ESTUDO DE BIOSSURFACTANTE COMERCIAL PARA
APLICAÇÃO AMBIENTAL
Ferreira I.N.(1).; Brasileiro P.P.F.(1); Rufino. R.D.(1); Luna J.M(.1);
Sarubbo. L.A.(1) [email protected]
(1)
Universidade Católica de Pernambuco - UNICAP, Recife - PE, Brasil, CAPES,
FACEPE.
RESUMO
Biossurfactantes são metabólitos produzidos por bactérias e leveduras e alguns
fungos. Esses compostos, em virtude de sua compatibilidade com o meio
ambiente, têm sido cada vez mais estudados. Dessa forma, o presente estudo
teve como principal objetivo formular um aditivo estável, à base de
biossurfactante. O líquido metabólico livre de células contendo o
biossurfactante de Pseudomonas sp produzido em biorreator, foi submetido à
adição de 0,2% de sorbato de potássio, a fim de testar sua estabilidade frente a
diferentes variações de pH, temperatura e sal. Após formulação dos líquidos
metabólicos contendo o biossurfactante produzido, as amostras foram
estocadas à temperatura ambiente por 180 dias. Durante esse período foram
realizados testes de tensão superficial, atividade de emulsificação e capacidade
de dispersão, nos intervalos de tempo: 0, 15, 30, 70, 110 e 180 dias. A tensão
superficial apresentou variações em torno de 26 a 30mN/m. A atividade de
emulsificação alcançou valores de 100% com óleo de motor, e a capacidade de
dispersão também apresentou índices de 100% com a proporção de 1:25
(biossurfactante/óleo). Dessa forma, pode-se concluir que o biossurfactante de
Pseudomonas sp pode ser usado como coadjuvante no controle da poluição
causada por derivados de petróleo, em ambientes aquáticos.
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Palavras-chave:
Biorremediação.
Tensão
Superficial,
Atividade
de
Emulsificação,
INTRODUÇÃO
No Brasil, acidentes envolvendo hidrocarbonetos derivados de petróleo
têm
causado
sérios
problemas
ambientais.
Dessa
forma,
o
desenvolvimento de procedimentos e técnicas de combate à poluição
ambiental por derivados de petróleo torna-se mais importante a cada
dia. Dentre as técnicas de remediação disponíveis, a biorremediação
tem se destacado, embora a solubilidade reduzida dos hidrocarbonetos
dificulte o acesso dos micro-organismos e a consequente biodegradação
do poluente (RUFINO et al., 2013).
Uma das possíveis soluções para a baixa disponibilidade dos poluentes
hidrofóbicos consiste no uso de surfactantes. Esses compostos são
formados por estruturas moleculares contendo porções hidrofílicas e
hidrofóbicas que tendem a se distribuir nas interfaces entre as fases
fluidas com diferentes graus de polaridade (óleo/água e água/óleo).
Estas propriedades promovem a redução da tensão superficial e
interfacial, conferindo a capacidade de detergência, emulsificação,
lubrificação, solubilização e dispersão de fase. A eficiência e a
efetividade são características básicas essenciais que determinam um
bom surfactante. A eficiência é medida através da CMC, enquanto que a
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efetividade está relacionada com os valores de tensão superficial e
interfacial, os quais devem ser reduzidos ((SANTOS et al., 2013).
Os
biossurfactantes
apresentam
inúmeras
vantagens
sobre
os
surfactantes de origem química, tais como baixa toxicidade,
estabilidade frente à ampla faixa de pH e temperaturas elevadas, bem
como resistência a elevadas concentrações salinas (LUNA et al., 2013).
Os resíduos industriais têm despertado grande interesse dos
pesquisadores como alternativa para o fornecimento de substratos de
baixo custo para a produção de biossurfactantes, uma vez que a escolha
do substrato possa representar uma redução de até 40% do custo total
do processo. Resíduos de destilaria, soro de queijo, melaço e efluente de
óleo de oliva, entre outros, têm sido descritos como substratos para a
produção de biossurfactantes (RUFINO et al., 2008).
Neste sentido, o presente trabalho teve como objetivo formular um
aditivo à base de biossurfactante estável para aplicação como
coadjuvante da biorremediação de ambientes aquáticos.
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MATERIAL E MÉTODOS
Micro-organismo
A Pseudomonas sp. isolada em área portuária e depositadas no Banco
de Culturas do Núcleo de Pesquisa em Ciências Ambientais
(NPCIAMB) da Universidade Católica de Pernambuco foi testada como
produtora do biossurfactante.
Meio de crescimento do inoculo
Para crescimento do inóculo foi utilizado o meio Caldo Nutritivo (CN),
com a seguinte composição: Extrato de carne (5,09g), Peptona (15,0g),
NaCl (5,0g), K2HPO4 (5,0g), Água destilada (1,0L), pH (7,0).
Meio de produção
O meio mineral utilizado foi descrito por Bushnell e Hass (1941),
acrescido das fontes de carbono (melaço de cana) e nitrogênio
(milhocina) adicionadas nas concentrações de 3% cada.
Preparação do inoculo
Culturas jovens da bactéria obtidas após 24 horas de cultivo em meio
AN foram transferidas para frascos de Erlenmeyer contendo 50 mL de
Caldo Nutritivo (CN), o qual foi mantido sob agitação orbital de 150
rpm durante um período de 10-14 horas a 28°C para obtenção de uma
D.O. (Densidade Óptica) de 0,7 (correspondente a um inóculo de 107
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U.F.C./mL) a 600 nm. Esta leitura foi utilizada como inóculo na
concentração de 3% (v/v).
Produção do biossurfactante
As fermentações para produção dos biossurfactantes foram realizadas
em biorreator de 50L de capacidade, contendo o meio de produção e
incubados com 3% do pré-inoculo. O biorreator foi mantido sob
agitação durante 48 horas, à temperatura de 28°C. Ao fim do cultivo,
amostras foram retiradas para determinação da tensão superficial e do
rendimento em biossurfactante isolado.
Determinação da tensão superficial: a tensão superficial foi medida no
líquido metabólico livre de células em tensiômetro KSV Sigma 70
(Finland) utilizando-se o anel de NUOY. A tensão superficial foi
medida através da imersão do anel de platina no líquido metabólico e
registrando-se a força requerida para puxá-lo através da interface arlíquido.
Capacidade de dispersão
A capacidade de dispersão ou agregação de manchas de petróleo foi
simulada em laboratório contaminando-se amostras de água do mar
com óleo de motor. Os testes foram conduzidos pela adição do líquido
metabólico livre de células 10µL em 15µL do óleo de motor. Os
resultados foram observados visualmente.
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Atividade de emulsificação
Para a determinação da atividade de emulsificação, amostras do líquido
metabólico livre de células foram analisadas segundo a metodologia
descrita por Cooper e Goldenberg (1987).
Estabilização do líquido metabólico com propriedade surfactante
O líquido metabólico do biossurfactante produzido em biorreator foi
conservado de acordo com os procedimentos: Ao líquido metabólico foi
adicionado a concentração de 0,2%; de sorbato de potássio. Em seguida,
o líquido metabólico tratado conforme os procedimentos descritos
acima foram estocados à temperatura ambiente ao longo de 180 dias
para observação da estabilidade. Testes foram realizados para
determinação do tempo de estocagem (0, 15, 30, 70, 110 e 180 dias) à
temperatura ambiente de 28-30 ºC, verificando-se a tensão superficial, a
capacidade de emulsificação e a estabilidade frente a condições
específicas como presença de sal (1, 3 e 5%), aquecimento (40 e 50 ºC)
e variações de pH (5, 7 e 9). Testes de dispersão/agregação também
serão realizados.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
A tensão superficial é a força de atração existente entre as moléculas
dos líquidos (RUFINO et al., 2008). O presente estudo teve como
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principal objetivo avaliar o comportamento do biossurfactante
produzido frente a diferentes condições de conservação. A Figura 1
apresenta as tensões superficiais do líquido metabólico produzido por
Pseudomonas sp quando submetido a diferentes variações de pH( 5, 7 e
9), temperatura (40 e 50°C) e diferentes concentrações de NaCl (1, 3 e
5%).
As tensões superficiais do líquido metabólico submetido a variações de
pH, apresentaram as seguintes alterações: durante os 180 dias de
experimento a tensão do líquido metabólico submetido a pH 5
permaneceu em torno de 26,6 mN/m. Ao ser submetido ao pH 7 o
líquido metabólico apresentou tensão superficial por volta de 28mN/m.
Quando submetido a pH 9 a tensão superficial aumentou para
29,5mN/m, conforme a figura 1 A. Segundo Mulligan; Gibbs (1993), a
tensão superficial de um bom biossurfactante deve ser menor que
30mN/m.
A atividade de emulsificação consiste na capacidade do líquido
metabólico contendo biossurfactante emulsificar o óleo e permanecer
estável nessa união (RUFINO et al., 2008). A Figura 2A, B e C mostra
os valores da atividade de emulsificação do líquido metabólico
produzido por Pseudomonas sp, após 180 dias de conservação,
submetido a adição de 0,2% de sorbato de potássio e variação de pH 5,
7 e 9.
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Figura 1. Tensão superficial do líquido metabólico livre de células
produzido por Pseudomonas sp, após 180 dias de conservação e
submetido a adição de 0,2% de sorbato de potássio e aos seguintes
procedimentos: (A) diferentes variações de pH: 5, 7 e 9; (B) diferentes
temperaturas: 40 e 50°C; (C) diferentes concentrações de NaCl: 1, 3, e
5%; (D) controle.
A atividade de emulsificação do líquido metabólico livre de células
apresentou melhores resultados com óleo de motor nos primeiros trinta
dias de experimento, em todas as variações de pH, atingindo valores de
até 94% de emulsificação. Pode-se observar que o líquido metabólico
de pH 5 apresentou os melhores resultados para emulsificação com óleo
de soja, milho e motor, conforme Figura 2A.
A figura 2D, E e F apresenta os resultados do índice de emulsificação
do líquido metabólico de Pseudmonas sp, submetido a 0,2% de sorbato
de potássio e adição de variadas concentrações de NaCl. Os melhores
resultados foram observados na menor concentração de sal, 1%, e nos
primeiros trinta dias de conservação com óleo de motor, atingindo 95%
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de emulsificação. Nas imagens contendo o líquido metabólico
submetido a 3 e 5% de sal pode-se observar que não há atividade de
emulsificação com óleo de motor no tempo 15 dias.
A figura 2G e H mostra os índices de atividade de emulsificação do
líquido metabólico livre de células produzido por Pseudomonas sp
submetido a adição de 0,2% de sorbato de potássio e variações de
temperatura: 40 e 50°C. Assim como nas demais variações, o líquido
metabólico submetido a diferentes variações de temperatura também
apresentou seus melhores resultados com óleo de motor e nos primeiros
trinta dias de conservação, atingindo até 96% de emulsificação.
A atividade de emulsificação do líquido metabólico com óleo de soja e
óleo de milho, alcançou até 60% de emulsificação. A partir de 70 dias
de conservação os índices de emulsificação não ultrapassaram 50% para
todos os óleos.
A Figura 3 apresenta os resultados da capacidade de dispersão, com
óleo de motor, nas proporções 1:2, 1:8 e 1:25 (biossurfactante/óleo) do
líquido metabólico livre de células produzido por Pseudomonas sp,
após adição de 0,2% de sorbato de potássio e submetido a diferentes
variações de pH (5, 7 e 9); temperatura (40 e 50°C) e diferentes
concentrações de NaCl (1, 3 e 5%).
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Figura 2. atividade de emulsificação do líquido metabólico livre de células produzido
por Pseudomonas sp, após 180 dias de conservação, submetido a adição de 0,2% de
sorbato e variações de: (A) pH 5; (B) pH 7; (C) pH 9; (D) NaCl 1%; (E) NaCl 3%; (F)
NaCl 5%; (G) temperatura 40°C; (H) temperatura 50°C.
A Figura 3A, B e C apresentam os resultados de capacidade de
dispersão do biossurfactante de Pseudomonas sp, após 180 dias de
conservação, submetido a adição de 0,2% de sorbato e variações de pH
5, 7e 9. Pode-se observar que no tempo zero dia de experimento a
capacidade de dispersão da gota de óleo não ultrapassou valores de
16%. Os melhores resultados podem ser observados entre 15 e 70 dias
de experimento, alcançando valores de até 100% de dispersão com óleo
de motor. Nos demais dias a capacidade de dispersão ficou entre 33 e
77%.
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Ao ser submetido a diferentes concentrações de NaCl pode-se observar
melhores resultados entre 15 e 70 dias de experimento nas três
proporções de óleo de motor, alcançando até 100% de dispersão da
gota. Vale resaltar, que em todas a concentrações de sal o tempo zero
dia apresenta valores de dispersão em torno de 7 e 16%. Nos demais
dias de conservação a capacidade de dispersão do biossurfactante ficou
em torno de 37 e 80%, conforme Figura 3B, C e D.
Figura 3. capacidade de dispersão, com óleo de motor, nas proporções 1:2, 1:8 e 1:25
(biossurfactante/óleo) do líquido metabólico livre de células produzido por
Pseudomonas sp, após adição de 0,2% de sorbato de potássio e submetido a diferentes
variações de: (A) pH 5; (B) pH 7; (C) pH 9; (D) NaCl 1%; (E) NaCl 3%; (F) NaCl
5%; (G) temperatura 40°C; (H) temperatura 50°C.
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Ao ser submetido a variações de temperatura, a capacidade de dispersão
do líquido metabólico de Pseudomonas sp apresentou até 100% de
eficácia aos 70 dias de experimento, nas proporções de 1:8 e 1:25
(biossurfactante/óleo). No tempo zero dia, observa-se capacidade de
dispersão em torno de 7 a 10%, conforme figura 3G e H.
CONCLUSÃO
Os resultados mostram que independente do método de conservação
utilizado, as tensões do biossurfactante de Pseudomonas sp não
apresentaram alterações significativas durante 180 dias de experimento.
A atividade de emulsificação e a capacidade de dispersão do
biossurfactante apresentaram resultados variados, dependendo das
proporções de biossurfactante/óleo utilizadas.
O biopolímero produzido e utilizado em diferentes condições de
conservação, apresentou-se estável dentro das condições estudadas.
Sendo dessa forma, promissor para utilização em ambientes variados
para o controle da poluição causada por derivados de petróleo.
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REFERÊNCIAS
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RUFINO, R.D.; SARUBBO, L.A.; BARROS-NETO, B.; CAMPOS-TAKAKI, G.M.
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