Estudo do potencial genotóxico de um extrato aquoso de
Schinus terebinthifolius Raddi: uma análise in vivo com ensaio
de micronúcleo
Orlando Nascimento Terra Junior
Rio de Janeiro
2012
ORLANDO NASCIMENTO TERRA JUNIOR
Aluno do Curso de Ciências Biológicas
Matrícula 0823800126
Estudo do potencial genotóxico de um extrato aquoso de
Schinus terebinthifolius Raddi: uma análise in vivo com ensaio
de micronúcleo
Monografia de Conclusão de Curso de Graduação,
apresentado ao Curso de Ciências Biológicas, da UEZO
– Modalidade Químico-Biológica, como parte dos
requisitos para obtenção do grau de Bacharel, sob a
Orientação da Prof. Msc. Adriano Arnóbio José da
Silva e Silva.
Rio de Janeiro
2012
Estudo do potencial genotóxico de um extrato aquoso de
Schinus terebinthifolius Raddi: uma análise in vivo com ensaio
de micronúcleo
Elaborado por Orlando Nascimento Terra Junior
Aluno do Curso de Ciências Biológicas da UEZO
Este trabalho de Graduação foi analisado e aprovado com
Grau: ...........................................
Rio de Janeiro, _____ de _______________de 2012
_____________________________________________________
MSc. Gustavo Vicentis de Oliveira Fernandes
_____________________________________________________
MSc. Margareth de Oliveira Timóteo
_____________________________________________________
MSc. Adriano Arnóbio José da Silva e Silva, Presidente
Rio de Janeiro, RJ - BRASIL
JULHO DE 2012
ii
Agradecimentos
Primeiramente, e sempre, a Deus por todas as bênçãos recebidas, e por ter me
ajudado a chegar ate aqui.
Aos meus pais, Orlando Terra e Palmira da Fonseca, pelo incentivo diário as
atividades acadêmicas, por sempre me estimularem e estarem do meu lado em todos os
momentos.
A meu irmão Alex Luiz, que também me ajudou no cotidiano da vida universitária.
As minhas avós Ilka de Menezes e Maria da Penha, por estarem do meu lado em
cada etapa de minha vida, sempre me oferecendo carinho e atenção, e são e sempre serão
partes essenciais da minha formação.
A toda minha família, que sempre me proporcionou bons momentos ao longo de
minha vida.
A meu orientador Adriano Arnóbio, que sempre me estimulou a buscar o
conhecimento, e a lutar pelos meus objetivos, acreditando sempre no meu potencial.
A equipe de professores e colaboradores, em especial aos professores Sérgio Seabra
e Ronaldo Figueiró.
A minha amada Aline Lorete, que esta intimamente ligada a minha historia na
UEZO e o qual sem a ajuda dela, não teria chegado aqui.
A meus amigos da UEZO em especial os amigos que estiveram do meu lado dia-adia e que hoje são como irmãos, Pablo Rodrigues, Letícia Lopes, Vitor Alves, Gabriel
Maldonado e Guilherme Alfradique.
iii
A meus amigos Thiago Dias, Raphael Lima (Paquito), Rafael Guilherme e
Stephanie Lagoas, que fazem parte juntamente comigo, de um grupo de amizade forte, e
hoje são verdadeiros irmãos e bênçãos na minha vida. Por toda amizade, fidelidade,
estimulo, bom humor e diversão, Muito obrigado.
A meus amigos João Pontes e Marcela Freitas, que também fazem parte da minha
historia, e me proporcionou grandes momentos.
Aos companheiros de turma que durante esses quatro anos trocaram experiências,
ajudas, e apoio, em especial Barbara, Maria Lucia, Angel, Julio Cesar, Marlon, Raquel,
Mayra e Amanda.
A todos meus amigos em especial.
Aos técnicos por toda dedicação, paciência e conhecimento compartilhado.
A todos os funcionários da UEZO, agradeço de coração pela colaboração
indispensável.
Ao apoio financeiro da FAPERJ.
iv
Resumo
A fitoterapia é um ramo da medicina que se utiliza de produtos naturais para intervenções
medicamentosas a partir de um conhecimento a respeito das atividades terapêuticas destes.
Apesar de as plantas medicinais já fazerem parte da cultura popular, nas últimas décadas o
interesse pela fitoterapia teve um aumento considerável entre usuários, pesquisadores e serviços
de saúde. O Teste do Micronúcleo in vivo em ratos é um sistema de avaliação de mutagenicidade
usada para descoberta de substâncias químicas que possam induzir a formação de fragmentos de
DNA e avaliação risco de populações expostas a xenobióticos. Diversos estudos comprovam a
versatilidade e aplicação do teste do micronúcleo em várias aplicações nas Ciências Médicas.
Schinus terebinthifolius Raddi também conhecida popularmente como Aroeira, é descrita como
medicinal há muitos anos e referido desde a primeira edição da Farmacopéia Brasileira. Diversos
trabalhos têm demonstrado uma possível utilização como agente auxiliador na cicatrização de
feridas cutâneas, na cicatrização de feridas cirúrgicas, e no tratamento de cervicites e no
corrimento genital. Outras propriedades medicinais foram atribuídas a Schinus terebinthifolius
Raddi, dentre elas, antioxidante e antibacteriano. Assim, o objetivo deste trabalho é analisar o
potencial genotóxico do extrato aquoso de Schinus terebinthifolius Raddi em medulas ósseas de
ratos Wistar através das frequências de micronúcleos em eritrócitos policromáticos. Neste estudo
foi realizada uma dosagem aguda em diferentes concentrações do extrato. Os resultados do
presente estudo com o extrato aquoso liofilizado de Schinus terebinthifolius Raddi indicam que
não houve efeitos genotóxicos e citotóxicos nas concentrações testadas, e apresentam um
aumento na razão de eritrócitos policromáticos por eritrócitos normocromáticos (EPC / ENC).
Palavras-chave: Schinus terebinthifolius Raddi, micronúcleo, fitoterápicos, mutagênicidade,
citotoxicidade.
v
Abstract
Phytotherapy is the branch of medicine that uses natural products to drug interventions
from knowledge about yours therapies activities. Although medicinal plants have become
part of popular culture in recent decades the interest in herbal medicine has increased
considerably among users, researchers and health services. The Micronucleus Test in vivo
in rats is a rating system used for detection of mutagenicity of chemicals that can induce
the formation of DNA fragments and risk assessment of populations exposed to
xenobiotics. Numerous studies demonstrate the versatility and application of test
micronucleus in various applications in medical sciences. Schinus terebinthifolius Raddi
also known popularly as Aroeira, is long described as medicine and refered since the first
edition of the Brazilian Pharmacopoeia. Several studies have demonstrated a possible use
as an agent assisting in the healing of skin wounds, the healing of surgical wounds, and
treatment of cervicitis and genital discharge. Other medicinal properties were attributed to
Schinus terebinthifolius Raddi, such as, antioxidant and antibacterial. The objective of this
study is to analyze the genotoxic potential of aqueous extract of Schinus terebinthifolius
Raddi in bone marrow of rats through the frequency of micronuclei in polychromatic
erythrocytes. In this study was performed with an acute dosing in different concentrations
of the extract. The results of this study with the lyophilized aqueous extract of Schinus
terebinthifolius Raddi indicate that there was no genotoxic and cytotoxic in tested
concentrations, and exhibit an increase in the ratio of polychromatic erythrocytes by
erythrocytes normochromatic (PCE / NCE).
Keywords: Schinus terebinthifolius Raddi, micronucleus, phytotherapy, mutagenicity,
cytotoxicity.
vi
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Folhas e frutos da Schinus terebinthifolius Raddi................................................07
Figura 2. Substâncias isoladas das folhas de S. terebinthifolius Raddi................................08
Figura 3. Principais elementos encontrados nos óleos essenciais de folhas secas de S.
terebinthifolius Raddi...........................................................................................................09
Figura 4. Célula policromatica com micronúcleo, corado pelo método de Giemsa, aumento
de 1000x..............................................................................................................................18
Figura 5. a) Célula normocromática sem micronúcleo. b) Célula policromática sem
micronúcleo. c) Célula policromática com micronúcleo......................................................19
Figura 6. a) Célula normocromática sem micronúcleo. b) Célula policromática sem
micronúcleo. c) Célula policromática com micronúcleo......................................................19
vii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Resultados............................................................................................................17
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
CFFM
Ciclofosfamida
CO2
Dióxido de carbono
DNA
Ácido desoxirribonucléico
ENC
Eritrócito Normocromático
EPC
Eritrócio Policromático
MNEPC
Micronúcleo em Eritrócito Policromático
NaCl
Cloreto de Sódio
OECD
Organisation for Economic Co-operation and Development
OMS
Organização Mundial de Saúde
RENISUS
Relação Nacional de Plantas Medicinais de Interesse ao SUS
STR
Schinus terebinthifolius Raddi
viii
Sumário
Resumo ..............................................................................................................................v
Abstract..............................................................................................................................vi
LISTA DE FIGURAS.......................................................................................................vii
LISTA DE TABELAS......................................................................................................viii
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS......................................................................viii
1. Introdução.........................................................................................................................1
1.1. Fitoterapia.......................................................................................................................1
1.2. Fitoterapia no Brasil........................................................................................................2
1.3. O Teste do Micronúcleo in vivo......................................................................................4
1.4. Schinus terebinthifolius Raddi........................................................................................6
1.4.1. Características Gerais.......................................................................................6
1.4.2. Composição Química ......................................................................................7
1.4.3. Atividade farmacológica....................................................................................9
1.5. Justificativa ...................................................................................................................10
1.6. Objetivos.......................................................................................................................10
1.6.1. Objetivo Geral.................................................................................................10
ix
1.6.2. Objetivos Específicos.....................................................................................10
2. Materiais e Métodos.........................................................................................................11
2.1. Extrato aquoso de S. terebinthifolius Raddi.....................................................................11
2.1.1. Coleta e Armazenamento................................................................................11
2.1.2. Infusão das folhas frescas...............................................................................11
2.1.3. Liofilização do extrato....................................................................................12
2.1.4. Ressuspensão do extrato aquoso liofilizado de Aroeira................................12
2.2. Animais..........................................................................................................................12
2.2.1. Controles positivo e negativo.........................................................................13
2.3. Administração do extrato..............................................................................................13
2.3.1. Procedimentos para o tratamento com extrato...............................................13
2.3.2. Condições ambientais.....................................................................................14
2.4. Teste de Micronúcleo in vivo .......................................................................................14
2.4.1. Obtenção da medula óssea..............................................................................14
2.4.2. Preparo das lâminas..............................................................................................15
2.4.3. Coloração e montagem das lâminas...............................................................15
2.4.4. Análise das lâminas .......................................................................................16
2.5. Análise Estatística.........................................................................................................17
x
3. Resultados.........................................................................................................................17
3.1. Imagens..............................................................................................................18
4. Discussão..........................................................................................................................20
5.Conclusão..........................................................................................................................22
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS....................................................................................23
ANEXO 1.............................................................................................................................32
xi
1
1. INTRODUÇÃO
1.1 Fitoterapia
Desde primórdios da evolução humana, o homem foi aprendendo a selecionar plantas
para a sua alimentação e para o alívio de seus males e doenças. O que resultou em um maior
domínio e uso de plantas e ervas medicinais (FERREIRA & PINTO, 2010).
Em todas as épocas que se sucederam esse acúmulo de conhecimento e tradições sobre
o uso de plantas como medicamentos, tornou seu uso cada vez mais amplo, e atualmente se
conhece essa abordagem terapêutica como fitoterapia (ÁLVAREZ, 2005).
A fitoterapia é um ramo da medicina, que se utiliza de produtos naturais para
intervenções medicamentosas a partir de um conhecimento a respeito das atividades
terapêuticas destes. Estes produtos possuem algumas formas de administração, podendo ser
administrados por via tópica, onde o produto é administrado diretamente na região de
interesse, e por via enteral, onde o produto é administrado via trato digestivo (REZENDE &
COCCO, 2002).
Apesar de as plantas medicinais já fazerem parte da cultura popular, nas últimas
décadas o interesse pela fitoterapia teve um aumento considerável entre usuários,
pesquisadores e profissionais de saúde (KENNY et al, 2001). De acordo com a Organização
Mundial de Saúde (OMS), aproximadamente 75% da população mundial que vive em países
em desenvolvimento, depende essencialmente da fitoterapia para seus cuidados primários de
saúde, devido principalmente a dificuldades econômicas (WHO, 2008). Vale ressaltar que
67% das espécies vegetais medicinais do mundo são originadas dos países em
desenvolvimento (ALONSO, 1998).
2
Esta estimativa torna-se próxima a de 1978, na declaração de Alma-Ata, a Organização
Mundial da Saúde onde foi reconhecido que 80% da população dos países em
desenvolvimento utilizam práticas tradicionais nos seus cuidados básicos de saúde e 85%
usam plantas ou preparações destas (OMS, 1979). Neste mesmo ano a OMS passou a
reconhecer o uso de fitoterápicos com finalidade profilática, curativa, paliativa ou com fins de
diagnóstico.
Existe a estimativa que 25% dos medicamentos conhecidos e descritos na farmacopéia
moderna são derivados de plantas e muitos outros são sintéticos análogos feitos a partir de
componentes protótipos de plantas. Assim, a afirmativa de que as plantas medicinais são
fontes exclusivas das substâncias mais importantes utilizadas na atualidade para fins
terapêuticos, torna-se verídica. Além das propriedades terapêuticas, algumas plantas
medicinais são empregadas também como suprimentos nutricionais, cosméticos, bebidas e
perfumes (ÁLVAREZ, 2005).
Sabe-se que atualmente as regiões onde há o uso extensivo de plantas medicinais como
remédio para tratamento de diversas doenças são a Ásia, América Latina, Índia e África
(RUFFA et al., 2002; SCHMOURLO et al., 2005).
1.2. – Fitoterapia no Brasil.
No Brasil, até a primeira metade do século XX, era essencialmente rural e usava
amplamente a flora medicinal, tanto nativa quanto introduzida. Atualmente, a medicina
popular do país é reflexo das uniões étnicas entre os diferentes imigrantes e os inúmeros povos
autóctones que difundiram o conhecimento das ervas locais e de seus usos, transmitidos e
aprimorados de geração em geração (LORENZI & MATOS, 2002).
A discussão acerca do uso de fitoterápicos é antiga, como em 1986, na 8ª Conferência
Nacional de Saúde (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 1987), quando foi recomendada a introdução
3
das práticas tradicionais de cura popular no atendimento público de saúde. Algumas iniciativas
de utilização do conhecimento popular e científico disponível têm demonstrado resultados
promissores e visível expansão, como o Projeto Farmácias Vivas da Universidade Federal do
Ceará, organizado sob influência das recomendações da OMS acerca do emprego de plantas
medicinais nos programas de atenção básica à saúde. É o primeiro programa de assistência
social farmacêutica baseado no emprego científico de plantas medicinais desenvolvido no
Brasil, tendo por objetivo produzir medicamentos fitoterápicos acessíveis à população carente
(MATOS, 1998).
Para poder estabelecer uma discussão mais ampla sobre os fitoterápicos, e garantir o
acesso seguro e racional destes, foi estabelecido no Decreto Nº 5.813, de 22 de junho de 2006,
a Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos, que visa estabelecer diretrizes e
linhas prioritárias para o desenvolvimento de ações em torno de objetivos comuns voltados à
garantia do acesso de fitoterápicos em nosso país, em particular estimulando desenvolvimento
de tecnologias e inovações, assim como ao fortalecimento das cadeias e dos arranjos
produtivos, ao uso sustentável da biodiversidade brasileira e ao desenvolvimento do Complexo
Produtivo da Saúde (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2006).
Em 2009, outra importante medida foi criada no âmbito dos fitoterápicos, trata-se da
criação da Relação Nacional de Plantas Medicinais de Interesse ao SUS (RENISUS), com
respaldo da Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos, que tem como finalidade
subsidiar o desenvolvimento de toda cadeia produtiva, inclusive nas ações que serão
desenvolvidas também pelos outros ministérios participantes do Programa Nacional de Plantas
Medicinais e Fitoterápicos, relacionadas à regulamentação, cultivo, manejo, produção,
comercialização e dispensação de plantas medicinais e fitoterápicos (RENISUS, 2009).
A criação da RENISUS estabeleceu um vigoroso e estratégico estudo para estabelecer
uma lista com espécies vegetais considerando as já utilizadas nos serviços de saúde estaduais e
municipais, o conhecimento tradicional e popular e os estudos químicos e farmacológicos
4
disponíveis. Dentre as espécies que compõem a lista da RENISUS esta inclusa a Schinus
terebinthifolius Raddi (S. terebinthifolius Raddi), espécie alvo do presente estudo.
Tais medidas são importantes no ponto de vista econômico, pois as preparações
fitofarmacêuticas e os produtos naturais isolados representam um mercado que movimenta
bilhões de dólares, tanto em países industrializados e em desenvolvimento (SKELLY, 1996).
Estima-se que 25% dos US$ 8 bilhões de faturamento da indústria farmacêutica brasileira
registrada em 1996, advêm de medicamentos derivados de plantas (GUERRA & NODARI,
2003). Considera-se também que as vendas nesse setor crescem 10% ao ano, com estimativa
de terem alcançado a cifra de US$ 550 milhões no ano de 2001 (KNAPP, 2001).
1.3. O Teste do Micronúcleo in vivo.
O Teste do Micronúcleo in vivo em ratos é um sistema de avaliação de mutagênicidade
usado para descoberta de substâncias químicas que possam induzir a formação de fragmentos
de DNA e avaliação risco de populações expostas a xenobióticos (PACHECO & HACKEL,
2002). O ensaio tem a capacidade de avaliar a capacidade clastogênica (que quebram
cromossomos) e aneugênica (que induzem aneuploidia ou segregação cromossômica anormal)
de moléculas (FENECH, 2000).
O Teste do Micronúcleo in vivo é também recomendado pela Organization for
Economic Co-operation and Development (OECD), para avaliação de risco a exposições a
xenobióticos (OECD, 1997).
O micronúcleo se constitui em uma pequena massa nuclear delimitada por membrana e
separada do núcleo principal. Os micronúcleos são formados durante a telófase da mitose ou
meiose, quando o envelope nuclear é reconstituído ao redor dos cromossomos das células
filhas. São resultantes de fragmentos cromossômicos acêntricos ou de cromossomos inteiros
que não foram incluídos no núcleo principal. Assim, o micronúcleo representa perda de
5
cromatina em consequência de dano cromossômico estrutural (fragmento) ou dano no
aparelho mitótico (KIRSCH-VOLDERS, 2002).
A formação de micronúcleos pode ocorrer numa frequência espontânea no organismo
humano. O nível desta frequência e a área do DNA removido do núcleo principal são fatores
que podem resultar no processo patológico (FENECH, 2000).
É importante ressaltar que os micronúcleos são formados independentemente do tipo
de dano ocorrido durante o ciclo. Por isso, os danos no DNA causados, por exemplo, pela
exposição a agentes mutagênicos, somente são expressos em micronúcleos após um ciclo de
divisão celular, sendo dependentes da proporção de células que estão se dividindo (FENECH,
2003). Consequentemente, a comparação da frequência de micronúcleos entre populações de
células em divisão só seria segura quando a cinética de divisão nuclear após o dano ao DNA
fosse idêntica (FENECH, 1997; CLARE et al., 2006).
Bhattathiri e colaboradores (1998) utilizaram o teste do micronúcleo para investigar a
radiossensibilidade de tumores cancerígenos avaliada pelo aumento na frequência de células
micronucleadas após irradiação de 49 pacientes com carcinoma na cavidade oral. Pacientes
com recorrência de novos tumores foram classificados como resistentes à radioterapia em
comparação com os sensíveis que não desenvolveram novos tumores. Em ambos os grupos
houve uma relação positiva na frequência de micronúcleos com a dose de radiação. Entretanto,
o aumento na contagem de células com micronúcleos ocorreu mais precocemente no grupo
resistente em comparação com o sensível (3,3 dias versus 7,6 dias), apresentando nos
primeiros uma estabilização nesta frequência, ausente no grupo sensível. A indução
relativamente maior de células micronucleadas nos tumores dos indivíduos do grupo sensível
sugeriu que o teste do micronúcleo possa ser utilizado como um teste de radiosensibilidade, ou
como sugere os autores, de radiocurabilidade.
Uma tentativa de verificar a extensão do dano genético em linfócitos do sangue
periférico como reflexo de eventos pré-clínicos do processo de carcinogênese foi realizada por
6
Hagmar e colaboradores (1998) através da frequência de aberrações cromossômicas e
micronúcleos em linfócitos de indivíduos de países nórdicos com controles pareados quanto às
mesmas variáveis. A análise estatística revelou que somente as aberrações cromossômicas
teriam uma tendência linear significante quanto ao risco subsequente do processo
carcinogênico, sugerindo a avaliação das quebras cromossômicas como um biomarcador
precoce para o risco do desenvolvimento de câncer.
Estes estudos apresentam a versatilidade e aplicação do teste do micronúcleo em várias
aplicações nas Ciências Médicas.
1.4. Schinus terebinthifolius Raddi
1.4.1. Características Gerais
Schinus terebinthifolius Raddi também conhecida popularmente como Aroeira, é uma
espécie pioneira e dióica (CRONQUIST, 1981; FLEIG, 1987). Possui folhas compostas por
folíolos lanceolados e pontiagudos, numerosas flores dispostas em pedúnculos pequenos e
brancos ou amarelo esverdeadas. Seu fruto é uma drupa vermelha e lustrosa, cujo cheiro se
assemelha ao da pimenta. É uma planta originária do Peru, sendo também encontrada na
Europa, Ásia e alguns países da América, inclusive o Brasil. No Brasil ela possui distribuição
em todo território, sendo catalogadas oito espécies diferentes (COUTINHO et al., 2006).
7
Figura 1. Folhas e frutos da Schinus terebinthifolius Raddi (fonte: www.eol.org/ imagem retirada no
dia 02 de setembro de 2011).
A Schinus terebinthifolius Raddi é nativa da América tropical, foi introduzida em
vários países do mundo para fins ornamentais, onde atualmente é considerada praga, ou planta
invasora (MORTON, 1978), sendo considerada uma ameaça por competir com outras espécies
nativas das regiões, sendo classificada na categoria I da lista de espécies invasoras do “Florida
Exotic Pest Plant Coincil’s” (BARBOSA et al., 2007). No Brasil, é encontrada em várias
formações vegetacionais desde o Estado de Pernambuco até o do Rio Grande do Sul (FLEIG,
1987; FLEIG & KLEIN, 1989; CARVALHO, 1994).
1.4.2. Composição Química
Estudos fitoquímicos e biológicos efetuados com espécies do gênero Schinus
descrevem a ocorrência de terpenóides e ácidos graxos em S. terebinthifolius Raddi
(MONEAM, 1986; JAIN, 1995). Dentre os terpenóides, dois triterpenos isolados de S.
8
terebinthifolius Raddi (JAIN, 1995) foram caracterizados como inibidores específicos da
fosfolipase A2.
Foram identificados outros componentes como taninos (TIRELLI et al, 2010) e
flavonóides (CERUCKS et al, 2007). Os taninos são uma classe de metabólitos secundários
envolvidos na defesa das plantas contra a herbivoria.
Componentes de baixa e média polaridade também foram descritos na literatura, onde
(1), miricetrina (2), quercitrina (3), galato de metila (4) e miricetina (5), descritas pela primeira
vez neste gênero, (CERUKS et al, 2007).
Figura 2. Substâncias isoladas das folhas de S. terebinthifolius Raddi (CERUKS et al, 2007).
A composição química do óleo essencial obtido das folhas e dos frutos da Schinus
terebinthifolius Raddi apresentam sesquiterpenos e monoterpenos. Os derivados do
germacreno são abundantes nas folhas frescas. O óleo essencial extraído das folhas frescas
apresentam uma maior concentração de β-pineno (10,21% e 3,81%), (E)-cariofileno (4,78% e
13,61%), germacreno-D (5,19% e 37,55%), ∆-cadineno (15,48% e 3,28%) e α-cadinol
(20,60% e 4,29%), respectivamente (CLEMENTE, 2009).
9
Figura 3. Principais elementos encontrados nos óleos essenciais de folhas secas de S. terebinthifolius Raddi
(LEMOS, 2010).
1.4.3. Atividade farmacológica.
O uso medicinal da Schinus terebinthifolius Raddi é descrito há muitos anos e referido
desde a primeira edição da Farmacopéia Brasileira (LUCENA, 2006). As principais partes de
Schinus terebinthifolius Raddi relatadas na literatura são a casca, entrecasca e as folhas (ELMASSRY et al., 2009).
Diversos trabalhos têm demonstrado uma possível utilização como agente auxiliador
na cicatrização de feridas cutâneas, na cicatrização de feridas cirúrgicas, e no tratamento de
cervicites e no corrimento genital (AMORIM & SANTOS, 2003; BRANCO-NETO et al,
2006; NUNES JUNIOR. et al, 2006,). Lucena e colaboradores (2006) demonstraram que o uso
de extrato hidroalcoólico de Schinus terebinthifolius Raddi mostrou efeito cicatrizante
favorável nas cistotomias em ratos. Outras propriedades medicinais foram atribuídas a Schinus
terebinthifolius Raddi, dentre elas, antioxidante (AMORIN, 2003; VELÁSQUEZ, 2003), e
antibacteriano (SCHMOURLO, 2005).
10
1.5. Justificativa
Em função do número crescente de profissionais e pacientes utilizando plantas
medicinais - mais especificamente a Schinus terebinthifolius Raddi – na qual é usada para o
tratamento de várias doenças, inclusive no tratamento de reumatismo e como um poderoso
agente curativo de úlceras e feridas, apresentando também efeitos depurativos e contra
afecções uterinas em geral (MARTÍNEZ et al., 1996; MARTÍNEZ et al., 1997; GUERRA et
al., 2000), é evidente a importância de estudos mais elaborados sobre análise de segurança
mutagênica, visando compreender suas possíveis ações em caráter de genotoxicidade, uma vez
que esta planta de potencial para ser um fitoterápico.
1.6. Objetivos
1.6.1. Objetivo Geral
Analisar o potencial genotóxico do extrato aquoso de Schinus terebinthifolius Raddi
em medulas ósseas de ratos Wistar através das frequências de micronúcleos em eritrócitos
policromáticos.
1.6.2. Objetivos Específicos
• Verificar o potencial de supressão medular através da variação da razão entre
eritrócitos normocromáticos e policromáticos em medulas ósseas de ratos Wistar;
11
• Analisar o potencial genotóxico em ratos Wistar através das frequências de
micronúcleos em eritrócitos policromáticos.
2. MATERIAIS E MÉTODOS
2.1. Extrato aquoso de S. terebinthifolius Raddi
2.1.1. Coleta e Armazenamento
As folhas frescas de Schinus terebinthifolius Raddi foram coletadas nas propriedades
da Secretaria Municipal do Meio Ambiente, Agricultura e Pesca do Município de Itaguaí
(SMMAAP– Itaguaí / RJ), em um total aproximado de 2,83 Kg. As mesmas foram limpas,
secas e armazenadas no congelador do Laboratório de Análises Química e Biológica (LAQB)
do Centro Universitário Estadual da Zona Oeste – UEZO, por aproximadamente 16 horas a –
28 ºC. A exsicata foi depositada no Museu Nacional pelo professor Max Valério Dória
Barbosa, código R 210.885.
2.1.2. Infusão das folhas frescas
O extrato aquoso foi processado a partir de folhas frescas de Schinus terebinthifolius
Raddi por infusão das mesmas de acordo com a Farmacopéia Brasileira (1ª edição), com
algumas modificações. A cada 2 litros de água mineral (Minalba. L66-Fab: 19/12/2010) foram
utilizados 800 g de folha fresca. A água foi fervida até atingir 100 ºC em um béquer e depois
foi transferida a outro béquer onde estavam contidas folhas frescas previamente trituradas em
12
processador elétrico. Após a homogeneização, a solução atingiu uma temperatura de 70 ºC e
permaneceu em repouso por 30 minutos em meio fechado. Após esse período a solução foi
filtrada em funil de porcelana com auxílio de papel de filtro e bomba a vácuo (Nevoni.
Modelo: 14014POC). O extrato obtido foi armazenado em frascos âmbar, identificados e
mantidos em congelador (Blood Plasma Freezer – Indrel. Modelo: GPS 10-D) até o momento
de sua liofilização.
2.1.3. Liofilização do extrato
O extrato foi liofilizado (Liofilizador Liotop. Modelo: L202 – Liobras) no Laboratório
de Análises Química e Biológica (LAQB) da UEZO e armazenado a – 28 ºC no congelador do
mesmo local (Blood Plasma Freezer – Indrel. Modelo: GPS 10-D). Obtendo-se um peso total
do extrato liofilizado de 3.000 g.
2.1.4. Ressuspensão do extrato aquoso liofilizado de Schinus terebinthifolius Raddi
O extrato aquoso de Schinus terebinthifolius Raddi foi obtido a partir de um frasco
contendo 1.000 g de extrato liofilizado diluído em 10 ml de solução de NaCl a 0,9% estéril,
obtendo-se a partir desse, cinco concentrações de extrato: 25, 50, 100, 150 e 200 mg.kg. O
extrato foi homogeneizado em vortex (Agitador vortex de tubos Mod. AP56 Phoenix - Bivolt)
por 1 minuto.
2.2. Animais
Foram utilizados 35 ratos Wistar machos adultos (entre 7 e 12 semanas) saudáveis, o
qual foram divididos em 7 grupos de 5, correspondentes as doses do extrato e os controles.
13
Este trabalho foi submetido à Comissão de Ética para Cuidado e Uso de Animais
Experimentais, protocolo de número CEUA/046/2011, sob responsabilidade do Professor
Doutor Mario Bernardo Filho (ANEXO 1).
2.2.1. Controles positivo e negativo
A Ciclofosfamida é um agente alquilante, utilizado no tratamento de neoplasias em
geral. Este agente inibe a replicação do DNA e a transcrição do RNA através do cruzamento
inter e intra - cadeias (ROESER et al, 1978; PEREIRA et al, 2004). Como sua mutagênicidade
e clastogenicidade é amplamente conhecida utiliza – se esta substância para realizar ensaios de
micronúcleo como controle positivo. A ciclofosfamida (Genuxal® - Baxter frasco-ampola
1000 mg) utilizada neste ensaio foi obtida a partir de uma diluição em solução NaCl 0,9%
estéril.
Para controle negativo foi utilizado à solução de NaCl 0,9% estéril (Baxter) devido sua
neutralidade quanto à mutagênicidade e citotoxicidade.
2.3. Administração do extrato
2.3.1. Procedimentos para a administração do extrato
Antes de iniciar o estudo, os animais foram pesados. A variação de peso entre os
animais, não excedeu a ± 20% do peso médio. Os animais foram selecionados ao acaso, de tal
maneira que o peso médio dos grupos de tratamento não tivesse diferença estatisticamente
significativamente. Ao final desta etapa, cada animal foi identificado e de acordo com o peso,
receberam as doses ajustadas por via oral utilizando sonda (gavagem).
14
2.3.2. Condições ambientais
Após a administração do extrato aquoso de Schinus terebinthifolius Raddi, os animais
retornaram as suas condições iniciais, onde permaneceram por mais 24 horas. Ração e água
foram fornecidos à vontade (ad libitum). A temperatura ambiente do biotério registrada foi de
22°C ± 2°C. A umidade relativa do ar foi de 50% ± 20% e um ciclo de luz 12h claro/ 12h
escuro foi mantido. As condições de temperatura do ambiente foram rigorosamente
monitoradas e controladas durante esse período.
2.4. Teste de Micronúcleo in vivo
2.4.1. Obtenção da medula óssea
A técnica utilizada para o estudo de micronúcleos em células de medula óssea foi a
descrita por Schmid (1976), obedecendo a alguns critérios recomendados por Ribeiro et al
(2003), adaptado a partir de Lindberg et al (2012).
Após o período de 24 horas a partir da administração do extrato aquoso de Schinus
terebinthifolius Raddi, os animais foram submetidos à câmara de CO2. Após a morte dos
animais, foram retirados os fêmures (o par para cada animal), e lavados em solução NaCl
0,9% estéril.
Estes foram cortadas em suas extremidades, e com auxilio de uma agulha 40x12, foram
lavados duas vezes em 0,75 mL de solução de NaCl 0,9% até a obtenção medula vermelha em
microtubo.
15
Os microtubos foram centrifugados a 1000 rpm por 5 minutos. O sobrenadante foi
removido e com auxilio de uma pipeta Pauster o conteúdo restante foi resuspenso em 0,5 mL
de solução de NaCl 0,9% até obtenção de uma suspensão homogênea. Este procedimento
assegura uma distribuição ao acaso das células de medula óssea.
2.4.2. Preparo das lâminas
As lâminas foram preparadas através da técnica de distensão (esfregaços), pingando-se
duas gotas da suspensão dos microtubos citados acima na extremidade de uma lâmina
(previamente marcada com o código do animal), e, com o auxílio de outra lâmina inclinada
num ângulo de 45°, fazendo uma distensão. Estas lâminas foram secas ao ar. E posteriormente
fixadas em Metanol P.A. (Vetec®) por 10 minutos. Foram preparadas duas lâminas de cada
animal.
2.4.3. Coloração e montagem das lâminas
As células foram coradas, 24 horas após a preparação das lâminas, para diferenciar
eritrócio policromático (EPC) de eritrócito normocromático (ENC). O método de coloração
incluiu o uso de Giemsa a 5% por 5 minutos. Posteriormente as lâminas foram lavadas com
água destilada e foram secas ao ar. Após a secagem, as lâminas foram montadas com
lamínulas, com Entellan®, evitando-se, tanto quanto possível, a formação de bolhas. Após a
secagem ao ar, foi utilizado esmalte (Colorama®) nas bordas.
16
2.4.4. Análise das lâminas
Os critérios para identificação do micronúcleo são o seu tamanho, a sua forma e a sua
coloração. No tamanho, eles devem ter 1/10 a 1/20 do tamanho do EPC. O micronúcleo deve
ser arredondado ou oval, com contorno liso e definido, e coloração azul escuro. O
micronúcleo, geralmente, apresenta menor evidência de estrutura interna que o núcleo das
células nucleadas, mas são semelhantes, em aparência, a esses núcleos. Para a quantificação de
células portadoras de micronúcleo são analisadas 1000 eritrócitos policromáticos, em
contagem sistemática em diferentes campos da lâmina, escolhidos ao acaso. As células
policromáticas são bem arredondadas, de coloração azulada (Figura 4, 5 e 6).
O método para avaliação da razão entre eritrócitos policromáticos e normocromáticos
consiste na contagem sistemática destas células em diferentes campos da lâmina. Esses
campos são escolhidos aleatoriamente sem sobreposição (Figura 5). As células
normocromáticas são ligeiramente menores que as policromáticas, apresentam coloração
rosada. São consideradas na contagem apenas as células devidamente integras. Em cada
lâmina, foram analisados simultaneamente os eritrócitos policromáticos (EPCs) e os eritrócitos
normocromáticos (ENCs). A partir de uma contagem de 200 células totais, é gerada uma razão
de todos os policromáticos encontrados sobre os normocromáticos encontrados, após essa
divisão, o valor é organizado em planilha para posterior análise estatística.
As lâminas de todos os animais (grupos tratados, controle negativo e controle positivo)
foram codificadas e analisadas, dentro de um curto espaço de tempo, pelo mesmo observador,
em teste cego, de modo a eliminar erros de análise.
17
2.5. Análise Estatística
Os dados foram analisados quanto à verificação da distribuição de normalidade, através
do modelo estatístico de Shapiro-Wilk. Após esta análise foi realizada uma comparação de
grupos pelo modelo estatístico não paramétrico de Kruskal-Wallis (ZAR, 1999; ARANGO,
2011).
3. RESULTADOS
A frequência de Micronúcleo em Eritrócitos Policromáticos (MNEPC) e a proporção
de Eritrócitos Policromáticos e Normocromáticos (EPC/ENC) após o tratamento em diferentes
doses de extrato aquoso liofilizado de S. terebinthifolius Raddi (STR) são mostradas na tabela
1.
Tratamento
Controle Negativo (NaCl)
Controle Positivo (CFFM)
25 mg.kg STR
50 mg.kg STR
100 mg.kg STR
150 mg.kg STR
200 mg.kg STR
Tempo (h)
24
24
24
24
24
24
24
Total MNEPC
por 10.000 céls
analisadas
10
20*
14
11
7
9
14
MNEPC
Média ± DP
2.00 ± 1.73
4.00 ± 2.12
2.80 ± 1.92
2.20 ± 1.30
1.40 ± 0.54
1.80 ± 0.44
2.80 ± 1.09
(EPC / ENC)
Média ± DP
2.79 ± 2.18
0.95 ± 0.90
4.74 ±2.65b
6.76 ± 3.81ab
5.29 ± 2.86b
5.74 ± 2.25ab
5.22 ± 2.15b
Tabela 1. Resultados. As doses testadas (25, 50, 100, 150 e 200 mg.kg) não indicaram aumento estatisticamente
significativo na frequência MNPCE, quando comparado com o grupo de controle positivo (p> 0,05) * . As doses
50 e 150 mg.kg indicaram aumento na relação EPC/ENC quando comparado com o grupo de controle negativo
(p< 0,05)
a
. As doses que apresentaram aumento na relação EPC/ENC quando comparadas com o grupo de
b
controle positivo (p< 0,05) . CFFM. Ciclofosfamida. STR. Schinus terebinthifolius Raddi.
18
3.1. Imagens
Figura 4. Célula policromática com micronúcleo, corado pelo método de Giemsa, aumento de 1000x
(Microscópio Óptico Nikon E200).
19
b
c
a
Figura 5. a) Célula normocromática sem micronúcleo. b) Célula policromática sem micronúcleo. c)
Célula policromática com micronúcleo. Coloração pelo método de Giemsa, aumento de 400x
(Microscópio Óptico Nikon E200).
c
a
b
Figura 6. a) Célula normocromática sem micronúcleo. b) Célula policromática sem micronúcleo. c)
Célula policromática com micronúcleo. Coloração pelo método de Giemsa, aumento de 1000x
(Microscópio Óptico Nikon E200).
20
4. DISCUSSÃO
Os dados obtidos na tabela 1 reforçam as afirmações no que diz respeito ao potencial
genotóxico e citotóxico da ciclofosfamida (CONTRAN et al., 1999; PREMKUMAR et al., 2004;
ZHAN et al., 2005; ACEVES ÁVILA et al., 2004; DANTAS, et al., 2009). Houve aumento na
frequência de micronúcleos em eritrócitos policromáticos causados pela ciclofosfamida na
concentração de 50mg.kg, este efeito esta relacionado aos danos causados ao genoma celular
(KIJIMA et al., 2003). Houve uma diminuição na relação EPC/ENC, indicando efeito citotóxico
da ciclofosfamida. A frequência de micronúcleos em eritrócitos policromáticos encontrados no
presente estudo, aproxima-se no que foi publicado por Dantas et al (2009) em 24 horas após a
administração de ciclofosfamida, totalizando 20 MNEPCs.
No controle negativo, em que se utilizou uma solução de NaCl 0,9%, foram
encontrados um total de 10 micronúcleos, sendo uma razão de 1 micronúcleo para cada 1.000
eritrócitos policromáticos analisados, a relação EPC/ENC foi de 2.79. Este resultado reafirma
a neutralidade da solução de NaCl 0,9% quanto à mutagênicidade. A presença de
micronúcleos no grupo – controle negativo ocorre de forma espontânea no processo de divisão
celular. O que diferencia um processo espontâneo ao acaso da formação de micronúcleos, de
um processo celular que sofreu influência de uma substancia genotoxica é a frequência total de
micronúcleos formados (FENECH, 2000).
Os resultados obtidos nos grupos testes nas concentrações: 25, 50, 100, 150 e 200
mg.kg de Schinus terebinthifolius Raddi indicam que não houve efeito mutagênico quando
comparado ao controle positivo (p> 0,05). Carvalho et al (2003) avaliaram o efeito
mutagênico de um extrato aquoso do fruto de Schinus terebinthifolius Raddi frente ao DNA
plasmidial, indicando que o extrato não foi capaz de induzir a quebras da fita dupla do DNA
plasmidial, corroborando com o resultado do presente estudo.
21
As doses de 50 e 150 mg.kg de Schinus terebinthifolius Raddi apresentaram um
aumento na relação EPC/ENC quando comparadas com o grupo de controle negativo (p<
0,05), indicando uma estimulação da divisão e maturação das células nucleadas na
eritropoiese. A frequência de eritrócitos policromáticos (EPC) entre os 200 eritrócitos
analisados nas distenções de medula óssea é usada como um indicador de eventuais efeitos
adversos do tratamento sobre a função deste órgão hematopoiético. A redução da frequência
reflete uma diminuição na formação de novos eritrócitos traduzindo-se como um efeito
mielotóxico de um agente químico (MELO et al, 2009). Já o aumento na relação de Eritrócitos
Policromáticos pode indicar uma estimulação da divisão e maturação das células nucleadas na
eritropoiese. Porém o presente estudo não pode relacionar o aumento desta relação com um
estimulo direto ao fenômeno de eritropoiese, uma vez que o estudo foi realizado em 24 horas
(efeito agudo) e o fenômeno da eritropoiese está relacionado a um período de 48-72 horas
(SHUGA et al, 2007).
A comparação da razão de EPC / ENC, entre os grupos testes nas doses de 25, 50, 100,
150 e 200 mg.kg de Schinus terebinthifolius Raddi e o controle positivo (ciclofosfamida),
indica que não houve um efeito citotóxico sobre a medula óssea (OECD, 1997).
Os resultados do presente estudo com o extrato aquoso liofilizado de Schinus
terebinthifolius Raddi indicam que não houve efeitos genotóxicos e citotóxicos nas
concentrações testadas, e apresentam um aumento na razão de EPC / ENC. Contudo, mais
estudos com modelos crônicos devem ser realizados para elucidar o efeito sobre o aumento da
razão de eritrócitos policromáticos.
22
5. CONCLUSÃO
Diante dos resultados obtidos é possível sugerir que o extrato aquoso liofilizado de
Schinus terebinthifolius Raddi processado a partir das folhas frescas, nas concentrações
utilizadas, não apresentou potencial genotóxico através das frequências de micronúcleos em
eritrócitos policromáticos em medulas ósseas de ratos Wistar.
Pode-se inferir que o extrato analisado é seguro quanto a seu uso no mercado de
consumo no que diz respeito a processos mutagênicos e citotóxicos que envolvam a medula
óssea.
Especula-se, que o extrato nas concentrações utilizadas gerou aumento da variação da
razão entre eritrócitos policromáticos e normocromáticos em medulas ósseas de ratos Wistar.
No entanto, mais estudos devem ser elaborados para maior compreensão deste fenômeno.
23
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ANEXO 1