UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
FACULDADE DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
KALINE DE MEDEIROS NASCIMENTO
COMPOSIÇÃO QUÍMICA E ATIVIDADE ANTIFÚNGICA DOS ÓLEOS
ESSENCIAIS DE ESPÉCIES DE Piper FRENTE A CEPAS DE Candida
SPP.
FORTALEZA
2011
KALINE DE MEDEIROS NASCIMENTO
COMPOSIÇÃO QUÍMICA E ATIVIDADE ANTIFÚNGICA DOS ÓLEOS
ESSENCIAIS DE ESPÉCIES DE Piper FRENTE A CEPAS DE Candida SPP.
Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação em Ciências Veterinárias da
Faculdade de Veterinária da Universidade
Estadual do Ceará, como requisito parcial para
a obtenção do grau de Mestre em Ciências
Veterinárias.
Área de Concentração: Reprodução e Sanidade
Animal.
Linha de Pesquisa: Reprodução e sanidade de
carnívoros, onívoros, herbívoros e aves.
Orientador: Profª. Dra. Selene Maia de Morais
FORTALEZA
2011
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação
Universidade Estadual do Ceará
Biblioteca Central Prof. Antônio Martins Filho
N244c
Nascimento, Kaline de Medeiros
Composição química e atividade antifúngica dos óleos
essenciais de espécies de Piper frente a cepas de Candida
spp. / Kaline de Medeiros Nascimento. – 2011.
81 f. : il. color., enc. ; 30 cm.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Estadual do
Ceará, Faculdade de Veterinária, Programa de PósGraduação em Ciências Veterinárias, Curso de Mestrado
Acadêmico em Ciências Veterinárias, Fortaleza, 2011.
Área de Concentração: Reprodução e Sanidade Animal.
Orientação: Profa. Dra. Selene Maia de Morais.
1. Piper. 2. Óleos essenciais. 3. Candida spp. I. Título.
CDD: 664
COMPOSIÇÃO QUÍMICA E ATIVIDADE ANTIFÚNGICA DOS ÓLEOS
ESSENCIAIS DE ESPÉCIES DE Piper FRENTE A CEPAS DE Candida SPP.
Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação em Ciências Veterinárias da
Faculdade de Veterinária da Universidade
Estadual do Ceará, como requisito parcial para a
obtenção do grau de Mestre em Ciências
Veterinárias.
Aprovada em: ____/ _____/ ______
Banca Examinadora
__________________________________________________
Profª. Dra. Selene Maia de Morais
Orientadora – UECE
___________________________________________________
Prof. Dr. Helio Vitoriano Nobre Júnior
Co-orientador – UFC
____________________________________________________
Dra. Eveline Solon Barreira Cavalcanti
Examinador-UECE
Ao meu noivo e família, por todo apoio e incentivo.
Dedico.
AGRADECIMENTOS
À Deus toda a honra deste trabalho, porque sem Ele nada seria feito.
À Universidade Estadual do Ceará, através do Programa de Pós-Graduação em Ciências
Veterinárias, pela oportunidade de realização desse curso.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, pela concessão da
bolsa de estudos.
À minha orientadora Selene Maia de Morais pela paciência, atenção e por todo auxílio.
Ao Prof. Hélio Vitoriano Nobre Júnior pela contribuição na orientação dos testes biológicos.
Aos alunos do Laboratório de Produtos Naturais (LPN) da UECE, pelo apoio dado nos
momentos iniciais desta pesquisa.
Aos alunos do Laboratório de Bioprospecção Experimental de Leveduras (LABEL) da UFC,
pela grande ajuda e pelos dias felizes que passamos.
Ao amigo Dr. Hemerson Iury Ferreira Magalhães pela dedicação e auxílio no
desenvolvimento desse trabalho.
À minha família e ao meu noivo, pelo apoio e incentivo.
As minhas colegas de pós-graduação, em especial a amiga Mírley Barbosa, por toda força e
companheirismo.
A minha querida prima, Joyce Nascimento, por me ajudar na conclusão deste trabalho.
A todos, indistintamente, que contribuíram para que eu pudesse concluir mais esta etapa.
"Você é quem decide o que vai ser eterno em
você, no seu coração.
Deus nos dá o dom de eternizar em nós o que
vale a pena, e esquecer definitivamente aquilo
que não vale".
Pe. Fábio de Melo
RESUMO
Ao longo das décadas, a quantidade de informações sobre recursos medicinais a partir do uso
de plantas das florestas tropicais aumentou significantemente. A região amazônica do Brasil
devido sua grande diversidade biológica é de relevante importância para descoberta de
substâncias com potencial medicinal e principalmente em relação a este estudo, a atividade
antibacteriana. As drogas antifúngicas sistêmicas são em número bastante limitado e, além
disso, apresentam efeitos colaterais que podem limitar sua utilização, portanto é importante a
procura de novas drogas antifúngicas que apresentem maior segurança na sua utilização e
menos efeitos colaterais. Dentre a bioprodução oriunda da Amazônia destaca-se a família
Piperaceae com distribuição principalmente pantropical que compreende 12 gêneros e 1400
espécies. O gênero Piper é o maior da família, com 700 espécies. Entre elas, há 170 espécies
que ocorrem no Brasil sendo utilizadas popularmente como renomados agente anti-séptico,
inseticida e antimicrobiano. O objetivo desse trabalho foi elucidar os componentes químicos e
a atividade dos óleos essenciais de espécies de Piper da Amazônia Brasileira contra cepas de
Candida spp. Folhas das espécies Piper marginatum, P. aleyreanum, P. dilatatum, P.
aduncum e P. alatabaccum foram coletados na floresta amazônica para a avaliação da
atividade antifúngica contra nove cepas de Candida spp., incluindo três cepas isoladas de
sangue com MIC´s elevados para o fluconazol. As cepas foram identificadas em
CHROMagar. Os óleos essenciais foram obtidos por hidrodestilação e testados na faixa de 10
a 0,015 mg/mL pelo método de microdiluição em caldo de acordo com o protocolo M27-A3.
As cepas de C. parapsilosis ATCC 22019 e ATCC 6258 foram utilizadas como controle. Os
principais componentes dos óleos essenciais foram para P. marginatum foram: α-copaeno e
3,4-(metilenodioxi) propiofenona, para P. aleyreanum: E-cariofileno e óxido de cariofileno,
para P. dilatatum: α-copaeno, óxido de cariofileno, linoleato de metila e octadecanoato de
metila, por P. alatabaccum: E-cariofileno, spathulenol, metil linoleato e metil octadecanoate e
para P. aduncum: trans-isocroweacin, dill apiol e cis-isoelemicin. P. dilatatum foi o mais
ativo com MIC50 de 0,65 ± 0,39 mg / mL. Os outros óleos mostraram MIC50 variando de 1,55
± 0,77-2,10 ± 0,75 mg / mL, confirmando a importância dos óleos essenciais de Piper como
alternativas naturais para o tratamento de infecções causadas por Candida spp.
ABSTRACT
Over the decades, the amount of resource information from the medicinal use of plants of
tropical forests has increased significantly. The Amazon region of Brazil, due to its great
biological diversity, is of great significance for the discovery of substances with medicinal
potential. The systemic antifungal drugs are very limited in number and, moreover, have side
effects that may limit its use, therefore it is important the search for new antifungal drugs safe
for the utilization. Among bioproduction coming from the Amazon, stands out the Piperaceae
family, with pantropical distribution, primarily comprising twelve genera and 1400 species.
The genus Piper is the largest family with 700 species. Among them there are 170 species
occurring in Brazil are popularly used as renowned antiseptic agent, insecticide and
antimicrobial. The aim of this study was to determine the chemical components and activity
of essential oils from Piper species of the Brazilian Amazon against strains of Candida spp.
Leaves of the species Piper marginatum, P. aleyreanum, P. dilatatum, P. aduncum and
P. alatabaccum were collected in the Amazon forest for evaluation of antifungal activity
against nine Candida spp. strains, including three strains isolated from blood and being
fluconazole-resistant. The strains were identified on CHROMagar. The essential oils were
obtained by hydrodistillation of plant leaves and tested in the range of 10 to 0.015 mg/mL by
broth microdilution method according to protocol M27-A3. The strains C. parapsilosis ATCC
22019 and ATCC 6258 were used as controls. The main components of the plant essential oils
were for P. marginatum: α-copaene and 3,4-(methylenedioxy) propiophenone, for
P. aleyreanum: E-caryophyllene, caryophyllene oxide,
for
P. dilatatum: α-copaene,
caryophyllene oxide, methyl linoleate, methyl octadecanoate, for P. alatabaccum: Ecaryophyllene, spathulenol, methyl linoleate, methyl octadecanoate and for P. aduncum:
trans-isocrowecin, dill apiol and cis-isoelemicin. P. dilatatum was the most active with MIC50
of 0.65 ± 0.39 mg/mL and other showed MIC50 ranging from 1.55± 0.77 to 2.10 ± 0.75
mg/mL, demonstrating the importance of Piper essential oils as natural alternatives for the
treatment of infections caused by Candida spp.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Folhas de P. marginatum ....................................................................................... 20
Figura 2. Estrutura química do Óxido de cariofileno ............................................................ 21
Figura 3. Estrutura química do Isocariofileno ....................................................................... 21
Figura 4. Estrutura química do Espalutenol .......................................................................... 22
Figura 5. Folhas de P. dilatatum........................................................................................... 22
Figura 6. Folhas de P. aduncum. .......................................................................................... 23
Figura 7. Colônia de coloração branca, superfície lisa, textura glabrosa úmida, característica
das espécies de Candida ........................................................................................ 25
Figura 8. Micromorfologia mostrando clamidoconídios de C. albicans ................................ 26
Figura 9. Placa de 96 poços e pipeta multicanal utilizadas na microdiluição em caldo...........27
LISTA DE QUADROS
Quadro 1: Distribuição geográfica de espécies do Piper nos estados brasileiros e suas principais
indicações na medicina popular ............................................................................ 17
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
μL - Microlitros
α - Alfa
β - Beta
γ - Gama
ρ - Para
CLAE - Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
CLSI - Clinical and Laboratory Standards Institute
DMSO – Dimetilsulfóxido
EO- Essential oils
GC- gas cromatography
ISO - International Standard Organization
mg - Miligrama (s)
MIC- Minimum inhibitory concentration
mL - Mililitro (s)
MS- mass spectrometry
NCCLS - National Committee for Clinical Laboratory Standards
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO
12
2 REVISÃO DE LITERATURA
14
2.1 Plantas Medicinais e o gênero Piper: breve histórico e perspectivas
14
2.2 Estudos químicos e biológicos das espécies de Piper estudadas nessa dissertação
20
2.2.1 P. marginatum
20
2.2.2 P. aleyreanum
21
2.2.3 P. dilatatum
21
2.2.4 P. aduncum
23
2.2.5 P. alatabaccum
24
2.3 Fungos e sua importância na medicina veterinária
24
2.4 Métodos de estudo da atividade antifúngica in vitro
27
3 JUSTIFICATIVA
29
4 HIPÓTESE CIENTÍFICA
30
5 OBJETIVOS
31
5.1 Objetivo Geral
31
5.2 Objetivos Específicos
31
6 CAPÍTULO 1
32
7 CAPÍTULO 2
50
8 CONCLUSÕES GERAIS
67
9 PERSPECTIVAS
68
10 REFERÊNCIAS BILBIOGRÁFICAS
69
11 ANEXOS: Cromatografia gasosa dos óleos essenciais estudados
77
12
1 INTRODUÇÃO
A procura por novos agentes antimicrobianos, a partir de plantas, é intensa devido
à resistência dos microorganismos patogênicos frente aos produtos sintéticos (BAUTISTABAÑOS et al., 2003). A resistência aos antifúngicos, clínica ou in vitro, pode ocorrer quando
células de fungos suscetíveis passam a ser resistentes devido ao contato prévio com as drogas
ou é inerente ao próprio microrganismo. (MORSCHHÄUSER, 2002)
Os produtos naturais têm sido muito utilizados como modelos para o
desenvolvimento de novos compostos antimicrobianos e os resultados apresentam grande
utilidade contra doenças fúngicas (DENNING, 2002). O Brasil é o país com maior
diversidade genética vegetal do mundo, contando com mais de 55.000 espécies catalogadas
(AZEVEDO & SILVA, 2006), frente a esta diversidade uma estratégia atual vem sendo
buscar métodos alternativos para o controle de doenças e pestes, que visem causar menos
danos ao ambiente e a saúde humana. (MOREIRA et al., 2004). Dentre os agentes
terapêuticos provenientes das plantas com uso medicinal popular e científico, destacam-se os
óleos essenciais. (COSTA et al., 2008)
Trabalhos desenvolvidos com óleos essenciais, obtidos a partir de plantas
medicinais têm indicado atividade no controle de fitopatógenos, substituindo o uso de
pesticidas que em longo prazo causam impactos negativos para a sociedade e para o meio
ambiente devido à poluição causada pelos resíduos químicos dos mesmos (MOREIRA et al.,
2004). Alguns exemplos são o óleo essencial extraído de Caesulia axillaris com desempenho
superior a oito fungicidas sintéticos e eficácia no controle da mancha foliar do arroz, causada
por Helminthosporium oryzae (AMADIOHA, 2000) e o óleo de Piper aduncum com
comprovada ação inibitória contra vários fitopatógenos destre eles Crinipellis perniciosa,
Phytophthora palmivora e Phytophthora capsici. (BASTOS & SILVA, 2002)
Muitas das espécies de Piper são usadas para fins curativos por diversas culturas,
tendo a sua constituição sido composta por amidas insaturadas, flavonóides, lignanas,
aristolactamas, ésteres, de cadeias longas e curtas, terpenos, esteróides, propenilfenois e
alcalóides (PARMAR et al., 1997). O óleo essencial das folhas de P. hispidum possui como
principais componentes α-canfeno guaiene e γ-elemeno (FACUNDO et al., 1994). As folhas
de P. amalago são utilizadas no México e no Brasil para aliviar dores estomacais e no
combate a diversas infecções. No estado da Paraíba folhas e talos de P. marginatum e P.
13
tuberculatum são utilizados contra picada de cobra e como sedativos (GUIMARÃES &
GIORDANO, 2004). Na China, algumas prescrições recomendam o uso das folhas de Piper
futokasura no tratamento de arritmias cardíacas e da asma. Infusões das folhas de P. aduncum
e P. hispidum são utilizadas na Jamaica para o tratamento de dores estomacais. (PARMAR et
al. 1997). A espécie Piper aleyreanum, é muito usada por populações tradicionais e indígenas
da região Amazônica, devido suas propriedades anestésica no alívio de dores (JOLY, 1998).
Piper carniconnectivum é uma espécie encontrada na Amazônia, na região norte do Brasil
sendo útil como bioprodutora de óleo essencial. (RIBEIRO et al, 1999)
A ação antimicrobiana dos óleos essenciais, tanto in vitro como in vivo, tem
justificado a investigação sobre a medicina tradicional centrada na caracterização de sua
atividade antimicrobiana. (AGARWAL et al., 2010)
Os antifúngicos podem ser agrupados em três classes baseados no seu ponto de
ação, inibidores da síntese do ergosterol (o principal esterol de fungos); polienos, que
interagem fisicoquimicamente com os esteróis de membrana e inibidores da síntese de
proteína (ARTHINGTON-SKAGGS et al., 1999). Óleos essenciais são relatados como
inibidores da síntese de ergosterol. (BARBOSA, 2010)
Neste trabalho foi avaliada a atividade antifúngica dos óleos essenciais P.
marginatum Jacq, P. aleyreanum C.DC., P. dilatatum L. C. Rich., P. aduncum L. e P.
alatabaccum Trel & Yuncker contra cepas de Candida spp, isoladas no Ceará.
14
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 PLANTAS MEDICINAIS E O GÊNERO PIPER: BREVE HISTÓRICO E
PERSPECTIVAS
Iniciada antes da medicina moderna, a medicina tradicional é definida pela
Organização Mundial da Saúde (OMS) como sendo a soma de todos os conhecimentos
teóricos e práticos, explicáveis ou não, utilizados para diagnóstico, prevenção e tratamentos
físicos, mentais ou sociais, baseados exclusivamente na experiência e observação e
transmitidos verbalmente ou por escrito de uma geração a outra. (PEREIRA, OLIVEIRA,
LEMOS, 2004)
As plantas medicinais têm sido utilizadas por milhares de anos como tratamento
alternativo para a cura de diversos males. A maioria da população dos países em
desenvolvimento ainda utiliza as plantas medicinais como principal fonte para suprir as suas
necessidades medicamentosas. Mesmo em países industrializados, uma grande percentagem
dos produtos farmacêuticos comercializados provém de produtos naturais e essa proporção
eleva-se em regiões do mundo, como Ásia, África e América Latina, onde vive a maior parte
da população mundial. (PIMENTA, 2008)
Em 1913 a “Flora Médica Brasiliense”, ressalta a importância de serem estudadas,
metódica e cientificamente, as plantas da Amazônia num trabalho conjunto de botânicos,
químicos, biólogos, farmacólogos e clínicos. (MATTA, 1913)
No entanto, a atividade antimicrobiana das plantas começou a ser estudada
somente na década de 1940 quando Osborn (1943), pesquisando a atividade, in vitro, de 2.300
plantas superiores, contra Staphylococcus aureus e Escherichia coli, verificou que 63 gêneros
continham substâncias que inibiram o crescimento de um ou de ambos os microrganismos.
(SARTORI, 2005)
Bastos (1997) justificou que o óleo essencial das folhas de P. aduncum foi efetivo
sobre a germinação de basidiósporos e crescimento micelial de Crinipellis perniciosa.
Atualmente as espécies de Piper são classificadas como grandes produtoras de óleos
essenciais. (SILVA & BASTOS 2007)
A família Piperaceae é classificada entre as mais primitivas famílias entre as
angiospermas e compreende aproximadamente três mil espécies distribuídas em oito gêneros
(DI STASI et al.,2002), dos quais se destacam os gêneros Piper, Peperomia e Pothormorphe.
15
O gênero Piper possui por volta de 700 espécies distribuídas em todas as regiões tropicais do
mundo. (SILVA & BASTOS, 2007)
No Brasil, ocorrem cerca de 266 espécies do gênero Piper, das quais 13 espécies e
4 variedades foram descritas apenas no estado do Ceará, embora praticamente todas também
ocorram em outros estados nacionais. Da Amazônia, várias espécies já foram estudadas como
P. belte, P. nigrum, P. amapaense, P. duckei, P. bartlingianum e P. arboreum (GUIMARÃES
& GIORDANO, 2004). O quadro 1 sumariza a ocorrência e as principais atividades
medicinais das diversas espécies do gênero Piper nos estados brasileiros. A maioria das
espécies deste gênero não tem valor econômico, embora apresentem uma grande importância
ecológica dentro do seu habitat natural, principalmente nas florestas úmidas. As folhas das
plantas do gênero Piper servem de alimento para uma série de insetos herbívoros, enquanto
que os frutos amadurecidos nutrem uma variedade de animais frugívoros, por exemplo,
morcegos e pássaros (DYER et al., 2004). No entanto, algumas plantas do gênero Piper são
economicamente muito importantes. Um exemplo é a espécie P. methysticum cujas raízes são
fontes de “kawa”, substância da classe das kavapironas, usada tradicionalmente na Polinésia
como uma bebida narcótica, hoje, esta planta é de interesse para as indústrias na formulação
de sedativos. Outras espécies complacentes como P. cubeba, P. longum e P. auritum são
usadas localmente como condimentos ou medicinais. (DYER et al., 2004).
Em trabalho realizado com treze plantas utilizadas na medicina popular para o
tratamento de doenças infecciosas P. regnellii apresentou atividade frente a Candida krusei e
C. tropicalis.(PESSINI, et al., 2003). Segundo Silva e Bastos (2007) óleos essenciais de P.
callosum, P. marginatum var. anisatum, P. callosum e P. ebnckea também apresentaram
excelente atividade frente C. perniciosa.
Os óleos essenciais constituem os elementos voláteis contidos em muitos órgãos
vegetais e estão relacionados com funções necessárias à sobrevivência vegetal, exercendo
papel fundamental na defesa contra microrganismos. (SIQUI et al., 2000)
Praticamente todos os óleos essenciais constituem uma mistura de princípios
químicos, muito complexa e variam amplamente em sua composição, sendo a maior parte
constituída principalmente de terpenos (MATOS et al., 1989). Devido a sua composição
variada, os óleos essenciais demonstram uma variedade de ações farmacológicas, tornando-os
potenciais fontes para o desenvolvimento de novas drogas. (AMARAL, 2004)
Nos últimos anos a atividade antifúngica de óleos essenciais tem sido relatada
para diversas espécies, envolvendo principalmente as famílias Lamiaceae, Asteraceae,
Verbenaceae, Rutaceae, Lauraceae e Cupressaceae (ABAD et al., 2007). Na região
16
Amazônica, tem-se uma das maiores biodiversidades, com um número satisfatório de óleos
essenciais e extratos utilizados, popularmente, no tratamento de infecções fúngicas. Dentre as
diversas espécies merecem destaque Piper aduncum (pimenta-de-macaco) e Piper
hispidinervum (pimenta longa) (MENEZES, et al., 2009).
Neste trabalho foram utilizados os óleos essenciais de Piper spp. para
determinação de sua atividade antifúngica.
17
Quadro 1. Distribuição geográfica de espécies de Piper nos estados brasileiros e as principais indicações na medicina popular.
Espécies
Piper aduncum L.
Piper amalago (Jacq.)
Yunck.
Piper arboreum Yunck.
Distribuição Geográfica
Amazonas, Amapá, Pará,
Mato Grosso, Ceará, Bahia,
Minas Gerais, Espírito Santo,
Rio de Janeiro, São Paulo e
Paraná
Ceará, Pernambuco, Bahia,
Minas Gerais, Rio de
Janeiro,
São Paulo, Paraná, Santa
Catarina, Rio Grande do Sul
e Mato Grosso
Amazonas,
Ceará,
Pernambuco, Bahia, Rio de
Janeiro, São Paulo, Paraná,
Santa Catarina, Rio Grande
do Sul e Mato Grosso
Propriedades medicinais
Referências
As folhas são utilizadas sob a forma de chá SOUZA, 2008
contra apatia intestinal e males estomacais.
São adstringentes e diuréticos, sendo um
hemostático poderoso usados em feridas,
úlceras e leucorréias. Suas espigas curvas e
aromáticas contêm taninos, essências e
resinas. A infusão das folhas é usada como
estomáquica, balsâmica, adstrigente e
desobstruente do fígado.
Suas folhas são usadas sob a forma de
cataplasmas ou, através do cozimento, são PISSINATE, 2006
empregadas em banhos ou chás, devido suas
propriedades sudoríferas acentuadas. São
úteis ainda para os males do estômago. Os
frutos são estimulantes além de serem
usados para o tratamento das cardialgias, no
tratamento de reumatismos.
Sob a forma de chá e banhos aromáticos é a
planta
usada
contra
reumatismos, SILVA, 2002
bronquites, resfriados e gripes fortes, sendo
ainda carminativa e emoliente. As folhas
tem óleo de sabor picante, com aroma
semelhante ao do hortelã-pimenta, sendo
empregadas como sudoríficas e afrodisíacas.
Também são utilizadas nas dores de
18
Piper bartlingianum Miq.
Piper carniconectivum L.
Piper cernuum Vell.
Piper crassinervium
Kunth
Piper dilatatum Rich.
Piper divaricatum G.
Mey.
Amazonas, Amapá,
Ceará
Amazonas, Rondônia
garganta e dentes.
Pará, Não descritas
Amazonas, Ceará, Bahia,
Minas
Gerais,
Espírito
Santo, Rio de Janeiro, São
Paulo, Paraná e Santa
Catarina
Amazonas, Ceará, Minas
Gerais, Rio de Janeiro, São
Paulo, Paraná e Santa
Catarina
Amazonas, Amapá, Pará,
Maranhão,
Pernambuco,
Bahia, Minas Gerais, São
Paulo, Paraná, Santa Catarina
e Mato Grosso
Amazonas, Amapá, Pará,
Ceará, Pernambuco, Bahia,
Minas
Gerais,
Espírito
Santo, Rio de Janeiro e Mato
GUIMARÃES &
GIORDANO, 2004
Usado na medicina popular. Bioprodutor de FACUNDO, 2006
óleo essencial.
O suco das espigas, em aguardente, é de uso GUIMARÃES &
interno contra mordedura de cobra e o GIORDANO, 2004
bagaço misturado com raízes pode ser
aplicado sobre o ferimento produzido pelo
animal. A raiz é considerada um
medicamento sialagogo e diurético. O pó
resultante das espigas secas é útil para
tratamento de gonorréias crônicas e
leucorréias.
Não descritas
GUIMARÃES &
GIORDANO, 2004
Antiinflamatória e cicatrizante
SANTOS, 2001
BASTOS, 2007
A raiz é aromática, de sabor forte, PISSINATE, 2006
semelhante ao do gengibre. As folhas e as
raízes, quando em infusão, são empregadas
internamente contra dores reumáticas e
19
Grosso
Piper hispidum Sw.
Piper marginatum Jacq.
Piper rufipilum Yunck.
Piper tuberculatum Jacq.
cólicas, e, quando cozidas, são utilizadas sob
a forma de banhos antireumáticos.
Amazonas, Pará, Ceará,
As folhas, as raízes e os frutos são
Pernambuco, Bahia, Rio de
adstrigentes, diuréticos e estimulantes, PISSINATE, 2006
Janeiro,
Paraná,
Santa empregados como desobstruentes do fígado.
Catarina e Mato Grosso
Também é utilizada para deter hemorragias
traumáticas. As folhas são utilizadas sob a
forma de banhos contra as hemorróidas,
reumatismos e desinterias, quandofrescas
são usadas como emplastros em hernia de
umbigo de crianças, tendo o mesmo uso no
estado seco e reduzido a pó, sendo ainda
consideradas hemostáticas. Os frutos são
antiblenorrágicos.
Amazonas, Pará, Ceará, Também é usada sob a forma de chá,
ALMEIDA, 2008
Paraíba e Pernambuco
considerada antiespasmódica para afecções
do fígado e do baço; segundo os índios
quando amassadas, são utilizadas para
aliviar coceiras das picadas de insetos.
Endêmica no estado do Ceará
Amazonas, Pará, Maranhão,
Piauí,
Ceará,
Paraíba,
Pernambuco, Rio de Janeiro
e Mato Grosso
Não descritas
YUNCKER, 1966
No Ceará é conhecida como pimenta-de- NAVICKIEN, 2000
macaco ou pimenta-longa, considerada
planta medicinal como estimulante e
carminativa.
20
2.2
ESTUDOS QUÍMICOS E BIOLÓGICOS
ESTUDADAS NESTA DISSERTAÇÃO
DAS
ESPÉCIES
DE
PIPER
2.2.1 P. marginatum Jacq
Fonte: www.discoverlife.org
Figura 1. Foto das folhas de P. marginatum
P. marginatum é conhecida popularmente como caapeba cheirosa ou malvarisco.
As folhas são utilizadas na forma de infusão da raiz e da folha para o tratamento de dores em
geral, febre, gases, blenorragia, afecções do fígado e antídoto contra picada de cobra. Seus
frutos são usados como substitutos da pimenta-do-reino, utilizando-os como condimento
(ALMEIDA, 2008). Já foram isolados das raízes de P. marginatum l, 2-metoxi-4,5metilenodioxipropifenol e (E,E)-N-isobutil-2,4-octadienamida. A partir do extrato hexanico
dessa espécie foram isolados: 1-(1-Z-propenil)-2,4,6-trimetoxibenzeno e ácido 3-farnesil-4hidroxibenzoico e do extrato clorofórmico foi isolado óxido cariofileno (fig.2) (CHAVES,
2002). Em um recente estudo de populações de P. marginatum de vários ecossistemas da
Amazônia brasileira, (ANDRADE., et al. 2008) foi descrito sete quimiotipos com base nas
diferenças da composição do óleo das folhas.
21
O
CH3
H
CH3
H2C
H
CH3
Figura 2. Estrutura química do Óxido de cariofileno
2.2.2 P. aleyreanum C.DC
A espécie P. aleyreanum é conhecida pelas populações indígenas como “pani
nixpu” sendo utilizada para a saúde dos dentes; os “Kaxinawá” dizem que seu sumo os
fortalece e protege (MCCALLUM, 1996). Em estudo realizado sobre a composição química
das folhas dessa espécie por FACUNDO & MORAIS (2003) foram relatados para a mesma
como componentes majoritários galangina, 2- metoxi-4,5-metilenodioxipropifenol e
sitosterol, sendo este o primeiro relato da ocorrência de galangina no gênero Piper; Galangina
foi previamenteisolado de brotos de Populus nigra (EGGER et al., 1969) e de folhas de
Castanea sativa (BASILE et al., 2000). β-pineno, isocaryophylleno (fig.3) e β-cariofileno
também já foram encontrados na composição química do óleo essencial de P. aleyreanum
(FACUNDO, 2007). Não foram encontrados outros relatos na literatura para P. aleyreanum
CH3
HO
H3C
CH2
Figura 3. Estrutura química do Isocariofileno
2.2.3 P. dilatatum Rich
Piper dilatatum é um arbusto de 1-2 m de altura, conhecida popularmente como
pariparoba-murta e pau-de-junta suas folhas têm ação antiinflamatória e cicatrizante,
aliviando crises de bronquite e asma, úlceras, reumatismos e hemorróidas, e suas raízes são
usadas no tratamento de odontalgias. Em estudo comparando a atividade fungitóxica de óleo
22
essencial de 10 espécies de Piper coletadas na região Amazônica, sobre o crescimento
micelial e a germinação de basidiósporos de Crinipellis perniciosa e sobre o crescimento
micelial de Phytophthora palmivora e P. capsici o óleo de P. dilatatum foi o mais eficiente.
Na composição do óleo essencial de P.dilatatum já foi relatada a presença de cis-β-ocimeno,
β-cariofileno, germacreno D, espatulenol (fig.4) e óxido de cariofileno (fig.2) (BASTOS
2007, SANTOS, 2001).
CH2
H
CH3
OH
H3C CH3
Figura 4. Estrutura química do Espatulenol
Fonte: floradobrasil.jbrj.gov.br
Figura 5. Fotografia das folhas de P. dilatatum
23
2.2.4 P. aduncum
É um arbusto de ampla distribuição tropical, com ocorrência em solos arenoargilosos, conhecido popularmente como “pimenta-de-macaco” e “aperta-ruão”. Esta espécie
é considerada uma planta oportunista que invade áreas desflorestadas após exploração de
madeira, de alta rusticidade e elevada resistência às mudanças climáticas. O uso medicinal de
“pimenta-de-macaco” tem sido relatado: em doenças ginecológicas e desordens intestinais
(SOUZA, 2008), como diurético, antiblenorrágico, carminativo, excitante digestivo, para
males do fígado, no combate a erisipela e tratamento de ulceras crônicas (COIMBRA, 1994).
Extratos orgânicos das folhas de P. aduncum apresentaram atividades moluscicida, citotóxica
e antibacteriana, para as quais se associou a presença de dihidrochalconas e derivados
prenilados do ácido benzóico (ORJALA et al., 1993 & 1994).
Fonte: botanical.com
Figura 6. Folhas de P. aduncum
O óleo essencial de P. aduncum foi testado contra o fungo Clinipellis perniciosa,
conhecido como “vassoura-de-bruxa”, responsável por ataque patogênico ao cacau e cupuaçu.
Na concentração de 50 a 100 ppm inibiu 100% o crescimento e a germinação deste fungo
(BASTOS, 1997). O óleo essencial de P. aduncum apresentou atividade inseticida e larvicida
contra insetos fitófagos e mosquitos transmissores de dengue e malária, eliminando-os
24
totalmente em baixas concentrações (SOUTO, 2006). Em sua composição química estão
Dilapiol, piperitona, terpinen-4-ol e ϒ-terpineno. (MAIA, 2000)
2.2.5 P. alatabaccum Trel & Yuncker
P. alatabaccum Trel & Yuncker (Piperaceae), conhecida pelo nome vernáculo
''João brandinho'', é uma espécie que ocorre na região amazônica no norte do Brasil
(RIBEIRO
et
al.,
1999).
Na
composição
dessa
espécie
estão
N-(3’,4’,5’-
trimethoxydihydrocinnamoyl-D3-pyridin-2-one, Piplartine, N-(3’,4’,5’-trimethoxycinnamoylD3-
pyridin-2-one,
Piperovatine
(N-isobutil-6-p-methoxyphenylsorbamide)
e
5,5’,7-
trimethoxy-3’,4’-methylenedioxyflavone. Este é o primeiro relato de 5,5’,7-Trimethoxy-3’,4’methylenedioxyflavone no gênero Piper (FACUNDO et al., 2003). Não foram encontrados
na literatura outros relatos para P. alatabaccum.
2.3 FUNGOS E SUA IMPORTÂNCIA NA MEDICINA VETERINÁRIA
Os fungos apresentam semelhança às células hospedeiras, sendo assim, a
elaboração de estratégias terapêuticas específicas dirigidas contra o parasita e atóxicas para o
hospedeiro se tornam difíceis. Os mesmos são eucarióticos, com núcleo bem definido
circundado por uma membrana nuclear; uma membrana celular que contém lipídeos,
glicoproteínas e esteróis; parede celular; mitocôndrias; aparelho de Golgi; ribossomos ligados
ao retículo endoplasmático e um citoesqueleto constituído por microtúbulos, microfilamentos
e filamentos intermediários. (SCHAECHTER et al., 2002). De acordo com sua morfologia os
fungos podem ser classificados em filamentosos, leveduras e dimórficos. (SIDRIM &
ROCHA, 2004)
As micoses podem ser classificadas, segundo os tecidos e órgãos atingidos em:
micoses superficiais, de localização nas camadas mais superficiais da pele ou dos pêlos;
micoses cutâneas ou dermatomicoses, localizadas na pele, no pêlo ou nas unhas; micoses
subcutâneas; micoses sistêmicas ou profundas atingindo, principalmente, órgãos internos e
vísceras, e as micoses oportunistas que atingem os pacientes imunocomprometidos por
doença de base, como câncer, diabetes, ou aqueles que são submetidos a tratamentos com uso
de corticoidoterapia, imunossupressores e antibioticoterapia. (TRABULSI et al., 2004)
25
As dermatofitoses são micoses superficiais que se localizam nas zonas planas e
intertriginosas da pele (LACAZ et al., 2002), e são produzidas por fungos especializados,
denominados dermatófitos, os quais têm a habilidade de degradar a queratina e transformá-la
em material nutritivo para seu crescimento (SIDRIM & ROCHA, 2004). No Ceará, as
espécies mais envolvidas em dermatofitoses são o T. rubrum seguido pelo T. tonsurans, M.
canis, T. mentagrophytes e E. floccosum. (BRILHANTE et al., 2000)
As enfermidades micóticas têm importância distinta dentro das enfermidades
veterinárias devido ao seu potencial zoonótico (NAKAMURA et al., 1999).O sucesso no
tratamento pode estar relacionado ao conhecimento do patógeno, e por conseqüência, do seu
perfil ecológico. (VIEIRA, 2009)
Fungos leveduriformes possuem importância veterinária, como espécies dos
gêneros Candida e Malassezia. O gênero Candida é composto por fungos leveduriformes
hialinos, que apresentam duas formas de reprodução: assexuada ou anamorfa e sexuada ou
teleomorfa. Taxonomicamente são enquadradas dentro do grupo dos ascomicetos, visto que, a
reprodução sexuada é caracterizada pela produção de ascos. (SIDRIM & ROCHA, 2004)
As espécies de Candida apresentam colônias de coloração branca, superfície lisa
ou levemente rugosa e textura glabrosa úmida (MORETTI et al., 2004), que crescem bem
dentro de 48 horas, entre temperaturas de 25 e 37°C (SIDRIM & ROCHA, 2004).
Fonte: NASCIMENTO, 2011
Figura 7. Colônia de coloração branca, superfície lisa, textura glabrosa úmida, característica
das espécies de Candida
Com relação à microscopia, lâminas preparadas diretamente a partir de um
fragmento da colônia ou de uma amostra clínica positiva, permitem a visualização apenas de
estruturas unicelulares, denominadas blastoconídeos, que podem estar isoladas ou
26
apresentando brotamento. Desta forma, torna-se necessário a realização de microcultivo em
placa de Petri, para melhor visualização da disposição das estruturas fúngicas típicas de cada
espécie, sendo este, na maioria das vezes, suficiente para identificar o microrganismo.
(MORETTI et al., 2004)
Fonte: BRITO, 2005.
Figura 8. Micromorfologia mostrando clamidoconídios de Candida albicans
Candida albicans causa 50–60% das todas as candidemias diagnosticadas seguida
de C. parapsilosis (10-20%) e C. tropicalis (6-7%). Infecções da corrente sanguínea por
Candida spp. apresentam uma mortalidade elevada e são responsáveis pelo aumento dos
custos hospitalares. (ALFONSO et al., 2010)
Infecções em animais causadas por Candida spp. são freqüentes (MULLER et al.,
2002) e no Brasil a presença de C. albicans foi detectada em bovinos com otite (DUARTE et
al., 2001) e em casos de dermatomicoses em cães (RAPOSO et al., 1996). Além de C.
albicans, as espécies mais prevalentes são C. parapsilosis e C. guilliermondii, tendo sido
relatadas como responsáveis por dermatomicoses em cães. (MULLER et al., 2002)
Candida spp. é um habitante normal do trato gastrintestinal das aves, sendo a
espécie mais comumente isolada nesses animais. Entretanto o desequilíbrio populacional
dessas leveduras leva ao aparecimento de problemas no sistema digestivo, podendo infectar
também o sistema reprodutivo, olhos e tornar-se sistêmica. (GODOY, 2001).
A candidíase em aves apresenta como sintomatologia dispnéia, anorexia,
prostração, regurgitação, vômito, diarréia, perda de peso, inglúvio dilatado, esofagite e
27
espessamento da parede do esôfago. Casos raros e graves podem provocar deformidades no
bico. (BRAGA et al., 2007).
A história natural das doenças causadas por leveduras é mais bem compreendida à
luz da susceptibilidade do hospedeiro. O indivíduo normal apresenta mecanismos de defesa
inespecíficos e específicos, tais como barreiras anatômicas e fisiológicas, resposta
inflamatória e resposta imunológica, que, juntos, representam obstáculo ao estabelecimento da
infecção fúngica. (VIEIRA, 2009)
2.4 MÉTODOS DE ESTUDO DA ATIVIDADE ANTIFÚNGICA IN VITRO
A fim de determinar a potência de um antibiótico em solução, sua concentração
em líquidos e tecidos corporais e a sensibilidade de um determinado microrganismo a
concentrações conhecidas deste antibiótico a atividade antifúngica é medida in vitro.
(JAWETZ et al., 2005)
O Clinical Latoratory Standards Institute (CLSI, anteriormente denominado
National Committee for Clinical Laboratory Standards - NCCLS) nos Estados Unidos é a
entidade responsável pela normatização de técnicas de laboratório clínico que padronizou os
testes de sensibilidade de fungos para drogas antimicóticas, definindo variáveis como método
e preparação de inóculo, composição e pH do meio a ser utilizado, temperatura e tempo de
incubação e determinação dos critérios de leitura do teste. (VIEIRA, 2009)
O primeiro método padronizado pelo CLSI (1992) foi a macrodiluição em caldo,
porém, por tratar-se de método laborioso e de difícil execução em laboratórios de rotina,
houve a busca de métodos alternativos. Entre os mais estudados, citam-se a microdiluição em
caldo com bons resultados e, mais recentemente, o Etest.
Fonte: NASCIMENTO, 2011
Figura 9. Placa de 96 poços e pipeta multicanal utilizadas na microdiluição em caldo
28
A microdiluição em placa, realizada segundo parâmetros do CLSI, além da maior
facilidade na sua execução, permite a análise de grande número de amostras, com economia
de material. (SIDRIM & ROCHA, 2004)
Outros procedimentos, tais como o método de difusão em cavidade ágar, apesar
de não ser padronizado pelo CLSI, possibilita análises qualitativas, permitindo-se fazer uma
comparação da eficiência da droga testada com outra droga utilizada como referência. Estudos
posteriores são necessários para determinação da concentração inibitória mínima (MIC) in
vitro, para que seja possível correlacionar com resultados in vivo.
29
3 JUSTIFICATIVA
O aumento da incidência de infecções causadas por fungos nas clinicas veterinárias,
juntamente com a resistência que estes agentes têm desenvolvido aos antimicrobianos, tem
levado a uma busca constante por alternativas terapêuticas eficazes que possam oferecer
melhores opções de tratamento. No Norte e Nordeste do Brasil varias plantas são utilizadas
pela população para o tratamento de diversas enfermidades, principalmente em locais mais
carentes. Para o seu uso em larga escala, no entanto, estudos que comprovem essas atividades
fazem-se necessários. Deste modo, um estudo detalhado a cerca da atividade antifúngica dos
óleos essenciais de espécies do gênero Piper entre essas, P. marginatum Jacq, P. aleyreanum
C.DC., P. dilatatum L. C. Rich., P. aduncum L. e P. alatabaccum Trel & Yuncker é
importante para sua validação como prováveis substâncias com atividade contra fungos
frequentemente isolados de animais em clinicas veterinárias.
30
4 HIPÓTESE CIENTÍFICA
Os óleos essenciais de P. marginatum Jacq, P. aleyreanum C.DC., P. dilatatum L.
C. Rich., P. aduncum L. e P. alatabaccum Trel & Yuncker possuem atividade contra cepas de
Candida spp.
31
5 OBJETIVOS
5.1 OBJETIVO GERAL
Determinar a constituição química e avaliar a atividade antifúngica in vitro dos
óleos essenciais de Piper da Amazônia Brasileira contra cepas de Candida spp, isoladas no
Ceará.
5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Determinar a composição química dos óleos essenciais de P. marginatum, P.
aleyreanum, P. dilatatum, P. aduncum e P. alatabaccum por cromatografia gasosa
acoplada a espectrometria de massa.

Avaliar a atividade antifúngica dos óleos essenciais de P. marginatum, P. aleyreanum,
P. dilatatum, P. aduncum e P. alatabaccum pelo método de microdiluição em caldo
contra fungos do gênero Candida.
32
6 CAPÍTULO 1
Composição química e efeito anticandida de óleos essenciais de Piper spp.
da Amazônia Brasileira
Chemical composition and anticandidal effect of essential oils of Piper spp. from
Brazilian Amazon
Periódico: Journal of Ethnopharmacology (Submetido em 18 de Novembro de 2011)
33
Resumo
O gênero Piper tem 170 espécies no Brasil, a maioria contem terpenos e compostos fenólicos
com atividade antimicrobiana. Folhas das espécies Piper marginatum, P. aleyreanum, P.
dilatatum, P. aduncum e P. alatabaccum foram coletados na floresta amazônica para a
avaliação da atividade antifúngica contra nove cepas de Candida spp., incluindo três cepas
isoladas do sangue com MIC’s elevados para o fluconazol. As cepas foram identificadas em
CHROMagar. Os óleos essenciais foram testados na faixa de 10 a 0,015 mg/mL pelo método
de microdiluição em caldo de acordo com o protocolo M27-A3. As cepas de C. parapsilosis
ATCC 22019 e ATCC 6258 foram utilizadas como controle. Os principais componentes para
P. marginatum foram: α-copaeno e 3,4-(methylenedioxy) propiophenone, para P.
aleyreanum: E-cariofileno e óxido de cariofileno, para P. dilatatum: α-copaeno, óxido de
cariofileno, metil linoleato e metil octadecanoato, por P. alatabaccum: E-cariofileno,
spathulenol, metil linoleato e metil octadecanoate e para P. aduncum: trans-isocrowecin, dill
apiol e cis-isoelemicin. P. dilatatum foi o mais ativo com MIC50 de 0,65 ± 0,39 mg / mL. Os
outros óleos mostraram MIC50 variando de 1,55 ± 0,77-2,10 ± 0,75 mg / mL, demonstrando a
importância dos óleos essenciais de Piper como alternativas naturais para o tratamento de
infecções causadas por Candida spp.
34
Chemical composition and anticandidal effect of essential oils of Piper spp. from
Brazilian Amazon
Kaline de M. Nascimentoa,b, Valdir A. Facundo c, Laudir G. Ballicoc, Daniella Karini S. Limac,
Bruno C. Cavalcantie, Daniel P. Bezerraf, Manoel O. de Moraese, Cecília R. da Silvad,
Hemerson Iury F. Magalhãesd, Hélio V. Nobre Júniord, Selene M. de Moraisa,b,*
a
Course of Chemistry, Ceará State University, Fortaleza, Ceará, Brazil.
b
Veterinary Science Post Graduation Programam, Ceará State University, Fortaleza, Ceará,
Brazil.
c
Department of Chemistry, Federal University of Rondônia
d
Laboratory of Bioprospection and Experiments in Yeast (LABEL) Department of Clinical
and Toxicological Analysis, College of Pharmacy, Federal University of Ceará.
e
Department of Physiology and Pharmacology, Federal University of Ceará, Fortaleza, CE,
Brazil.
f
Department of Physiology, Federal University of Sergipe, Aracaju, SE, Brazil;
*Corresponding author at: Course of Chemistry, Avenida Parajana 1700, Campus do Itaperi,
60740-000 Fortaleza, Ce, Brazil. Tel: +55 85 31019933.
E-mail address:[email protected](S.M. de Morais)
35
1. Introduction
The Piperaceae family out stands among the biodiversity of the Amazon forest with
mainly a pantropical distribution, comprising twelve genera and 1400 species. The genus
Piper is the largest Family with 700 species. Among them are 170 species, which occur in
Brazil. Most species are fast growing and popularly used as antiseptic, insecticidal and
antimicrobial agents (Fazolin et al., 2007, Duarte et al., 2007). In the Amazon Rainforest,
many of the native tribes use P. aduncum (matico) leaves as an antiseptic and wound healing.
In Peru, it was used for stopping hemorrhages and treating ulcers, and in European practice in
the treatment of diseases of the genitals and urinary organs and for treatment of haemostasis
and dysentery in Colombian ethnobotany (Rali et al., 2007). Piper marginatum is reputed in
the Brazilian folk medicine for its analgesic / antiinflammatory, hemostatic and skin woundhealing properties (D’Angelo et al., 1997).
Chemical studies showed that the genus Piper has many components, including
unsaturated amides, flavonoids, lignans, aristolactams, long and short chain esters, essential
oils, steroids and alkaloids (Facundo et al., 2005). The antimicrobial activity of essential
oils, both in vitro and in vivo, has justified the research on these plant components for
microbial infections (Agarwal et al., 2010)
Candidiasis is present in humans and animals and can affect mucous membranes and
mucocutaneous junctions or places where humidity is persistent. It causes papular, pustular
dermatitis or ulcerative and as well exudative external otitis. Candida albicans is yeast found
in mucocutaneous regions, genital and digestive tract of mammals and birds, being an
opportunistic pathogen producing more frequently stomatitis and vaginitis, but it could reach
the skin, fingernails, respiratory tract and lead to septicemia, depending on the degree of
immunosuppression of the individual. In dogs, candidiasis can also present as septicemia with
36
lesions in the muscles, bones and skin and is caused by various species of Candida (Raposo et
al., 1996). Candida albicans causes 50-60% of all diagnosed candidemia followed by
C. parapsilosis (10-20%) and C. tropicalis (6.7%). Bloodstream infections by Candida spp.
have a high mortality and are responsible for increasing hospital costs (Alfonso et al., 2010).
The systemic antifungal drugs are very limited in number and, moreover, have side effects
that may difficult its use, then, the discovery of new antifungal drugs should be pursued
continuously (Dolan et al., 2009).
Essential oil from plants are targets for achieving this goal, therefore this study was
designed to evaluate the antifungal activity of essential oils from Piper species of the
Brazilian Amazon forest against strains of Candida spp to justify its popular use in microbial
infection diseases.
2. Materials and methods
2.1. Plant materials and isolation of essential oil
The leaves of the species P. marginatum Jacq, P. aleyreanum C.DC., P. dilatatum L. C.
Rich., P. aduncum L. and P. alatabaccum Trel & Yuncker were collected between nine and
eleven hours of january 2010, from a native population in an area of abandoned pasture,
starting the regeneration of the forest, located 15 km from the capital Porto Velho, Rondonia.
The botanical identifications were made by botanist Dr. José Gomes from the herbarium of
the National Institute for Amazon Research, where a voucher specimen is stored under the
numbers 223344 for P. marginatum, 223303 for P. aleyreanum, 211724 for P. dilatatum,
221713 for P. aduncum and 211711 for P. alatabaccum. Essential oils (EO) were extracted
from fresh leaves by hydrodistillation for four hours in a Clevenger type apparatus. The oil
37
was dried over anhydrous sodium sulfate and, after filtration, stored at 4ºC until analysis.
2.2. Identification of essential oil components
The EO was analyzed by gas chromatography / mass spectrometry (GC/MS) to identify
their components. GC/MS was performed using a Hewlett-Packard 5971 instrument
employing C; the following conditions: column (30 m x 0,25 mm); carrier gas: He (1
mL/min); injector temperature: 250ºC; detector temperature: 200ºC; column temperature: 35180°C at 4ºC/min then 180-250ºC at 10ºC/min; mass spectra: electron impact 70 eV.
Identification of the chemical components was based on the comparison of their mass spectral
with the National Institute for Standard Technology – NIST62 library, comparison of
calculated retention indexes with literature values as described by Adams (2007).
2.3 Determination of anticandidal activity
Nine strains of Candida spp. were selected for testing (1 C. albicans, 3 C. tropicalis
and 5 C. parapsilosis), 3 of which were resistant to fluconazole. These strains are the most
commonly isolated from fungal infections in Ceará State, Northeastern Brazil. The strains
were isolated from blood samples between 2009 and 2010 and belong to the Collection of
Yeasts of LABEL / FF / UFC (Laboratory of Bioprospection and Experiments in Yeast,
Faculty of Pharmacy, Federal University of Ceará). Strains were inoculated on potato
agar (HiMed Mumbai-India) and incubated at 37 °C/24 h. They were then plated on
CHROMagar Candida (HiMed Mumbai-India) to assess purity. The identification was made
by micromorphology on rice agar Tween 80, germ tube production, fermentation and
assimilation of carbohydrates as well as molecular tests. (Medrano et al., 2006; Menezes et
al., 2009)
38
Susceptibility tests of Candida spp. essential oils were performed according to protocol
M27-A3 by the method of microdilution in RPMI medium (pH 7.0) buffered with MOPS in
96-well plates. Each essential oil was weighed (160 mg) and dissolved in 4.0 mL of DMSO.
The solution was diluted in RPMI and the concentration of DMSO was not > 1%. The range
tested was from 10 to 0.018 mg/mL. The strains were exposed to EO and incubated at
37°C/24 h. The MIC of EO was the lowest concentration that caused a reduction of 50% and
90% in of Candida spp. compared with the control. The strains C. parapsilosis ATCC 22019
and C. krusei ATCC 6258 were used as controls (CLSI, 2008a; CLSI, 2008b; Kiraz et al.,
2010). We used recently revised CLSI CBP values to identify strains of Candida resistant to
the fluconazole MIC results at > 4g/mL were defined as resistant for C. albicans, C.
parapsilosis, and C. tropicalis (Pfaller et al., 2010a,b; Pfaller et al., 2011).
2.4. Statistical analysis
The antifungal activity evaluated by broth microdilution method was expressed as mean
± SD of MIC50 and MIC90, using a GraphPrism Program. The differences among the oils were
evaluated by Tukey’s test with the significance level set at 5%. Retention indexes expressed
were calculated by linear regression using Kovat’s indexes of a hydrocarbon homologous
series, using the software Origin.
Results
Among the studied Piper species, a great diversity was found among the chemical
components. The structures of main compounds found in the oils are shown in Figure 1. For
the species P. aleyreanum, the major components were caryophyllene oxide (25.48%), Ecaryophyllene (15.11%) and limonene (6.28%). The species P. marginatum showed high
39
concentrations of 3,4-(methylenedioxy)propiophenone (27.08%), α-copaene (23.98%) and Eanethole (7.90%). For the species P. aduncum the major componentes were trans-isocrowecin
(32.02%), apiole (29.51%) and cis-isoelemicin (8.04%). The major componentes of P.
alatabaccum were methyl stearate (20.90%), methyl linoleate (17.90%), spathulenol (13.64%)
and E-caryophyllene (11.96%). For the species P. dilatatum the substances caryophyllene
oxide (22.62%), methyl stearate (19.79%) and methyl linoleate (18.31%) were the
components that prevailed as shown in Table 1.
Essential oils of Piper species from Amazon region showed the following MIC50
means: 0.37 ± 0.1 mg/mL for P. dilatatum, which was the most active when evaluated by
Tukey’s test, and 1.05 ± 0.37 mg/mL for P. marginatum, 0.81 ± 0.33 mg/mL for Piper
aleyreanum, 0.96 ± 0.7 for P. aduncum and 0.90 ± 0.45 for P. alatabacum. Besides P.
dilatatum, other essential oils did not show statistical differences in their antifungal activity
(Table 2).
3. Discussion
Candida spp. yeasts are usually isolated from biological samples and the amount of
available drugs is extremely limited. Pharmacological alternatives are needed to combat this
common infection. In addition to this, there are strains resistant to traditional antifungal
agents. Candida albicans is the major human and animal fungal pathogen and the effect of
antifungals essential oils from plants on this yeast is well known, many can be used in
conventional therapy, because the number of available antifungal agents is quite limited.
(Agarwal et al., 2010)
The epidemiology of systemic fungal infections (SFI) is changing, Candida albicans
yeast is still the most important, however, C. tropicalis, C. glabrata, C. parapsilosis and C.
krusei have been increasingly isolated and in some studies go beyond the isolation of C.
40
albicans. (Menezes, 2009; Diekma et al., 2009; Horn et al., 2009; Gomes et al., 2010;
Rodríguez et al., 2010; Sellami et al., 2011). In Ceará the Candida spp. most commonly
isolated are C. albicans, C. tropicalis and C. parapsilosis (Menezes et al., 2009; Gomes et al.,
2010; Vasconcelos et al., 2011) were then chosen to perform the tests with essential oils
of Piper spp.
The main prescription antifungals for the treatment of IFS are fluconazole and
amphotericin (Horn et al., 2009). Candida spp. resistant to fluconazole have been detected in
various parts of the world (Pfaller et al., 2008; Pfaller et al., 2010b). Fluconazole is an
inexpensive drug with few side effects used in the treatment of infections caused by Candida
spp. The antifungal resistance has been found in several studies around the world, especially
resistance to fluconazole. In this study it was used strains of Candida spp. with elevated MICs
to fluconazole.
All oils showed activity against Candida spp. Essential oils are known to contain a
cocktail of natural monoterpenes, sesquiterpenes and hydrocarbons, with a variety of
functional groups that lead to an antifungal activity as described by Moreira (2004). The Piper
species are currently classified as major producers of essential oils (Silva et al, 2007).
The studied Piper species showed a great diversity of chemical components. Among
tested oils, the statistical comparison of anticandidal activities showed P. dilatatum as the
more active (Figure 2) with MIC50 in the range of 0.15-0.60 mg/mL as displayed in Table 2.
For P. dilatatum the main constituents are α-copaene, cayophyllene oxide, methyl linoleate
and methyl stearate. Caryophyllene oxide, an oxygenated sesquiterpenoid, well known as
preservative in food, drugs and cosmetics, has been tested in vitro as an antifungal against
dermatophytes. Its antifungal activity has been compared to ciclopiroxolamine and
sulconazole, commonly used in onychomycosis treatment (Yang et al., 1999). Ten alkyl fatty
acid esters (AFAEs) were tested for in vivo antifungal activity against five plant diseases such
41
as rice blast, rice sheath blight, tomato gray mold, tomato late blight and barley powdery
mildew. Some AFAEs showed the most control efficacy against barley powdery mildew
among the tested plant diseases. Methyl and ethyl palmitates, methyl and ethyl oleates, methyl
linoleate, and methyl linolenate demonstrated both curative and protective activities against
barley powdery mildew (Choi et al., 2010). The essential oil of Piper diospyrifolium showed
as main constituent α-copaene (47.73%), nevertheless the oil did not display antifungal
activity (Morandim et al., 2010). Taking into account the above information, caryophyllene
oxide and alkyl fatty acid esters probably respond for the antifungal activity of P. dilatatum.
The major constituents of P. aduncum oil were trans-isocrowecin, dill apiole and cisisoelemicin. In the study of other Piper species made by Morandim et al. (2010), P.
solmsianum showed the best activity and the major compound was E-isoelemicin (53.45%).
Rali et al. (2007) demonstrated the insecticidal activity of dill apoile against malaria mosquito
vector. Therefore, main compounds of P. aduncum essential oil, dill apiole and E-isoelemicin,
could be responsible for its antifungal activity.
The oil of P. marginatum showed MIC50 varying between 0.30-1.25 mg/mL. The
essential oil of P. marginatum showed as main constituents alpha-copaene and 3,4(methylenedioxy) propiophenone and (E)-anethole. The antifungal activity could be related to
(E)-anethole and minor compounds α-pinene, β-pinene E-ocimene and E-caryophyllene
(Huang et al., 2010; Moreira et al, 2007).
In conclusion, the Piperaceae family presents several species from Amazon forest used
in popular medicine in diseases caused by fungi, which use can be justified by the presence of
essential oils with antifungal activity and therefore could be pointed out as therapeutic
alternatives for the treatment of fungal infections caused by Candida spp.
42
Acknowledgements
This work was supported by the National Scientific and Technological Research
Council (CNPq), the Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nivel Superior
(CAPES) and Fundação Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Científico (FUNCAP).
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47
Table I: Chemical composition of essential oils of Brazilian Amazon Piper spp. species
Concentration (% peak area)
Component
RI*
Pa
Pm
Pad
Pal
Pd
α-pinene
939
4.94
2.46
1.57
Camphene
954
1.02
Sabinene
975
0.62
β-pinene
979
4.99
2.27
1.55
Limonene
1029 6.28
β-ocimene
1050
4.27
Z-ocimenone
1229
1.88
E-ocimenone
1238
3.86
E-anethole
1285
7.9
Safrole
1287
3.29
α-cubebene
1351
5.69
α-copaene
1377 5.28
23.98
18.16
β-Bourbonene
1388 1.12
β-Elemene
1391 5.37
0.95
5.57
3,4-(methylenodioxi)-propiophenone 1404
27.08
E-Caryophyllene
1419 15.11
2.28
2.15
11.96
Aromadendrene
1441 2.20
α-Humulene
1455 2.11
0.58
Germancrene D
1485
1.04
β-selinene
1490
4.06
6.82
Valencene
1496
5.70
α-selinene
1498
0.59
Bicyclogermacrene
1500
5.82
1514 0.79
-Cadinene
Myristicin
1519
6.08
δ-Cadinene
1523 1.02
Elemol
1550
2.51
Trans-isocrowecin
1553
32.02
Cis-isoelemicin
1570
8.04
Spathulenol
1578
4.8
0.92
13.64 7.48
Caryophyllene oxide
1583 25.48
0.64
5.98 22.62
Dill apiole
1620
29.51
Methyl palmitate
1921
5.54
Methyl hexadecanoate
1922
7.95
Methyl linoleate
2096
4.50
17.90 18.31
Methyl octadecanoate
2125
20.90 19.79
*RI: Kovats indices, calculated by linear regression. Pa - Piper aleyreanum, Pm - Piper
marginatum,
Pd - Piper dilatatum, Pad - Piper aduncum, Pal - Piper alatabacum.
48
Table II: Anticandidal effect of essential oils from Piper spp after 48 hours.
Candida
FLU
(µg/ml)
MIC50 MIC90
Pm
(mg/mL)
MIC50 MIC90
Pa
(mg/mL)
MIC50 MIC90
Pd
(mg/mL)
MIC50 MIC90
C. tropicalis
1.00
2.00
-
-
-
-
-
C. tropicalis
0.50
1.00
1.25
2.50
-
-
C. tropicalis
2.00
4.00
1.25
2.50
-
C. albicans
1.00
2.00
1.25
2.50
C. parapsilosis
4.00
8.00
0.60
C. parapsilosis
4.00
8.00
C. parapsilosis
2.00
C. parapsilosis
Pad
(mg/mL)
MIC50 MIC90
Pal
(mg/mL)
MIC50 MIC90
-
-
-
-
-
0.60
0.30
2.50
5.00
-
-
-
0.30
0.60
0.60
1.25
0.60
1.25
0.60
1.25
0.30
0.60
0.60
1.25
0.60
1.25
1.20
1.25
2.50
0.15
0.30
1.25
2.50
1.25
1.25
1.25
2.50
1.25
2.50
0.60
1.25
1.25
2.50
1.25
2.50
4.00
0.30
0.60
0.60
1.25
0.15
0.30
0.30
0.60
0.15
0.30
1.00
2.00
1.25
2.50
0.60
0.60
0.60
1.25
0.60
1.25
1.25
2.50
C. parapsilosis
8.00
16.0
1.25
2.50
0.60
1.20
0.30
0.60
0.60
1.25
1.25
2.50
GM
1.91
3.70
0.95
1.91
0.77
2.03
0.33
0.56
0.79
1.61
0.75
1.37
Mean ± SD (MIC50)
1.05 ± 0.37a
0.81 ± 0.33a
0.37 ± 0.19b
0.96 ± 0.7a
0.90 ± 0.45a
Mean ± SD (MIC90)
2.10 ± 0.75a
1.55 ± 0.77a
0.65 ± 0.39b
1.95 ± 1.39a
1.65 ± 1.86a
FLU - Fluconazol, Pa - Piper aleyreanum, Pm - Piper marginatum, Pd - Piper dilatatum, Pad - Piper aduncum, Pal - Piper alatabacum.
(-) Not growth. GM – geometric media. Same small letters mean no significant diferences between columns at p < 0.05.
49
O
CH3
H
CH3
O
CH3
CH3
H
CH2
O
H2C
CH3
CH3
H
H3C
H3C
H
H
O
α- copaene
Caryophyllene oxide
Z-iso croweacin
CH3
O
CH2
O
CH2
O
CH3
H
O
O
CH3
OH
O
CH3
Apiole
H3C CH3
Spathulenol
CH3
Methyl linoleate
Figure 1: Chemical structures of main compounds of the essential oils of Piper species
50
7 CAPÍTULO 2
Antifungal activity of Piper essential oils from Amazon against Candida tropicalis strains
isolated
from poultry in Brazil
Atividade antifúngica de óleos essenciais de Piper da Amazônia contra cepas de Candida
tropicalis isoladas de aves brasileiras
Periódico: Veterinary Microbiology (Submetido em 18 de Novembro de 2011)
51
Resumo
Neste trabalho foi avaliada a composição química e a atividade antifúngica dos óleos
essenciais de Piper marginatum, P. aleyreanum, P. dilatatum, P. aduncum e P. alatabaccum
oriundos da Amazônia contra cepas de Candida tropicalis isoladas de aves domésticas
brasileiras. O projeto foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética para o Uso de Animais
da Universidade Estadual do Ceará. A análise química dos óleos foi feita por cromatografia
gasosa acoplada à espectrometria de massa (CG/EM). Foram utilizadas 16 aves entre elas 04
marrecos, 01 galo e 11 galinhas. Foi relizada coleta de secreção da microbiota oral das aves
com utilização de swab descartável. Os óleos essenciais foram testados na faixa de 10 a 0,015
mg/ml pelo método de microdiluição em caldo de acordo com o protocolo M27-A3. O MIC
do OE foi a menor concentração que causou uma redução de 50% e 90% de C. tropicalis
comparado com o controle. Para a espécie P. aleyreanum, os componentes principais foram
óxido de cariofileno (25,48%), E-cariofileno (15,11%) e limoneno (6,28%). A espécie P.
marginatum mostrou altas concentrações de metil eugenol (27,08%), α-copaeno (23,98%) e
E-anetol (7,90%). Para a espécie P. aduncum os componentes principais foram transisocrowecin (32,02%), apiole (29,51%) e cis-isoelemicin (8,04%). Os componentes principais
para P. alatabaccum foram metil octadecanoate (20,90%), metil linoleato (17,90%),
spathulenol (13,64%) e E-cariofileno (11,96%). Para a espécie P. dilatatum prevaleceram as
substâncias óxido de cariofileno (22,62%), metil-octadecanoate (19,79%) e metil linoleato
(18,31%). De acordo com o cálculo das médias geométricas para atividade com MIC50 os
óleos essenciais de espécies de Piper da Amazônia mostraram os seguintes resultados: P.
dilatatum que foi o mais ativo a MG foi 278, para as espécies P. aleyreanum, P. marginatum,
P. aduncum e P. alatabaccum as GM’s foram respectivamente 703, 1340, 786 e 650. Todos
os óleos mostraram atividade contra Candida tropicalis.
52
Antifungal activity of Piper essential oils from Amazon against Candida tropicalis strains
isolated from poultry in Brazil.
Kaline de Medeiros Nascimento 1,2, Valdir Alves Facundo 3, Laudir Gorje Ballico 3, Daniella
Karini Souza Lima3, Danielle Silveira Macedo 5, Manoel Odorico de Moraes5 Bruno Coêlho
Cavalcanti5, Cecília Rocha da Silva4, Hemerson Iury Ferreira Magalhães4, Hélio Vitoriano
Nobre Júnior4, Selene Maia de Morais1,2*
1
Course of Chemistry, Ceará State University, AV. Paranjana Itaperi Campus, 1700, CEP
60740-000, Fortaleza, Ceará, Brazil.
2
Veterinary Science Post Graduation Program, Ceara State University ; Paranjana Avenue, 1700
of the Campus, Itaperi, 000-60740 Fortaleza , Ceará, Brazil
3
Department of Chemistry, Federal University of Rondônia
4
Department of Clinical and Toxicological Analysis, School of Pharmacy, Laboratory of
Bioprospection and Experiments in Yeast (LABEL), Federal University of Ceará, EC, Brazil.
5
Department of Physiology and Pharmacology, Federal University of Ceará, Fortaleza, CE,
Brazil
*Corresponding author at: Course of Chemistry, Avenida Parajana 1700, Campus do Itaperi,
60740-000 Fortaleza, Ce, Brazil. Tel: +55 85 31019933.
E-mail address:[email protected](S.M. de Morais)
53
Abstract
The increasing incidence of infections caused by fungi in domestic birds, along with the
resistance that these antimicrobial agents have developed, has led to constant search for
effective alternative treatment that may offer better treatment option. The essential oil of five
Piper species grown in the Amazon forest were extracted and tested against Candida
tropicalis the main fungus present in poultry oral microbiota. The essential oils of Piper
species showed a great diversity of chemical components such as sesquiterpenes, aromatic
compounds and fatty acid methyl esters. Among tested oils Piper dilatatum showed the best
MIC50 with activity in the range of 18-600 µg/ml. The main constituents of P. dilatatum are αcopaene, cayophyllene oxide, methyl linoleate and methyl octadecanoate. Piperaceae Family
contains several species rich in essential oils with antifungal potential, which could be
therapeutic alternatives for the treatment of fungal infections that attack domestic birds caused
by C. tropicalis.
Keywords: Piper, essential oil, candidiasis, birds
54
Introduction
Candida tropicalis is one of the predominant species between the not-albicans related to
candidemia (Alfonso et al., 2010) and it is usually found in the gastrointestinal tract of birds,
being one of the species most commonly isolated in these animals, however the population
imbalance of these yeasts causes problems in the digestive tract, and may also infect the
reproductive tract and eye, as well as become systemic (Shrubsole-Cockwill, 2010). Rare and
serious cases can cause deformities in beak causing the bird to not use it appropriately
difficulting or even preventing normal feeding (Osório, 2007; Godoy, 2001).
The increasing incidence of infections caused by fungi in domestic birds, along with the
resistance that these antimicrobial agents have developed, has led to constant search for
effective treatment alternatives that may offer better treatment options (Bautista-Baños et al.,
2003).
The Amazon region of Brazil presents a great plant genetic potential, therefore, a
relevant value for the discovery of substances with medicinal activity (Azevedo et al., 2006;
Lucena et al., 2007; Teklehaymanot et al., 2007).
Piperaceae Family which comprises 12 genres and 1400 species with mainly a
pantropical distribution stands out among the bioproduction which come from Amazon. The
genre Piper is the largest of the family, with 700 species. Between them, there are 170 species
that occur in Brazil. The Piperaceae is represented by herbs, lianas, shrubs, and rarely by trees
(Andrade et al., 2008).
Piper amalago leaves are used in Mexico and in Brazil to relieve stomach pains and
fight various infections. In the State of Paraíba, leaves and stalks of Piper marginatum and
Piper tuberculatum are used against snake bite and as a sedative (Guimarães et al., 2004).
Chemical studies showed that the Piper genus has many components, including flavonoids,
unsaturated amides, lignans, aristolactams, long and short chain esters, terpenes, steroids and
55
alkaloids (Facundo et al., 2005). Terpenes and phenolic compounds in general are responsible
for the antimicrobial activity demonstrated in vegetable oils. The antimicrobial activity of
essential oils in vitro, both and in vivo, has justified the research on traditional medicine
focused on the characterization of its antimicrobial activity (Agarwal et al., 2010).
This work evaluated the antifungal activity of essential oils of P. marginatum Jacq, P.
aleyreanum C. DC., P. dilatatum L. C. Rich., P. aduncum L. and P. alatabaccum Trel &
Yuncker against Candida tropicalis strains obtained from domestic birds.
Materials and methods
Plant materials and isolation of essential oil
The leaves of the species P. marginatum, P. aleyreanum, P. dilatatum, P. aduncum and,
P. alatabaccum were collected from the native population in an area of abandoned pasture,
where started the regeneration of the forest, located 15 km from the capital, Porto Velho,
Rondonia. The botanical identifications were made in the herbarium of the National Institute
for Amazon Research, where the voucher specimen is stored under the numbers 223344 for P.
marginatum, 223303 for P. aleyreanum, 211724 for P. dilatatum, 221713 for P. aduncum and
211711 for P. alatabaccum. Essential oils (EO) from fresh leaves were extracted by
hydrodistillation for four hours in a Clevenger type apparatus (Craveiro et al., 1976). The oil
was dried over anhydrous sodium sulfate and, after filtration, stored at 4° C until and analyzed.
Identification of oil components
The oils were analyzed by gas cromatography-mass spectrometry (GC/MS) to identify
their components. GC/MS was performed using a Hewlett-Packard 5971 instrument
employing C; the following conditions: column (30 m x 0.25 mm); carrier gas: He (1 ml/min);
injector temperature: 250° C; detector temperature: 200ºc; column temperature: 35-180° C at
56
4° C/min then 180-250° C at 10° C/min; mass spectra: electron impact 70 eV. Identification
of the chemical components was based on the comparison of their mass spectral with the
National Institute for Standard Technology – NIST62 library and comparison of calculated
retention indexes with literature values (Adams, 2007).
Fungal strains
16 birds were used including teal (4), cock (1) and hen (11). The project was submitted
to the Ethics Committee for the use of domestic animals of the University of Ceará State
under number 11044867-7/29 and approved in August 25, 2011. Collection of
microorganisms of oral microbiota secretion collection of birds was carried out with use of
disposable swab. The material collected was sown in potato agar (Himedia Mumbai-India) in
test tubes previously prepared. Then they were sown on CHROMagar Candida (Himedia
Mumbai-India) to assess purity. The identification was done via commercial system
Auxacolor ® and confirmed by rice agar micromorphology (Medrano et al.; 2006; Menezes et
al.; 2009).
Anticandidal activity
C. tropicalis strains, isolated from poultry oral microbiota, were selected for testing.
The strains were inoculated in potato dextrose agar (Himedia Mumbai-India) and incubated at
37oC /24 h and sensitivity testing of strains of C. tropicalis essential oils was carried out in
accordance with the M27-A3 Protocol, by the method of microdiluition in RPMI broth (pH
7.0), buffered with MOPS in 96-well plates. Each EO (160 mg) was weighed and dissolved in
DMSO (1.0 ml). The solution was diluted in RPMI medium and DMSO concentration was
not higher than 1%. The range tested varied from 10.000 to 18 µg/ml. The strains were
exposed to EO and incubated at 35ºC /24 h. The MIC of the EO was the lowest concentration
57
that caused a 50% reduction of Candida growth spp. when compared with the control. The
strains C. parapsilosis ATCC 22019 and C. krusei ATCC 6258 were used as controls (CLSI,
2008a; CLSI, 2008b; Kiraz et al.; 2010).
Results
The studied Piper species showed a great diversity among chemical components. The
essential oil composition of these species was displayed in Table 1. For the species P.
aleyreanum, the major components were caryophyllene oxide (25.48%), caryophyllene
(15.11%) and-limonene (6.28%). The species P. marginatum showed high concentrations of
methyl eugenol (27.08%) α-copaene (23.98%) and E-anethole (7.90%). For the species P.
aduncum the major components were trans-isocrowecin (32.02%), apiole (29.51%) and cisisoelemicin (8.04%). The major components of P. alatabaccum were methyl octadecanoate
(20.90%), methyl linoleate (17.90%), spathulenol (13.64%) and-caryophyllene (11.96%). For
the species P. dilatatum the substances caryophyllene oxide (22.62%), methyl octadecanoate
(19.79%)-and methyl linoleate (18.31%) were the components that prevailed.
Piper essential oils of species from the Amazon region showed the following MIC50
means: 278 µg/ml for P. dilatatum, the most active when evaluated by Tukey's test, and 1340
µg/ml for P. marginatum, 703 µg/ml for P. aleyreanum, 786 µg/ml for P. aduncum and 650
µg/ml for P. alatabacum. Besides P. dilatatum, other essential oils did not show statistical
differences in their antifungal activity.
Discussion
In animals as in humans, mycosis is an opportunistic infection frequently becoming a
clinical problem despite improvements in veterinary medical technology and prevention.
Deep mycoses such as candidiasis, have been reported in farm animals such as cows, horses
58
and pigs and pets such as birds, dogs and cats. The diagnosis of these diseases is often based
on clinical signs, and on abnormal histological and mycological findings. Due to contact with
people, animals may represent a source of fungal infections in human being therefore
alternatives for the control of these infections are relevant to this public health problem
(Ishibashi et al., 2010).
Candida spp. yeasts are usually isolated from biological samples and the amount of
available drugs is extremely limited. Pharmacological alternatives are needed to combat this
common infection. In addition to this, there are strains resistant to traditional antifungal
agents. The effect of antifungal essential oils from plants on this yeast is well known, and
many have been used in conventional therapy (Agarwal et al., 2010).
Candida spp. is part of the normal intestinal microbiota of healthy birds and is typically
found in the upper gastrointestinal tract, primarily the oropharynx, crop, and esophagus
(Samour et al., 2002; Velasco, 2000). C. tropicalis is an opportunistic diploid fungus, with a
worldwide distribution, and is one the primary cause of candidiasis, which is often associated
with immunosuppression. It is often isolated from poultry droppings; however the lack of
specific care with cleaning breeding enables fungal species get contact with the oral cavity of
birds (Shrubsole-Cockwill, 2010; Hubálek, 2004). In this study we evaluated the antifungal
activity of Piper spp. against strains of C. tropicalis from domestic birds.
All oils showed activity against C. tropicalis. Essential oils are known to contain a
cocktail of natural monoterpenes, sesquiterpenes and hydrocarbons, with a variety of
functional groups that lead to an antifungal activity (Moreira et al., 2004). The Piper species
are currently classified as major producers of essential oils (Silva et al., 2007).
The studied Piper species showed a great diversity of chemical components. Among
tested oils P. dilatatum showed the best MIC50 with activity in the range of 18-600 µg/ml as
displayed in Table II. The main constituents of P. dilatatum are α-copaene, cayophyllene
59
oxide, methyl linoleate and methyl octadecanoate. Caryophyllene oxide, an oxygenated
sesquiterpenoid, well known as preservative in food, drugs and cosmetics, has been tested in
vitro as an antifungal against dermatophytes. Its antifungal activity has been compared to
ciclopiroxolamine and sulconazole, commonly used in onychomycosis treatment (Yang et al.,
1999). Ten alkyl fatty acid esters (AFAEs) were tested for in vivo antifungal activity against
five plant diseases such as rice blast, rice sheath blight, tomato gray mold, tomato late blight
and barley powdery mildew. Some AFAEs showed the most control efficacy against barley
powdery mildew among the tested plant diseases. Methyl and ethyl palmitates, methyl and
ethyl, methyl linoleate, oleates and methyl linolenate demonstrated both curative and
protective activities against barley powdery mildew (Choi et al., 2010). The essential oil of
Piper diospyrifolium showed the αmain constituent-copaene (47.73%), nevertheless the oil
did not display antifungal activity (Morandim et al., 2010). Taking into account the above
information, caryophyllene oxide and alkyl fatty acid esters probably respond for the
antifungal activity of P. dilatatum.
The major constituents of P. aduncum oil were trans-isocrowecin, dill apiole and cisisoelemicin. In the study of other Piper species made by (Morandim et al., 2010), P.
solmsianum showed the best activity and the major compound was isoelemicin (53.45%).
Rally et al. (2007) demonstrated the insecticidal activity of dill apoile against malaria
mosquito vector. Therefore, main compounds of P. aduncum essential oil, dill and-apiole and
isoelemicin, could be responsible for its antifungal activity.
The oil of P. marginatum showed MIC50 varying between 150-2500 µg/ml. Leaf
samples of Piper marginatum Jacq. collected in different areas of the Brazilian Amazon were
classified in seven chemotypes (Andrade et al., 2008). The main constituents were
sesquiterpenes as (E)-beta-ocimene, beta-caryophyllene, bicyclogermacrene, alpha-copaene
and
gamma-terpinene
and
aromatic
compounds
as
safrole,
3,4-(methylenedioxy)
60
propiophenone,
2-methoxy-4,5-(methylenedioxy)
propiophenone,
myristicin,
(E)-
isoosmorhizole, (E)-anethole and (E)-asarone. The major constituents of P. marginatum EO
used in this study were α-copaene, 3,4-(methylenedioxy) propiophenone and (E)-anethole
which are included among previous identified components of several chemotypes. The
antifungal activity could be related to known antifungal compounds as (E)-anethole and minor
compounds α-pinene, β-pinene E-ocimene and E-caryophyllene (Huang et al., 2010; Moreira
et al, 2007).
In conclusion, Piperaceae Family contains several species rich in essential oils with
antifungal potential, which could be therapeutic alternatives for the treatment of fungal
infections that attack domestic birds caused by C. tropicalis.
61
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65
Table I: Chemical composition of essential oils of Brazilian Amazon Piper spp. species
Concentration (% peak area)
Component
RI*
Pa
Pm
Pad
Pal
Pd
α-pinene
939
4.94
2.46
1.57
Camphene
954
1.02
Sabinene
975
0.62
β-pinene
979
4.99
2.27
1.55
Limonene
1029 6.28
β-ocimene
1050
4.27
Z-ocimenone
1229
1.88
E-ocimenone
1238
3.86
E-anethole
1285
7.9
Safrole
1287
3.29
α-cubebene
1351
5.69
α-copaene
1377 5.28
23.98
18.16
β-Bourbonene
1388 1.12
β-Elemene
1391 5.37
0.95
5.57
3,4-(methylenodioxi)-propiophenone 1404
27.08
E-Caryophyllene
1419 15.11
2.28
2.15
11.96
Aromadendrene
1441 2.20
α-Humulene
1455 2.11
0.58
Germancrene D
1485
1.04
β-selinene
1490
4.06
6.82
Valencene
1496
5.70
α-selinene
1498
0.59
Bicyclogermacrene
1500
5.82
1514 0.79
-Cadinene
Myristicin
1519
6.08
δ-Cadinene
1523 1.02
Elemol
1550
2.51
Trans-isocrowecin
1553
32.02
Cis-isoelemicin
1570
8.04
Spathulenol
1578
4.8
0.92
13.64 7.48
Caryophyllene oxide
1583 25.48
0.64
5.98 22.62
Dill apiole
1620
29.51
Methyl palmitate
1921
5.54
Methyl hexadecanoate
1922
7.95
Methyl linoleate
2096
4.50
17.90 18.31
Methyl octadecanoate
2125
20.90 19.79
*RI: Kovats indices, calculated by linear regression. Pa - Piper aleyreanum, Pm - Piper
marginatum,
Pd - Piper dilatatum, Pad - Piper aduncum, Pal - Piper alatabacum.
66
Table II: Anticandidal effect of essential oils from Piper spp after 48 hours against Candida tropicalis isolated from birds.
Animal
FLU
Pm
Pa
Pd
Pad
Pal
source
(µg/ml)
(µg/ml)
(µg/ml)
(µg/ml)
(µg/ml)
(µg/ml)
MIC50
MIC90
MIC50
MIC90
MIC50
MIC90
MIC50
MIC90
MIC50
MIC90
MIC50
MIC90
Teal
0.5
1.0
2500
5000
600
1250
600
1250
1250
2500
1250
2500
Cock
4.0
8.0
150
300
-
--
-
-
-
-
-
-
Hen
0.5
1.0
2500
5000
600
1250
150
300
-
-
-
-
Hen
4.0
8.0
1250
2500
600
1250
150
300
2500
5000
300
600
Hen
0.5
0.5
-
-
-
-
-
-
-
-
75
150
Hen
0.5
1.0
-
-
300
600
150
300
600
1250
150
300
Hen
4.0
8.0
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Hen
32.0
32.0
-
-
75
150
-
-
18
30
-
-
Hen
8.0
16.0
-
-
600
1250
600
1250
1250
2500
600
1250
Hen
0.5
0.5
300
600
18
18
18
30
300
600
-
-
Teal
0.5
1.0
-
-
1250
2500
600
1250
600
1250
1250
2500
Hen
16.0
32.0
-
-
-
-
-
-
-
-
75
150
Hen
2.0
4.0
-
-
600
1250
18
30
150
300
300
600
Hen
0.5
1.0
-
-
-
-
600
1250
-
-
-
-
Teal
1.0
2.0
-
-
2500
5000
150
300
600
1250
1250
2500
Teal
1.0
2.0
-
-
600
1250
30
75
600
1250
1250
2500
811
1622
412
792
145
292
458
915
402
808
GM
Mean ±SD MIC50
1340 ± 1139a
703 ± 679a
278 ± 260b
786 ± 725a
650 ± 537a
Mean ±SD MIC90
2680 ± 2279a
1433 ± 1356a
575 ± 544b
1593 ± 1446a
1305 ± 1074a
FLU - Fluconazol, Pa - Piper aleyreanum, Pm - Piper marginatum, Pd - Piper dilatatum, Pad - Piper aduncum, Pal - Piper alatabacum. (-) Not growth.
GM – geometric mean. Same small letters mean no significant differences among essential oils activity displayed in the columns at P < 0.05.
67
8 CONCLUSÕES GERAIS

Os óleos essenciais de P. marginatum Jacq, P. aleyreanum C.DC., P. dilatatum L. C.
Rich., P. aduncum L. e P. alatabaccum Trel & Yuncker foram capazes de inibir a
atividade de cepas Candida spp.

O óleo essencial mais eficaz foi o P. dilatatum, pois apresentou menores valores de
CIM;

A atividade antifúngica dos óleos essenciais avaliados pode abrir perspectivas, no
desenvolvimento de fitoterápicos eficazes, podendo ser usados no tratamento de
doenças infecciosas causadas por microrganismos do gênero Candida;

Estudos posteriores acerca da toxicidade podem levar ao emprego desses óleos in vivo.
68
9 PERSPECTIVAS
A partir dos resultados obtidos sobre a atividade antifúngica dos óleos essenciais de P.
marginatum Jacq, P. aleyreanum C.DC., P. dilatatum L. C. Rich., P. aduncum L. e P.
alatabaccum Trel & Yuncker contra as cepas de Candida spp., observou-se que essas plantas
constituem uma fonte biologicamente ativa com potencial exploração na busca de novos
fármacos antifúngicos.
69
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77
11 ANEXOS
CROMATOGRAMAS DOS ÓLEOS ESSENCIAIS ESTUDADOS
Anexo 1: Cromatograma do óleo essencial de Piper marginatum Jacq
78
Anexo 2: Cromatograma do óleo eseencial de Piper aleyreanum C.DC
79
Anexo 3: Cromatograma do óleo eseencial de Piper dilatatum L. C. Rich.
80
Anexo 4: Cromatograma do óleo eseencial de Piper aduncum L.
81
Anexo 5: Cromatograma do óleo eseencial de Piper alatabaccum Trel & Yuncker