BIOTECNOLOGIAS DA REPRODUÇÃO ANIMAL
PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES BOVINOS
Paulo Bayard D. GONÇALVES1, M.H. BARRETA, L.C. SIQUEIRA, A.Q.
ANTONIAZZI
INTRODUÇÃO
A produção in vitro de embriões (PIV) é uma biotécnica de reprodução
assistida e uma ferramenta para pesquisa de eventos relacionados à
maturação e fecundação de oócitos, capacitação espermática e
desenvolvimento embrionário na fase de pré-implantação. Além disso, a PIV é
um instrumento de suporte para outras biotécnicas como clonagem,
transgênese e transferência nuclear. Sua aplicação em escala comercial se
tornou viável após o advento da aspiração folicular in vivo e pelo
aprimoramento das condições de cultivo in vitro.
Passam-se 25 anos após o nascimento do primeiro bezerro produzido in
vitro e os índices de blastocistos obtidos ainda estão aquém do desejado,
variando entre 20-50% (média de 35%). Além da baixa eficiência da técnica, os
embriões que conseguem se desenvolver in vitro apresentam qualidade inferior
àqueles produzidos in vivo. Diversos parâmetros são utilizados para avaliar a
qualidade dos embriões PIV como morfologia, criotolerância, transcrição
(mRNA), eclosão in vitro e prenhez após a transferência. Entretanto, nenhuma
dessas técnicas permite uma seleção eficiente que assegure bons índices de
prenhez. O aumento da eficiência da PIV está condicionado ao
desenvolvimento de trabalhos que visem aperfeiçoar e simplificar as condições
de cultivo durante as várias etapas do processo, principalmente no que se
refere à maturação citoplasmática e molecular de oócitos obtida in vitro.
Maturação nuclear, citoplasmática e molecular do oócito
In vivo, a maturação nuclear do oócito inicia após o pico pré-ovulatório de
LH durante o estro e in vitro, a retirada do oócito do ambiente folicular reinicia a
meiose. Em bovinos, a maturação nuclear do oócito requer de 18-24h e
compreende a progressão do estádio diplóteno da primeira prófase meiótica
até metáfase II. A capacitação do oócito, avaliada pelo desenvolvimento
embrionário, tem sido positivamente associada com o tamanho do folículo
antral do qual foi recuperado (LONERGAN et al., 1994), com o estádio de
desenvolvimento folicular (MACHATKOVA et al., 2004) e com o local de
maturação (in vivo vs. in vitro; RIZOS et al., 2002). O TCM199 é o meio mais
difundido entre os laboratórios de PIV. Seus principais suplementos são o soro
fetal bovino, FSH, LH, piruvato, penicilina e estreptomicina. A maturação in vitro
varia de 18-24h em 5% de CO2 em ar e umidade saturada.
1
Laboratório de Biotecnologia e Reprodução Animal, Universidade Federal de Santa Maria,
Santa Maria, RS, Brazil. e-mail: [email protected]
Ciênc. vet. tróp., Recife-PE, v. 11, suplemento 1, p.135-138, abril, 2008
P. B. D. GONÇALVES et al.
In vivo, os folículos préovulatórios atingem um diâmetro de
12-20mm, e ovulam um oócito com
núcleo e citoplasma maturados
adequadamente. Entretanto, os
oócitos coletados para PIV são em
sua maioria oriundos de pequenos
folículos antrais e apesar de
competentes para o reinício da
meiose, apresentam baixa capacitação para o desenvolvimento
embrionário, por apresentarem uma
maturação citoplasmática e molecular insuficiente. As condições de
cultivo in vitro têm sido constantemente manipuladas para melhorar
a capacitação do oócito após sua
retirada do ambiente folicular.
Fatores de crescimento, gonadotrofinas e esteróides têm sido
adicionados aos mais diversos
meios de maturação. Porém,
apenas modestos incrementos na
capacidade de desenvolvimento
embrionário puderam ser observados e a produção de blastocistos
raramente
atingiu
50%
(THOMPSON,
2000).
Métodos
celulares e bioquímicos têm sido
usados para inibir o reinício da
meiose dos oócitos após sua
retirada do ambiente folicular,
visando melhorar o desenvolvimento citoplasmático e molecular
na ausência de maturação nuclear
(SIRARD, 2001). Esses estudos
demonstram que é possível manter
o reinício da meiose bloqueado por
24-48h sem afetar drasticamente o
desenvolvimento embrionário ou
fetal. Porém, nenhuma dessas
metodologias tem melhorado a
capacidade de desenvolvimento
embrionário. Recentemente, nosso
grupo demonstrou que a angiotensina II é capaz de reverter o
efeito inibitório das células da teca
sobre a maturação nuclear de
oócitos bovinos (GIOMETTI et al.,
2005). Além disso, o cultivo de
136
CCOs em um sistema de maturação
com células foliculares, angiotensina II e IGF-I aumentou as taxas de
clivagem, blastocisto e eclosão in
vitro (STEFANELLO et al., 2006).
Fecundação in vitro
In vivo, o espermatozóide
percorre um longo trajeto para
chegar ao infundíbulo e fecundar o
oócito. Durante esse percurso,
glicosaminoglicanas presentes no
trato genital feminino induzem sua
capacitação. Para fertilização in
vitro, a capacitação espermática é,
geralmente, promovida pela heparina. Antes do processo de
capacitação, os espermatozóides
viáveis contidos em uma palheta de
sêmen precisam ser separados do
plasma seminal, crioprotetores,
extensores e células mortas. Para
bovinos, os métodos de separação
espermática mais utilizados são o
gradiente de percoll e o swim-up. O
co-cultivo de espermatozóides e
oócitos é realizado por um período
de 18-22h, a 39˚C e 5% de CO2 em
ar e umidade saturada. O sistema
de fertilização in vitro tenta
mimetizar as condições in vivo.
Porém, resultados variados são
obtidos
com
espermatozóides
oriundos de touros ou partidas
diferentes.
Desenvolvimento embrionário in
vitro
O momento crítico para o
desenvolvimento embrionário começa após a fecundação, quando a
segunda meiose é reiniciada para
formar o pró-núcleo feminino, e
termina com a ativação do genoma
embrionário 8-16 células (BREVINI
GANDOLFI & GANDOLFI, 2001). O
desenvolvimento nesse período é
dependente de mRNA e proteínas
acumuladas durante a maturação
citoplasmática
(BLONDIN
&
Ciênc. vet. tróp., Recife-PE, v. 11, suplemento 1, p.135-138, abril, 2008
P. B. D. GONÇALVES et al.
SIRARD, 1995). A transcrição
deficiente antes da ativação do
genoma embrionário não permite o
desenvolvimento em várias espécies. Isso foi um dos obstáculos da
PIV nas décadas de 60 e 70, fato
que contribuiu para melhoria dos
sistemas de cultivo.
Diversos fatores de crescimento têm sido adicionados aos
meios de cultivo in vitro para
melhorar os índices de desenvolvimento embrionário (LONERGAN
et al., 1996; MATSUI et al., 1997).
Porém, apenas em meios definidos
esses fatores incrementam as taxas
de blastocisto. O cultivo in vivo no
oviduto de ovelhas (LONERGAN et
al., 2003) e vacas, de embriões
bovinos fertilizados in vitro, parece
fornecer um ambiente adequado
para o desenvolvimento embrionário. A produção de blastocistos
em sistemas de cultivo in vivo não é
superior a observada in vitro, mas a
qualidade dos blastocistos cultivados in vivo é superior (RIZOS et al.,
2002).
O cultivo embrionário in vitro
varia de 7-9 dias a 39ºC, atmosfera
controlada (5% de O2, 5% de CO2 e
90% de N2) e umidade saturada. A
taxa de blastocisto geralmente é
avaliada no 7º dia após a
fecundação sendo que, os blastocistos podem permanecer na estufa
até o 9º dia para avaliar a taxa de
eclosão in vitro.
CONSIDERAÇÕES FINAIS
A otimização da técnica de PIV
visando à produção de embriões de
boa qualidade e em número cada
vez mais expressivo resultará na
diminuição do custo por embrião
produzido e possibilitará uma maior
difusão da técnica entre os
produtores. Ainda, tais melhorias
seriam de grande valia para o
aprimoramento de outras biotéc-
137
nicas que dependam da PIV. Para
isso
se
faz
necessário
o
desenvolvimento de um sistema de
maturação in vitro adequado que
permita uma maior capacitação dos
oócitos e conseqüentemente uma
maior taxa de desenvolvimento
embrionário.
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