AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA E PROTÉICA DAS CÉLULAS DO
TUMOR TRANSPLANTÁVEL DE ERLICH
Juliana Cristina Lima 1;
Márcia Regina Machado dos Santos 2;
Tânia Aguiar Passeti 3.
Área do Conhecimento: Ciências da Vida
Palavras Chaves: TTE, células mamárias, proteínas, RNA e DNA
INTRODUÇÃO
O tumor transplantável de Ehrlich (TTE) é um
dos tumores mais usados naS pesquisas sobre o câncer. Ele
foi descrito por Paul Ehrlich em 1905 como um carcinoma
mamário de camundongos fêmea. Inicialmente, o tumor
foi desenvolvido sob a forma sólida e, posteriormente, em
1932, Leowenthal e Jahn desenvolveram a forma ascítica
(DAGLI, 1989).
A vantagem da utilização de neoplasias
transplantáveis, em comparação às demais, recai sobre o
conhecimento prévio da quantidade e das características
iniciais das células tumorais a serem inoculadas e, sobre o
desenvolvimento rápido da neoplasia que otimiza o tempo
de estudo (SILVA et al, 2006).
Na análise minuciosa da literatura, encontramos
poucos trabalhos que relatem as alterações genéticas e
protéicas das células do TTE em relação às células normais
de mama de camundongos fêmea. Os poucos trabalhos
encontrados são relativamente antigos, necessitando de
reavaliação dos resultados. Como exemplo, podemos citar
o trabalho de Lehmann e col., 1989 onde ficou demonstrado
que as células do TTE aumentam a expressão do RNAm
dos protooncogenes c-fos, c-myc e c-ras, indicando
possivelmente que esses protooncogenes possam estar
envolvidos na modulação da célula normal em célula
maligna.
a estudar as células dessa neoplasia maligna relacionando
as alterações gênicas e protéicas encontradas. O
detalhamento genético desse tumor frente às células
normais de mama pode abrir portas para novos estudos que
resultem em avanços na compreensão dos mecanismos de
desenvolvimento das células tumorais, bem como para
novos tratamentos gênicos.
OBJETIVO
Este trabalho tem por objetivo avaliar a expressão
gênica e expressão de proteínas das células do Tumor
Transplatável de Ehrlich em relação às células normais de
mama de camundongos fêmea.
MATERIAL E MÉTODO
Para a realização do presente estudo, utilizaramse 15 camundongos fêmea da linhagem CD1, fornecido pelo
Biotério de Camundongos Isogênicos do Departamento de
Imunologia ICB/USP, com idade entre 4 a 8 semanas.
As células do (TTE) foram fornecidas pelo
Biotério da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia
da Universidade de São Paulo, sendo esses animais
manipulados no Hospital da Faculdade de Medicina
Veterinária da UNIBAN.
O estudo da expressão gênica das células
tumorais e as conseqüentes alterações protéicas compõem
a linha de pesquisa mais atual e promissora do câncer.
Esse conhecimento pode levar não somente à obtenção de
marcadores tumorais para diagnóstico, mas também a uma
melhor avaliação dos resultados obtidos em tratamento,
facilitando desse modo a compreensão da evolução da
neoplasia maligna.
Dos animais utilizados, três foram inoculados
com aproximadamente 2,0x106 células do TTE no dorso.
Os animais foram mantidos até aparecimento de uma massa
tumoral palpável. O grupo controle contou com 12 animais
limpos que tiveram suas mamas retiradas para avaliação
comparativa com as células do TTE. Os animais foram
eutanasiados com 100 mg/kg de peso de Pentobarbital
intra-peritoneal. Após o procedimento acima, os animais
Devido às escassas informações sobre o perfil
genético e protéico das células do TTE, propusemo-nos
Estudante do curso de Medicina Veterinária; e-mail: [email protected] 1
Professor da Universidade Bandeirante de São Paulo; e-mail: [email protected] 2
Professor da Universidade Bandeirante de São Paulo; e-mail: [email protected] 3
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tiveram sua pele divulsionada e foram retiradas as mamas
e o TTE em forma sólida. Aproximadamente 50-100 mg
de TTE ou da mama foi adicionado a 1 ml de Trizol e
processado de acordo com o protocolo de AUSUBEL,
1990. Da suspensão das moléculas das células acima
foram separados o DNA, RNA e proteína, de acordo
com o protocolo desenvolvido por AUSUBEL, 1990.
As proteínas das células normais de mama e das células
do TTE isoladas acima foram separadas pela técnica de
Western Blotting descrita por FRED HUTCHINSON,
2007. O RNA das células normais de mama e das células
do TTE isolados foi incubado com EtBr e foi separado em
gel de agarose, de acordo com a técnica descrita por FRED
HUTCHINSON, 2007.
sugerindo que esta pode ser a p53. Para a confirmação desse
resultado há necessidade da realização de imunoblotting
com anticorpos específicos contra a proteína p53 e outras
proteínas relacionadas ao ciclo celular que são cruciais
para o desenvolvimento da malignidade (dados não
mostrados).
Os resultados obtidos nesse trabalho requerem
a realização de novos testes para sua confirmação,
bem como a observação de outras diferenças ainda não
descritas. A continuação desse trabalho pretende traçar o
perfil gênico e protéico das células do TTE e, assim, poder
fornecer novos recursos para futuros estudos que utilizem
essas células, tanto para tratamento da neoplasia quanto
para compreensão dos mecanismos de desenvolvimento
do câncer.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
O RNA retirado das células do TTE e as células
de mama normal de camundongos fêmea foram submetidos
ao processo de separação em gel de agarose. A comparação
da corrida eletroforética do RNA no gel das duas amostras
é demonstrada na figura anexa. Nessa figura podemos
observar que o perfil de bandas apresentado no material
retirado das células tumorais é ligeiramente diferente
do apresentado no perfil das bandas do RNA das células
de mama normais de camundongos fêmea. Observando
as bandas 28S e 18S do gel, notamos que essas bandas
estão deslocadas no perfil do tumor em relação à mama
normal, enquanto que a banda 8S se mantém igual nos dois
perfis. Sabendo que essas bandas são de RNA ribossomal
e que elas são altamente conservadas nos seres vivos,
esse achado pode apresentar uma alteração relevante não
só no desenvolvimento do tumor, mas dentro da biologia
celular. Esse fato pode ter ocorrido nessas células, em
particular, devido a esse tumor ser transplantado de animal
para animal por mais de 70 anos podendo gerar mutações
diferentes que normalmente não ocorrem em tumores
naturais. A confirmação desse achado e a melhor avaliação
da expressão do RNA dessas células só poderão ser feitas
com a continuação do trabalho. Nessa próxima fase do
projeto, o RNA separado será hibridizado com sondas de
RNA conhecidas e marcadas com material radioativo. Dessa
maneira podemos comprovar as diferenças observadas
nesse trabalho e elucidar outras, montando o perfil das
alterações genéticas encontradas nesse tumor maligno.
Quanto à separação de proteínas em gel de
poliacrilamida das duas amostras estudadas, podemos
observar que há diferenças no perfil eletroforético das
proteínas das células do carcinoma mamário em relação
às células normais de mama. Neste resultado temos uma
banda protéica presente na corrida eletroforética das
proteínas das células de mama normal que não existe
no perfil das proteínas das células do TTE. Essa banda
protéica está entre os pesos moleculares de 45 e 66 KDA,
CONCLUSÃO
Os resultados apresentados sugerem que há
diferença no perfil de RNA ribossômico das células do TTE
em relação às células normais de mama de camundongos
fêmea, sendo que essa está presente nas bandas 28S e 18S.
Em relação ao perfil protéico das duas amostras, temos a
ausência de uma banda protéica na corrida do material das
células do TTE em relação às células normais de mama de
camundongos fêmea. Essa banda tem peso molecular entre
45 e 66 KDA, sugerindo que possa ser a p53. Os resultados
ainda dependem de novos testes para confirmação do
sugerido nesse trabalho.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
AUSUBEL, F.M. Currents protocols in molecular biology.
Greene, V.2, 1990.
DAGLI, M. L. Z. Disseminação linfática do tumor de
Ehrlich:estudo experimental. 148f. Tese (Doutorado
em Patologia Experimental e Comparativa)-Faculdade de
Medicina Veterinária e Zootecnia,Universidade de São
Paulo, São Paulo, 1989.
FRED HUTCHINSON – Câncer Research. Disponível em
< http://WWW.fhcrc.org/science/labs/breeden/Methods/
Northern_Blot.html > acessado em 03 nov. 2007.
LEHMANN, W; STRAUS, M; KIESSLING U; GRAETZ,
H; KOBERLING, A; LANGEN, P. Effect of a mammaryderived growth inhibitor on the expression of the oncogenes
c-fos, c-myc and c-ras. FEBS Lett. 1989 Feb 13; 244(1):
185-7.
SILVA, A.E.; SANTOS, F.G.A.; CASSALI, G.D.
Marcadores de proliferação celular na avaliação do
crescimento do tumor sólido de Ehrlich. Arq.Bras.Med.
Vet.Zootec, v.58, n.4, p.658-661, 2006.
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