CARACTERIZAÇÃO MICROBIOLÓGICA DO QUEIJO
DA OVELHA SERRA DA ESTRELA
Freni Tavaria e F. Xavier Malcata
Escola Superior Biotecnologia
Universidade Católica Portuguesa
INTRODUÇÃO
O queijo Serra da Estrela, oriundo da região que lhe dá o nome, é a mais importante
variedade de queijo tradicional produzido em Portugal, em termos organolépticos e de imagem de
marca. No entanto, a aceitação pela União Europeia deste e de outros produtos tradicionais
manufacturados a partir de leite cru, frequentemente em condições precárias de higiene e sanidade,
está a ser cada vez mais condicionada. Esforços no sentido do melhoramento deste queijo têm
sido construídos em diversas áreas do conhecimento (Macedo, 1996); em particular, a
caracterização da flora indígena do leite, bem como da microflora do queijo ao longo da
maturação, é imprescindível como suporte de tentativas de controle mais eficaz em termos de
segurança para o consumidor e em termos da qualidade final do queijo.
No presente trabalho investigou-se a microflora do queijo Serra da Estrela ao longo do
período de maturação (entre 0 e 60 dias), ao longo da região demarcada, para um total de 8
queijarias no primeiro ano de amostragem (Tavaria e Malcata, 1998) e de 6 queijarias no segundo
ano (Tavaria et al., 1998); tal investigação considerou ainda a variação quantitativa de bactérias
lácticas, enterobactérias, estafilococos e leveduras num período mais longo de maturação (60-180
dias) para um total de 4 queijarias, tendo-se simultaneamente considerado o efeito da refrigeração
do leite antes de ser iniciado o fabrico (Tavaria e Malcata, 1998).
METODOLOGIA
ANÁLISES MICROBIOLÓGICAS
Amostras (10 g) de cada queijo foram homogeneizadas com 90 mL de uma solução estéril
de 2 %(w/v) de citrato de sódio durante 2 min. Alíquotas de 1 mL foram sujeitas a diluições
decimais em água peptonada (0.1%), sendo de seguida plaqueadas em duplicado em meio
adequado: KF-Streptococcus agar para os enterococos, Rogosa agar para os lactobacilos, M17
para os lactococos, MSE para os leuconostoc, BPM para os estafilococos, VRBGA para as
enterobactérias e PDA, com 10 mL/L de ácido láctico a 10 %(v/v), para as leveduras. A
identificação até à espécie de estirpes lácticas foi feita partindo do perfil electroforético das
proteinas celulares por comparação com estirpes de referência de uma base de dados previamente
preparada.
ANÁLISES ESTATÍSTICAS
Todos os dados experimentais das contagens foram sujeitos a transformação logarítmica e
expressos como unidades formadoras de colónias (ufc) por grama de queijo. Seguidamente foram
objecto de análise de variância utilizando o software Statistica.
RESULTADOS
MICROBIOLOGIA DO QUEIJO DA SERRA NO PERÍODO DE MATURAÇÃO 0-60
DIAS: EFEITO DO PRODUTOR E DO TEMPO DE MATURAÇÃO
Dados relativos às contagens microbiológicas efectuadas em meios selectivos diversos
indicaram que os dois grupos predominantes no queijo Serra da Estrela maturado até 60 dias são
as enterobactérias e as bactérias lácticas. Durante a primeira semana de maturação, verifica-se uma
predominância de espécies Gram- (enterobactérias); porém, à medida que a maturação progride, é
notório o domínio das bactérias lácticas (60% das espécies isoladas) (Tavaria e Malcata, 1996).
Ao longo do período de maturação verifica-se uma diminuição da biodiversidade da microflora no
queijo. Entre as espécies prevalecentes no final da maturação, encontra-se o Enterococcus durans
(que vem tomar o lugar do E. faecalis e do E. faecium). Das espécies identificadas de bactérias
lácticas, salientam-se o Lactobacillus plantarum, o Lb. pentosus, o Lb. brevis, o Lb. paracasei, o
Lactococcus lactis e o Leuconostoc mesenteroides spp. Mesenteroides/dextranicum. (Tavaria et
al., 1998). Apesar do abaixamento do pH causado pela predominância da flora láctica ser de certa
forma um factor de controle da viabilidade de algumas estirpes (sobretudo de estafilococos e
enterobactérias), o número destas após 45 d de maturação é ainda consideravelmente alto (105 e
106/gqueijo, respectivamente), pelo que é arriscado o consumo precoce deste produto. O factor
proveniência geográfica tem um contributo significativo para a variabilidade encontrada, em
relação a todos os grupos microbianos (Tavaria e Malcata, 1997).
MICROBIOLOGIA NO PERÍODO DE MATURAÇÃO 0-60 D: EFEITO DO ANO DE
FABRICO
Os números de microorganismos viáveis presentes no queijo Serra da Estrela são
semelhantes aos divulgados para outros queijos tradicionais produzidos a partir de leite cru
(Nunez & Medina, 1979; Tzanetakis et al., 1987; Fernandez del Pozo et al., 1988; Freitas &
Malcata, 1997). Imediatamente após o fabrico, o número total de bactérias viáveis mantém-se em
níveis relativamente elevados (105-107 ufc/gqueijo), sendo as leveduras e os estafilococos os grupos
menos numerosos. O número de enterobactérias decresce ca. de 5% desde o fabrico até aos 60 d,
enquanto o número de bactérias lácticas aumenta durante a maturação. Tendências semelhantes
foram descritas por outros autores para queijos espanhóis produzidos com leite cru de ovelha
(Nuñez et al., 1989); no queijo Manchego, p.ex., a microflora é composta essencialmente por
lactococos que, após 1 mês de maturação, são substituídos por lactobacilos, com concomitante
decréscimo do número de micrococos e estafilococos (coagulase-positivos) ao longo da
maturação. Fernandez del Pozo et al. (1988) descreve uma situação semelhante durante a
maturação do queijo La Serena: um aumento no número de contagens totais, de lactobacilos, de
leuconostocs e de enterococos foi observado nos estágios iniciais da maturação, enquanto que o
crescimento de estafilococos sofreu inibição logo a partir do 2o dia de maturação.
O ano de fabrico revelou-se como estatisticamente significativo (p<0.05) para todos os
grupos microbianos, à excepção dos enterococos e dos lactobacilos, sendo o factor proveniência
geográfica novamente muito significativo (p<0.0001). Estes resultados reforçam a convicção de
que (i) urge proceder à uniformização do processo de fabrico dos produtos tradicionais fabricados
artesanalmente e de que (ii) a viabilidade de microorganismos potencialmente perigosos (como
sejam os enterococos, as enterobactérias e os estafilococos) deve ser cuidadosamente
monitorizada. Esforços neste sentido foram já implementados na vizinha Espanha, onde p.ex. na
produção do queijo Manchego se conseguiu um decréscimo no número de Enterobacteriaceae
durante a maturação através da inoculação com culturas de Streptococcus lactis (Gaya et al.,
1983). Em 1988, Gaya et al. reduziram igualmente o número de Staphylococcus aureus no queijo
Manchego por adição de uma cultura de arranque comercial.
MICROBIOLOGIA NO PERÍODO DE MATURAÇÃO 60-180 D: EFEITO DO
PRODUTOR, DA PROVENIÊNCIA GEOGRÁFICA, DO TEMPO DE MATURAÇÃO E
DA REFRIGERAÇÃO DO LEITE
No período de maturação que decorre entre os 60 e os 180 d, verificou-se que o número de
bactérias lácticas (i.e. enterococos, lactobacilos, lactococos e leuconostocs) se manteve
relativamente alto (106-108 ufc/gqueijo), verificando-se durante aquele período, um decréscimo de
23% para os lactobacilos, 14% para os lactococos, 11% para os leuconostocs e 7% para os
enterococos. Por outro lado, as enterobactérias viáveis ao fim de 180 d existiam a níveis inferiores
a 10 ufc/gqueijo, enquanto que os estafilococos mostraram um decréscimo de apenas 3% e as
leveduras de 68% em relação à situação aos 60 d. A análise estatística mostrou que a proveniência
geográfica e o tempo de maturação continuam a ser altamente significativos, sugerindo que, pelo
menos em termos quantitativos, os queijos são substancialmente diferentes uns dos outros.
Quanto à refrigeração prévia do leite, esta revelou Ter um efeito significativo (de sinal
negativo) no que respeita ao número de enterobactérias e (de sinal positivo) para os lactobacilos
relativamente ao leite extremo. No entanto, em queijos produzidos com leite refrigerado, o tempo
de maturação não é um factor significativo, contrariamente ao que acontece para queijos feitos
com leite não refrigerado. É de notar que não foram detectadas diferenças no número de
enterococos, lactococos, leuconostocs, estafilococos e leveduras entre queijos produzidos com
leite refrigerado e com leite não refrigerado, o que obviamente sugere que a refrigeração pode ser
um procedimento a utilizar se se pretender optimizar a produção deste queijo após scale-up do
processo artesanal.
Agradecimentos
Os autores agradecem financiamento parcial no âmbito dos projectos IMPACTO - Investigação
dirigida ao Melhoramento do Processo de produção do queijo serrA por integração de abordagens
Científicas e TecnOlógicas (PRAXIS) e PROTOLACTIS - PROdução, por Tecnologias
Optimizadas, de LACticínios Tradicionais (PAMAF). Um agradecimento especial é dirigido à
ANCOSE (Associação Nacional dos Criadores de Ovinos Serra da Estrela) pela produção e
transporte dos queijos, de acordo com o plano experimental previamente delineado, e em
particular ao Engº João Madanelo pelo seu empenho neste projecto de colaboração com a
Universidade Católica Portuguesa.
BIBLIOGRAFIA
Fernandez del Pozo, B., Gaya, P., Medina, M., Rodriguez-Marin, A. & Nuñez, M. 1988 Changes
in the microflora of La Serena ewe’s milk cheese during ripening. J. Dairy Res. 55, 449-455.
Freitas, A. C., Pais, C., Malcata, F. X. & Hogg, T. 1996. Microbiological characterization of
Picante da Beira Baixa cheese. J. Food Prot. 59, 155-159.
Gaya, P., Medina, M. & Nuñez, M. 1983. Accelerated decrease of Enterobacteriaceae counts
during ripening of raw milk Manchego cheese by lactic culture inoculation. J. Food Prot. 46,
305-308.
Gaya, P., Medina, M., Bautista, L. & Nuñez, M. 1988. Influence of lactic starter inoculation, curd
heating and ripening temperature on Staphylococcus aureus behaviour in Manchego cheese.
Int. J. Food Microbiol. 6, 249-257.
Macedo, A. C. 1996. Microbiological, chemical, biochemical, and technological contributions to
the characterization and improvement of Serra da Estrela cheese. Tese de Doutoramento,
Escola Superior de Biotecnologia, Porto.
Nuñez, M. & Medina M. 1979. La flore lactique du fromage blue de Cabrales. Lait 59, 497-513.
Tavaria, F. K. & Malcata, F. X. 1998. Microbiological characterization of Serra da Estrela cheese
throughout its appellation d’origine protégée region. J. Food Prot. 61: 601-607.
Tavaria, F. K. & Malcata, F. X. 1998. Microbiological characterization of mature Serra da Estrela
cheese. In: 25th International Dairy Congress (FIL-IDF), Setembro 21-24, 1998, Aarhus,
Dinamarca.
Tavaria, F. K., Ricardo H. Pires, Sofia C. Antunes & Malcata, F. X. 1998. Characterization of
bacterial isolates from Serra da Estrela cheese via analysis of their electrophoretic protein
profiles. In: IV Iberian Congress of Biotechnology (BIOTEC98), Julho 12-15, Guimarães,
Portugal.
Tavaria, F. K. & Malcata, F. X. 1997. Variation of the microbiological profile of Serra da Estrela
cheese throughout the AOP region. In: Microflora meeting (Mastering the Influence of
Microorganisms on the FinaL PrOperties of RAw milk cheeses), Póvoa do Varzim,
Portugal, Maio 26-27, 1997.
Tavaria, F. K. & Malcata, F. X. 1996. Queijo Serra da Estrela: Avaliação microbiológica ao longo
da região demarcada. Terra Fértil, 2:21-24.
Tzanetakis, N., Litopoulou-Tzanetaki, E. & Manolkidis, K. (1987) Microbiology of Kopanisti, a
traditional Greek cheese. Food Microbiol. 4, 251-256.
Figura 1 - Distribuição dos diferentes grupos microbianos nas várias queijarias ao longo do
período de maturação (0-60 d).
Lactobacilos
Lactococos
10
Log (UFC/g queijo )
Log (UFC/g queijo )
10
8
6
4
2
8
6
4
2
0
0
1
3
5
7
12 16 32 45 60 90 120
1
3
Tempo de maturação (d)
5
7
Tempo de maturação (d)
Estafilococos
Enterobactérias
10
Log (UFC/g queijo )
Log (UFC/g queijo )
10
8
6
4
2
8
6
4
2
0
0
1
3
5
7
12 16 32 45 60 90 120
1
3
Tempo de maturação (d)
5
7
12 16 32 45 60 90 120
Tempo de maturação (d)
Leveduras
Enterococos
10
Log (UFC/gqueijo )
10
Log (UFC/g queijo )
12 16 32 45 60 90 120
8
6
4
2
8
6
4
2
0
0
1
3
5
7
12 16 32 45 60 90 120
Tempo de maturação (d)
1
3
5
7
12 16 32 45 60 90 120
Tempo de maturação (d)
Figura 2. Comparação das contagens para dois anos consecutivos em 5 queijarias; (u)
Enterobactérias, (n) Lactobacilos, (s) Lactococos, (¡) Estafilococos, (ÿ) Enterococos e (l)
Leveduras.
Mangualde-1996
Mangualde-1997
10
Log (UFC/gqueijo )
8
6
4
2
8
6
4
2
0
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
0 5 10 15 20 25 3035 40 45 50 55 60 65
Tempo de maturação (d)
Tempo de maturação (d)
Nelas-1996
Nelas-1997
10
Log (UFC/g queijo )
Log (UFC/g queijo )
10
8
6
4
2
0
8
6
4
2
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
0 5 10 15 20 25 3035 40 45 50 55 60 65
Tempo de maturação (d)
Tempo de maturação (d)
Penalva do Castelo-1997
Penalva do Castelo-1996
10
Log (UFC/gqueijo )
Log (UFC/gqueijo )
12
10
8
6
4
2
8
6
4
2
0
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
0 5 10 15 20 25 3035 40 45 50 55 60 65
Tempo de maturação (d)
Tempo de maturação (d)
Penalva do Castelo-1997
Penalva do Castelo-1996
10
Log (UFC/gqueijo )
12
Log (UFC/gqueijo )
Log (UFC/gqueijo )
10
10
8
6
4
2
8
6
4
2
0
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
0 5 10 15 20 25 3035 40 45 50 55 60 65
Tempo de maturação (d)
Tempo de maturação (d)
Figura 3. Contagens de bactérias lácticas (lactococos, lactobacilos, leuconostocs e enterococos),
enterobactérias, estafilococos e leveduras em 4 queijarias durante o período de maturação (60-180
d).
Estafilococos
Log (UFC/g queijo )
Log (UFC/g queijo )
Enterobactérias
8
6
4
2
0
60
90
120
150
8
6
4
2
0
60
180
Tempo de maturação (d)
90
Log (UFC/gqueijo )
Log (UFC/gqueijo )
120
150
8
6
4
2
0
60
180
90
150
180
Lactobacilos
Log (UFC/g queijo )
120
150
180
10
8
6
4
2
0
60
Tempo de maturação (d)
90
120
10
8
6
4
2
0
60
150
Tempo de maturação (d)
Leuconostocs
Log (UFC/gqueijo )
Log (UFC/g queijo )
Lactococos
10
8
6
4
2
0
90
120
Tempo de maturação (d)
Tempo de maturação (d)
60
180
Leveduras
10
8
6
4
2
0
90
150
Tempo de maturação (d)
Enterococos
60
120
90
120
150
Tempo de maturação (d)
180
180
Figura 4. Distribuição dos diferentes microbianos em queijos produzidos com leite refrigerado e
não-refrigerado; (u) Enterobactérias, (n) Lactococos, (s) Lactobacilos, (l) Estafilococos, (×)
Enterococos, (S) Leuconostocs e (+) Leveduras.
Refrigerado
Lactobacilos
Lactococos
Não-refrigerado
Log (UFC/gqueijo )
Log (UFC/gqueijo )
10
8
6
4
2
10
8
6
4
2
0
0
60
90
120
150
60
180
90
Tempo de maturação (d)
180
10
Log (UFC/gqueijo )
10
Log (UFC/gqueijo )
150
Leuconostoc
Enterococos
8
6
4
2
8
6
4
2
0
0
60
90
120
150
60
180
Log (UFC/gqueijo )
10
8
6
4
2
0
90
120
150
150
180
10
8
6
4
2
0
180
60
Tempo de maturação (d)
90
120
150
180
Tempo de maturação (d)
Leveduras
Log (UFC/gqueijo )
120
Estafilococos
Enterobactérias
60
90
Tempo de maturação (d)
Tempo de maturação (d)
Log (UFC/gqueijo )
120
Tempo de maturação (d)
10
8
6
4
2
0
60
90
120
150
180
Tempo de maturação (d)