Á
André Fioravante Guerra
Microscopia
Valença, 1ª Edição, 2015. 12p.
Disponível em:
www.microbiologia-de-alimentos.com
HISTÓRIA
çã
.
Laboratórios são ambientes
restritos, onde somente
pessoas capacitadas são
autorizadas para adentrá-los.
Os laboratórios de
microbiologia são classificados
de acordo com seus níveis de
biossegurança. Estes são
classificados, baseados nas
práticas, técnicas,
equipamentos de segurança e
instalações do laboratório,
com numerações de 1 a .
4 A partir do momento que
uma pessoa entra em um
laboratório de microbiologia,
este está exposto a um risco
biológico que pode ser maior
ou menor dependendo dos
agentes biológicos
manipulados neste
laboratório.
Profissionais capacitados para
trabalharem nestes ambientes
são obrigados a saberem o
que cada nível de
biossegurança representa.
No Brasil, somente em 1995
foi criada uma legislação
específica para biossegurança
em laboratórios.
Estes riscos podem ser muito
minimizados em qualquer dos
4 níveis se os materiais são
manipulados adequadamente
e com responsabilidade.
O princípio da microscopia data da prática de polir lentes com
objetivo de visualizar objetos em maiores proporções. Fiorentino
Salvino d´Amato, em 1285 foi um dos pioneiros nesta arte. Em 1590,
o holandês Zaccharias Jansen, teve a inteligência de combinar duas
lentes e construiu um objeto que consistia em um tubo com 25 cm de
comprimento e 6 cm de diâmetro. Nas extremidades havia dois tubos
de latão, cada um suportando uma lente com aumento de 3 e 5 vezes.
O foco para observação era conseguido através do deslizamento
entre os tubos. A proporção de aumento era de 30 vezes. Na Figura 1
está apresentado uma replica do microscópio de Jansen.
Figura 1 – Réplica do primeiro microscópio composto de Zaccharias Jansen.
Seu conterrâneo Antoni van Leeuenhoek em 1673 conseguiu
polir uma lente com alto poder de aumento de 300 vezes. Este foi um
microscópio muito utilizado nos ambientes científicos e com ele o
autor construiu uma obra valiosíssima para a ciência, onde estão
registrados os animáculos observados por ele. Na Figura 2 está
mostrado uma réplica do microscópio de Antoni van Leeuenhoek.
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Figura 2 – Réplica do microscópio de Antoni van Leeuenhoek.
Embora o microscópio de Leeuenhoek tenha feito mais sucesso que o de Jansen, seu
princípio óptico era mais atrasado, pois não possuía associação de lentes.
O inglês Robert Hooke construiu talvez o microscópio mais inteligente dessa época,
pois este associava duas lentes, uma objetiva e outra ocular e presença de luz. A iluminação
era feita por uma luz de óleo que passava por um reservatório de água. Com seu
instrumento ele publicou suas observações em uma obra intitulada Micrographia. Na
Figura 3 está mostrado o microscópio de Robert Hooke.
Figura 3 – Microscópio de Robert Hooke.
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MICROSCOPIA ÓPITICA
No século XIX com o aperfeiçoamento da fabricação das lentes possibilitou a
construção de microscópios mais precisos e com imagens mais nítidas. Assim surgiu a
microscopia óptica.
Estes microscópios possuem um sistema monocular ou binocular dotados de lentes
oculares com aumento de 10 vezes. As lentes objetivas podem ser muito variáveis com
aumento de 1 até 250 vezes, porém normalmente utiliza-se objetivas de 4, 10, 40 e 100
vezes de aumento. A proporção de aumento é dado pela seguinte Equação 1.
Aumento = Aum. da objetiva x Aum. da ocular x Aum. do tubo
Eq. 1
Tubo monocular = 1
Tubo binocular = 1,2
A visualização é auxiliada por uma fonte de luz de tungstênio com controle de
intensidade, normalmente dotado de um diafragma como filtro de luz. Na Figura 4 e 5 está
mostrado as partes de um microscópio óptico assim como alguns modelos.
Figura 4 – Partes de um microscópio óptico.
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Microscópio óptico
monocular
Fabricante – Nikon
Mod. Eclipse E-200
Microscópio óptico
binocular
Fabricante – Nikon
Mod. L 2000 I Bioval
Microscópio óptico
binocular
Fabricante – Nikon
Mod. Eclipse Ci-L
Microscópio óptico
Invertido
Fabricante – Nikon
Mod. TS100/TS 100-F
Figura 5 – Alguns modelos de microscópios ópticos.
O funcionamento do microscópio óptico está mostrado na Figura 6
Figura 6 – Função da adição do óleo de imersão; microscopia em campo claro; microscopia em campo
escuro
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MICROSCOPIA DE
CONTRASTE DE FASE
Neste tipo de microscopia, a luz gerada por uma lâmpada de
tungstênio-halogênio é direcionada através de um coletor
de lentes e focada em um ânulo específico. Estas ondas
incidem sobre a amostra a ser observada.
Os microrganismos constituem um meio diferente para a
passagem da luz e desta forma, a luz é refratada quando
incidem por eles. O feixe de luz que não incidente não são
desviadas e chegam primeiro na lente objetiva (Figura 7).
Após são separadas e focalizadas no plano de
imagem para formar a imagem final. A luz incidente sobre
os microrganismos sofre um retardo devido a refração, este
fenômeno permite a visualização de microrganismos vivos.
Figura 7 – Retardo da luz
devido a refração
Este microscópio é dotado de um sistema óptico especial
que transforma diferenças de fase dos raios luminosos em
diferenças de intensidade. Assim, as diferenças de fase, para
as quais o olho não é sensível, tornam-se visíveis, pois são
traduzidas em diferenças de intensidade luminosa,
facilmente perceptível. O microscópio de contraste de fase
pode ser usado de modo que as estruturas celulares
apareçam escuras (fase positiva) ou claras (fase negativa).
O maior uso da microscopia de contraste de fase é na
biotecnologia, pois é possível quantificar leveduras viáveis e
não viáveis através de uma coloração com azul de metileno.
.
A capacidade de contraste de fase pode ser adicionada a
quase qualquer microscópio de campo claro, desde que as
objetivas de fase especializadas, grafadas como ph (phase),
sejam especializadas para se conformem aos parâmetros de
comprimento do tubo e desde que o condensador aceite um
anel de fase anular do tamanho correto. Na Figura 8 está
apresentado esquematicamente a microscopia de contraste
de fase
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Anel de fase
ph
Lente objetiva
Condensador
Figura 8 – Esquematização da microscopia de contraste de fase.
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MICROSCOPIA DE
INTERFERÊNCIA
DIFERENCIAL
Neste tipo de microscopia é possível visualizar as amostras em
3 dimensões, com isso há melhor visualização dos detalhes da
imagem. Estas são visualizadas como projeção relevo em uma
placa metálica.
É possível obter ampliações de 10, 20, 40, 60 e 100 vezes.
Esta microscopia é útil para materiais excessivamente
espessos ou quando se deseja obter detalhes de
microrganismos sem necessidade de corar.
O microscópio mais conhecido neste tipo de microscopia é
denominado “microscópio de Nomarski”.
Figura 9 – Caminho da luz em
um
microscópio
de
interferência diferencial.
.
A luz emitida pela fonte de luz passa por um filtro e em seguida
pelo prisma de Nomarski, este a divide em dois feixes com
distância de 90°. Estes dois feixes são condensados por um
condensador e incidem pela amostra em uma distância de 0,2
µm. Como os raios estão separados em 90°C, este
deslocamento promove uma visualização em forma de relevo
da amostra. Após os feixes de luz passam pela objetiva onde
sofrem um aumento substancial. Antes de chegar à lente
ocular, a luz ainda passa por mais um prisma que separa os
feixes de luz em 135° por mais um filtro Figura 9.
Todo esse aparato faz com que a imagem de visão seja uma
placa com relevo em superfície. O relevo é a amostra de
interesse.
Na Figura 10 está apresentado
microscopia de contraste de fase.
esquematicamente
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a
Filtro
Prisma Wollaston
Nomarski modificado
Lente objetiva
ph
0,2 µm
Condensador
Filtro Wollaston
Nomarski modificado
Filtro polarizador
Figura 10 – Esquematização da microscopia de interferência diferencial.
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MICROSCOPIA DE
FLUORESCÊNCIA
As pesquisas com radiação ultravioleta de August Köhler
deram origem a microscopia de fluorescência. Estas ondas,
por serem de comprimento mais curto, contribuem para o
incremento de resolução comparado com a microscopia
óptica. Destas pesquisas surgiu o microscópio de luz
ultravioleta.
Em 4 de Abril de 1908, August Köhler e Henry Siedentopf,
apresentaram em um curso de microscopia de fluorescência
o microscópio de ultra violeta.
O microscópio de fluorescência foi um enorme progresso
nos estudos das estruturas celulares e seus constituintes. A
imagem
observada
é
o
resultado
da radiação
eletromagnética emitida pelas moléculas que absorveram a
excitação primária e re-emitiram uma luz com maior
comprimento de onda. Para deixar passar somente a
emissão secundária desejada, devem-se colocar filtros
apropriados debaixo do condensador e por cima da objetiva.
O microscópio é semelhante ao convencional, exceto por
apresentar um sistema diferente de iluminação e jogos de
filtro. O primeiro filtro filtra a luz antes de a mesma alcançar
o material e outro que filtra a luz emitida pelo mesmo.
Figura 11 – Caminho da luz em
um
microscópio
de
fluorescência.
A amostra deve ser previamente marcada com algum
composto fluorescente, normalmente fluorocromo. Somente
a luz emitida pelo objeto é observada, ficando desse modo
brilhante com fundo negro. O microscópio óptico de
fluorescência trabalha com sistema epi-iluminação.
.
A fonte de luz é de mercúrio de alta pressão (312 – 579 nm).
Esta após passagem pelo filtro de excitação incide por um
condensador que a condensa para a amostra. Os feixes de
luz passam pela amostra marcada com fluorocromo, seguem
pela objetiva e por mais um filtro de barragem (Figura 11).
Este último permite a passagem somente da luz
fluorescente.
Na
Figura
12
está
apresentado
esquematicamente a microscopia de contraste de fase.
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Filtro de barragem
ph
Amostra
corada
com
Lente objetiva
Condensador
Filtros de excitação
Seleção
do
comprime
nto de
Luz de mercúrio de alta
pressão (312 – 579 nm)
Figura 12 – Esquematização do funcionamento de um microscópio de fluorescência.
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MICROSCOPIA DE VARREDURA
CONFOCAL
Este tipo de microscopia foi desenvolvida por Marvin Minsky em 1955 na Universidade de
Harvard devido à necessidade de obter imagem das redes neurais de tecido cerebral vivo
não corados.
Esta microscopia permite obter visualizações digitais tridimensionais das amostras
observadas. Permite, ainda, observação de eventos biológicos que ocorrem in vivo.
O funcionamento do equipamento é através de um gerador de laser. Este passa por um
prisma que o separa em feixes. No interior do microscópio há um espelho que reflete estes
raios que incidem sobre a amostra. Após, a luz e refletida e passa por um filtro de barragem
que possui a função de deixar passar somente a luz fluorescente e um orifício chamado
pinhole que elimina os raios provenientes das amostras não focadas. Seu sistema óptico é
o mesmo da de fluorescência tradicional, com exceção de que a iluminação se dá somente
em pequenos pontos iluminados pelo laser.
Assim como na microscopia de fluorescência, é necessário que a amostra emita
fluorescência natural como é o caso de alguns vegetais como a clorofila ou seja marcada
com alguma substância fluorescente. Na observação microbiológica normalmente se utiliza
fluorocrono.
Este tipo de microscopia é indicada para estudos com materiais espessos, sem coloração
prévia, vivos ou pré-fixados e permite o detalhamento de estruturas subcelulares que não
são observadas no microscópio de fluorescência convencional como: microtúbulos,
elementos fibrilares do citoesqueleto e elementos finos da matrix celular (Taboga, 2001).
Também é possível obter visualização tridimensionais com este microscópio, para isso os
cortes ópticos devem ser transferidos para um computador (Taboga, 2001).
Na Figura 13 está mostrado o funcionamento esquemático no microscópio de varredura
confocal.
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Pinhole de abertura– eliminação da luz
provenientes de objetos que estejam fora do
plano focal
Filtro de barragem
Laser
Lente objetiva
Figura 13 – Esquematização do funcionamento de um microscópio confocal de varredura.
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MICROSCOPIA ELETRÔNICA
Este tipo de microscopia baseia-se no prinípio incidência de elétrons ou laser sobre
a amostra. Este evento fornece informações sobre a resolução atômica. Quando os elétrons
incidem sobre a amostra, este pode passar por ela sem perda de energia, podem ser
difratados com orientação específica possibilitando ou mesmo excitar os elétrons da
amostra. Desta forma é possível obter imagens bastante detalhadas da amostra.
Os dois princípios básicos da microscopia eletrônica são:
- os elétrons têm propriedades ondulatórias, à semelhança da luz visível, ultravioleta e raio x e
o comprimento de onda de um elétron em movimento depende da sua velocidade e energia de
aceleração que lhe é imposta. Este princípio foi proposto por Louis Broglie em 1924.
- Um campo magnético, adequadamente estruturado, pode ser usado como lentes de aumento
para um feixe de elétrons (Melo, 2002). Então, o comprimento de onda de um elétron é dado
pela Equação 2. Este princípio foi proposto por Bush em 1926.
λ = h/mv
Eq. 2
λ = comprimento de onda
h= constante de Planck (6,62559 x 10-34J.s-1)
m = a massa da partícula
v = velocidade da partícula.
Microscopia Eletrônica de Transmissão
Neste tipo de microscopia é formada uma imagem bidimensional sobre uma tela devido a
passagem de um o feixe de elétrons através de cortes extremamente finos da amostra.
O que forma esta imagem é um feixe de elétrons que incide pela amostra e em seguida na tela
de transmissão. O pequeno comprimento de onda de elétrons significa que o limite de
resolução do microscópio de transmissão é de 0,0002 µm, sendo maior do que o de varredura
(Melo, 2002).
Na Figura 14 está mostrado o funcionamento esquemático no microscópio eletrônico de
transmissão.
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ADILSON SECCO
Figura 14 – Esquematização do funcionamento de um microscópio eletrônico de transmissão.
Microscopia Eletrônica de Varredura
Neste tipo de microscopia é possível obter uma imagem bastante detalhada da superfície da
amostra. A imagem é formada a partir de elétrons secundários que partem da amostra quando
esta é atingida pelos feixes de elétrons gerados pelo aparelho. Estes são captados por um
amplificador e são transformados em imagem visível em um monitor.
O limite de resolução nesse microscópio é de 0,02 _µm sendo menor do que o de transmissão
(Melo, 2002).
Na Figura 15 está mostrado o funcionamento esquemático no microscópio eletrônico de
varredura.
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Fonte de elétrons
Lente condensadora
Deflector
Lente objetiva
Amostra
Elétrons secundários
gerados pela amostra
Figura 15 – Esquematização do funcionamento de um microscópio eletrônico varredura.
Microscopia Eletrônica de Alta Voltagem
Neste tipo de microscopia os elétrons são acelerados em alta voltagem entre 500 e 1000 KV,
Seu funcionamento e estrutura é semelhante ao do microscópio eletrônico convencional,
porém, são aparelhos extremamente grandes, chegando a ocupar edifícios de 3 andares
(Taboga, 2001).
Com esse tipo de microscopia é possível observar organelas celulares e até a
organização tridimensional dos componentes do citoesqueleto (Taboga, 2001).
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Microscopia Eletrônica de Tunelamento Quântico
Neste tipo de microscopia é possível ampliar a potência visual do olho humano em cerca de 1
milhão de vezes. Essa técnica aumenta em 100 vezes a capacidade dos microscópios
eletrônicos (Taboga, 2001).
Seu princípio pressupõe que todos os corpos que apresentam características ondulatórias
emitam energia. Pelo caminhamento da agulha posicionada a 1x10-6 mm da superfície da
amostra forma-se uma corrente energética chamada de tunelamento.
Assim, quando a agulha passa sobre um átomo, a corrente aumenta e quando ela percorre
sobre os espaços entre os átomos ela diminui. Estes sinais são transmitidos para a tela de um
computador formando imagens semelhantes a relevos (Taboga, 2001).
Na Figura 16 está mostrado o funcionamento esquemático no microscópio eletrônico de
tunelamento quântico.
.
Figura 16 – Esquematização do funcionamento de um microscópio eletrônico de tunelamento quântico.
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Microscopia Eletrônica de Força Atômica
O microscópio é semelhante ao de tunelamento quântico, porém da agulha sai um feixe de laser
e não de elétrons (Taboga, 2001). O princípio de funcionamento de um microscópio de força
atômica é baseado na reflexão da luz de um feixe de laser por um espelho.
Após a reflexão, a luz do laser passa por uma lente e incide sobre um fotodetector. A incidência
do feixe de laser no fotodetector provoca o aparecimento de uma diferença de potencial (ddp)
em suas extremidades. Esta depende da área iluminada pelo feixe de laser que por sua vez
depende da altura da ponta de prova. A posição da ponta de prova varia conforme o relevo da
superfície em estudo e com isso a ddp gerada pelo fotodetector traduz os deslocamentos da
ponta durante a varredura. Estes deslocamentos são medidos com a amplificação da ddp
gerada no fotodetector.
Na Figura 17 está mostrado o funcionamento esquemático no microscópio eletrônico de
tunelamento quântico.
Fotodocumentador
Figura 17 – Esquematização do funcionamento de um microscópio eletrônico força atômica.
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BIBLIOGRAFIA
MELO, R.C.N. Células & Microscopia: princípios básicos e práticas. Juiz de Fora, Ed. UFJF, 2002,
144p.
TABOGA, S.R. Microscopia. In: RECCO-PIMENTEL, S.M.; CARVALHO,H.F. A célula 2001. cap.
2, p. 06-14, 2001
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