa apresentando aspecto histológico normal.
c,e) Observar a presença de hiperplasias de nódulos linfóides (setas) e atipias celulares (estrela). d)
Detalhe da área de necrose (estrela). f) Observar forte inflamação da mucosa (setas). g, h) Vasta área de
necrose (estrelas) com atipias celulares com formação de estruturas de difícil identificação (setas).
53
4.4. Imunohistoquímica
A técnica de imunohistoquímica é um procedimento sensível de detecção
molecular, que pode auxiliar em diagnósticos de doenças inflamatórias, infecciosas e
neoplasias. No caso do câncer, essa técnica pode ainda auxiliar no fornecimento de
dados relevantes e individualizados sobre o melhor tratamento, provável evolução de
tumores indiferenciados e determinação de fatores preditivos de neoplasias
(ZAVRIDES et al, 2005; PALTIAN et al, 2009).
No trabalho desenvolvido, embora os resultados das análises histológicas
demonstrarem o desenvolvimento de lesões com características neoplásicas, esses dados
devem ser reforçados com evidências moleculares. Em trabalhos anteriores, do nosso
grupo de pesquisa, foram realizados ensaios Western Blotting utilizando-se de
marcadores moleculares CD44 e o antígeno carcinoembrionário (CEA). Porém não foi
possível detectá-los nos extratos de proteínas de membrana provenientes dos pólipos
dos animais induzidos. Na ocasião, o resultado negativo pôde ser justificado pelo
estágio inicial de desenvolvimento tumoral e a utilização de anticorpos recomendados
para análises imunohistoquímicas.
É importante ressaltar que o CEA é um antígeno reconhecido como um
marcador tumoral de tecidos neoplásicos colorretais, sendo praticamente nula sua
expressão em tecidos saudáveis (COBBEN-BELD et al, 1996; KAHLENBERG et al,
2003). Já o marcador CD44 é um antígeno expresso endogenamente, porém sua
expressão é aumentada em tecidos tumorais pulmonares e intestinais (KARGL et al,
1997; CARLI et al, 2012).
Dessa forma, no atual projeto utilizaram-se tais marcadores moleculares pela
técnica de imunohistoquímica de lâminas montadas a partir dos pólipos coletados nos
intestinos delgados dos animais necropsiados. Tanto o antígeno CD44 e o CEA foram
detectados de forma mais aguda estatisticamente nos tecidos de animais submetidos aos
tratamentos com carcinógenos, corroborando com a literatura supracitada.
Os resultados demonstraram que as expressões de CEA nos animais controle
foram muito baixas em relação aos grupos induzidos com os carcinógenos (Fig. 22).
Foram verificados aumentos em torno de 100 vezes na expressão deste antígeno em
todos os grupos testes de maneira similar entre si (DBT, DBTO2 e DMH), sem
apresentar diferenças estatísticas. A grande diferença de expressão citada acima está de
acordo com a expectativa de quase nulidade da presença do antígeno em células
54
normais. Desta forma verifica-se que esse marcador foi satisfatório para detecção desse
estágio neoplásico em início de desenvolvimento.
Nº de células marcadas
CEA
300
200
b
b
b
100
H
D
M
2
B
TO
D
B
T
a
C
D
N
TR
O
LE
O
C
a
O
Ó
N
LE
TR
O
O
LE
SA
LI
N
A
0
Grupos
Figura 22: Gráfico com os resultados obtidos da quantificação de células de intestino delgado marcadas
pelo anticorpo para CEA nos cinco grupos avaliados. Letras diferentes indicam diferenças estatísticas no
teste de comparação múltipla Tukey e análise de variância (ANOVA) ONE-WAY, p<0,05.
A expressão de CD44 nos pólipos intestinais dos grupos testes mostrou-se
aumentada em torno de 3 vezes em todos os grupos testes quando comparado aos
respectivos grupos controles. No entanto, entre os animais testes (DBT, DBTO2 e
DMH), não houve diferenças estatísticas (Fig. 23). Embora em menor intensidade que o
CEA, esses dois marcadores não revelaram diferenças de expressão entre os três grupos
de tratamentos citados acima. Dessa forma, o CEA e o CD44 avaliaram de forma
coerente e semelhante os estágios de desenvolvimento neoplásico desses três grupos. A
explicação para uma menor diferença de expressão da CD44 entre controle e teste se
deve a franca expressão endógena dessa proteína de adesão em células normais
(CHRISTOFORI, 2003; PALTIAN et al, 2009). Esses resultados reforçam ainda mais
as evidências que os três agentes se equiparam em potência como carcinógenos.
55
CD44
Nº de células marcadas
b
b
300
b
200
100
a
a
M
H
D
2
B
TO
D
B
T
D
C
O
N
TR
O
LE
C
O
Ó
N
LE
TR
O
O
LE
SA
LI
N
A
0
Grupos
Figura 23: Gráfico com os resultados obtidos da quantificação de células de intestino delgado marcadas
pelo anticorpo para CD44 nos cinco grupos avaliados. Letras diferentes indicam diferenças estatísticas no
teste de comparação múltipla Tukey e análise de variância (ANOVA) ONE-WAY, p<0,05.
56
Figura 24: Fotomicrografias de cortes histológicos de intestino delgado (4µm) marcados pela técnica de
imunohistoquímica para os anticorpos CD44 e CEA, nos cinco grupos avaliados. A marcação é
significativamente maior nos animais dos grupos testes para ambos anticorpos. Foram verificados
aumentos na expressão de 3x e 100x, para CD44 e CEA, respectivamente. 440x.
57
4.5. Ensaios de Fluorescência com BBI – FITC
O papel quimiopreventivo dos inibidores de proteases do tipo Bowman-Birk foi
demonstrado em vários modelos de câncer induzido com DMH (KENNEDY,1998;
ARMSTRONG et al, 2000). Existem diversos trabalhos que demonstram uma atividade
protetora em roedores tratados simultaneamente com injeções intraperitoneais de 1,2dimetilhidrazina e BBI adicionado às dietas (ST. CLAIR et al, 1990; CARLI et al,
2012). Além disso, é conhecida atividade inibitória do BBI sobre proteases envolvidas
na degradação da membrana basal e proliferação neoplásica prevenindo processos
angiogênicos necessários para a progressão tumoral (LOSSO et al, 2008). Além disso, a
capacidade antiinflamatória de BBI é bem demonstrada em estudos anteriores,
reduzindo danos oxidativos celulares causados por radicais livres (KENNEDY, 1998a),
e inibindo proteases envolvidas em processos inflamatórios (WARE et al, 1997). Dessa
forma, como a inflamação está estreitamente associada à carcinogênese, acredita-se que
a atividade antiinflamatória do BBI possa ser o principal mecanismo quimiopreventivo
contra o desenvolvimento do câncer (KENNEDY, 1998b, KENNEDY et al, 2008).
O aumento da expressão de proteases, em pólipos intestinais de camundongos
tratados com DMH, capazes de se ligarem em colunas de afinidade de BBI, evidencia
uma possibilidade de utilizar esse inibidor como um ligante específico de proteases
envolvidas no desenvolvimento de câncer induzido quimicamente (CARLI et al, 2012).
Além disso, outros autores caracterizaram duas proteases de 45 e 60 kDa, purificadas
em colunas de afinidade de BBI, obtidas da fração lisossomal de pólipos neoplásicos
intestinais induzidas com DMH (BILLINGS et al, 1988; BILLINGS et al, 1991).
A elevada afinidade dos BBI’s por enzimas tripsina e quimotripsina símile
(GARIANI et al, 1997) favorece o emprego desse inibidor como possível ferramenta de
avaliação de alterações teciduais de animais tratados com DBT, DBTO2 e DMH,
mediante a ligação às proteases que podem constituir marcadores moleculares das
lesões causadas por estes agentes. Assim sendo, BBI de semente de soja foi conjugado a
isotiocianato de fluoresceína (FITC), para ser aplicado em cortes frescos de intestinos
de grupos controles e testes. Os resultados foram analisados através do programa
ImageTool 3.0 a fim de mensurar a intensidade de fluorescência em imagens
aleatoriamente selecionadas a partir do intestino delgado dos animais. Os valores foram
registrados como unidades arbitrárias (UA).
58
A partir disso, verificou-se uma marcação do conjugado BBI-FITC mais intensa
em todos os grupos submetidos aos tratamentos com os agentes químicos (Fig. 25 e 26).
O aumento da fluorescência nos grupos testes foi em torno de 1,7 vezes em relação aos
controles, sem apresentar diferenças estatísticas entre os grupos DMH, DBT e DBTO2.
Sendo assim, verificou-se que o conjugado BBI-FITC, proposto como um ligante
específico de proteases tripsina e quimotripsina símiles indicou ser satisfatório para
detecção do aumento da concentração de proteases-alvo do BBI, em animais tratados
com agentes carcinógenos em estágio neoplásico inicial de desenvolvimento. Esses
resultados demonstram que os inibidores de Bowman-Birk podem ser úteis no
diagnóstico precoce de análises histopatológicas de animais submetidos à exposição a
agentes químicos como DMH e também para os hidrocarbonetos policíclicos
aromáticos sulfurados como o DBT e DBTO2.
Intensidade Relativa
de Fluorescência (UA)
FA
150
b
100
b
b
a
a
50
H
D
M
2
B
TO
D
B
T
D
lin
a
Sa
on
tr
ol
e
C
C
on
tr
ol
e
Ó
le
o
0
INTESTINO DELGADO
Figura 25: Gráfico com os resultados obtidos da quantificação média da intensidade de fluorescência
(UA) de regiões marcadas por fluorescência direta, pelo conjugado BBI-FITC, em intestinos delgados
dos cinco grupos avaliados. A fluorescência de fundo foi medida e subtraída da região de interesse. Letras
diferentes indicam diferenças estatísticas no teste de comparação múltipla Tukey e análise de variância
(ANOVA) ONE-WAY, p<0,05.
59
Figura 26: Fotomicrografias de cortes histológicos de intestino delgado (20µm) marcados pela técnica de
fluorescência direta, pelo conjugado BBI-FITC, nos cinco grupos avaliados. A marcação é
significativamente maior nos animais dos grupos testes em relação aos seus respectivos controles. Foram
verificados aumentos na expressão de proteases BBI-alvo em torno de 1,7x nos animais teste. 110x.
4.6. Expressão Gênica Relativa dos Transcritos Avaliados
O desenvolvimento neoplásico consiste em um processo multicausal no qual
controles normais da proliferação celular e da interação célula-célula são modificados.
A ativação irregular de proto-oncogenes juntamente com a inibição desregulada de
genes supressores tumorais representam os fundamentos desse processo (BUTEL,
2000). Diversos genes já foram descritos como pertencentes a essas categorias em
cânceres humanos, entretanto estima-se que ainda exista uma grande variedade a serem
identificados (DEVRIESE et al, 2012). Dentro deste imenso universo de possibilidades,
a alteração de genes específicos, com papéis centrais em canais regulatórios, revela o
60
potencial impacto de um único distúrbio molecular para a promoção da neoplasia (LI et
al, 2009a).
No atual trabalho, foram escolhidos sete genes notoriamente envolvidos no
processo carcinogênico em diferentes fases de seu desenvolvimento, no intuito de
avaliarmos possíveis alterações de expressão de maneira mais ampla. Essa escolha
justifica-se pelo precário conhecimento científico a respeito de efeitos toxicológicos de
Dibenzotiofeno e seus derivados sulfonados, inclusive em regimes de indução tumoral
em animais empregando-se tais compostos. Nesse contexto, destacaram-se os seguintes
proto-oncogenes e gene supressor de tumor:
- Cd44, que codifica uma glicoproteína integral de membrana, que funciona como um
receptor hialurônico para a matriz extracelular, envolvida na migração e adesão celular,
sendo seu aumento transcricional e de suas variadas isoformas, fortemente relacionado
com o desenvolvimento tumoral (HYNES, 2009; CHRISTOFORI, 2003);
- c-Myc, c-Jun e Stat3, atuam como fatores de transcrição que desempenham papéis
fundamentais em processos celulares como, crescimento e proliferação celular, apoptose
e processos inflamatórios (HANADA et al, 2001; GAO et al, 2004; KUSABA et al,
2006; CROCE, 2008);
- Psma6, codifica a subunidade alfa tipo 6 do proteassoma, importante complexo
enzimático responsável pela degradação de proteínas celulares regulando a homeostase
celular. Qualquer distúrbio em sua estrutura ou expressão pode resultar no
desenvolvimento e/ou progressão de patologias (EGERER et al, 2002; DAHLMANN,
2007);
-Mapk3, codifica a proteína da família das quinases reguladas por sinal extracelular
envolvida na regulação de processos de proliferação, diferenciação e progressão do
ciclo celular. Tal proteína atua na via ERK/MAPK adicionando um grupo fosfato a
proteína vizinha, dando prosseguimento à cascata de sinalização que resulta na
fosforilação de fatores de transcrição no núcleo. Sua superexpressão está vinculada a
progressão tumoral em diferentes tecidos (JOHNSON et al, 2000; ORTON et al, 2005);
- Sulf1, gene supressor de tumor envolvido na modulação a interação com o fator de
crescimento de células. Quando Sulf1 é regulado negativamente, aumenta-se a
61
disponibilidade de ligação do fator de crescimento via carboidratos sulfatados,
relacionando-se com a progressão tumoral (LAI et al, 2003; NAWROTH, 2007).
Além das avaliações histológicas que permitiram observar alterações de caráter
neoplásico em ratos submetidos à indução química com os três agentes empregados
nesse trabalho, avaliaram-se alterações na expressão gênica de transcritos específicos
em abordagem frequentemente empregada pela literatura (WANG et al, 2006;
CARDOSO et al, 2007; CROCE, 2008; PATEL et al, 2008). Desta forma, para estudar
alterações dos níveis transcricionais em pólipos intestinais delgados, extraídos de
animais tratados quimicamente, os níveis desses RNA’s mensageiros foram medidos
utilizando técnicas de qPCR com corante SYBR Green®.
A análise da expressão dos genes Cd44, c-Myc, c-Jun, Stat3, Psma6, Mapk3 e
Sulf1 foi avaliada nos grupos teste DBT, DBTO2 e DMH, em comparação pelo método
do 2-ΔCq. Empregou-se como referência o gene Actb, que codifica a actina, por se tratar
de uma proteína constitutiva, envolvida na estrutura e integridade celular. A amostra
calibradora utilizada foi o tecido intestinal delgado sadio dos animais pertencentes ao
grupo controle óleo, porque apresentou o melhor padrão de normalidade quando
avaliado pela histologia. O efeito do tratamento químico sobre a expressão gênica
relativa foi avaliado pela análise de variância (ANOVA) ONE-WAY (teste de Tukey) e
considerado significativo quando p<0,05 (Fig. 27). Todos os dados seguiram padrões de
conformidade com as diretrizes do MIQE (Minimum Information for Publication of
Quantitative Real-Time PCR Experiments) (BUSTIN et al, 2009; BUSTIN, 2010;
TAYLOR et al, 2010).
62
Figura 27: Gráficos da expressão gênica dos transcritos selecionados nos pólipos de intestino delgado de
4 animais referentes para cada grupo estudado (Controle Óleo, DBT, DBTO2 e DMH). A expressão
destes genes foi avaliada pelo método do 2-ΔCq. Como gene de referência foi utilizado o gene Actb. O
efeito do tratamento dos animais com os agentes químicos sobre a expressão gênica foi avaliado pela
análise de variância (ANOVA) ONE-WAY (teste de Tukey) e p<0,05 (Letras diferentes representam
diferenças).
63
A análise quantitativa da expressão gênica pela qPCR não demonstrou
diferenças significativas na expressão dos transcritos avaliados, em animais tratados
com DMH, DBT e DBTO2, em relação aos pertencentes ao grupo controle. As variações
encontradas são consistentes com as possibilidades de oscilação nas expressões de
genes durante processos tumorais. Famílias específicas de oncogenes, como a do c-Myc,
normalmente, são amplificadas durante tais processos. Entretanto, a amplificação de cMyc correlaciona-se com um avançado estágio tumoral em cânceres cervicais, de
pulmão, mama, esôfago, ovários e cólon (BODE et al, 2003; HULS et al, 2003;
CROCE, 2008). Além disso, é importante ressaltar que os pólipos intestinais, analisados
em nosso trabalho, demonstraram aspectos de um estágio inicial de desenvolvimento
tumoral, caracterizando um nível pré-neoplásico das células, o que também pode
justificar a não alteração da expressão gênica dos oncogenes estudados (CORPET et al,
2002; CARDOSO et al, 2007).
Em geral, os mecanismos que levam a superexpressão de genes em células
neoplásicas ainda permanecem pouco compreendidos. São descritos genes que se
mostram amplificados em genomas de células tumorais que não são necessariamente
superexpressos, devido a influências externas ou por RNA’s interferentes (miRNA e
siRNA) (PLASTERK, 2002; CHOPRA et al, 2002). Isto indica que a amplificação
gênica por si só, ainda não constitui evidência que prove o papel chave de um gene na
orientação de proliferação tumoral (CROCE, 2008; DUFFY et al, 2003; ALBERTS et
al, 2002).
Por outro lado, diversos trabalhos demonstraram diferenças na expressão gênica
utilizando diferentes metodologias de tratamento e técnicas de análise. Starkel e
colaboradores (1999) ao induzirem lesões em fígados de ratos, demonstraram aumento
na expressão de genes como Stat3, c-Myc e c-Jun através de ensaios de RT-PCR e
Northern Blotting, durante as primeiras horas após as lesões. Além disso, outros estudos
demonstraram alterações na expressão gênica de oncogenes estudados neste trabalho,
empregando amostras de tecido tumoral de carcinogênese induzida com DMH em ratos
(SALIM et al, 1997; WANG et al, 2006). Entretanto, tais trabalhos também utilizaram
protocolos e modelos diferentes do atual trabalho, como, por exemplo, indução
empregando dimetilhidrazina em animais susceptíveis ao desenvolvimento de câncer.
Em pesquisas de Stopera e colaboradores (1993), utilizaram-se linhagens de ratos
Sprague Dawley, similares a Wistar utilizada em nosso estudo, porém induziram as
lesões utilizando o carcinógeno azoximetano em regimes de tratamento mais agressivos.
64
São também conhecidas pesquisas que obtiveram diferenças significativas de expressão
oncogênica, utilizando a técnica de qPCR Taqman, em culturas de células humanas
MCF-7 expostas a radiação gama (KROUPIS et al, 2005). Sendo assim, mesmo com a
análise gênica desse trabalho não demonstrando diferenças após tais induções com os
agentes DBT, DBTO2 e DMH, não se pode ignorar a aplicabilidade da técnica qPCR na
busca de novos biomarcadores e no auxílio de diagnósticos de doenças como o câncer
(CARDOSO et al, 2007; DEVRIESE et al, 2012). Além disso, diversos estudos, com
resultados negativos, dificilmente chegam a ser publicados, o que conduz a literatura a
um viés na busca de informações (CORPET et al, 2002).
Os resultados não significativos, para alteração da expressão gênica dos ensaios
de qPCR, não convergem com resultados obtidos na avaliação histológica deste
trabalho. As lesões apresentaram um estágio inicial do câncer constituindo um quadro
de manifestações pré-neoplásicas presentes nos pólipos intestinais. Tal estágio foi
caracterizado pela presença de células alteradas em regiões pontuais do tecido,
formando pólipos esparsos ao longo dos intestinos, que foram evidenciadas pelos
anticorpos CD44 e CEA em ensaios imunohistoquímicos (Fig. 22, 23 e 24). Tais
achados relacionam-se com recentes trabalhos com técnicas imunohistoquímicas, que
indicaram a associação da expressão da glicoproteína CD44 com tumores de glândulas
mamárias em estágios iniciais e relativamente benignos em cães (PALTIAN et al,
2009).
De forma semelhante à imunohistoquímica, a fluorescência direta do conjugado
BBI-FITC, permitiu a marcação dos tecidos em estágio pré-neoplásico. Embora não seja
possível uma associação direta desse aumento de fluorescência com marcadores
específicos de tumores, há sem dúvida uma concordância desses resultados com a
imunohistoquímica. Possivelmente, as proteases alvo envolvidas na prevenção do
câncer induzido quimicamente que são inibidas pelo BBI, estão de fato aumentadas nas
preparações de pólipos intestinais induzidas tanto pelo DMH (CARLI et al, 2012),
como na indução com DBT e DBTO2. Sendo assim, esses dois agentes sulfurados
demonstraram ser capazes de induzir neoplasias em mesma intensidade que o DMH,
considerado um agente mutagênico e um carcinógeno clássico. Nesses diferentes tipos
de induções químicas foram apresentadas alterações de mesma densidade de eventos
histopatológicos, imunohistoquímicos e em intensidade similares de fluorescência
associada à ligação com inibidores de Bowman-Birk.
65
5. Conclusão
66
5. Conclusão
Os dados experimentais de análises histológicas e moleculares de amostras de
intestinos de ratos Wistar tratados em regime crônico com DBT, DBTO2 e DMH,
permitiram as seguintes avaliações:

A apreciação macroscópica e histológica de intestinos grosso e delgado
indicaram uma equivalência na ocorrência de processos neoplásicos em
estágio inicial de desenvolvimento tanto para os animais dos grupos
tratados com DBT e DBTO2, quanto para os animais tratados com DMH;

Demonstrou-se que o aumento na expressão dos marcadores CD44 e
CEA, avaliados pela técnica de imunohistoquímica em animais tratados
com os três agentes químicos estudados, é de maneira equivalente e
coerente ao estágio de desenvolvimento neoplásico verificado pelas
análises histopatológicas;

A análise quantitativa da expressão gênica pela qPCR não demonstrou
diferenças significativas na expressão dos genes Cd44, c-Myc, c-Jun,
Stat3, Psma6, Mapk3 e Sulf1, em animais tratados com DMH, DBT e
DBTO2, em relação ao grupo controle;

Comprovou-se que a técnica de fluorescência direta, empregando-se o
conjugado BBI-FITC, marcou intensamente cortes histológicos frescos
de pólipos intestinais em estágio neoplásico inicial de desenvolvimento
de ratos tratados com os três agentes carcinógenos em intensidade
semelhante;

A equivalência no potencial carcinogênico entre os agentes policíclicos
aromáticos sulfurados e o DMH confere a estas substâncias uma grande
importância toxicológica, sobretudo no que diz respeito às questões
ambientais ligadas ao petróleo.
67
6. Perspectivas
68
6. Perspectivas

Avançar na avaliação dos ensaios fluorescentes com BBI como possível
instrumento de diagnóstico de alterações teciduais causadas pela carcinogênese
química;

Considerando-se o escasso entendimento da toxicologia dos hidrocarbonetos
policíclicos aromáticos sulfurados e sua relevância ambiental, o presente
trabalho comprova o efeito carcinogênico desses agentes em ratos Wistar e
incentiva o monitoramento ambiental e estudos de novos marcadores
moleculares.
69
7. Referências Bibliográficas
70
7. Referências Bibliográficas
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86
8. Anexos
87
8. Anexos
Anexo 01: Gráficos de amplificações referente às curvas de eficiência dos genes Actb, Cd44, Jun, Sulf1,
Stat3, Mapk3 e Psma6 utilizando diluição seriada de 5x de cDNA de pólipos intestinais. Em X estão
demonstrados os valores dos ciclos de PCR e em Y os valores de ∆Rn. As intercessões da linha verde
com as curvas indicam os Cq’s das curvas de amplificação.
88
Actb
Cd44
Jun
Sulf1
Stat3
Mapk3
Psma6
Anexo 02: Curvas padrões referentes aos genes Actb, Cd44, Jun, Sulf1, Stat3, Mapk3 e Psma6 utilizando
diluição seriada de 5x de cDNA de pólipos intestinais. Em X estão demonstrados os valores de Log da
concentração de cDNA e em Y os valores de Cq’s correspondes a cada diluição.
89
Actb
Cd44
Jun
Sulf1
Stat3
Mapk3
Psma6
Anexo 03: Curva de dissociação referente aos amplicons dos primers de Actb, Cd44, Jun, Sulf1, Stat3,
Mapk3 e Psma6. No eixo x estão representadas as temperaturas de dissociação dos amplicons gerados
pelas reações de PCR e no eixo Y as derivadas dos valores de emissão de fluorescência respectivos.
90