ISSN 2236-4420
263
Alterações no perfil proteico em sementes de Araucaria angustifolia durante a
maturação e sua relação com a viabilidade
Cristhyane Garcia1; Marília Shibata1; Cileide Maria Medeiros Coelho2;
Francine Lunardi Farias Soares1; Miguel Pedro Guerra1
1
Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias – UFSC/CCA, Programa de Pós-Graduação em
Recursos Genéticos Vegetais, Rodovia Admar Gonzaga, 1346, Bairro Itacorubi, CEP 88.034-001, Florianópolis, SC. E-mail:
[email protected]; [email protected]; [email protected]; [email protected]
2
Universidade do Estado de Santa Catarina, Centro de Ciências Agroveterinárias – UDESC/CAV, Av. Luiz de Camões, 2090,
Bairro Conta Dinheiro, CEP 88.520-000, Lages, SC. E-mail: [email protected]
Resumo: Objetivou-se avaliar o teor de proteínas solúveis totais e as diferenças no perfil protéico nos tecidos de
sementes de Araucaria angustifolia (Bert) O. Kuntze em dois estádios de maturação. A partir de uma amostra
representativa da população obteve-se uma amostra de sementes para realizar o teste de germinação (25 °C) e
outra amostra foi utilizada para separar o eixo embrionário, cotilédones e megagametófito. Determinou-se o grau
de umidade e extraíram-se as proteínas solúveis em cada tecido da semente, a partir dos quais realizou-se
eletroforese em dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) 12%. O grau de umidade das sementes no estádio I (início
da fase de maturação - mês de abril) foi 12% superior em relação ao estádio IV (início da dispersão das sementes
maduras - mês de julho). Em ambos os estádios, o eixo embrionário e os cotilédones apresentaram grau de
umidade superior ao megagametófito. Já o teor de proteínas solúveis não diferiu entre os tecidos do eixo
embrionário e cotilédones para as sementes em estádio I, mas esta diferença foi acentuada no estádio IV. O perfil
das proteínas do eixo embrionário e cotilédones apresentou subunidades proteicas de em torno de 48 kDa, 30
kDa, 25 kDa e 6 kDa. Entretanto, no megagametófito do estádio I, apenas duas subunidades proteicas foram
observadas (25 kDa). Apesar de ocorrer um decréscimo no grau de umidade da semente ao longo da maturação,
houve incremento no teor de proteínas solúveis do embrião, particularmente no tecido do eixo embrionário.
Conclui-se que o decréscimo no teor de água não foi limitante para o acúmulo de proteínas durante a maturação;
tais alterações não refletiram na viabilidade das sementes de A. angustifolia.
Palavras chave: pinheiro brasileiro, maturidade fisiológica, germinação, SDS-PAGE.
Changes in the protein profile of Araucaria angustifolia seeds during maturation and its
relationship with viability
Abstract: The aim of this study was to evaluate the total soluble protein content and differences in the protein
profile in the tissues of Araucaria angustifolia seeds in two maturation stages. Seeds for the germination test (25
°C) and for the separation of the embryonic axes, c otyledons and megagametophyte were obtained from a
representative population. From each tissue, soluble proteins were extracted and the moisture content was
determined. The electrophoresis was performed on sodium dodecyl sulfate (SDS-PAGE) 12%. The seed moisture
content in stage I (early phase of maturation – month of April) was 12% higher than in stage IV (early dispersal of
mature seeds – month of July). In both stages, embryonic axes and cotyledons showed higher moisture content
than the megagametophyte. The soluble protein content did not differ among embryonic axes and cotyledon
tissues in stage I seeds, but a significant difference was observed in the stage IV. The protein profile from
embryonic axes and cotyledons showed protein subunits around 48 kDa, 30 kDa, 25 kDa and 6 kDa. However,
only two protein subunits were detected (25 kDa) in stage I megagametophyte. Despite the decrease in seed
moisture content during seed maturation, the embryo protein content increased, mainly in the embryonic axes
tissue. The results indicate that the decrease in water content did not limit protein accumulation during maturation
and did not affect the viability of A. angustifolia seeds.
Key words: brazilian pine, physiological maturity, germination, SDS-PAGE.
Magistra, Cruz das Almas-BA, v. 24, n. 4, p. 263-270, out./nov. 2012.
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Garcia et al.
Introdução
A espécie Araucaria angustifolia (Bert) O.
Ktze. é a única do gênero com ocorrência natural no
Brasil. Ao longo de décadas, esta conífera da Mata
Atlântica representou a principal fonte de madeira
(Astarita e Guerra, 1998), cuja intensa exploração a
tornou criticamente ameaçada de extinção (Farjon,
2006). As sementes da espécie são recalcitrantes e
sensíveis à dessecação (Tompsett, 1984; Farrant et
al., 1989; Panza et al., 2002), o que dificulta sua
utilização em programas de restauração ambiental.
Aspectos da maturação das sementes têm
sido alvo de investigação, pois os pesquisadores
reconhecem que tal conhecimento é fundamental
quando se procura obter um material de melhor
qualidade (Terra et al., 2010). As proteínas de
reserva têm sido consideradas marcadores do
processo de maturação em embriões zigóticos de
gimnospermas e angiospermas (Dunstan et al.,
1998). Além de serem importantes fontes de
carbono, as proteínas são os únicos compostos de
reserva em sementes que possuem o nitrogênio em
sua composição (Buckeridge et al., 2004a), e
fornecem os aminoácidos, cujos usos são essenciais
aos processos de germinação e desenvolvimento da
plântula a partir do crescimento embrionário (Shewry
et al., 1995; Buckeridge et al., 2004b).
Algumas alterações celulares durante o
crescimento, o desenvolvimento e em resposta aos
fatores ambientais podem ser compreendidas
através da expressão de proteínas envolvidas na
bioquímica celular (Chen e Harmon, 2006; Franco et
al., 2009). Entender a atuação de proteínas e genes
associados ao desenvolvimento da semente pode
contribuir para o aprimoramento de técnicas de
propagação e conservação de germoplasma (Zhen
et al., 2012). Na área de ciência em sementes a
pesquisa sobre tais técnicas associadas aos
mecanismos moleculares tem sido estimulada (Miller
et al., 2010). Além disso, estudos sobre o processo
de maturação de sementes recalcitrantes podem
permitir uma melhor compreensão das alterações
estruturais
e
funcionais
envolvidas
no
desenvolvimento do embrião zigótico (Santos et al.,
2006). O uso de técnicas de microscopia pode
auxiliar na identificação e localização de proteínas
nos tecidos de embriões e megagametófito de
sementes de A. angustifolia (Panza et al., 2002).
Nas coníferas, tanto embriões somáticos
quanto embriões zigóticos acumulam proteínas de
reserva em abundância durante a fase de maturação
dos embriões (Hakman, 1993). Apesar de sua
importância, as informações sobre a mobilização
de proteínas de reserva em sementes de
gimnospermas ainda são escassas (Capocchi et al.,
2011). Os poucos trabalhos visando identificar e
avaliar as alterações na expressão de proteínas
durante o desenvolvimento das sementes de A.
angustifolia, em geral, investigaram o padrão
eletroforético durante o desenvolvimento do embrião
zigótico (Santos et al., 2006; Silveira et al., 2008;
Balbuena et al., 2009), mas pouco foi descrito até o
momento sobre as mudanças no perfil proteico
durante a fase de acúmulo de reservas na semente.
Assim, esta pesquisa foi realizada buscandose avaliar o teor de proteínas solúveis totais e as
diferenças no perfil proteico do eixo embrionário,
cotilédones e megagametófito de sementes de A.
angustifolia em dois estádios da maturação,
buscando-se obter informações sobre o padrão de
alocação das proteínas e sua relação com a
viabilidade das sementes.
Material e Métodos
Para os experimentos, foram utilizadas
sementes coletadas em dois estádios de maturação,
provenientes da região do planalto sul de Santa
Catarina, altitude média de 950 m, onde o clima é
o
subtropical temperado (temperatura média de 14 C),
constantemente úmido (UR média de 82%), e os
solos são, predominantemente, derivados de rochas
ácidas e básicas (Epagri, 1999). Pinhas de A.
angustifolia foram coletadas nos meses de abril e
julho e as sementes foram classificadas em estádios
I (104 dias do ano e 19 meses após a polinização) e
IV (183 dias do ano e 22 meses após a polinização)
de maturação conforme, Shibata et al. (2012). Optouse por utilizar sementes coletadas nas fases inicial
(estádio I) e final da maturação (estádio IV),
diferenciadas em função de seu grau de umidade, a
fim de que as condições mais contrastantes fossem
avaliadas.
Após o beneficiamento, as sementes foram
subdivididas em quatro repetições. Algumas
sementes foram mantidas íntegras para a realização
dos testes de umidade e germinação; as demais
sementes tiveram seus eixos embrionários,
cotilédones e megagametófitos isolados.
Determinou-se o grau de umidade das
sementes inteiras a partir de duas repetições de três
sementes cortadas transversalmente. E para os
diferentes tecidos da semente, foram utilizadas duas
repetições contendo 10 amostras de cada tecido
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Garcia et al.
(eixos embrionários, cotilédones e megagametófito).
Determinou-se o peso das amostras e transferiu-as à
o
estufa a 105 ºC±3 C, por 24 horas (BRASIL, 2009).
O teste de germinação foi conduzido
utilizando-se quatro repetições de 25 sementes,
acondicionadas em bandejas plásticas com substrato
areia, previamente esterilizada, sob luminosidade
o
constante e temperatura de 25 C, em câmara
germinativa tipo BOD. Previamente ao teste, as
sementes foram tratadas com solução de hipoclorito
de sódio (2%, v/v), por 3 minutos. As avaliações de
porcentagens de plântulas normais foram realizadas
70 dias após o início do teste de germinação.
A extração das proteínas solúveis totais foi
realizada através da metodologia descrita por Steiner
(2005), com adaptações (Farias et al., 2011), em que
100 mg de massa fresca de eixos embrionários,
cotilédones e megagametófitos, por repetição, foram
macerados com auxílio de nitrogênio líquido e
extraídos com tampão fosfato de sódio dibásico (20
mM) pH 7,5, EDTA (1 mM), NaCl (50 mM), glicerol
(10% v/v), PMSF (1 mM) e β-mercaptoetanol (1,5%
v/v). Os teores de proteínas solúveis totais das
amostras foram quantificados espectrofotometricamente pelo método de Bradford (1976),
utilizando albumina de soro bovino como padrão
2
(BSA 0 – 800 µg/mL, R = 0,9845, y= 0,0005x +
0,0171).
Para as análises eletroforéticas, 20 µg de
proteína de cada amostra foram submetidas a
eletroforese em gel de poliacrilamida SDS-PAGE
12% (Laemmli ,1970), a 100 V por 2 horas em cuba
Mini-Protean II electrophoresis cell II (Bio-Rad
Laboratories,
Hercules,
CA,
USA).
Posteriormente, os géis foram corados com azul de
coomassie 0,1%, conforme Alfenas (1998) por 12
horas e descorados com solução de ácido acético
10%, metanol 45% e água destilada 45%.
O experimento foi realizado em delineamento
inteiramente casualizado. Os dados obtidos em
porcentagem foram transformados em arco seno
√x/100. Realizou-se análise de variância e teste de
Tukey para separação de médias, a 5% de
probabilidade, através do programa estatístico SAS
(2003). A análise dos resultados obtidos pela
eletroforese de proteínas foi qualitativa, buscando-se
avaliar, visualmente, a presença e intensidade das
bandas.
Resultados e Discussão
A análise do grau de umidade possibilitou
diferenciar os estádios de maturação das sementes
provenientes das duas épocas de coleta. As
sementes no estádio I apresentaram maior grau de
umidade (58%) em relação ao estádio IV (46%)
(Figura 1). Observou-se que um maior percentual de
água foi mantido nos tecidos do eixo embrionário e
dos cotilédones, enquanto que o inverso foi
observado no megagametófito para os dois estádios
de maturação (Figura 1). Portanto, este tecido foi o
que mais contribuiu para que houvesse redução no
grau de umidade das sementes íntegras ao longo do
período de maturação.
Figura 1 - Grau de umidade de sementes de Araucaria angustifolia nos estádios I e IV, nos tecidos: eixo embrionário,
cotilédones e megagametófito. As letras referem-se ao teste de Tukey (P<0,05), sendo: maiúsculas – comparação
entre os diferentes tecidos; minúsculas – comparação entre estádios de maturação.
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Garcia et al.
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Estabelecer uma relação entre as variações de
entanto, Fernandez (2002), também estudando
umidade com o percentual de germinação é
sementes maduras desta espécie, encontrou
importante,
especialmente
para
sementes
maiores teores no megagametófito (24 mg) do que
recalcitrantes, pois pequenas alterações no grau de
no embrião (17,69 mg). Os resultados observados
umidade podem representar danos à viabilidade das
quanto ao teor de proteína apresentaram relação
sementes. Com base nesta afirmação realizou-se o
positiva com aqueles do trabalho de Balbuena et al.
teste de germinação e observou-se que no estádio I,
(2009) para o perfil proteico em 2-DE, o qual permitiu
84% das sementes estavam viáveis enquanto que no
detectar um maior teor de proteínas nos embriões
estádio IV, houve um acréscimo para 91%, porém
em relação ao megagametófito, mesmo em estádios
este aumento não foi significativo (Figura 2). Com
anteriores à maturação no desenvolvimento das
sementes de A. angustifolia.
isso, nota-se que a redução no grau de umidade não
foi limitante para alterar a viabilidade das sementes.
Em trabalho realizado por Eira et al. (1994), foi
verificado que houve perda total da viabilidade das
sementes desta espécie, ao atingirem umidade em
torno de 38%, sendo este considerado nível letal
para
as
sementes.
Em
sementes
de
Archontophoenix alexandrae, espécie que também
possui comportamento recalcitrante, não houve
decréscimo na porcentagem de germinação das
sementes com a redução de 47,5% para 35,4% em
seu grau de umidade (Martins et al., 2003). Em
sementes de Inga vera, a redução no grau de
umidade de 76,8% para 55,4% não alterou a taxa de
germinação (Bonjovani e Barbedo, 2008). Mas uma
redução moderada no grau de umidade em
Figura 2 - Porcentagem de germinação de sementes de
Araucaria angustifolia nos estádios I e IV de
sementes florestais recalcitrantes de Magnolia ovata
maturação. As letras referem-se ao teste de
foi acompanhada de um pequeno acréscimo na
Tukey (P<0,05).
germinação, atribuída à possível continuação do
processo de maturação, mesmo após a coleta das
sementes (José et al., 2011).
Como não foram observadas diferenças na
viabilidade das sementes, buscou-se verificar mais
detalhadamente como ocorrem as alterações
bioquímicas com base na quantificação e
visualização do perfil proteico. O teor de proteínas
solúveis totais nas sementes de A. angustifolia diferiu
entre os tecidos das sementes analisadas, no
estádio I observou-se maior acúmulo no eixo
-1
embrionário (12,39 mg.g ) e nos cotilédones (13,76
-1
mg.g ), entretanto no estádio IV, apenas o eixo
embrionário apresentou maiores teores do que os
-1
demais tecidos com 22,06 mg g (Figura 3).
Silveira et al. (2008), em estudo sobre o
-1
Figura 3 - Teor de proteínas solúveis (mg.g mf) de eixos
conteúdo de proteína durante o desenvolvimento de
embrionários, cotilédones e megagametófitos
sementes de A. angustifolia nos tecidos do eixo
de sementes de Araucaria angustifolia nos
embrionário e megagametófito, obtiveram valores
estádios
I e IV. As letras referem-se ao teste
-1
semelhantes entre 18 e 27 mg g em sementes
de Tukey (P<0,05), sendo: maiúsculas –
coletadas no mês de março, classificadas em estádio
comparação entre os diferentes tecidos;
maduro. Os resultados observados também estão
minúsculas – comparação entre estádios de
em similaridade com o relatado por Astarita et al.
maturação.
(2003), onde os cotilédones e eixos embrionários de
A. angustifolia apresentaram maiores concentrações
de proteínas solúveis do que o megagametófito. No
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Garcia et al.
A semente de A. angustifolia tem como
principal reserva o amido (Tompsett, 1984), o qual é
armazenado no megagametófito, tipicamente o órgão
com função de reserva em sementes da espécie.
Apesar disso, o embrião maduro de A. angustifolia
apresentou elevado teor de proteínas. Isto pode ser
explicado pela presença de vacúolos de proteínas de
reserva em eixos embrionários e cotilédones de A.
angustifolia (Panza et al., 2002). Através de análises
histoquímica e ultraestrutural em sementes maduras,
além da presença de vacúolos proteicos, tais autores
também
observaram
corpos
proteicos
no
megagametófito, tecido constituído principalmente
por amido. Além disso, há grande quantidade de
proteína em todo o citoplasma celular em embriões
zigóticos de A. angustifolia durante a maturação,
inclusive nas regiões meristemáticas (Rogge-Renner
et al., 2012).
Em relação ao perfil geral de proteínas nos
diferentes tecidos das sementes, foram visualizadas
três bandas principais com, aproximadamente, 48
kDa, 30 kDa e 25 kDa, exceto no megagametófito do
estádio I, onde diferenças acentuadas ocorreram em
função da ausência das bandas em torno de 48 kDa
e 30 kDa e menor intensidade nas proteínas de,
aproximadamente, 25 kDa (Figura 4). Tais resultados
assemelham-se com algumas proteínas visualizadas
267
por Fernandez (2002) no megagametófito e no
embrião de sementes de A. angustifolia, onde as
bandas mais intensas tinham em torno de 28 kDa, 20
kDa, 21 kDa e 13-12 kDa, enquanto que no
megagametófito de sementes de Araucaria bidwillii,
as quatro bandas principais possuem cerca de 21
kDa, 20,7 kDa , 7 kDa e 4 kDa (Capocchi et al,
2011).
Em relação aos diferentes estádios de
maturação, a intensidade das bandas foi maior no
estádio IV, com destaque para as bandas em torno
de 30 kDa, 25 kDa e 6 kDa. Este fato é esperado,
pois as proteínas são consideradas marcadores da
maturação dos embriões zigóticos, e seus acúmulos
ocorrem principalmente no final do desenvolvimento
das sementes. Além disso, a síntese de proteínas foi
intensificada, possivelmente para dar início ao
crescimento do eixo embrionário e, consequentemente, à protrusão da radícula, já que as proteínas
podem ser reguladas pós-tradução. Acredita-se que
as sementes com comportamento recalcitrante
continuam seu processo de desenvolvimento em
direção à germinação, de forma mais rápida a partir
do momento em que as sementes se desligam
fisiologicamente da planta matriz (Marcos Filho,
2005).
Figura 4 - Perfil eletroforético de proteínas do eixo embrionário (EE), cotilédone (C) e megagametófito (M) de Araucaria
angustifolia nos estádios I (104 dias do ano e 19 meses após a polinização) e IV (183 dias do ano e 22 meses
após a polinização) de maturação. P – Padrão de peso molecular (kDa). As setas indicam a ausência de bandas
(48 e 30 kDa) e redução da intensidade de bandas (25 kDa) no megagametófito no estádio I, e aumento na
intensidade de bandas no estádio IV (48, 30, 25 e 6 kDa).
Magistra, Cruz das Almas-BA, v. 24, n. 4, p. 263-270, out./nov. 2012.
Garcia et al.
Apesar da alteração do perfil proteico do
estádio I para o IV de maturação, este resultado não
apresentou relação com o percentual de germinação,
o qual manteve-se em 90%. Sabe-se que a redução
na qualidade fisiológica das sementes está
relacionada a alterações bioquímicas que conduzem
ao comprometimento de suas atividades metabólicas
(Tunes et al., 2009). Conforme os resultados
observados entre os estádios de maturação I e IV, as
alterações bioquímicas verificadas no teor e perfil
das proteínas não foram suficientes para
comprometer a qualidade fisiológica destas
sementes.
Apesar da viabilidade das sementes ao longo
do processo de maturação não sofrer alterações,
algumas proteínas sintetizadas tardiamente durante
esta fase podem favorecer o desenvolvimento inicial
das plântulas e posterior estabelecimento a campo.
Experimentos que avaliem o perfil proteico durante e
após a germinação e estabelecimento a campo
poderiam elucidar estas questões.
A variação constatada nos diferentes tecidos
de sementes de A. angustifolia nos dois estádios de
maturação demonstrou que há necessidade de um
maior aprofundamento de estudos relacionados às
alterações bioquímicas associadas às fisiológicas.
Além disso, a relação de tais processos metabólicos
com a longevidade e a deterioração das sementes
deve ser investigada, uma vez que as sementes de
A. angustifolia perdem rapidamente sua viabilidade,
dificultando a conservação desta espécie.
Conclusões
O decréscimo no grau de umidade da semente
do estádio I para o IV não é limitante para o acúmulo
de proteínas na semente de A. angustifolia,
sugerindo uma continuidade na síntese proteica nos
eixos, cotilédones e megagametófito após o início da
maturação, uma vez que o perfil proteico do estádio
IV apresentou bandas com maior intensidade nos
três tecidos.
A viabilidade das sementes não é modificada
pela alteração do perfil proteico e pelo teor de água
nos estádios I e IV da maturação das sementes de A.
angustifolia.
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Recebido em: 10/07/2012
Aceito em: 21/10/2012