UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ ADRIANA CAMPOS ANÁLISE FITOQUÍMICA E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIPROLIFERATIVA DE ESPÉCIES ADAPTADAS DA FLORA CATARINENSE: Synadenium grantii, Cipura paludosa, Epidendrum mosenii e Maytenus robusta Itajaí 2015 UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS ADRIANA CAMPOS ANÁLISE FITOQUÍMICA E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIPROLIFERATIVA DE ESPÉCIES ADAPTADAS DA FLORA CATARINENSE: Synadenium grantii, Cipura paludosa, Epidendrum mosenii e Maytenus robusta Tese submetida à Universidade do Vale do Itajaí como parte dos requisitos para a obtenção do grau de Doutor em Ciências Farmacêuticas. Orientador: Prof. Dr. Valdir Cechinel Filho Itajaí, Julho de 2015 FICHA CATALOGRÁFICA C157a Campos, Adriana, 1988Análise fitoquímica e avaliação da atividade antiproliferativa de espécies adaptadas da flora catarinense: Synadenium grantii, Cipura paludosa, Epidendrum mosenil e Maytenus robusta / Adriana Campos, 2015. 112f.; il.; fig.; tab. Cópia de computador (Printout(s)). Tese (Doutorado) Universidade do Vale do Itajaí, Programa de Doutorado em Ciências Farmacêuticas. “Orientador: Prof. Dr. Valdir Cechinel Filho ” Bibliografia: p.93-107 1. Plantas medicinais. 2. Éster de forbol. 3. Naftoquinonas. 4. Antineoplásicos. 5. Extratos vegetais – isolamento & purificação. 6. Maytenus. I. Título. CDU: 615.32 Josete de Almeida Burg – CRB 14.ª 293 CDU: 612.78 ANÁLISE FITOQUÍMICA E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIPROLIFERATIVA DE ESPÉCIES ADAPTADAS DA FLORA CATARINENSE: Synadenium grantii, Cipura paludosa, Epidendrum mosenii e Maytenus robusta Adriana Campos ‘Esta Tese foi julgada adequada para obtenção do Título de Doutor em Ciências Farmacêuticas, Área de Concentração Produtos Naturais e Substâncias Bioativas e aprovada em sua forma final pelo Programa de Doutorado em Ciências Farmacêuticas da Universidade do Vale do Itajaí. ’ ____________________________________ Prof. Dr. Valdir Cechinel Filho Orientador __________________________________________________________ Prof. Dr. Clóvis Antonio Rodrigues Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas Apresentado perante a Banca Examinadora composta pelos Professores: ______________________________________ Prof. Dr. Valdir Cechinel Filho (UNIVALI) Presidente ______________________________________ Profa. Dra. Angela Malheiros (UNIVALI) Membro ______________________________________ Prof. Dr. Sérgio Faloni de Andrade (UNIVALI) Membro ____________________________________ Prof. Dr. João Ernesto de Carvalho (UNICAMP) Membro externo ____________________________________ Prof. Dr. Edesio Luiz Simionatto (FURB) Membro externo Itajaí (SC), 17 de Julho de 2015 Aos meus pais Aluízio e Rejane, dedico mais uma conquista, pois antes desta vitória ser minha com certeza ela é de vocês, que são a estrutura de toda minha trajetória. A vocês minha eterna admiração, orgulho e meus sinceros agradecimentos! AGRADECIMENTOS A Deus! Ao Professor Valdir Cechinel Filho, por todos os ensinamentos, apoio e paciência que sempre me dedicou nestes anos. Admiro sua inteligência, competência e seu dom profissional. Obrigada por ter me recebido de forma tão agradável e por toda confiança. Aos meus pais Aluízio e Rejane, por todo carinho e incentivo. O apoio e o amor de vocês foi essencial durante esta trajetória e esta conquista. Aos membros da banca de qualificação, Professora Dra. Angela Malheiros e Professor Dr. Sérgio Faloni de Andrade, pelas críticas e contribuições para conclusão deste trabalho. Ao Professor Dr. João Ernesto de Carvalho e toda equipe do CPQBA (UNICAMP), pela gentileza e disposição em me ensinar e ajudar com os experimentos in vitro. Ao Professor Dr. Atanasio Pandiella e toda equipe do CIC - Salamanca, pela atenção e disposição em me ensinar técnicas novas. Obrigada por terem me recebido com tanto carinho e serem minha família durante 3 meses. À amiga e Professora Luciane Angela Nottar Nesello, pelas colaborações e ensinamentos. Sua sabedoria e amor pela pesquisa e docência me motivaram a continuar nesta área tão bonita e me fizeram crescer tanto profissional quanto pessoalmente. Aos meus colegas do laboratório de Fitoquímica e minhas amigas do NUTRIFAR, que se tornaram mais que colegas de trabalho, e sim amigos de verdade! Obrigado a todos a vocês pelo apoio e amizade, dentro e fora do laboratório! Aos colaboradores e à coordenação do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Prof. Dr. Clóvis Antonio Rodrigues, Prof. Dra. Tania Mari Bellé Bresolin, Juliano dos Santos e Helenise Heyse Moreria; Ao Prof. Theo e Pedro peja ajuda nas técnicas de CLAE e RMN; Ao Joel e Deivisson, pela paciência e dedicação, sempre nos ajudando como técnicos do laboratório. Às agências de fomento: CAPES, pela concessão da minha bolsa e CNPQ e FAPESC pelo auxílio financeiro ao laboratório. “A mente que se abre para uma nova ideia jamais voltará ao seu tamanho original”. (Albert Einstein) ANÁLISE FITOQUÍMICA E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIPROLIFERATIVA DE ESPÉCIES ADAPTADAS DA FLORA CATARINENSE: Synadenium grantii, Cipura paludosa, Epidendrum mosenii e Maytenus robusta Adriana Campos Julho/ 2015 Orientador: Prof. Dr. Valdir Cechinel Filho Área de Concentração: Produtos Naturais e Substâncias Sintéticas Bioativas Número de Páginas: 110 As plantas têm uma longa história de uso no tratamento de várias doenças, incluindo o câncer. A descoberta de compostos de origem vegetal que atuam no combate ao câncer tem incentivado várias pesquisas nessa área. Com isso, o objetivo do presente estudo foi de obter extratos, frações e compostos puros a partir de plantas com potencial anticâncer e avaliar este potencial através de ensaios in vitro e in vivo, bem como estabelecer os possíveis mecanismos de ação. A seleção das plantas para o estudo foi com base em dois fatores: uso atual na medicina popular como agente anticâncer (Synadenium grantii) e por apresentarem atividade antimicrobiana e anti-inflamatória já comprovadas (Cipura paludosa, Epidendrum mosenii e Maytenus robusta). Os resultados obtidos demonstraram que o caule da S. grantii e o os bulbos da C. paludosa possuem atividade antiproliferativa relevante. Como princípios ativos considerados responsáveis por essa atividade, foi isolado o composto 20-fenilacetato de 3,4,12,13-tetraacetilforbol na fração CHCl3 do caule da S. grantii, com presença mais significativa na primavera, e os compostos eleuterina, isoeleuterina e eleuterol dos bulbos da C. paludosa, com presença mais significativa no verão. Estes compostos apresentaram ação citocida e/ou citotóxica contra várias das linhagens celulares tumorais avaliadas, especialmente contra glioma, mama e rim, com valores de TGI entre 2,8 e 25,2 µg/mL. Os resultados obtidos até o presente são promissores sob o ponto de vista químico e medicinal, e estimulam a continuidade destes estudos para a constante busca de plantas e compostos com potencial atividade antiproliferativa, visando a descoberta de um novo e eficaz agente terapêutico anticâncer. Palavras-chave: Naftoquinonas. Plantas medicinais. Potencial anticâncer. Éster de forbol. PHYTOCHEMICAL ANALYSIS AND EVALUATION OF ANTIPROLIFERATIVE ACTIVITY OF SPECIES ADAPTED FROM THE FLORA OF SANTA CATARINA: Synadenium grantii, Cipura paludosa, Epidendrum mosenii e Maytenus robusta Adriana Campos July/ 2015 Advisor: Prof. Dr. Valdir Cechinel Filho Area of Concentration: Natural Products and Synthetic Bioactive Substances Number of Pages: 110 Plants have a long history of use in the treatment of various diseases, including cancer. The discovery of several compounds of plants that act against cancer has prompted research in this area. Thus, the aim of this study was to obtain extracts, fractions and pure compounds from plants with potential antiproliferative activity, to evaluate this potential through in vitro and in vivo assays, and to establish the possible mechanisms of action. The selection of plants for the study was based on two factors: current use in folk medicine as anticancer agent (Synadenium grantii), and the presence of proven antimicrobial and anti-inflammatory activity (Cipura paludosa, Epidendrum mosenii and Maytenus robusta). The results showed that the stems of S. grantii and the bulbs of C. paludosa have significant antiproliferative activity. As active principles considered responsible for this activity, the following compounds were isolated: the compound 3,4,12,13-tetraacetylphorbol-20- phenylacetate in the CHCl3 fraction from S. grantii stems, which is present in higher quantity in the spring, and the compounds eleutherine, isoeleutherine and eleutherol from C. paludosa bulbs, which are present in higher quantities in the summer. These compounds showed cytocidal and/or cytotoxic activity against various tumor cell lines, especially against glioma and breast cancer cell lines, with TGI values of between 2.8 and 25.2 µg/mL. The results are promising from a chemical and medical point of view, and encourage the continuation of these studies in the constant search for plants and compounds with potential antiproliferative activity, in order to discover a new and effective therapeutic anticancer agent. Keywords: Medicinal plants. Anticancer potential. Phorbol ester. Naphthoquinones. LISTA DE FIGURAS Figura 1 Estrutura química dos alcaloides da Vinca, vinblastina e vincristina............................................................................................ 30 Figura 2 Estrutura química do taxano paclitaxel (Taxol®) ............................... 31 Figura 3 Estrutura química da camptotecina.................................................... Figura 4 Fotografia da planta identificada como Synadenium grantii............... 34 Figura 5 Bulbos frescos da Cipura paludosa.................................................... 36 Figura 6 Estrutura química dos compostos isolados dos bulbos da C. 32 paludosa, hongkonina (A) e 11-hidroxieleuterina (B).......................... 36 Figura 7 Fotografia da planta identificada como Epidendrum Mosenii............. 37 Figura 8 Fotografia da planta identificada como Maytenus robusta................. 39 Figura 9 Fluxograma da obtenção das frações do caule da S. grantii - 2a coleta.................................................................................................. Figura 10 Fluxograma da obtenção das frações do caule da S. grantii - 3a coleta.................................................................................................. Figura 11 47 48 Placa de 96 poços utilizada nos ensaios para avaliação da atividade antiproliverativa in vitro ....................................................... 52 Figura 12 Fluxograma de operações realizadas para purificação de substâncias da fração CHCl3 do caule da S. grantii........................... 57 Figura 13 Cromatografia em camada delgada (CCD) das subfrações 11-15 e 16-19 da fração CHCl3 do caule da S. grantii..................................... 58 Figura 14 Fluxograma de operações realizadas para obtenção de compostos puros da fração CHCl3 do caule da S. grantii..................................... 59 Figura 15 Espectro de infravermelho (IV) do composto 1................................... 60 Figura 16 Estrutura molecular do composto 20-fenilacetato de 3,4,12,13tetraacetilforbol (composto 1)............................................................. Figura 17 61 Espectro de RMN-1H (CDCl3 300MHz) ampliado de 9.5 a 1.0 ppm do composto 20-fenilacetato de 3,4,12,13-tetraacetilforbol................ 62 Figura 18 Espectro de RMN-13C (CDCl3 75MHz) ampliado de 10 a 170 ppm do composto 20-fenilacetato de 3,4,12,13-tetraacetilforbol................ 63 Figura 19 Espectro de DEPT-135 do composto 20-fenilacetato de 3,4,12,13tetraacetilforbol (CDCl3 75MHz).......................................................... 64 Figura 20 Análise por CLAE da subfração 11-15 da fração CHCl3 do caule da S. grantii e do composto 1.................................................................. 66 Figura 21 Fluxograma de operações realizadas para purificação do EMB dos bulbos da C. paludosa........................................................................ 67 Figura 22 Estrutura molecular do composto isoeleuterina.................................. 68 Figura 23 Estrutura molecular do composto eleuterina...................................... 68 Figura 24 Estrutura molecular do composto eleuterol........................................ 69 Figura 25 Espectro de RMN-1H (CDCl3 300MHz) do composto eleuterol.......... 69 Figura 26 Espectro de RMN-13C (CDCl3 75MHz) ampliado de 20 a 160 ppm do composto eleuterol......................................................................... 70 Figura 27 Cromatograma (CLAE) dos extratos do caule da S. grantii obtidos nas 4 estações, bem como do composto 1........................................ 72 Figura 28 Cromatograma (CLAE) dos extratos dos bulbos da C. paludosa obtidos nas 4 estações, e dos compostos eleuterina, isoeleuterina e eleuterol, isolados da mesma............................................................. 73 Figura 29 Atividade antiproliferativa da subfração 11-15 da S. grantii................ 77 Figura 30 Atividade antiproliferativa da subfração 16-19 da S. grantii................ 77 Figura 31 Atividade antiproliferativa do composto 1 da S. grantii....................... 78 Figura 32 Atividade antiproliferativa do composto 2 da S. grantii....................... 78 Figura 33 Atividade antiproliferativa do quimioterápico doxorrubicina (controle posivito)............................................................................................... 79 Figura 34 Atividade antiproliferativa do composto isoeleuterina......................... 82 Figura 35 Atividade antiproliferativa do composto eleuterina............................. 83 Figura 36 Atividade antiproliferativa do composto eleuterol............................... 83 Figura 37 Metabolização de MTT (% controle) contra a linhagem celular MDAMB231 do composto 1 e da eleuterina............................................... 86 Figura 38 Metabolização de MTT (% controle) do composto 1 contra as linhagens celulares MDA-MB231 e HBL100....................................... 87 Figura 39 Ação do composto 1 no ciclo celular da linhagem celular tumoral MDA- MB231...................................................................................... Figura 40 88 Avaliação da apoptose induzida pelo composto 1 na linhagem celular tumoral MDA-MB231............................................................... 89 LISTA DE TABELAS Tabela 1 Principais linhagens celulares tumorais humanas utilizadas em ensaios de atividade antiproliferativa in vitro (ATCC; NCI).................. 41 Tabela 2 Plantas e suas partes coletadas para a realização do trabalho........... 45 Tabela 3 Sistema de solventes utilizados para técnica de CLAE........................ 50 Tabela 4 Dados de RMN-1H, RMN-13C e DEPT do composto 1 (20-fenilacetato de 3,4,12,13-tetraacetilforbol) em comparação com dados da literatura................................................................................................ 65 Tabela 5 Dados de RMN-1H e RMN-13C do composto eleuterol em comparação com dados da literatura.................................................... 71 Tabela 6 Valores da área do pico do composto 1 (20-fenilacetato de 3,4,12,13-tetraacetilforbol) nos extratos do caule da S. grantii nas 4 estações através da análise por CLAE................................................. 73 Tabela 7 Valores da área do pico dos compostos eleuterina, isoeleuterina e eleuterol nos extratos dos bulbos da C. paludosa nas 4 estações através da análise por CLAE................................................................ 74 Tabela 8 Valores de GI50 (µg/mL)a do controle positivo (doxorrubicina) e dos extratos metanólicos e das frações das plantas S. grantii, C. paludosa, E. mosenii e M. robusta........................................................ 75 Tabela 9 Valores de TGI (µg/mL)a do controle positivo (doxorrubicina) e subfrações da S. grantii........................................................................ 79 Tabela Valores de TGI (µg/mL)a do controle positivo (doxorrubicina) e dos 10 compostos isolados da S. grantii.......................................................... 81 Tabela Valores de TGI (µg/mL)a do controle positivo (doxorrubicina) e dos 11 compostos isoeleuterina e eleuterina isolados da C. paludosa............ 84 Tabela Valores de GI50 (µg/mL)a do controle positivo (doxorrubicina) e do 12 composto eleuterol isolado da C. paludosa.......................................... 85 LISTA DE ABREVIATURAS AE – Acetato de etila ATCC – American Type Culture Collection CC – Coluna cromatográfica CCD – Cromatografia em camada delgada CDCl3 – Clorofórmio deuterado CLAE – Cromatografia líquida de alta eficiência CPQBA – Centro de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas DEPT – Espectro de RMN-13C utilizando transferência de polarização DMEM – Meio de cultura Dulbecco’s modified Eagle’s medium DMSO – Dimetilsulfóxido DNA – Ácido desoxirribonucleico EDTA – Ácido etilenodiamino tetra-acético EMB – Extrato metanólico bruto GI50 – Growth Inhibition 50 (concentração necessária para inibir em 50% o crescimento celular) HER2 – Receptor do fator de crescimento epidérmico HIV – Vírus da imunodeficiência humana INCA – Instituto Nacional do Câncer IP – Iodeto de Propídio IV – Infravermelho MTT – Brometo de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazólio NIQFAR – Núcleo de Investigações Químico-Farmacêuticas NCI – National Cancer Institute OMS – Organização Mundial da Saúde PBS – Tampão fosfato-salino PKC – Proteína Quinase C PPGCF – Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas RIBECANCER – Rede Iberoamericana de Investigação em Câncer RMN-1H – Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio RMN-13C – Ressonância Magnética Nuclear de Carbono RPMI – Meio de cultura Roswell Park Memorial Institute SFB – Soro fetal bovino SRB – Sulforrodamina B UV – Ultravioleta TCA – Ácido tricloroacético TGI – Total Growth Inhibition (concentração necessária para inibir totalmente o crescimento celular) TMS –Tetrametilsilano TNBC – Triple negative breast cancer WHO – World Health Organization SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 23 2 OBJETIVOS ........................................................................................................... 25 2.1 Objetivo Geral .................................................................................................... 25 2.2 Objetivos Específicos ....................................................................................... 25 3 REVISÃO DA LITERATURA ................................................................................. 27 3.1 Carcinogênese ................................................................................................... 27 3.2 Produtos naturais e agentes anticâncer ......................................................... 29 3.2.1 Plantas com possível atividade anticâncer..................................................33 3.2.1.1 Synadenium grantii Hook f. (Euphorbiaceae) ........................................... 33 3.2.1.2 Cipura paludosa (Iridaceae) ....................................................................... 35 3.2.1.3 Epidendrum mosenii (Orchidaceae) .......................................................... 37 3.2.1.4 Maytenus robusta (Celastraceae) .............................................................. 38 3.2.2 Ésteres de forbol ............................................................................................ 39 3.3 Modelos farmacológicos para avaliação da atividade anticâncer ................ 40 3.3.1 Ensaios para avaliar atividade antiproliferativa in vitro.............................. 42 4 MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................... 45 4.1 Material vegetal ................................................................................................. 45 4.2 Análise fitoquímica............................................................................................ 46 4.2.1 S. grantii .......................................................................................................... 46 4.2.2 C. paludosa ..................................................................................................... 49 4.2.3 Análise da variação sazonal ......................................................................... 49 4.3 Identificação dos compostos ........................................................................... 50 4.4 Atividade antiproliferativa in vitro ................................................................... 51 4.4.1 SRB .................................................................................................................. 51 4.4.2 MTT .................................................................................................................. 53 4.5 Análise do ciclo celular e apotose ................................................................... 55 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................. 57 5.1 Análise fitoquímica............................................................................................ 57 5.1.1 Caule da S. grantii .......................................................................................... 57 5.1.2 Bulbos da C. paludosa ................................................................................... 67 5.1.3 Análise sazonal .............................................................................................. 72 5.2 Atividade antiproliferativa.................................................................................75 5.2.1 Atividade antiproliferativa da S. grantii ........................................................ 76 5.2.2 Atividade antiproliferativa da C. paludosa ................................................... 82 5.2.3 Atividade antiproliferativa do composto 1 (S. grantii) e eleuterina (C. paludosa) no modelo de MTT ................................................................................. 86 6 CONCLUSÕES ...................................................................................................... 91 REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 93 ANEXOS - Artigos submetidos para publicação ................................................ 108 23 1 INTRODUÇÃO Câncer é o nome dado a um conjunto de mais de 100 tipos diferentes de doenças que têm em comum o crescimento desordenado de células anormais que invadem os tecidos e órgãos, podendo espalhar-se para outras regiões do corpo. Além disso, sua origem se dá por condições multifatoriais. Esses fatores causais podem agir em conjunto ou em sequência para iniciar ou promover o câncer (INCA, 2014). Nas últimas décadas, o câncer ganhou uma dimensão maior, convertendo-se em um evidente problema de saúde pública mundial. Em 2012, o impacto mundial do câncer aumentou para cerca de 14 milhões de novos casos por ano, um número que deverá subir para 22 milhões por ano nas próximas duas décadas (WHO, 2014). Segundo o Instituto Nacional do Câncer (INCA), estima-se para o ano de 2030, cerca de 21,4 milhões de casos novos de câncer e 13 milhões de mortes por esta doença, em consequência do crescimento e do envelhecimento da população, bem como da redução na mortalidade infantil e nas mortes por doenças infecciosas em países em desenvolvimento (INCA, 2014). No Brasil, a estimativa para o ano de 2015, aponta para a ocorrência de aproximadamente 576 mil casos novos de câncer, sendo o câncer de pele do tipo não melanoma (182 mil casos novos) o mais incidente na população brasileira, seguido pelos tumores de próstata (69 mil), mama feminina (57 mil), cólon e reto (33 mil), pulmão (27 mil), estômago (20 mil) e colo do útero (15 mil) (INCA, 2014). Considerando-se o grande número de novos casos de câncer no país, o desenvolvimento de técnicas eficientes para prevenção e cura e a descoberta de novos agentes medicinais nesta área pode apresentar grande impacto tanto na ciência médica como na economia mundial. De acordo com um relatório da Organização Mundial de Saúde (OMS), mais de 80% da população do mundo depende da medicina tradicional para suas necessidades de cuidados de saúde primários (BHANOT; SHARMA; NOOLVI, 2011). As plantas têm uma longa história de uso no tratamento de câncer. Baseando-se nesta tendência, o Instituto Nacional do Câncer dos Estados Unidos (National Cancer Institute - NCI), promoveu, em 1960, um programa de triagem em 24 larga escala, na busca de quimioterápicos. Entre 1960 e 1982, foram testadas 35.000 plantas, dando origem a vários fármacos, como vinblastina, vincristina, paclitaxel (Taxol®) e camptotecina. Como consequência, mais de 60% dos agentes anticâncer utilizados hoje são provenientes de produtos naturais, incluindo plantas, microorganismos e organismos marinhos (CRAGG; NEWMAN, 2005; CRAGG; NEWMAN, 2013). A busca por agentes anticâncer tem aumentado com o objetivo de se encontrar tratamentos mais efetivos e seletivos, ou que visem à descoberta de novas estratégias que impeçam o avanço da doença (BRANDÃO et al., 2010). Para isto, a interdisciplinaridade é essencial, sendo a utilização da fitoquímica e da química orgânica na busca e produção de novos compostos, e os ensaios farmacológicos demonstrando a atividade dos mesmos e seus respectivos mecanismos de ação. Os produtos naturais continuam sendo uma das principais fontes de substâncias ativas utilizadas clinicamente como quimioterápicos (CRAGG; NEWMAN, 2014). É necessária a constante busca de novos e potenciais compostos, para a possível chance de descoberta de um novo fármaco com atividade anticâncer. Desta forma, o presente estudo tem como objetivo o isolamento e identificação de substâncias com este potencial. 25 2 OBJETIVOS 2.1 Objetivo Geral: Obter extratos, frações e compostos puros a partir de plantas com potencial antiproliferativo (Synadenium grantii, Cipura paludosa, Epidendrum mosenii e Maytenus robusta) e avaliar este potencial através de ensaios in vitro, bem como estabelecer os possíveis mecanismos de ação. 2.2 Objetivos Específicos: Obter extratos e frações a partir de plantas com potencial antiproliferativo (Synadenium grantii, Cipura paludosa, Epidendrum mosenii e Maytenus robusta), usando metodologias convencionais de maceração e partição líquido-líquido; Avaliar a propriedade antiproliferativa dos extratos e frações obtidas, por meio de ensaios in vitro, utilizando cultura de células tumorais; Obter compostos puros a partir dos extratos/frações com promissora atividade antiproliferativa, usando metodologias convencionais de cromatografia, identificar por técnicas de espectrometria, e avaliar sua possível atividade antiproliferativa in vitro; Realizar os estudos necessários para estabelecer os mecanismos de ação das substâncias com atividade antiproliferativa significativa; Avaliar o perfil químico, por meio da técnica de CLAE, das plantas Synadenium grantii e Cipura paludosa, considerando a variação sazonal. 26 27 3 REVISÃO DA LITERATURA 3.1 Carcinogênese O desenvolvimento de neoplasias, ou seja, o processo de carcinogênese, é resultante de alterações que se acumulam progressivamente no material genético (DNA) de uma célula normal. Este processo está relacionado à exposição com agentes carcinogênicos químicos, físicos e/ou biológicos presentes no meio ambiente, ao estilo de vida de um determinado indivíduo ou de uma população e a fatores genéticos e epigenéticos (PARMIGIANI; CAMARGO, 2010; VINEIS; SCHATZKIN; POTTER, 2010). A carcinogênese é um processo dinâmico, longo e envolve múltiplas etapas, como iniciação, promoção e progressão, na transformação das células normais em malignas (ULLAH et al., 2014). Na etapa de iniciação da carcinogênese ocorre alteração irreversível no DNA, podendo acarretar mutação. Esta alteração é gerada por uma substância genotóxica, que provoca danos genéticos passíveis de serem transmitidos para as células-filhas, mas compatíveis com a sobrevida da célula. Já a etapa de promoção é caracterizada pela proliferação celular, que contribui com a expansão clonal das células iniciadas pela ação de um agente promotor. Ou seja, na promoção ocorre a conversão da célula iniciada em célula pré-maligna. Este estágio é reversível, apresenta grande período de latência e representa o principal alvo da ação de agentes quimiopreventivos (IRIGARAY; BELPOMME, 2010; PITOT, 2007). A progressão da célula pré-maligna em maligna ocorre por divisão e proliferação celular incontrolada, perda da estabilidade genética, caráter invasivo, metástase e mudanças nas características bioquímicas, metabólicas e morfológicas das células. Além disso, é irreversível (OLIVEIRA et al., 2007). A perda do controle de proliferação e a aquisição de características associadas com a progressão tumoral são consequências de alterações que ocorrem no DNA das células normais. A célula alterada sofre uma expansão clonal transmitindo geneticamente a alteração para todas as células que se originam a partir dela (PARMIGIANI; CAMARGO, 2010). Estas células podem proliferar indefinidamente e adquirir defeitos na diferenciação e nos mecanismos de controle 28 que param a divisão celular ou induzem a morte celular (apoptose) em resposta ao stress celular ou aos danos no DNA (ALBERTS et al., 2008; ALBERTS et al., 2011). A apoptose é desencadeada por excesso ou falta de estímulos de crescimento, proliferação e/ou dano celular. Portanto, a apoptose pode representar um mecanismo protetor contra o desenvolvimento de neoplasias por meio da eliminação das células com danos genéticos ou das que iniciaram a proliferação (BRAS; QUEENAN; SUSIN, 2005; KONG et al., 2001). Cada modificação genética adquirida durante a carcinogênese confere às células cancerígenas várias vantagens, constituindo os Hallmarks of Cancer (características do câncer). Estas características favorecem a manutenção das células, e incluem fatores como a proliferação auto sustentada, evasão de sinais supressores de crescimento, resistência à apoptose, replicação ilimitada, indução de angiogênese e ativação de invasão e metástase (HANAHAN; WEINBERG, 2000; HANAHAN; WEINBERG, 2011) Por apresentarem propriedades invasivas, as células cancerígenas podem desprender-se do tumor primário, entrar na circulação sanguínea ou nos vasos linfáticos e formar tumores secundários em outros locais do organismo (ALBERTS et al., 2011). A desregulamentação do ciclo celular também é uma característica comum do processo de carcinogênese. O ciclo celular é dividido em quatro fases: G1, S, G2 e M. Na fase G1 (gap 1 = interfase), a célula aumenta de tamanho e prepara-se para copiar seu DNA. A replicação ocorre na fase seguinte, chamada de S (síntese) e permite que a célula duplique precisamente seus cromossomos. Depois, inicia-se a fase G2 (gap 2), durante a qual a célula prepara-se para a fase M (mitose) – na qual a célula-mãe, aumentada, finalmente divide-se ao meio, para produzir duas célulasfilhas, com igual número de cromossomos (MALUMBRES; BARBACID, 2009; RIVOIRE et al., 2001). No câncer, as células se reproduzem em um ritmo muito além dos limites normalmente regulados do ciclo celular, podendo formar tumores malignos. Felizmente, a prevenção do câncer geralmente ocorre através da regulação do ciclo celular por grupos de proteínas que interagem entre si em uma sequência específica de eventos que determinam se o ciclo celular irá continuar ou permanecer parado entre as fases (CHOW, 2010). 29 Sendo o câncer uma doença complexa que resulta de alterações simultâneas em genes geralmente relacionados à proliferação e à morte celular, considera-se estes eventos críticos no desenvolvimento da carcinogênese (FEO et al., 2006; KANUNFRE et al., 2004; PARMIGIANI; CAMARGO, 2010). Existe uma ligação inegável entre inflamação e câncer. Já foi confirmada a presença de células inflamatórias no interior de tumores e que estes podem surgir em locais de inflamação crônica. Esta observação foi feita há 150 anos e levou à conclusão de que a inflamação contribui significativamente para o desenvolvimento de câncer. Atualmente, evidências epidemiológicas indicam que mais de 25% dos tipos de câncer estão relacionados a infecções crônicas e outros tipos de inflamação (HUSSAIN; HARRIS, 2007; SCHETTER; HEEGAARD; HARRIS, 2010). Ambas as vias de inflamação, extrínseca e intrínseca podem levar ao processo de carcinogênese. Na via extrínseca as condições inflamatórias facilitam o desenvolvimento do câncer, e na intrínseca as próprias células tumorais estimulam o início do processo inflamatório, estabelecendo assim um microambiente favorável ao desenvolvimento tumoral. É por essa razão que, independente da origem do tumor, geralmente existem células inflamatórias ao seu redor (SCHETTER; HEEGAARD; HARRIS, 2010; VENDRAMINI-COSTA, 2012). 3.2 Produtos naturais e agentes anticâncer As plantas têm uma longa história de uso no tratamento de câncer, servindo como fonte de agentes terapêuticos desde muitos séculos, sendo elas próprias utilizadas ou servindo como base para o desenvolvimento de drogas sintéticas. (CRAGG; NEWMAN, 2014; MARCHETTI et al., 2012). Atualmente, mais de 50% de todos os medicamentos disponíveis no mercado são originados a partir de fontes naturais, dos quais mais de 70% de agentes anticâncer tem a sua origem em fontes naturais, devido à sua acessibilidade e abundância (CHINEMBIRI et al., 2014). Um dos principais motivos que faz dos produtos naturais fontes ricas de compostos com potencial terapêutico é que grande parte deles são metabólitos secundários produzidos pelos organismos com a função de defesa, podendo ser tóxicos e, portanto, com potenciais antiproliferativos ou irritativos. Estes metabólitos são, em geral, evolutivamente selecionados para se ligarem a macromoléculas, 30 representando estruturas privilegiadas - excelentes moldes para a síntese de novas moléculas. (CRAGG; GROTHAUS; NEWMAN, 2009). De 1960 a 1982, o NCI realizou um programa de coleta de plantas, com o objetivo de descobrir agentes anticâncer derivados destas (CHINEMBIRI et al., 2014). Hartwell (1982), na sua revisão de plantas usadas contra o câncer, listou mais de 3000 espécies de plantas que têm sido utilizadas no tratamento desta doença. Os primeiros agentes derivados de plantas a serem utilizados na prática clínica foram os chamados alcaloides da Vinca, vinblastina e vincristina (Figura 1), isolados da Catharanthus roseus G. Don., uma pequena planta endêmica de Madagascar utilizada popularmente no tratamento de diabetes (CRAGG; NEWMAN, 2005; CRAGG; NEWMAN, 2013). Figura 1. Estrutura química dos alcaloides da Vinca, vinblastina e vincristina. H N HO H N H O N H O O O O HO N H R O O Vinblastina: R=CH3 / Vincristina: R=CHO Durante os testes de atividade hipoglicemiante, os extratos da C. roseus reduziram a contagem de leucócitos do sangue e causaram supressão da medula óssea em ratos, sugerindo avaliação em modelos de leucemias e linfomas. Análogos semissintéticos mais recentes destes agentes, a vinorelbina e a vindesina, são utilizados principalmente em combinação com outros quimioterápicos para o tratamento de uma variedade de cânceres, incluindo leucemias, linfomas, câncer testicular, câncer de mama, pulmão, e sarcoma de Kaposi (CRAGG; NEWMAN, 2005). Os medicamentos de fontes naturais que fazem parte da guerra contra o câncer incluem os já mencionados alcalóides da Vinca (vimblastina, vincristina, 31 vindesina, vinorelbina), os taxanos (paclitaxel, docetaxel), a podofilotoxina, a camptotecina e seus derivados (topotecan, irinotecan), as antraciclinas e outros (BHANOT; SHARMA; NOOLVI, 2011; CRAGG; NEWMAN, 2013). Uma descoberta importante na área de câncer foi o taxano paclitaxel (Taxol®) (Figura 2), isolado a partir da casca da Taxus brevifolia em 1962. Este mostrou excelente atividade anticancerígena in vitro, e em 1977 começaram os testes préclínicos pelo NCI. Finalmente foi aprovado pelo FDA (Food and Drug Administration) para uso clínico contra o câncer de ovário em 1992 e contra o câncer de mama em 1994 (BRANDÃO et al., 2010). O sucesso do paclitaxel gerou estudos extensos sobre a síntese de análogos, e o primeiro a ser desenvolvido foi o docetaxel (Taxotere®) (CRAGG; NEWMAN, 2013). Uma vez que o paclitaxel teria que ser extraído de espécies que levam décadas para crescer e é produzido em quantidades muito baixas (0,01-0,03%), a introdução desse na terapêutica teve que esperar pelo desenvolvimento da síntese química e pela descoberta de precursores obtidos de fontes renováveis. O problema foi contornado quando pesquisadores identificaram a presença, em grande quantidade, da 10-desacetilbaccatina III (10-DAB), nas folhas da Taxus baccata. Tal molécula pode ser convertida em paclitaxel e em docetaxel (BRANDÃO et al., 2010). Figura 2. Estrutura química do taxano paclitaxel (Taxol®). O O O NH O OH O H O OH OH O O O O O Outra adição importante no arsenal de fármacos para o anticâncer é a classe de agentes clinicamente ativos derivados de camptotecina (Figura 3), isolada a partir da árvore ornamental chinesa, Camptotheca acuminata Decne (Nyssaceae) (RAHIER; THOMAS; HECHT, 2005). 32 Figura 3. Estrutura química da camptotecina. O N N O H3C HO O O uso da camptotecina foi avançado para ensaios clínicos pelo NCI na década de 1970, mas foi abandonada devido à toxicidade grave na bexiga. Uma extensa pesquisa levou ao desenvolvimento de derivados mais eficazes, como o topotecano e o irinotecano. O topotecano é usado para o tratamento de câncer de pulmão (tipo pequenas células) e de ovário, enquanto o irinotecano é utilizado para o tratamento de câncer colorretal (CRAGG; NEWMAN, 2005). Considerando que o Brasil possui a maior biodiversidade do planeta, com uma riquíssima flora distribuída em diferentes biomas, inúmeras plantas brasileiras nativas e exóticas vêm sendo estudadas para avaliar seu potencial anticancerígeno (CAMPOS et al., 2014). Como exemplo, pode-se citar as espécies Allamanda schottii e Allamanda blanchettii. Extratos etanólicos das raízes destas plantas demonstraram uma elevada atividade citotóxica na linhagem leucêmica K-562 e em cultura de células endoteliais. Os extratos apresentaram efeito citostático nas células K-562 em uma concentração de 80 g/L, sendo citotóxico a 400 g/L. Efeitos citostáticos e citotóxicos foram também verificados nas células endoteliais, entretanto, em concentrações 5 a 10 vezes inferiores às necessárias para células da linhagem leucêmica. Estes resultados são promissores, tornando as raízes das duas espécies bons alvos como possíveis agentes anticâncer (CAMPOS et al., 2014; SCHMIDT et al., 2006). Entre os compostos isolados do gênero Allamanda que demonstraram atividade citotóxica vale salientar a elevada atividade dos iridóides plumericina e isoplumericina em células tumorais de câncer de mama, cólon, pulmão e melanoma (ABDEL-KADER et al., 1997; ABE; YAMAUCHI, 1988; ANDERSON; CHANG; MCLAUGHLIN, 1988; CAMPOS et al., 2014; KUPCHAN et al., 1974). 33 As descobertas de novas substâncias de origem vegetal que atuam no combate ao câncer têm incentivado várias pesquisas nessa área. Número significativo de substâncias naturais provenientes de plantas estão em estudo clínico para serem utilizados no tratamento do câncer. (CRAGG; NEWMAN, 2014). Com o avanço da tecnologia, alguns dos agentes que falharam em estudos clínicos anteriores, estão sendo estudados novamente. Com a rápida identificação de novas proteínas que possuem efeitos reguladores importantes sobre a progressão tumoral, moléculas isoladas a partir de produtos naturais estão provando ser uma importante fonte de novos inibidores da ação destas proteínas, e têm o potencial para o desenvolvimento de agentes anticâncer seletivos (CRAGG; NEWMAN, 2005). A descoberta e desenvolvimento de fármacos anticâncer exige uma estreita colaboração multidisciplinar, junto com a otimização através da aplicação da química combinatória e medicinal, síntese, bioquímica, tudo combinado com a biologia (CRAGG; NEWMAN, 2014). 3.2.1 Plantas com possível atividade anticâncer selecionadas para este estudo As plantas foram selecionadas para o estudo devido a dois fatores: uso atual na medicina popular como agente anticâncer (Synadenium grantii) e por apresentarem atividade antimicrobiana e anti-inflamatória já comprovadas (Cipura paludosa, Epidendrum mosenii e Maytenus robusta). Evidências demostram que agentes antimicrobianos possuem efeitos antiproliferativos e/ou citotóxicos tanto in vitro como in vivo (ALIBEK et al., 2012). Além disso, vários estudos epidemiológicos, clínicos e experimentais estabeleceram os medicamentos anti-inflamatórios como promissores agentes anticâncer (FAJARDO; PIAZZA, 2015; RAO; REDDY, 2004). 3.2.1.1 Synadenium grantii Hook f. (Euphorbiaceae) A família Euphorbiaceae é complexa e heterogênea e contém cerca de 300 gêneros e 7.000 espécies que foram identificadas em todo o mundo (BITTNER et al., 2001). Análises fitoquímicas identificaram a presença de flavonoides, saponinas, 34 terpenos, alcaloides, taninos e lecitinas (DE OLIVEIRA et al., 2013; PREMARATNA; SHADAKSHARASWAMY; NANJAPPA, 1981). O gênero Synadenium, que pertence à família Euphorbiaceae, tem sido associado a algumas propriedades farmacológicas relevantes, tais como anticâncer (PREMARATNA; SHADAKSHARASWAMY; NANJAPPA, 1981), anti-inflamatória (SOUZA; AMANCIO-PEREIRA; CARDOSO, 2005), ação fibrinolítica (RAJESH et al., 2006) e imunorregulação (ROGERIO et al., 2007). A espécie Synadenium grantii Hook (Figura 4) é um arbusto de origem africana que pode atingir de 2,5 a 3 metros de altura e possui característica de elevada toxicidade. É conhecida popularmente no Brasil como "Leiteiro" e “Janaúba” (ANDERSEN et al., 2010). Figura 4. Fotografia da planta identificada como Synadenium grantii. Fonte: Autor. O látex desta planta é utilizado empiricamente no tratamento de várias doenças, tais como alergias, distúrbios gástricos e, especialmente, o câncer. Em alguns estados brasileiros, as pessoas utilizam esse látex como uma preparação chamada garrafada (ORTÊNCIO, 1997). Tal como outras espécies da Família Euphorbiaceae, sabe-se que o látex é rico em compostos apolares (COSTA et al., 2012; DE OLIVERA et al., 2013). Estudos prévios demonstraram que o latex da S. grantii pode apresentar efeito antiulcerogênico (COSTA et al., 2012) e antitumoral (DE OLIVERA et al., 35 2013). Além disso, o extrato de clorofórmio das folhas desta planta apresentou atividade citotóxica em células MRC-5 (fibroblastos pulmonares humanos), e antiparasitária contra Trypanosoma cruzi, Trypanosoma brucei e Plasmodium falciparum (HASSAN; MOHAMMED; MOHAMED, 2012). Ensaios in vitro e in vivo demostraram atividade antioxidante e antiinflamatória significativa das cascas do caule da S. grantii. Estas atividades podem estar associadas com a presença de compostos fenólicos e terpenos (MUNHOZ et al., 2014). Outras investigações fitoquímicas indicaram a presença de terpenos e compostos fenólicos no extrato das cascas da S. grantii (COSTA et al., 2012). Alguns outros compostos foram encontrados nesta planta, tais como ésteres de forbol, triterpenos, antocianinas e substâncias não saponificáveis (ANDERSEN et al., 2010; BAGAVATHI; SORG; HECKER, 1988; COSTA et al., 2012; HASSAN; MOHAMMED; MOHAMED, 2012; MUNHOZ et al., 2014). São poucos os trabalhos científicos com a S. grantii que comprovam sua atividade anticâncer, apesar de ser largamente utilizada no Brasil. Neste contexto, é importante a realização de trabalhos com a finalidade de gerar informações relevantes sobre a espécie S. grantii através da determinação do perfil fitoquímico e avaliação desta possível atividade anticâncer. 3.2.1.2 Cipura paludosa (Iridaceae) A família Iridaceae é composta por aproximadamente 90 gêneros, incluindo o gênero Cipura (RAVENNA, 1988). Extratos e princípios ativos obtidos de plantas desta família apresentam inúmeras atividades biológicas, como antibacteriana, anticancerígena, antioxidante, citotóxica, antinociceptiva, anti-inflamatória e imunomoduladora (ABDULLAEV; ESPINOSA-AGUIRRE, 2004; HOSSEINZADEH; NORAEI, 2009; RAHMAN et al., 2003). Cipura paludosa (Figura 5) é uma monocotiledônea nativa brasileira encontrada na floresta amazônica, e popularmente conhecida como “batata-roxa”, “alho-do-mato” e "cebolinha-do -campo". É utilizada na medicina popular contra várias doenças, incluindo inflamações, infecções e afecções do trato renal, diarréia e processos dolorosos (CORREA,1994). 36 Figura 5. Bulbos frescos da Cipura paludosa. Fonte: Autor. Estudos indicaram uma série de atividades biológicas desta planta, incluindo efeitos antinociceptivo, anti-inflamatório e neuroprotetor, além de sua capacidade antioxidante e antiglutamatérgica (LUCENA et al, 2007; LUCENA et al, 2010; SILVANETO et al, 2014; TESSELE et al., 2011). Esta planta vem sendo estudada por pesquisadores do Núcleo de Investigações Químico-Farmacêuticas (NIQFAR) e pelo Programa de PósGraduação em Ciências Farmacêuticas (PPGCF) da UNIVALI. A partir dos bulbos da mesma, quatro derivados de naftaleno foram isolados e identificados: três compostos conhecidos: eleuterina, isoeleuterina e hongkonina (Figura 6 - A), e um novo componente recentemente isolado, 11-hidroxieleuterina (Figura 6 - B). Os dois principais compostos (eleuterina e isoeleuterina) exibiram atividade pronunciada em diferentes modelos in vivo de inflamação e hipernocicepção (TESSELE et al, 2011). Figura 6. Estrutura química dos compostos isolados dos bulbos da C. paludosa, hongkonina (A) e 11-hidroxieleuterina (B). H3C O OH H3C CH3 O O CH3 O O CH3 OH CH3 (A) O OH (B) 37 3.2.1.3 Epidendrum mosenii (Orchidaceae) A família Orchidaceae consiste uma das maiores famílias de plantas florais conhecias, abrangendo aproximadamente 750 gêneros e mais de 30.000 espécies (KRAMER, 1989). A planta Epidendrum mosenii (Figura 7), membro desta família, é uma planta popularmente conhecida no Brasil como "orquídea da praia", crescendo geralmente perto da costa brasileira, inclusive no Vale do Itajaí, e usada em casas como uma planta ornamental (FERREIRA et al., 2000). Figura 7. Fotografia da planta identificada como Epidendrum mosenii. Fonte: ROSA, 2006. Estudo fitoquímico realizado por pesquisadores do NIQFAR da UNIVALI demonstrou a presença de esteroides e triterpenos nesta planta (FLORIANI et al., 1998). Também foi verificado ação analgésica, cujo efeito parece estar relacionado com os triterpenos folidotina e 24-metileno-ciclo-artanol em vários modelos experimentais in vivo (FERREIRA et al., 2000). Esta planta também é tradicionalmente utilizada no tratamento de processos infecciosos e dolorosos. Rosa e colaboradores (2007) demonstraram que 24metileno-ciclo-artanol é uma das principais substâncias ativas presentes na planta. Os resultados farmacológicos indicaram que a fração diclorometano foi ativa quando avaliada em teste de contorção abdominal em camundongos, sendo mais potente do que alguns medicamentos de referência utilizados como comparação. Os resultados 38 sugeriram que o efeito antinociceptivo da E. mosenii está relacionado, pelo menos em parte, à presença do 24-metileno-ciclo-artanol. Novaes e colaboradores (2001) verificaram que o extrato metanólico desta planta pode também ser utilizado como agente adjuvante no tratamento de diabetes mellitus, pois apresentou atividade hipoglicemiante significativa no teste de diabetes induzido com aloxano em ratos. 3.2.1.4 Maytenus robusta (Celastraceae) As plantas pertencentes à família Celastraceae são comuns em regiões tropicais e subtropicais (SPIVEY; WESTON; WOODHEAD, 2002). O gênero Maytenus é o maior desta família, compreendendo cerca de 225 espécies com importante valor terapêutico, como é o caso da Maytenus ilicifolia, conhecida popularmente como "espinheira-santa" (BRASIL, 2013; SANTOSOLIVEIRA; COULAUD-CUNHA; COLAÇO, 2009). Esta planta já é muito conhecida por apresentar atividade gastroprotetora, citotóxica, antioxidante, dentre outras (ARAÚJO-JÚNIOR et al., 2013; SANTOS-OLIVEIRA; COULAUD-CUNHA; COLAÇO, 2009; VELLOSA et al., 2006). Estudos fitoquímicos realizados com plantas pertencentes ao gênero Maytenus demonstraram a presença de muitas classes de constituintes, incluindo flavonoides, alcaloides e terpenos (DE SOUSA et al., 2008; NIERO et al., 2006; SOUSA et al., 2012; TIBERTI et al., 2007; YARIWAKE et al., 2005). A planta Maytenus robusta (Figura 8) é usada na medicina popular para tratar úlceras de estômago (BALBACH, 1980). Estudo recente demonstrou que o extrato hidroalcoólico desta planta exibe atividade gastroprotetora, inibindo significativamente a formação de úlceras induzidas usando diferentes modelos, bem como a sua capacidade para diminuir a secreção gástrica. Esses resultados foram semelhantes aos resultados observados em estudos realizados com a M. ilicifolia, que está atualmente em fase de extinção no Brasil. Como a M. robusta é muito bem adaptada para o Sul do Brasil, os resultados indicam que essa espécie poderia ser usada em preparações fitoterápicas como um substituto para M. ilicifolia. Além disso, este trabalho corrobora a indicação tradicional de M. robusta, contribuindo para sua validação farmacológica (ANDRADE et al., 2007). 39 Figura 8. Fotografia da planta identificada como Maytenus robusta. Fonte: BRASIL, 2013. Um novo triterpeno 3,15-dioxo-21α-hidroxi friedelano foi isolado a partir do extrato metanólico da Maytenus robusta e exibiu potentes efeitos dose-dependentes no teste de contorção abdominal em camundongos, sendo cerca de 10 vezes mais ativo do que a aspirina e paracetamol, usado como medicamentos de referência (NIERO et al., 2006). 3.2.2 Ésteres de Forbol Ésteres de forbol são membros da família tigliane dos diterpenos. São compostos policíclicos em que dois grupos hidroxilas, em átomos de carbono vizinhos, são esterificados em ácidos graxos (OSKOUEIAN; ABDULLAH; AHMAD, 2012a). Estes compostos são instáveis e sensíveis à oxidação, hidrólise, transesterificação, e epimerização durante procedimentos de isolamento (HAAS; STERK; MITTELBACH, 2002). Diversas plantas são conhecidas por apresentarem estes compostos, dentre elas, Sapium indicum, Sapium japonicum, Euphorbia frankiana, Euphorbia cocrulescence, Euphorbia ticulli, Croton spareiflorus, Croton tigilium, Croton ciliatoglandulifer, Jatropha curcas e Homalanthus nutans, todas da família Euphorbiaceae (BEUTLER et al., 1989). Estes compostos são conhecidos por apresentarem vários efeitos biológicos, como inflamação, promoção de tumor, proliferação e diferenciação celular. A maior parte das suas ações biológicas parecem ser mediadas através da ativação da proteína quinase C (PKC), que está envolvida na transdução de sinais e processos de desenvolvimento da maioria das células (DIMITRIJEVIĆ et al., 1996; GOEL et al., 2007). Contraditório com esta capacidade de promoção tumoral, há relatos de 40 atividade apoptótica em células tumorais relacionada à presença dos ésteres de forbol. Observou-se que muitos tipos de células malignas sofrem inibição de seu crescimento ou apoptose em resposta à ativação da PKC por estes compostos (GOEL et al., 2007; GONZALEZ-GUERRICO; KAZANIETZ, 2005). Estudo recente demonstrou que ésteres de forbol isolados da espécie Jatropha meal diminuíram a expressão de genes promotores de tumor, e foram citotóxicos contra as linhagens celulares de câncer de mama (MCF7) e câncer cervical (HeLa) de maneira concentração-dependente (OSKOUEIAN; ABDULLAH; AHMAD, 2012b). Além da atividade antitumoral, alguns ésteres de forbol inibem a replicação do vírus da imunodeficiência humana (HIV) e produzem mudanças estruturais no parasita Leishmania amazonensis (GOEL et al., 2007). 3.3 Modelos farmacológicos para avaliação da atividade anticâncer Atualmente, a combinação entre os modelos in vitro e in vivo tem sido uma boa estratégia para a descoberta de novos agentes anticâncer. Nos modelos in vitro, a linha de estudo segue para os ensaios de toxicidade, direcionando a pesquisa para compostos com potencial de matar células tumorais em cultura, numa correlação entre a concentração do fármaco utilizado e a resposta seletiva para alguma célula tumoral. Estes estudos in vitro abordam informações básicas sobre a célula tumoral e a busca por novos alvos moleculares (CARVALHO et al., 2014; CHABNER; ROBERTS JR, 2005). A utilização de modelos biológicos in vitro e in vivo na descoberta da atividade farmacológica de novos agentes é de extrema importância, principalmente no Brasil, pela sua imensa biodiversidade de plantas com potencial terapêutico (COSTA, 2011; NASCIMENTO et al., 2000; VILLAS BÔAS; GADELHA, 2007). Ensaios baseados em células são muitas vezes usados para triagem de conjuntos de compostos para determinar se as moléculas de teste têm efeitos sobre a proliferação celular ou mostram efeitos citotóxicos diretos que eventualmente conduzem à morte celular (RISS et al., 2013). A consolidação da metodologia in vitro para avaliação de espécies vegetais tem permitido a avaliação de centenas de extratos, frações, compostos ativos e substâncias obtidas por síntese. Com este aprimoramento da metodologia de cultura 41 de células foi possível o cultivo de diversas linhagens celulares oriundas de neoplasias humanas, possibilitando o desenvolvimento da metodologia para triagem in vitro. Com esse objetivo, o NCI desenvolveu um painel de células que atualmente conta com 60 linhagens provenientes de nove tipos de tumores humanos: leucemia, cólon, mama, rim, cérebro, melanoma, ovário, pulmão e próstata. Dessa forma podese avaliar um número elevado de drogas em diferentes tipos de células neoplásicas, possibilitando a descoberta de compostos com maior especificidade (BAGULEY, 2002; CARVALHO, 2006; SHOEMAKER, 2006). A disponibilidade de linhagens celulares bem caracterizadas permite ensaios de triagem em que o efeito de um candidato a fármaco sobre a proliferação de várias linhas de células tumorais pode ser determinado (HOGENESCH; NIKITIN, 2012). Estas linhagens celulares (Tabela 1) usadas para cultura em modelos in vitro são adquiridas de linhas estabelecidas e fornecidas por bancos celulares, como a American Type Culture Collection (ATCC) (FRESHNEY, 1994). Tabela 1. Principais linhagens celulares tumorais humanas utilizadas em ensaios de atividade antiproliferativa in vitro (ATCC; NCI). Nome Sigla Densidade de inoculação Adenocarcinoma colorretal HT-29 5000 Adenocarcinoma de mama MCF7 10000 Adenocarcinoma de ovário OVCAR-3 10000 Adenocarcinoma de ovário NCI/ADR-RES 15000 NCI-H460 7500 Adenocarcinoma de rim 786-0 10000 Adenocarcinoma de próstata PC-3 7500 Glioblastoma U251 7500 Leucemia mielóide crônica K-562 5000 Leucemia promielocítica aguda HL-60 40000 UACC-62 10000 MDA-MB-231 20000 resistente a multidroga Adenocarcinoma de pulmão, tipo não pequenas células Melanoma Triple negativa breast cancer 42 Atualmente as substâncias selecionadas pelos testes em cultura de células (in vitro) estão sendo avaliadas em modelos experimentais de câncer utilizando animais de laboratório (in vivo) (CARVALHO, 2006). A realização de estudos com modelos in vivo tem a finalidade de confirmar a atividade anticâncer observada nos ensaios in vitro, superando as limitações deste. Aliada à eficácia dos modelos in vivo, está a avaliação acerca da toxicidade e os mecanismos de ação dos novos compostos, permitindo a obtenção de informações acerca da farmacocinética e farmacodinâmica destes compostos (CARVALHO et al., 2014; HOGENESCH; NIKITIN, 2012;). 3.3.1 Ensaios para avaliar a atividade antiproliferativa in vitro A avaliação da proliferação celular tem como principal objetivo testar a atividade biológica de vários compostos, avaliando a capacidade de inibir o crescimento de células tumorais. Geralmente é o primeiro passo para avaliação dos produtos naturais candidatos a novos fármacos anticâncer (ALBERTS et al., 2008). Para a avaliação da atividade antiproliferativa, os testes mais utilizados são os de citotoxicidade in vitro com células tumorais, sendo o teste do MTT (MOSMANN,1983) e o teste da Sulforrodamina B (SKEHAN et al., 1990) os mais aplicados na rotina de triagem de compostos com potencial anticâncer pelo NCI (HOLBECK, 2004). Estes ensaios permitem avaliar grande número de compostos em pouco tempo, possibilitando a descoberta de novos fármacos anticâncer. Desta forma, a maior parte dos quimioterápicos usados hoje na terapêutica foram selecionados pela capacidade de controlar a proliferação celular (BOGO, 2012; DE ALMEIDA et al., 2005; SUGGITT; BIBBY, 2005). Independentemente do tipo de ensaio in vitro a ser utilizado, é importante saber quantas células remanescentes são viáveis no fim do experimento (RISS et al., 2013). A sulforrodamina B (SRB) foi primeiramente introduzida na triagem de drogas anticâncer, e atualmente tem sido amplamente empregada para a avaliação da citotoxidade e proliferação celular em ensaios em microplacas (LIN; HOULT; RAMAN, 1999; SKEHAN et al., 1990). A SRB é um corante proteico que, em condições moderadamente ácidas, se liga a aminoácidos básicos da proteína celular, e se dissocia em condições básicas. 43 A ligação da SRB é estequiométrica, e a quantidade de corante extraído de células pigmentadas é diretamente proporcional a massa total de proteína e, portanto, correlacionada com o número de células (PAPAZISIS et al., 1997, VICHAI; KIRTIKARA 2006). Este corante se liga aos resíduos de aminoácidos básicos das proteínas de células viáveis. Portanto, quanto maior a quantidade de SRB ligada ao compartimento, menor a atividade antiproliferativa da amostra testada, pois há mais células viáveis (MONKS et al., 1991; SKEHAN et al., 1990). O princípio do ensaio da SRB baseia-se na habilidade que tem este composto de se ligar a componentes proteicos das células, fixados pelo ácido tricloroacético; ou seja, o método independe da atividade metabólica das células, ao contrário do MTT que depende de uma enzima mitocondrial (HOUGHTON et al., 2007). Um dos agentes mais utilizados para a avaliação de viabilidade e proliferação celular é o metil-tiazolil-tetrazólio, conhecido como MTT (brometo de 3-[4,5dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazólio), que foi descrito por Mosmann em 1983. O sal MTT, de coloração amarela, é reduzido na mitocôndria das células vivas, através da clivagem da enzima mitocondrial succinato desidrogenase, em cristais de formazan, de coloração púrpura. Para a grande maioria das linhagens celulares, há uma relação linear entre a quantidade de formazan formado e o número de células vivas, dentro de uma faixa de densidade celular (BHATIA; YETTER, 2008; CARVALHO et al., 2014). Quando as células morrem, elas perdem a capacidade de reduzir o MTT a cristais púrpuros de formazan, assim a cor púrpura serve como um marcador de células vivas. Dessa maneira a quantidade de formazan, medida por espectrofotometria (com absorbância perto de 570nm), é diretamente proporcional ao número de células viáveis. (MARSHALL; GOODWIN; HOLT, 1995). Um aspecto muito discutido atualmente sobre o MTT diz respeito à exata localização celular da reação de redução que gera o formazan. Desde o início da utilização deste método, assumiu-se que a redução do MTT para formazan acontecia por ação de desidrogenases mitocondriais. A consequência desta explicação foi assumir que o MTT é reduzido dentro da mitocôndria (CARVALHO et al., 2014). 44 45 4 MATERIAL E MÉTODOS 4.1 Material vegetal A seleção das plantas estudadas no presente trabalho se deu de duas formas: reavaliação de plantas, já estudadas pelo grupo do NIQFAR, com potencial biológico em experimentos que possam indicar algum indício de ação anticâncer (antimicrobiano, anti-inflamatório, etc.), como a C. paludosa, E. mosenii, e M. robusta; prospecção de plantas usadas contra o câncer, conforme indicações da medicina popular, como a S. grantii. Na Tabela 2 estão apresentadas todas as plantas, as partes utilizadas, assim como a data e o local de coleta. Tabela 2. Plantas e suas partes coletadas para realização do trabalho. Planta Synadenium Partes Data / local 1ª Data / local 2ª Data / local 3ª utilizadas coleta coleta coleta Caule e folhas Março 2013 – Agosto 2013 – Março 2014 – Itajaí (SC) Itajaí (SC) Itajaí (SC) Março 2013 – Agosto 2013 – Sem coleta Itajaí (SC) Itajaí (SC) grantii Cipura Bulbo e raíz paludosa Epidendrum Caule, folhas e Fevereiro 2013 Sem coleta mosenii raíz Sem coleta Jaguaruna (SC) Maytenus robusta Raíz Março 2013 – Sem coleta Sem coleta Ilhota (SC) As plantas foram coletadas no mesmo local nas diferentes épocas indicadas na Tabela 2. Todas as plantas foram identificadas pelo Dr. Oscar B. Iza (Departamento de Botânica da Universidade de Vale do Itajaí). Um comprovante de amostra foi depositado no Herbário Barbosa Rodrigues em Itajaí, Santa Catarina, sob número de excicata VC Filho 118, 108, 003 e 012 para Synadenium grantii, Cipura paludosa, Epidendrum mosenii e Maytenus robusta, respectivamente. 46 4.2 Análise fitoquímica O material vegetal selecionado, conforme a Tabela 2, foi moído e submetido a um processo de maceração com metanol à temperatura ambiente, por um período de uma semana. Após, o solvente foi removido por destilação em rotaevaporador sob pressão reduzida, para obtenção do respectivo extrato metanólico bruto (EMB). O EMB da S. grantii foi solubilizado com os solventes de polaridade crescente: acetona e metanol. Após triagem da atividade antiproliferativa dos extratos e frações, as duas plantas que apresentaram resultados promissores (caule da S. grantii e bulbos da C. paludosa), foram submetidas à nova coleta e a procedimentos cromatográficos usuais, como cromatografia em camada delgada (CCD), cromatografia em coluna (CC) e cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) (CECHINEL FILHO; YUNES, 1998; MALHEIROS et al., 2010), visando o isolamento e a purificação dos possíveis princípios ativos presentes nessas espécies. 4.2.1 S. grantii Caules frescos (1 Kg) da S. grantii foram cortados em pedaços pequenos e submetidos a extração por maceração com metanol à temperatura ambiente durante sete dias. Após filtração, o solvente foi removido por evaporação sob pressão reduzida em rotaevaporador com controle de temperatura em aproximadamente 50 oC. O EMB obtido (31 g) teve um rendimento de 3,1%. Este foi então resuspendido em uma mistura de metanol:H2O (50:50) e submetido a partição líquido-líquido, utilizando os solventes de polaridade crescente, clorofórmio (CHCl3) e acetato de etila (AE), para a obtenção das respectivas frações, conforme metodologia anteriormente descrita (CECHINEL FILHO; YUNES, 1998; MALHEIROS et al., 2010). Todas as frações foram concentradas em rotaevaporador, tendo como rendimento 2,55% a fração CHCl3 (790 mg) e 5,81% a fração AE (1,8 g). Na Figura 9 está apresentado o fluxograma da obtenção das frações do caule da S. grantii na 2ª coleta. 47 Figura 9. Fluxograma da obtenção das frações do caule da S. grantii - 2ª coleta. Por apresentar melhor resultado na triagem da atividade antiproliferativa realizada com a 1ª coleta, 700 mg da fração CHCl3 (mais apolar) passou por um processo de CC aberta (Ø 3,5 x 50 cm), tendo como fase estacionária sílica gel 60 (Merck) (40 g) de granulometria 70-230 mesh (0,063 - 0,20 mm), eluída com gradiente de hexano e hexano:AE em polaridade crescente (hexano, 100 mL; 90:10, 100 mL; 80:20, 100 mL; 70:30, 100 mL; 50:50, 100 mL; AE, 100 mL). Foram coletadas 50 subfrações de aproximadamente 20 mL cada. As frações foram reunidas conforme perfil semelhante, através de CCD (cromatoplacas de sílica gel 60 F254 - Merck), utilizando hexano:acetona (80:20) como fase móvel. As placas foram reveladas em câmara de UV (254nm) e com anisaldeído sulfúrico com aquecimento a 100°C. As frações que exibiram o mesmo perfil cromatográfico foram reunidas e, quando impuras, nova CC foi realizada. Visando o isolamento e a purificação dos possíveis princípios ativos presentes na espécie em estudo, nova coleta do caule (2,5 kg) foi realizada (3ª coleta). O mesmo foi cortado em pedaços pequenos e submetido ao processo de maceração com metanol, por um período de uma semana. 48 Após filtração, o solvente foi removido por evaporação sob pressão reduzida em rotaevaporador (temperatura em aproximadamente 50 oC), para obtenção do respectivo EMB, com rendimento de 2,2% (55 g). Este foi então particionado com os seguintes solventes de polaridade crescente: CHCl3 (2,4 g / rendimento de 4,36%) e AE (1,1 g / rendimento de 2%). A Figura 10 apresenta o fluxograma da obtenção das frações do caule da S. grantii na 3ª coleta. Figura 10. Fluxograma da obtenção das frações do caule da S. grantii - 3ª coleta. A fração CHCl3 (2 g) foi utilizada para realização de CC (Ø 3,5 x 50 cm), tendo como fase estacionária sílica gel 60 (40 g), eluída com gradiente de hexano e hexano:AE em polaridade crescente (hexano, 100 mL; hexano:AE (95:05), 100 mL; 90:10, 100 mL; 85:15, 200 mL; 80:20, 200 mL; 70:30, 300 mL; 60:40, 200 mL; AE, 200 mL). Foram coletadas 73 frações de aproximadamente 20 mL cada. As frações foram reunidas conforme perfil semelhante, através de CCD, utilizando hexano:acetona (80:20) como fase móvel. As placas foram reveladas por UV (254nm) e com anisaldeído sulfúrico com aquecimento a 100°C. As frações que 49 exibiram o mesmo perfil cromatográfico foram reunidas e quando impuras foram purificadas por cromatografia flash (CC: Ø 1,5 x 30 cm), tendo sílica gel 60 (15 g) de granulometria 230-400 mesh (0,04 – 0,063 mm) como fase estacionária. 4.2.2 C. paludosa Os bulbos frescos (1 kg) da C. paludosa foram cortados em pedaços pequenos e extraídos por maceração com metanol à temperatura ambiente durante sete dias. Após filtração, o solvente foi removido por evaporação sob pressão reduzida em rota evaporador com controle de temperatura em aproximadamente 50 oC. O EMB (28 g) obtido teve um rendimento de 2,8%. Parte do EMB (13 g) passou pelo processo de CC (Ø 5,0 x 50 cm), tendo como fase estacionária sílica gel 60 (50 g), eluída com gradiente de hexano e hexano:AE em polaridade crescente (hexano, 200 mL; 90:10, 200 mL; 80:20, 200 mL; 70:30, 300 mL; 50:50, 200 mL; AE 200 mL). Frações de 10 mL foram coletadas e avaliadas por CCD utilizando hexano:AE (80:20) como fase móvel. As placas foram reveladas em câmara de UV (254 nm) e anisaldeído sulfúrico com aquecimento de 100°C. As frações que exibiram o mesmo perfil cromatográfico foram reunidas, quando impuras foram purificadas por CC ou cromatografia flash. 4.2.3 Análise da variação sazonal A análise da variação sazonal foi realizada pela metodologia de CLAE. Foi utilizado um sistema LC Shimadzu LC-20AT (Shimadzu, Tóquio, Japão), composto por um foto detector por arranjo de diodos SPD-M20A, um amostrador automático SIL-20AHT e software LC-Solution (Shimadzu, Tóquio, Japão). As amostras foram diluídas em metanol a 1 mg/ml. As injeções da amostra (20 µL) foram realizadas em coluna Coluna Phenomenex® Sinergy 4µm Hydro-RP 80A (150 x 4,60 mm) condicionada a 40°C. A fase móvel consistiu em água ultrapura, acetonitrila e metanol, e foi eluída em um sistema de gradiente de 37 minutos, conforme a Tabela 3. As análises foram monitorizadas entre 210 e 240 nm. Todos os solventes utilizados foram de grau CLAE. 50 Tabela 3. Sistema de solventes utilizados para técnica de CLAE. Tempo (min) Água ultrapura (%) Acetonitrila (%) Metanol (%) 0 90 8 2 10 58 40 2 20 8 90 2 37 90 8 2 4.3 Identificação dos compostos Para elucidar e caracterizar quimicamente os compostos purificados, foram utilizados dados espectroscópicos usuais como Infravermelho (IV), Ressonância Magnética Nuclear de hidrogênio (RMN-1H) e carbono 13 (RMN-13C) e CLAE (MALHEIROS et al., 2010). Para elucidação estrutural dos compostos isolados, foram utilizados os dados de RMN-1H e RMN-13C. Ambas as técnicas foram realizadas no espectrômetro BRUKER AC-300F 300 MHz, tendo como referência interna o tetrametilsilano (TMS) ou o próprio solvente. Os deslocamentos químicos foram registrados em valores adimencionais (ppm). A avaliação dos espectros obtidos dos compostos puros foi acompanhada com o auxílio de tabelas que indicam deslocamentos químicos para hidrogênios e carbonos em comparação com trabalhos encontrados na literatura. Todas as análises foram supervisionadas pelo Professor Dr. Franco Delle Monache da Universidade de La Sapienza, Roma (Itália). As análises espectrométricas por IV foram realizadas em espectrômetro interfotométrico Fourier Transform Infrared IRPrestige 21 (SHIMADZU), pelo método de reflectância difusa – DRIFTS. Os espectros foram obtidos registrando transmitância versus número de onda (cm-1) e foram corrigidos pelo algoritmo Kubelka Munk. Para análise através da CLAE, foi utilizado o mesmo equipamento da análise da variação sazonal (item 4.2.3). As amostras foram diluídas em metanol a 1 mg/ml, e as injeções das mesmas (20 µL) foram realizadas em coluna C18 Luna Phenomenex® (Wedelia) (250 x 4,6 mm, com espessura de película de 0,5 μm e 100 A), condicionada a 35°C. A fase móvel consistiu em acetonitrila (A) e água (pH 51 2,5 - ácido fosfórico) (B) e foi eluída em um sistema de gradiente, começando com 2% de A e após 98 minutos 100% de A. Isto foi seguido por um período de equilíbrio de 10 minutos antes da injeção da amostra seguinte. As análises foram monitorizadas a 210 nm. Todos os solventes utilizados foram de grau CLAE. 4.4 Atividade antiproliferativa in vitro 4.4.1 SRB Para a avaliação da atividade antiproliferativa in vitro, pelo método da SRB, foi realizado estágio no Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas (CPQBA) na Universidade de Campinas (UNICAMP) através da Rede Iberoamericana de Investigação em Câncer (RIBECANCER/CYTED/CNPq), sob a supervisão do Professor Dr. João Ernesto de Carvalho. A triagem para atividade antiproliferativa in vitro foi realizada em 4 linhagens de células tumorais humanas: U251 (glioma), MCF7 (mama), 786-0 (rim), NCI-H460 (pulmão, tipo não pequenas células). Valores GI50 (concentração necessária para inibir em 50% o crescimento celular) foram calculados para avaliação desta atividade. As frações e/ou compostos que apresentaram melhor atividade antiproliferativa foram novamente testados nas seguintes linhagens de células tumorais humanas: U251 (glioma), MCF7 (mama), NCI-ADR/RES (ovário com fenótipo de resistência a múltiplos fármacos), 786-0 (rim), NCI-H460 (pulmão, tipo não pequenas células), PC-3 (próstata), OVCAR-03 (ovário), HT-29 (cólon), K-562 (leucemia); e em uma linhagem não-tumoral humana: HaCat (queratinócito). Para avaliação foram utilizados os valores de GI50: Growth Inhibition 50 – concentração necessária para inibir 50% do crescimento celular e TGI: Total Growth Inhibition – concentração necessária para inibir totalmente o crescimento celular. A metodologia foi realizada conforme descrito por Vendramini-Costa (2012). No primeiro dia de experimento, a suspensão celular foi preparada com meio RPMI (meio de cultura Roswell Park Memorial Institute) com 5% de soro fetal bovino (SFB) e penicilina-estreptomicina (2 mg/L), e ajustada em sua respectiva densidade de inoculação. Foram aplicados 100 µl de suspensão celular em placas de 96 poços (Figura 11), que foram incubadas por 24 horas a 37°C em atmosfera de 5% de CO2 52 e ambiente úmido. Foi também preparada uma placa controle (placa T0), com todas as linhagens celulares utilizadas no experimento. As amostras (extratos, frações e compostos puros) foram diluídas em solução de dimetilsulfóxido (DMSO) (Merck®) na concentração de 0,1 g/mL. Para a adição à cultura de células, estas soluções foram diluídas em pelo menos 400 vezes em RPMI com 5% de SFB e penicilina-estreptomicina (2 mg/L), evitando a toxicidade do DMSO. As amostras foram adicionadas nas concentrações de 0,25; 2,5; 25 e 250 µg/mL, (100 µL/poço) em triplicata, e incubadas por 48 horas a 37°C em atmosfera de 5% de CO2 e ambiente úmido. Como controle positivo foi utilizado o quimioterápico doxorrubicina, nas concentrações de 0,025; 0,25; 2,5 e 25 µg/mL (100 µL/compartimento) em triplicata. Figura 11. Placa de 96 poços utilizada nos testes de atividade antiproliferativa in vitro. Fonte: VENDRAMINI-COSTA, 2012. No momento de adição das amostras, as células inoculadas na placa controle T0 foram fixadas com a adição de 50 µL/poço de ácido tricloroacético (TCA) a 50% (Sigma®) para determinação da quantidade de células presentes no momento em que as amostras foram aplicadas, sendo este o valor basal 0. O TCA atua como um 53 fixador, precipitando proteínas. Células viáveis se mantém fixas na placa, enquanto células não viáveis se desprendem, sendo lavadas. Após 48 horas de tratamento as células tratadas também foram fixadas com TCA a 50% e incubadas por 1 hora a 4°C. Em seguida, as placas foram submetidas a quatro lavagens consecutivas com água corrente e foram mantidas à temperatura ambiente até a secagem completa. Após a secagem, foram adicionados 50 µL/poço do corante proteico SRB (Sigma®) a 0,4% dissolvido em ácido acético a 1% e a seguir as placas foram incubadas à temperatura ambiente por 30 minutos. Estas foram então lavadas por 4 vezes consecutivas com solução de ácido acético 1% e, após secagem completa à temperatura ambiente, o corante ligado às proteínas celulares foi solubilizado com 150 µL/poço de Trizma Base (10µM, pH 10,5) (Sigma®). A leitura espectrofotométrica da absorbância foi realizada em leitor de microplacas a 540nm (Molecular Devices®, modelo VersaMax). A porcentagem de inibição do crescimento de cada amostra testada foi calculada segundo Carvalho e colaboradores (2014), sendo que T equivale a média da absorbância da célula tratada, C o controle de célula e T0 o controle das células no dia da adição das amostras. Se T > C, a amostra estimulou o crescimento = proliferação celular Se T ≥ T0 e < C, a amostra apresentou efeito citostático (inibição do crescimento) e a fórmula utilizada foi 100 X [(T-T0) / (C-T0)]; Se T < T0, a amostra apresentou efeito citocida (morte celular) e a fórmula utilizada foi 100 X [(T-T0) / (T0)]. O resultado obtido foi subtraído de 100%, obtendo-se então a porcentagem de crescimento. Os dados de absorbância foram analisados e compilados na elaboração de gráficos relacionando a porcentagem de crescimento celular com a concentração da amostra. As amostras foram consideradas ativas quando apresentaram inibição de crescimento maior que 50%. Utilizando-se o software Origin®, realizou-se a regressão linear dos dados obtidos com as médias da porcentagem de crescimento e foram calculados os valores de TGI (T=T0) e GI50. 4.4.2 MTT Os compostos naturais isolados (na sua forma mais pura) que apresentaram melhores resultados na primeira avaliação da atividade antiproliferativa foram 54 selecionados para novos testes, tanto para confirmar tal atividade, como para descrever seu possível mecanismo de ação. Para isto, foi realizado novo estágio no Centro de Investigacion del Cancer na Universidad de Salamanca (Salamanca Espanha) através da RIBECANCER, sob a supervisão do Professor Dr. Atanásio Pandiella. Foram utilizadas as seguintes linhagens celulares de câncer de mama triplonegativo: MDA-MB231 e HBL100. As células foram cultivadas em meio de cultura DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium), suplementado com 10% de SFB e antibióticos, e mantidas a 37°C em atmosfera húmida, na presença de 5% CO2 e 95% de ar. As linhagens celulares foram obtidas da American Type Culture Collection (ATCC - Manassas, VA). O meio de cultura celular e SFB foram adquiridos da Invitrogen (Gaithersburg, MD, USA). A avaliação da proliferação celular foi realizada utilizando o ensaio de MTT, em que o mesmo é reduzido a cristais púrpuros de formazan pela mitocôndria de células vivas. Aumento no número de células é detectado pelo aumento da metabolização do MTT, e diminuição no número de células é refletida pela diminuição metabolização do mesmo (SEOANE et al., 2010). As células foram plaqueadas em placas de 24 poços a 8000 células/poço (MDA-MB231) e 150000 células/poço (HBL100) e cultivadas durante a noite em DMEM + 10% de SFB. No dia seguinte, um ensaio MTT foi realizado em uma placa e considerado o ponto de partida (dia 0). Nas outras placas, o meio foi substituído por de 1 mL de DMEM e 1 µL dos compostos nas concentrações 10 nM, 100 nM, 1 µM, 10 µM e 100 µM ou com 1 µL do controle DMSO, em quadruplicata. Após 72h de tratamento, foi realizado o ensaio de MTT. Cada poço das placas foi substituído por 110 µL de meio contendo MTT (5 mg/mL em tampão fosfato-salino [PBS]) e incubados por 1 hora. O meio foi então removido e 500 µL de DMSO foi adicionado a cada poço. As placas foram agitadas no escuro por 10 minutos para dissolver os cristais de MTT-formazan. A absorbância das amostras foi registada a 570 nm em leitor de placas com múltiplas cavidades (Tecan ULTRA Evolution, Männedorf, Switzerland). Os resultados são apresentados como média ± desvio padrão em quadruplicada (SEOSANE et al., 2010; YUSTE et al., 2005). Com base nesses resultados, o composto mais ativo foi escolhido para continuar os estudos avaliando mecanismo de ação (ciclo celular e apoptose) in vitro. 55 4.5 Análise do ciclo celular e apoptose Para a análise de ciclo celular, as células MDA-MB231 foram cultivadas em placas de cultura celular de 100 mm (300000 células por placa), e após 24 horas de crescimento, uma placa foi tratada com o composto na concentração de 100 µM e outra apenas trocado o meio de cultura celular. Após as 48 horas de tratamento em estufa, o meio de cultura das placas foi coletado e as células foram lavadas com PBS e incubadas com tripsina-EDTA. As mesmas foram coletadas em um tubo de citômetro e centrifugadas a 300 g por 5 minutos a 4°C. O sobrenadante foi aspirado, ficando as células no fundo do tubo. Foi adicionado 200 µL de PBS e 1 mL de etanol 70%. As células foram então guardadas em -20°C. No dia seguinte, as células foram centrifugadas a 300g por 10 minutos a 4°C. Foi aspirado novamente o sobrenadante e adicionado 500 µL de PBS e RNAse A (Sigma-Aldrich). As células foram então incubadas por 1 hora a 37°C. Após esse período, foi adicionado 2,5 µL Iodeto de Propídio (IP) – 1 mg/mL (SEOSANE et al., 2010). A análise do ciclo celular foi realizada no citômetro de fluxo Accuri C6 pelo software BD AccuriTM C6. Para avaliação da apoptose, as células foram plaqueadas e tratadas da mesma forma que para o protocolo de ciclo celular. Após a primeira centrifugação a 300 g por 5 minutos a 4°C, o sobrenadante foi aspirado e foi adicionado 100 µL de binding buffer e após Anexina V/FITC (BD Biosciences) e IP – 50 µg/mL. As células foram incubadas por 30 minutos no escuro e adicionado mais 400 µL de binding buffer (MONTERO et al., 2014; SEOSANE et al., 2010). A análise foi realizada no citômetro de fluxo Accuri C6 pelo software BD AccuriTM C6. 56 57 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO 5.1 Análise Fitoquímica 5.1.1 Caule da S. grantii Com base nos resultados em relação à atividade antiproliferativa deste trabalho, a fração mais apolar (CHCl3), com rendimento de 2,55%, do caule da S. grantii foi escolhida para realização de procedimentos cromatográficos (Figura 12). As subfrações obtidas foram analisadas por CCD e reunidas quando exibiram o mesmo perfil cromatográfico. A subfração 5-13 (118 mg), obtida com hexano:AE (90:10) foi recromatografada utilizando-se um sistema de solvente hexano:AE. As duas subfrações que apresentaram melhor perfil fitoquímico avaliado por CCD (Figura 13), 11-15 (37 mg) e 16-19 (26 mg), ambas com a possível característica de terpenos, pois apresentaram colocação azul e preto quando reveladas com anisaldeído sulfúrico, foram avaliadas na atividade antiproliferativa in vitro. Figura 12. Fluxograma de operações realizadas para purificação de substâncias da fração CHCl3 do caule da S. grantii. CC = Coluna cromatográfica; FM = Fase móvel; FE = Fase estacionária. 58 Figura 13. Cromatografia em camada delgada (CCD) das subfrações 11-15 e 16-19 da fração CHCl3 do caule da S. grantii. Fase móvel: hexano:acetona (80:20). Revelador: anisaldeído sulfúrico com aquecimento em placa aquecedora (100°C). Com o objetivo de isolar maior quantidade e identificar os compostos presentes, após nova coleta, foi realizada CC com 2 g da fração CHCl3 do caule da S. grantii. A partir de procedimentos cromatográficos em coluna aberta e flash, demonstrados na Figura 14, dois compostos puros foram obtidos, composto 1 e composto 2. Para elucidação e caracterização química destes compostos, foram utilizados dados de IV, RMN-1H, RMN-13C e CLAE. 59 Figura 14. Fluxograma de operações realizadas para obtenção de compostos puros da fração CHCl3 do caule da S. grantii. CC = Coluna cromatográfica; FM = Fase móvel; FE = Fase estacionária. O espectro de absorção no IV referente ao composto 1 (Figura 14) apresenta bandas de absorção com intensidade máxima em 2970,30 cm-1, referente à estiramento de Csp3H. Em 1724 e 1751cm-1 são observados estiramentos de C=O, em 1600 cm-1 estiramentos de C=C e entre 1000 e 1300cm -1 estiramentos de C-O. A partir destas informações pode-se inferir que o composto 1 apresenta o grupo funcional éster, além de insaturações que podem ser atribuídas a grupos alcenos e aromáticos. 60 Figura 15. Espectro de infravermelho (IV) do composto 1. Através da análise dos dados de RMN-1H e RMN-13C, o composto 1 foi identificado como o éster de forbol 20-fenilacetato de 3,4,12,13-tetraacetilforbol, demonstrado na Figura 16. Este composto é raro e seu isolamento foi relatado na literatura recentemente, a partir das folhas da S. grantii (HASSAN; MOHAMMED; MOHAMED, 2012). Os espectros de RMN-1H (Figura 17), RMN-13C (Figura 18) e DEPT (Figura 19) mostram a presença de quatro grupos metila δH 0.88 (3H, d, J = 4.5), 0.98 (3H, s), 1.04 (3H, s), 1.53 (3H, m) e em δC 15.60, 17.26, 28.63 e 15.08 referentes as metilas 18, 17, 16 e 19, respectivamente. Quatro grupos acetil foram verificados em δH 1.96 (3H, s), 2.02 (3H, s), 2.10 (3H, s) e 2.14 (3H, s); em δC 20.61, 20.74, 20.98 e 21.10 e em δC 169.78, 170.16, 170.78 e 170.91, relativos a carboxilas. Estes grupos estão ligados aos carbonos 3, 4, 12 e 13, respectivamente. Também se observa um grupo fenilacetil em δH 3.74 (2H, s), δC 41.62 e 169.96 C=O, além dos sinais relativos aos hidrogênios e carbonos aromáticos. Hidrogênios referentes a dois grupos olefinas tri-substituídos foram encontrados em δH 4.65 (1H, d, J = 10.8) e 5.16 (1H, dl, J = 13.2), cujos carbonos se encontram em δC 124.59, 129.19, 129.46 e 136.50. 61 Os dados de RMN encontram-se na Tabela 4, os quais foram comprovados com dados encontrados na literatura (HASSAN; MOHAMMED; MOHAMED, 2012) e estão de acordo com a estrutura da Figura 16. Figura 16. Estrutura molecular do composto 20-fenilacetato de 3,4,12,13tetraacetilforbol (composto 1). 62 Figura 17. Espectro de RMN-1H (CDCl3 300MHz) ampliado de 9.5 a 1.0 ppm do composto 20-fenilacetato de 3,4,12,13-tetraacetilforbol. 63 Figura 18. Espectro de RMN-13C (CDCl3 75MHz) ampliado de 10 a 170 ppm do composto 20-fenilacetato de 3,4,12,13-tetraacetilforbol. 64 Figura 19. Espectro de DEPT-135 do composto 20-fenilacetato de 3,4,12,13tetraacetilforbol (CDCl3 75MHz). 65 Tabela 4. Dados de RMN-1H, RMN-13C e DEPT do composto 1 (20-fenilacetato de 3,4,12,13-tetraacetilforbol) em comparação com dados da literatura*. Composto 1 1 Composto 1* δH δC δH δC 4.65 (1H, d, J=10.8Hz) 129.19 CH 4.66 (1H, dd, J=1.2 e 11.2Hz) 129.21b 2 136.53a 136.5 C 3 5.37 (1H, s) 4 70.76 CH 5.36 (1H, s) 66.59a 67.14 C 5 2.12–2.18 (2H, m) 6 38.88 CH2 70.82b 2.12–2.19 (2H, brd, J=12.8Hz) 38.90c 124.69a 124.59 C 7 5.16 (1H, dl, J=13.2Hz) 129.46 CH 5.16 (1H, brd, J=11.6Hz) 129.22b 8 1.39 (m) 26.37 CH 1.39 (1H, brd, J=9.2Hz) 26.44b 9 77.73a 77.43 C 10 1.10–1.17 (1H, m) 29.68 CH 1.11–1.16 (1H, m) 29.70b 11 2.32 (1H, m) 29.27 CH 2.29 (1H, dd, J=7.2 e 8.4Hz) 29.32b 12 5.10 77.00 CH 5.11 (1H, d, J=8.4Hz) 77.49b 13 14 66.55a 67.14 C 1.10–1.17 (1H, m) 15 29.68 CH 1.11–1.16 (1H, m) 29.69b 22.88a 22.88 C 16 1.04 (3H, s) 28.63 CH3 1.08 (3H, s) 28.65d 17 0.98 (3H, s) 17.26 CH3 0.97 (3H, s) 17.25d 18 0.88 (3H, d, J=4.5Hz) 15.60 CH3 0.86 (3H, d, J=7.2Hz) 15.60d 19 1.53 (m) 15.08 CH 1.53 (3H, d, J=1.2Hz, CH3-19) 15.10b 20 4.38 (2H, s) 60.58 CH2 4.38 / 4.64 (2H, brd, J=12.4Hz) 60.61c C=O CH2 169.94a 169.96 C 3.74 (2H, s) 41.62 CH2 3.72 (2H, s) 41.64c 1’ 134.08 C 134.14a 2’,6’ 129.60 CH 129.48b 3’,5’ 128.59 CH 128.59b 4’ 127.21 C 127.22a 3-OCOCH3 1.96 (3H, s) 169.78 C 2.00 (3H, s) 20.59d 20.61 CH3 4-OCOCH3 2.02 (3H, s) 170.16 C 2.01 (3H, s) 2.10 (3H, s) 170.78 C 2.10 (3H, s) 2.14 (3H, s) 170.91 C 21.10 CH3 170.74a 20.97d 20.98 CH3 13-OCOCH3 170.14a 20.72d 20.74 CH3 12-OCOCH3 169.74a 2.14 (3H, s) 170.88a 21.09d *HASSAN; MOHAMMED; MOHAMED, 2012. a: quaternário (C), b: terciário (CH), c: secundário (CH 2), d: primário (CH3). 66 Por semelhança observada através de CCD, foi realizada a técnica de CLAE para verificar a presença do composto 1 (tempo de retenção em ± 77 minutos) na subfração 11-15 da 1ª análise, confirmando a presença do mesmo (Figura 20). Figura 20. Análise por CLAE da subfração 11-15 da fração CHCl3 do caule da S. grantii e do composto 1 (20-fenilacetato de 3,4,12,13-tetraacetilforbol). O composto 2 ainda não foi identificado, mas está em fase de elucidação estrutural. A estrutura dos ésteres de forbol é dependente do esqueleto de carbono diterpeno tetracíclico conhecido como tigliane, que representa a porção de álcool fundamental destes compostos. Tigliane contém quatro anéis designados como A, B, C e D. Estes compostos têm sido isolados de plantas pertencentes à família Euphorbiaceae (DIMITRIJEVIĆ et al., 1996; EVANS, 1986; GOEL et al., 2007; OSKOUEIAN; ABDULLAH; AHMAD, 2012a). Alguns padrões anteriormente isolados da S. grantii, entre os quais friedelina, 3β-friedelanol, eufol e citrostadienol (DE OLIVEIRA et al., 2013; MUNHOZ et al., 2014) foram avaliados por CCD junto com a fração CHCl3, e não foi verificada a presença dos mesmos nesta fração. 67 5.1.2 Bulbos da C. paludosa Parte do EMB dos bulbos da C. paludosa passou pelo processo de fracionamento por CC, conforme demonstrado na Figura 21. As subfrações foram analisadas por CCD e reunidas quando exibiram o mesmo perfil cromatográfico. Figura 21. Fluxograma de operações realizadas para purificação do EMB da C. paludosa. CC = Coluna cromatográfica; FM = Fase móvel; FE = Fase estacionária. A subfração 16-27 (635 mg), eluída com hexano:AE (90:10) foi escolhida para realização de nova CC. A partir desta, foi obtido 25 mg do composto isoeleuterina (Figura 22) e 23 mg de eleuterina (Figura 23), ambos já isolados a partir dos bulbos da C. paludosa, por pesquisados do NIQFAR (TESSELE et al., 2011). Ambas foram comparadas diretamente com as amostras autênticas previamente isoladas da mesma fonte. 68 Figura 22. Estrutura molecular do composto isoeleuterina. H3C O O CH3 O CH3 O Figura 23. Estrutura molecular do composto eleuterina H3C O O CH3 O CH3 O A subfração 11-20 (83 mg), da 2ª coluna, foi submetida à CC flash e obtevese 14 mg do composto eleuterol (Figura 24), identificado por técnicas de RMN-1H e RMN-13C. O espectro de RMN-1H (Figura 25) mostra a presença de 4 sinais de hidrogênios aromáticos em δ 6.95, 7.38, 7.57 e 7.89. O espectro mostra também um simpleto em δ 4.11 referente aos hidrogênios do grupo metóxi, ligado ao anel aromático A. Em δ 1.73 estão os hidrogênios do grupo metila ligado ao C-3. O quarteto em δ 5.72 refere-se ao hidrogênio do metileno do carbono em que a metila está ligada. Em δ 9.65 é possível verificar a presença do hidrogênio do grupo OH. Quando se analisa o espectro de RMN-13C (Figura 26), é possível observar dois sinais em δ 19.2 e 56.4, referentes aos carbonos dos radicas metila ligados aos carbonos 3 e 5. Um sinal em δ 78.5, característico do carbono C-3. O sinal em δ 156.6 refere-se ao carbono C-5 ligado ao grupo metóxi. Estes dados foram comparados com os da literatura na tabela 5 (HARA et al., 1997; IEYAMA; 69 GUNAWAN-PUTERI; KAWABATA, 2011; SHIBUYA et al., 1997), e estão de acordo com a estrutura proposta na Figura 24. Figura 24. Estrutura molecular do composto eleuterol. Figura 25. Espectro de RMN-1H (CDCl3 300MHz) do composto eleuterol. 70 Figura 26. Espectro de RMN-13C (CDCl3 75MHz) ampliado de 20 a 160 ppm do composto eleuterol. 71 Tabela 5. Dados de RMN-1H e RMN-13C do composto eleuterol em comparação com dados da literatura*. Eleuterol δH Eleuterol* δC δH C1 δC 172.2 C3 5.72 (1H, q, J=6.3 Hz) 78.5 5.70 (1H, q, J=6.5 Hz) 78.5 C4 149.7 149.7 C5 156.6 157.1 C6 7.57 (1H, t, J=8.1 Hz) 106.3 7.54 (1H, t, J=7.7 Hz) 107.1 C7 7.38 (1H, t, J=8.1 Hz) 126.6 7.39 (1H, t, J=7.7 Hz) 127.4 C8 6.95 (1H, d, J=7.5 Hz) 123 6.93 (1H, d, J=7.7 Hz) 123.8 C9 7.89 (1H, s) 116.5 7.84 (1H, s) 116.8 C10 125.9 125.7 C11 128 128.1 C12 118.0 118.0 C13 137.8 3-CH3 1.73 (3H, d, J=6.6 Hz) 19.2 1.73 (3H, d, J=6.5 Hz) 19.2 5-OCH3 4.11 (3H, s) 56.4 4.11 (3H, s) 56.7 OH 9.65 (1H, s) 9.63 (1H, s) *HARA et al., 1997; IEYAMA; GUNAWAN-PUTERI; KAWABATA, 2011; SHIBUYA et al., 1997. Os 3 compostos isolados são derivados de naftalenos, e já foram isolados nos bulbos de várias espécies do gênero Eleutherine, como da Eleutherine americana (HAN et al., 2008; HARA et al., 1997; PARAMAPOJN et al., 2008), Eleutherine bulbosa (ALVES; KLOOS; ZANI, 2003; GALLO et al., 2010), Eleutherine palmifolia (SHIBUYA et al., 1997), dentre outras. Os compostos isoeleuterina e eleuterina, piranonaftoquinonas, já foram isolados dos bulbos da C. paludosa (TESSELE et al., 2011) e o eleuterol foi pela primeira vez isolado nesta planta. 72 5.1.3 Análise Sazonal A análise sazonal, através da técnica de CLAE, do caule da planta S. grantii, dos bulbos da C. paludosa e dos constituintes de ambas as plantas está sendo demonstrada pela primeira vez. O objetivo desta análise consiste em identificar a época de coleta das plantas com maior concentração dos compostos isolados das mesmas que apresentaram atividade antiproliferativa significante. Na Figura 27 está apresentado o cromatograma dos extratos metanólicos do caule da S. grantii obtidos nas 4 estações, bem como do composto 1 (20-fenilacetato de 3,4,12,13-tetraacetilforbol) isolado da mesma. Figura 27. Cromatograma (CLAE) dos extratos do caule da S. grantii obtidos nas 4 estações, bem como do composto 1. uV(x100,000) 8.0 7.0 6.0 5.0 Composto 1 4.0 3.0 Primavera Verão Outono Inverno 2.0 1.0 0.0 -1.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 35.0 min As análises foram monitorizadas a 210 nm. O composto 1 (tempo de retenção em 22,8 minutos) foi detectado em todos os extratos avaliados. No entanto, pode-se observar maior intensidade (área) do pico na estação primavera e menor no outono/inverno (Tabela 6), demonstrando que, para futuros estudos, maior rendimento do composto pode ser obtido quando utilizado o caule da planta coletada na primavera. 73 Tabela 6. Valores da área do pico do composto 1 (20-fenilacetato de 3,4,12,13tetraacetilforbol) nos extratos do caule da S. grantii nas 4 estações através da análise por CLAE. Estações Área do pico (mAU) do composto 1 Primavera 2419779 Verão 763607 Outono 359498 Inverno 488439 A Figura 28 demonstra o cromatograma dos extratos das 4 estações dos bulbos da C. paludosa, e dos compostos eleuterina, isoeleuterina e eleuterol, isolados da mesma. Figura 28. Cromatograma (CLAE, 240 nm) dos extratos dos bulbos da C. paludosa obtidos nas 4 estações, e dos compostos eleuterina, isoeleuterina e eleuterol, isolados da mesma. 1 – Eleuterina; 2 – Isoeleuterina; 3 – Eleuterol; 4 – Verão; 5 – Outono; 6 – Primavera; 7- Inverno. As análises foram monitorizadas a 240 nm. O tempo de retenção da eleuterina está em aproximadamente 18 minutos, da isoeleuterina em 19 minutos e do eleuterol em 19,5 minutos. A presença dos três compostos foi verificada em todos os extratos avaliados. Os picos da eleuterina e isoeleuterina foram mais intensos no outrono e no verão, e do eleuterol na primavera e no verão (Tabela 7). Os três compostos apresenteram picos menos intensos no 74 inverno, demonstrando que, em épocas mais frias, a produção dos mesmos não é tão significante. Tabela 7. Valores da área do pico dos compostos eleuterina, isoeleuterina e eleuterol nos extratos dos bulbos da C. paludosa nas 4 estações através da análise por CLAE. Estações Área do pico Área do pico (mAU) Área do pico (mAU) - eleuterina - isoeleuterina (mAU) - eleuterol Verão 3644565 6816086 9881232 Outono 4270103 7484452 9355803 Primavera 3494872 6029888 11564460 Inverno 2075493 3860123 8394023 A época em que uma espécie é coletada é um dos fatores de maior importância, visto que a quantidade e, até mesmo a natureza dos constituintes ativos de uma planta não é constante durante o ano. São relatadas variações sazonais no conteúdo de praticamente todas as classes de metabólitos secundários (GOBBONETO; LOPES, 2007). Além da sazonalidade, o metabolismo secundário de plantas pode variar consideravelmente dependendo de outros fatores, como temperatura, altitude, índice pluviométrico, radiação UV, composição atmosférica, idade, água, micro e macronutrientes, herbivoria e ataque de patógenos (GOBBO-NETO; LOPES, 2007). O conhecimento da época de maior produção da substância ativa é de extrema importância para fins de obtenção de um possível medicamento de origem natural. 75 5.2 Atividade antiproliferativa Foi realizada uma análise in vitro premilinar para avaliar atividade antiproliferativa dos EMB das plantas S. grantii, C. paludosa, E. mosenii e M. robusta, bem como das frações da S. grantii. Para isto, foram utilizadas 4 linhagens de células tumorais humanas: U251 (glioma), MCF-7 (mama), 786-0 (rim), NCI-H460 (pulmão, tipo não pequenas células). Valores de GI50 foram calculados para avaliação desta atividade e estão demonstrados na Tabela 8. Tabela 8. Valores de GI50 (µg/mL)a do controle positivo (doxorrubicina) e dos extratos metanólicos e das frações das plantas S. grantii, C. paludosa, E. mosenii, e M. robusta. Controle e plantas U251 MCF7 786-0 NCI-H460 Doxorrubicina 0,025 <0,025 <0,025 <0,025 S. grantii caule EMB 30,3 28,5 26,7 8,1 S. grantii caule Fr. ac 2,9 2,9 1,4 0,37 S. grantii caule Fr. me >250 250 >250 >250 S. grantii folha EMB 128,7 35,6 69,8 >250 C. paludosa bulbo EMB 30,8 27,1 25,7 1,6 C. paludosa raíz EMB 28,7 25,9 37,5 40,9 E. mosenii caule EMB >250 >250 >250 >250 E. mosenii folha EMB >250 >250 >250 >250 E. mosenii raiz EMB 228,5 223,1 250 >250 M. robusta raiz EMB 34,7 37,6 193,5 201,4 Linhagens tumorais humanas: U251 (glioma), MCF7 (mama); 786-0 (rim); NCI-H460 (pulmão, tipo não pequenas células). aGI50: Growth Inhibition 50 – concentração necessária para inibir 50% do crescimento celular. EMB=extrato metanólico bruto. Fr. ac = fração acetona. Fr. me = fração metanol. Estre as plantas analisadas, o EMB do caule e das folhas da S. grantii apresentaram valores significativos de GI50. No entanto, a fração acetona do caule da mesma foi a que melhor apresentou atividade antiproliferativa, com valores de 2,9 µg/mL, 2,9 µg/mL, 1,4 µg/mL, 0,37 µg/mL para GI50 contra as linhagens U251 (glioma), MCF7 (mama), 786-0 (rim), NCI-H460 (pulmão, tipo não pequenas células), respectivamente. Com base nestes resultados, fica claro que as substâncias menos 76 polares (fração acetona) presentes no caule da S. grantii são os responsáveis pela atividade verificada. O EMB do bulbo e da raiz da C. paludosa também apresentaram atividade antiproliferativa sendo os valores de GI50 do bulbo mais significativo, com valores de GI50 de 30,8 µg/mL, 27,1 µg/mL, 25,7 µg/mL, 1,6 µg/mL contra as linhagens U251 (glioma), MCF7 (mama), 786-0 (rim), NCI-H460 (pulmão), respectivamente. Os resultados obtidos demonstraram que das plantas avaliadas, o caule da S. grantii e os bulbos da C. paludosa apresentam resultados mais promissores e princípios ativos com potencial atividade antiproliferativa. Por esta razão, ambas as plantas foram submetidas a procedimentos cromatográficos para isolamento dos compostos presentes e nova avaliação da atividade antiproliferativa. 5.2.1 Atividade antiproliferativa da S. grantii As subfrações 11-15 e 16-19 da fração CHCl3 (mais apolar) do caule da S. grantii foram selecionadas para realização de novo ensaio de atividade antiproliferativa in vitro. Estas foram avaliadas em 7 linhagens de células tumorais humanas: U251 (glioma), MCF7 (mama); NCI-ADR/RES (ovário com fenótipo de resistência a múltiplos fármacos); 786-0 (rim); NCI-H460 (pulmão, tipo não pequenas células); HT-29 (colon); K-562 (leucemia) e uma linhagem não-tumoral humana: HaCat (queratinócito). Para avaliação desta atividade foram utilizados os valores de TGI. Já os compostos 1 (20-fenilacetato de 3,4,12,13-tetraacetilforbol) e 2 isolados do caule da S. grantii foram avaliados em 9 linhagens de células tumorais humanas: U251 (glioma), MCF7 (mama), NCI-ADR/RES (ovário com fenótipo de resistência a múltiplos fármacos), 786-0 (rim), NCI-H460 (pulmão, tipo não pequenas células), PC3 (próstata), OVCAR-03 (ovário), HT-29 (colon), K-562 (leucemia) e uma linhagem não-tumoral humana: HaCat (queratinócito). Os gráficos gerados relacionam a porcentagem de crescimento das células e a concentração das amostras testadas e do controle positivo doxorrubucina (Figuras 29-33). Os valores entre 100% e 0 representam inibição de crescimento, sendo a linha 0 o marco para a inibição total de crescimento, ou seja, quando a quantidade de células ao final do experimento é a mesma do momento de adição das amostras (placa T0). Já os valores negativos representam morte celular, pois a quantidade de 77 células é menor do que aquela do momento de adição das amostras (quantidade de células analisadas na placa T0) (VENDRAMINI-COSTA, 2013). Figura 29. Atividade antiproliferativa da subfração 11-15 da S. grantii. 131111 Janaúba 11_15 100 Crescimento Celular (%) 75 50 25 0 -25 U251 MCF7 NCI/ADR-RES 786-0 NCI-H460 HT29 K-562 HaCaT -50 -75 -100 -3 10 -2 10 -1 10 0,25 0 10 2,5 1 10 25 2 10 250 Concentração (g/mL) Atividade antiproliferativa da subfração 11-15 da S. grantii em painel de 7 linhagens tumorais humanas e uma linhagem não-tumoral, após 48 horas de tratamento. Relação entre a porcentagem de crescimento celular e a amostra em suas diferentes concentrações (0,25; 2,5; 25 e 250 μg/mL). Figura 30. Atividade antiproliferativa da subfração 16-19 da S. grantii. 131111 Janaúba 16_19 100 Crescimento Celular (%) 75 50 25 0 -25 U251 MCF7 NCI/ADR-RES 786-0 NCI-H460 HT29 K-562 HaCaT -50 -75 -100 -3 10 -2 10 -1 10 0,25 0 10 2,5 1 10 25 2 10 250 Concentração (g/mL) Atividade antiproliferativa da subfração 16-19 da S. grantii em painel de 7 linhagens tumorais humanas e uma linhagem não-tumoral, após 48 horas de tratamento. Relação entre a porcentagem de crescimento celular e a amostra em suas diferentes concentrações (0,25; 2,5; 25 e 250 μg/mL). 78 Figura 31. Atividade antiproliferativa do composto 1 da S. grantii. 140728 Janaúba Bl-4 100 Crescimento Celular (%) 75 50 25 0 U251 MCF7 NCI/ADR-RES 786-0 NCI-H460 PC-3 OVCAR-3 HT29 K-562 HaCaT -25 -50 -75 -100 -3 -2 10 10 -1 10 0,25 0 10 2,5 1 10 25 2 10 250 Concentração (g/mL) Atividade antiproliferativa do composto 1 da S. grantii em painel de 9 linhagens tumorais humanas e uma linhagem não-tumoral, após 48 horas de tratamento. Relação entre a porcentagem de crescimento celular e a amostra em suas diferentes concentrações (0,25; 2,5; 25 e 250 μg/mL). Figura 32. Atividade antiproliferativa do composto 2 da S. grantii. 140728 Janaúba B8-12 100 Crescimento Celular (%) 75 50 25 0 U251 MCF7 NCI/ADR-RES 786-0 NCI-H460 PC-3 OVCAR-3 HT29 K-562 HaCaT -25 -50 -75 -100 -3 10 -2 10 -1 10 0,25 0 10 2,5 1 10 25 2 10 250 Concentração (g/mL) Atividade antiproliferativa do composto 2 da S. grantii em painel de 9 linhagens tumorais humanas e uma linhagem não-tumoral, após 48 horas de tratamento. Relação entre a porcentagem de crescimento celular e a amostra em suas diferentes concentrações (0,25; 2,5; 25 e 250 μg/mL). 79 Figura 33. Atividade antiproliferativa do quimioterápico doxorrubicina (controle posivito). 140728 Doxorrubicina 100 Crescimento Celular (%) 75 50 25 0 U251 UACC-62 MCF7 NCI/ADR-RES 786-0 NCI-H460 PC-3 OVCAR-3 HT29 K-562 HaCaT -25 -50 -75 -100 -3 10 -2 10 0,025 -1 10 0,25 0 10 2,5 1 10 25 2 10 Concentração (g/mL) Atividade antiproliferativa do quimioterápico doxorrubicina (controle positivo) em painel de 10 linhagens tumorais humanas e uma linhagem não-tumoral, após 48 horas de tratamento. Relação entre a porcentagem de crescimento celular e a amostra em suas diferentes concentrações (0,025; 0,25; 2,5; e 25 μg/mL). As subfrações 11-15 e 16-19 da S. grantii inibiram o crescimento das células avaliadas em função das concentrações empregadas, havendo também indução de apoptose (ação citocida). A Tabela 9 indica os valores da concentração de amostra necessária para inibir o crescimento celular (TGI) em 48 horas de tratamento. Tabela 9. Valores de TGI (µg/mL)a do controle positivo (doxorrubicina) e subfrações da S. grantii. U251 MCF7 NCI- 786-0 ADR NCI- HT-29 K-562 HaCat H460 Doxorrubicina 0,51 3,7 1,7 0,36 0,57 10,4 >25 0,26 S. grantii 11-15 6,4 9,2 11,7 10,5 9,9 10,5 >250 9,6 S. grantii 16-19 5,6 6,0 8,9 5,3 9,7 8,0 >250 8,7 Linhagens tumorais humanas: U251 (glioma), MCF7 (mama); NCI-ADR/RES (ovário com fenótipo de resistência a múltiplos fármacos); 786-0 (rim); NCI-H460 (pulmão, tipo não pequenas células); HT-29 (colon); K-562 (leucemia). Linhagem não-tumoral humana: HaCat (queratinócito). aTGI: Total Growth Inhibition – concentração necessária para inibir totalmente o crescimento celular 80 Ambas subfrações apresentaram atividade antiproliferativa significativa contra a maioria das linhagens celulares avaliadas, exceto leucemia, com valores de TGI entre 5,3 e 11,7 µg/mL, sendo a subfração 16-19 ligeiramente mais ativa do que subfração 11-15, especialmente contra as linhagens de glioma (U251), mama (MCF7) e rim (786-0), com valores de TGI < 6,25 µg/mL, demonstrando uma atividade antiproliferativa potente (FOUCHE et al., 2008). Quando comparadas com o controle doxorrubicina, ambas subfrações foram menos agressivas contra a linhagem não-tumoral humana, queratinócito. Os gliomas malignos representam cerca de 40 a 60% dos tumores cerebrais primários e são responsáveis por um nível desproporcional de morbidade e mortalidade em pacientes com câncer. Apesar de tratamentos como cirurgia, radioterapia, quimioterapia e imunoterapia, o tempo médio de sobrevivência é inferior a 15 meses. Portanto, os desafios no tratamento de gliomas malignos permanecem consideráveis (HUSE; HOLLAND, 2010; YIN et al., 2007). O câncer de mama é a neoplasia mais comum e a maior causa de morte por câncer nas mulheres em todo o mundo. Para o Brasil, em 2014, são esperados 57.120 casos novos de câncer de mama, com um risco estimado de 56,09 casos a cada 100 mil mulheres (INCA, 2014). Apesar de avanços importantes no tratamento, o câncer de mama metastático não tem cura, reforçando a necessidade de novos tratamentos para melhorar o resultado dos mesmos (SEOANE et al., 2010) Existem diferentes tipos de câncer de rim, cada um com sua própria histologia e curso clínico, que respondem de forma diferente ao tratamento. Esse tipo de câncer é responsável por mais de 115.000 mortes por ano em todo o mundo (FERLAY et al., 2010; LINEHAN; SRINIVASAN; SCHMIDT, 2010). A toxicidade do gênero Synadenium já foi demonstrada por Valadares e colaboradores (2007) e Mota e colaboradores (2012), que constataram que a planta S. umbellatum possui potencial citotóxico e efeitos mutagênicos. Estudos in vitro e in vivo, mostraram que o látex da S. grantii possui efeito citotóxico e atividade antitumoral contra células de melanoma B16F10. O composto citrostadienol, que foi isolado a partir desta planta, apresentou baixa atividade citotóxica quando testado in vitro contra a mesma linhagem celular, causando redução de 8% na viabilidade celular a uma concentração de 250 µg/mL (DE OLIVEIRA et al., 2013). Terpenos que estão presentes no látex, bem como em as outras partes da S. grantii são descritos como apresentando atividade citotóxica 81 (BAGAVATHI et al., 1988; COSTA et al., 2012; HASSAN; MOHAMMED; MOHAMED, 2012). O composto 1 apresentou atividade antiproliferativa moderada contra as linhagens de glioma (U251, TGI = 25,2 µg/mL), rim (786-0, TGI = 24,5 µg/mL), pulmão (NCI-H460, TGI = 31,1 µg/mL) e próstata (PC-3, TGI = 22,0 µg/mL), sugerindo que este pode contribuir, em parte, com a atividade antiproliferativa observada pela subfração 11-15. Além disso, o composto 1 não demonstrou atividade na linhagem não-tumoral humana (queratinócito) (Tabela 10). O composto 2 não apresentou atividade relevante. Tabela 10. Valores de TGI (µg/mL)a do controle positivo (doxorrubicina) e dos compostos isolados da S. grantii. 2 m a 7 4 p o h k Q Doxorrubicina 0,042 >25 >25 0,93 21,5 1,9 3,7 >25 1,7 12,9 Composto 1 25,2 >250 >250 24,5 31,1 22,0 74,9 >250 65,3 >250 Composto 2 76,1 >250 >250 114,2 104,5 79,7 >250 >250 50,1 >250 Linhagens tumorais humanas: 2 = U251 (glioma); m = MCF-7 (mama); a = NCI-ADR/RES (ovário com fenótipo de resistência a múltiplos fármacos); 7 = 786-0 (rim); 4 = NCI-H460 (pulmão, tipo não pequenas células); p = PC-3 (próstata); o = OVCAR-03 (ovário); h = HT29 (colon); k = K-562 (leucemia). Linhagem não-tumoral humana: Q = HaCat (queratinócito). aTGI: Total Growth Inhibition – concentração necessária para inibir totalmente o crescimento celular. A ação antiproliferativa do composto 1, um éster de forbol, não foi tão pronunciada como a apresentada pela subfração 11-15 em que estava presente, sugerindo um possível sinergismo entre os compostos, ou a presença de outros princípios ativos que contribuem para a atividade Forbóis e os seus diferentes derivados são referidos como sendo promotores de tumor. Estes compostos não induzem tumores, mas promovem seu crescimento após a exposição a uma substância cancerígena. Alguns ésteres de forbol isolados da espécie Jatropha curcas apresentaram propriedades carcinogênicas e mutagênicas. No entanto, alguns forbóis naturais são inibidores de tumor e possuem atividade antileucêmica e antimicobacteriana (CHUMKAEW et al., 2003; GOEL et al., 2007; OSKOUEIAN; ABDULLAH; AHMAD 2012a). 82 5.2.2 Atividade antiproliferativa da C. paludosa Os compostos isoeleuterina, eleuterina e eleuterol isolados da C. paludosa, foram selecionadas para realização de novo ensaio in vitro de atividade antiproliferativa, avaliada em 7 linhagens de células tumorais humanas: U251 (glioma), MCF7 (mama); NCI-ADR/RES (ovário com fenótipo de resistência a múltiplos fármacos); 786-0 (rim); NCI-H460 (pulmão, tipo não pequenas células); HT29 (colon); K-562 (leucemia) e uma linhagem não-tumoral humana: HaCat (queratinócito). Para avaliação desta atividade foram utilizados valores de TGI e GI50. Os gráficos gerados relacionam a porcentagem de crescimento das células e a concentração das amostras testadas (Figuras 34-36), avaliados da mesma maneira que as subfrações da S. grantii (Figuras 29-30). Figura 34. Atividade antiproliferativa do composto isoleuterina. 131111 Isoleuterine 100 Crescimento Celular (%) 75 50 25 0 -25 U251 MCF7 NCI/ADR-RES 786-0 NCI-H460 HT29 K-562 HaCaT -50 -75 -100 -3 10 -2 10 -1 10 0,25 0 10 2,5 1 10 25 2 10 250 Concentração (g/mL) Atividade antiproliferativa da isoleuterina em painel de 7 linhagens tumorais humanas e uma linhagem não-tumoral, após 48 horas de tratamento. Relação entre a porcentagem de crescimento celular e a amostra em suas diferentes concentrações (0,25; 2,5; 25 e 250 μg/mL). 83 Figura 35. Atividade antiproliferativa do composto eleuterina. 131111 Eleuterine 100 75 Crescimento Celular (%) 50 25 0 -25 U251 MCF7 NCI/ADR-RES 786-0 NCI-H460 HT29 K-562 HaCaT -50 -75 -100 -3 10 -2 10 -1 10 0,25 0 10 2,5 1 10 25 2 10 250 Concentração (g/mL) Atividade antiproliferativa da eleuterina em painel de 7 linhagens tumorais humanas e uma linhagem não-tumoral, após 48 horas de tratamento. Relação entre a porcentagem de crescimento celular e a amostra em suas diferentes concentrações (0,25; 2,5; 25 e 250 μg/mL). Figura 36. Atividade antiproliferativa do eleuterol. 140728 Eleutherol 100 Crescimento Celular (%) 75 50 25 0 U251 MCF7 NCI/ADR-RES 786-0 NCI-H460 PC-3 OVCAR-3 HT29 K-562 HaCaT -25 -50 -75 -100 -3 10 -2 10 -1 10 0,25 0 10 2,5 1 10 25 2 10 250 Concentração (g/mL) Atividade antiproliferativa do eleuterol em painel de 7 linhagens tumorais humanas e uma linhagem não-tumoral, após 48 horas de tratamento. Relação entre a porcentagem de crescimento celular e a amostra em suas diferentes concentrações (0,25; 2,5; 25 e 250 μg/mL). 84 Os compostos isoeleuterina e eleuterina apresentaram atividade antiproliferativa significativa, com efeito citocida, especialmente contra as linhagens de glioma (U251) e da mama (MCF7), com valores de TGI entre 2,8 e 13,4 μg/mL (Tabela 11). De acordo com Fouche e colaboradores (2008), valores de TGI entre 6,25 e 15 μg/mL representam atividade moderada, e valores de TGI < 6,25 µg/mL atividade potente, demonstrando a atividade pronunciada destes dois compostos. Tabela 11. Valores de TGI (µg/mL)a do controle positivo (doxorrubicina) e dos compostos isoeleuterina e eleuterina isolados da C. paludosa. U251 MCF-7 NCI- 786-0 ADR NCI- HT29 K-562 HaCat H460 Doxorrubicina 0,51 3,7 1,7 0,36 0,57 10,4 >25 0,26 Isoleuterina 13,4 6,6 46,0 67,2 79,4 78,8 >250 45,1 Eleuterina 2,8 4,8 20,4 129,9 93,4 29,0 >250 20,0 Linhagens tumorais humanas: U251 (glioma), MCF-7 (mama); NCI-ADR/RES (ovário com fenótipo de resistência a múltiplos fármacos); 786-0 (rim); NCI-H460 (pulmão, tipo não pequenas células); HT29 (colon); K-562 (leucemia). Linhagem não-tumoral humana: HaCat (queratinócito). aTGI: Total Growth Inhibition – concentração necessária para inibir totalmente o crescimento celular Em geral, eleuterina foi mais ativa que isoeleuterina, especialmente contra glioma (U251), sendo 4 vezes mais potente. Estes compostos são isômeros epiméricos que diferem em termos da relação cis ou trans, respectivamente, dos dois grupos metil secundário, sendo o grupo metil β-metil para o 1º e α-metil para o 2º. Estes resultados indicam que a melhor atividade do 1º está relacionada com a quiralidade e seu anel de pirano com o grupo β-metil. O composto eleuterol demonstrou efeito citostático contra todas as linhagens tumorais avaliadas, especialmente contra glioma (U251), mama (MCF7) e leucemia (K-562), inibindo 50% do crescimento celular (GI50) (Tabela 12). 85 Tabela 12. Valores de GI50 (μg/mL)a do controle positivo (doxorrubicina) e do composto eleuterol, isolado da C. paludosa. U251 Doxorrubicina <0,025 Eleuterol 3,1 MCF- NCI- 786-0 7 ADR 0,069 0,10 0,038 3,0 23,3 26,8 NCI- HT29 K562 HaCat <0,025 4,2 0,045 0,059 25,5 65,5 6,3 18,7 H460 Linhagens tumorais humanas: U251 (glioma); MCF-7 (breast); NCI-ADR/RES (ovary); 786-0 (kidney); NCI-H460 (lung); HT29 (colon); K562 (leukemia). Linhagem não-tumoral humana: HaCat (queratinócito). aGI50: Growth Inhibition 50 – concentração necessária para inibir 50% do crescimento celular. Diversos estudos com derivados de naftoquinonas demonstraram seus efeitos em várias atividades biológicas, como a antitumoral, antiviral, antibacteriana, e antifúngica (ALVES; KLOOS; ZANI, 2003; FERREIRA et al., 2014; HOOK; MILLS; SHERIDAN, 2014; RAHMOUN et al., 2012; SASAKI; ABE; YOSHIZAKI, 2002). As piranonaftoquinonas isoeleuterina e eleuterina isoladas dos bulbos da C. paludosa já apresentaram ação anti-inflamatória e antinociceptiva contra modelos químicos e mecânicos de dor em ratos (TESSELE et al., 2011). Foi demonstrado também que estes compostos melhoraram a memória de curto e de longo prazo em ratos (LUCENA et al., 2013), possuem atividade antifúngica e imunomodulatória (ALVES; KLOOS; ZANI, 2003; HONG et al., 2008). Foi verificado também que ambos compostos possuem atividade antiproliferativa contra a linhagem celular K562 (XU et al., 2006), o que não foi observado no presente estudo. Eleuterina, o principal composto isolado, também mostrou atividade inibidora contra a topoisomerase humana II, e compostos com esta ação podem ser considerados como parte de quimioterapia de primeira linha para uma ampla variedade de tumores sólidos e hematológicos (HARA et al., 1997; KUSUMA et al., 2010). Isoeleuterina já demonstrou atividade inibitória na replicação do HIV em linfócitos H9 (HARA et al., 1997). O composto eleuterol já foi isolado nos bulbos da E. bulbosa, e está espécie é utilizada por algumas populações para o tratamento de distúrbios intestinais (LIN; PUCKREE; MVELASE, 2002). 86 Este é o primeiro relatório indicando a planta C. paludosa com efeito antiproliferativo, demostrando que esta espécie pode ser considerada uma potencial fonte de compostos com atividade antiproliferativa. 5.2.3 Atividade antiproliferativa do composto 1 (S. grantii) e eleuterina (C. paludosa) no modelo de MTT Com base nesses resultados apresentados, o composto 1 isolado da S. grantii e o composto eleuterina da C. paludosa, foram selecionados para realização de nova análise da atividade antiproliferativa in vitro, agora pelo método do MTT. Os resultados da Figura 37 demonstra que os dois compostos (composto 1 e eleuterina) apresentaram atividade antiproliferativa (diminuição da metabolização do MTT = diminuição do número de células) na maior concentração utilizada (100 microM) contra a linhagem MDA-MB231 (linhagem resistente). No entanto é possível observar que o composto 1 já começou a ter efeito entre as concentrações 1 e 10 microM, então este foi escolhido para nova análise utilizando estas concentrações na mesma linhagem celular (MDA-MB231) e em uma linhagem considerada mais sensível (HBL100) (Figura 38). Figura 37. Metabolização de MTT (% controle) contra a linhagem celular MDAMB231 do composto 1 e da eleuterina. Metabolização MTT (% controle) MDA-MB231 120 100 80 60 Composto 1 40 Eleutherine 20 0 Control 10 nM 100 nM 1 microM Concentração 10 microM 100 microM 87 Figura 38. Metabolização de MTT (% controle) do composto 1 contra as linhagem celulares MDA-MB231 e HBL100. Metabolização MTT (% controle) Composto 1 120 100 80 60 MDA-MB231 40 HBL100 20 0 Control 1microM 5microM 10microM 25microM 50microM 100microM Concentração Avaliando a Figura 37 pode-se observar que o composto 1 foi mais ativo contra a 2ª linhagem (HBL100), considerada mais sensível, apresentando boa atividade já a partir de 1 microM. O câncer de mama triplo-negativo (Triple negative breast cancer - TNBC) é responsável por 15% de todos os cânceres de mama. É definido pela ausência da expressão de receptores de estrogênio, progesterona e de HER2 (receptor do fator de crescimento epidérmico) (CLEATOR; HELLER; COOMBES, 2007; MONTERO et al., 2014). O fenótipo triplo-negativo possui características patológicas e clínicas bastante diferentes dos demais subtipos de câncer de mama. Estes tumores afetam mais frequentemente mulheres com menos de 50 anos, apresentando comportamento mais agressivo (CORRÊA et al., 2010). Devido à ausência de tratamentos específicos para esse subgrupo, os cânceres de mama triplo-negativos são gerenciados com o tratamento padrão, no entanto, esse tratamento é associado com uma elevada taxa de recidiva local e sistêmica (CLEATOR; HELLER; COOMBES, 2007). No momento, não há um agente comprovadamente eficaz para o tratamento do câncer de mama triplo-negativo. Dados recentes mostram que o câncer de mama triplo-negativo tem características moleculares específicas que podem ser possíveis alvos para novos fármacos (TOMAO et al., 2015). 88 Em consideração ao mecanismo de ação em que o composto 1 possa estar atuando, foram avaliados os mecanismos de ciclo celular e apoptose contra a linhagem celular MDA-MB231. Quando avaliada a ação do composto 1 (100 microM) no ciclo celular (Figura 39), pode-se observar um aumento de 4% das células na fase G0/G1 e uma dimuinção de 3% das células na fase M quando comparado com o controle. No entanto, como os valores não são significativos, não é possível afirmar que o mesmo age na regulação do ciclo celular. Figura 39. Ação do composto 1 no ciclo celular na linhagem celular tumoral MDAMB231. Ação do composto 1 no ciclo celular na linhagem MDA-MB231, marcados com IP por citometria de fluxo. As células foram tratadas com DMSO e com o composto 1 (100 microM) por 48 horas. A fase G0 compreende o momento em que as células permanecem em um estado de repouso, latência ou quiescência e a fase G1 representa o período no qual a célula está se preparando para a síntese de DNA. Em ambas as fases ainda não ocorreu a divisão celular. Na fase M (mitose) as células dividem-se ao meio para produzir duas novas células, iniciando o processo de proliferação celular (NECKEL, 2011). Na avaliação da apoptose (Figura 40), pode-se verificar que, tanto as células sem tratamento (controle), quanto as células tratadas com o composto 1 (100 microM), ficaram concentradas no quadrante inferior esquerdo, consideradas células viáveis, pois não estão marcadas por anexina V-FITC ou IP. Com base nesses resultados pode-se afirmar que o composto não age pelo mecanismo de apoptose. O marcador IP é permeável somente em células onde a integridade da membrana foi perdida, evidenciando fenômenos típicos da morte por necrose. As 89 células marcadas apenas com Anexina V-FITC indicam morte apoptótica. Já as células marcadas com ambos os fluoróforos representam a porcentagem de células nos estágios finais de apoptose e coincidentes com a morte por necrose. As células viáveis, por sua vez, não são marcadas nem por anexina V-FITC, nem por IP (NECKEL, 2011; ZWAAL; SCHROIT, 1997). Figura 39. Avaliação da apoptose induzida pelo composto 1 na linhagem celular tumoral MDA-MB231. Avaliação da apoptose induzida pelo composto 1 na linhagem MDA-MB231, através de ensaio da Anexina V-FITC e IP por citometria de fluxo. As células foram tratadas com DMSO e com o composto 1 (100 microM) por 48 horas. Ressalta-se a importância de verificar por qual mecanismo de ação o mesmo age, por isso novos estudos in vitro de ciclo celular e apoptose serão realizados para a confirmação deste. 90 91 6 CONCLUSÕES A partir dos resultados obtidos no presente estudo, verificou-se que a fração CHCl3 do caule da Synadenium grantii e o EMB dos bulbos Cipura paludosa possuem princípios ativos com potencial antiproliferativo relevante. Já as duas outras plantas avaliadas, Epidendrum mosenii e Maytenus robusta não demostraram resultado antiproliferativo considerado promissor. A análise fitoquímica permitiu evidenciar a presença de um raro éster de forbol conhecido como 20-fenilacetato de 3,4,12,13-tetraacetilforbol na fração CHCl3 do caule da S. grantii, com presença mais significativa na primavera. Este apresentou atividade antiproliferativa moderada contra as linhagens de glioma, rim, pulmão e próstata, além de não demonstrar atividade contra a linhagem não-tumoral humana (queratinócito). O mesmo apresentou também atividade antiproliferativa nas concentrações entre 1 e 100 microM, nas linhagens celulares MDA-MB231 e HBL100 (câncer de mama triplo-negativo). No entanto ainda não foi possível verificar por qual mecanismo de ação o composto age, uma vez que não demonstrou resultados significativos na análise de ciclo celular e apoptose. Estudos estão em andamento para confirmar estes efeitos em outros modelos farmacológicos (in vivo), verificar seu mecanismo de ação, e para isolar outros possíveis princípios ativos dessa promissora planta como um agente anticâncer. Nos bulbos da C. paludosa foi possível verificar a presença dos derivados de naftaleno eleuterine, isoeleuterine e eleuterol, com presença mais significativa no verão. Os dois primeiros, considerados os compostos majoritários desta espécie, demonstraram efeito citocida contra as linhagens de glioma, mama e pulmão, sendo os principais princípios ativos responsáveis pela atividade antiproliferativa verificada nesta espécie. Já o composto eleuterol demonstrou efeito menos significativo, apresentando um efeito mais citostático do que citocida. Os resultados obtidos até o presente são promissores sob o ponto de vista químico e medicinal, e estimulam a continuidade destes estudos para a constante busca de plantas e compostos com potencial atividade antiproliferativa, visando a descoberta de um novo e eficaz agente terapêutico anticâncer. 92 93 REFERÊNCIAS ABDEL-KADER, M. S; WISSE, J.; EVANS, R.; WERFF, H. V. D.; KINGSTON, D. G. I. Bioactive iridoids and a new lignan from Allamanda cathartica and Himatanthus fallax from the Suriname rainforest. Journal of Natural Products, v.60, p.12941297, 1997. ABDULLAEV, F. I.; ESPINOSA-ARGUIRRE, J. J. Biomedical properties of saffron and its potential use in cancer therapy and chemoprevention trials. Cancer Detection and Prevention, v. 28, p. 426-432, 2004. ABE, F.; YAMAUCHI, T. 9-hidroxypinoresinol, 9-hidroxymedioresinol and related lignans from Allamanda Neriifolia. Phytochemistry, v.27, n.2, p.575-577, 1988. ALBERTS, B.; JOHNSON, A.; LEWIS, J.; RAFF, M.; ROBERTS, K.; WALTER, P. 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Adriana Campos, Débora Barbosa Vendramini-Costa, Giovanna Barbarini Longato, Tailyn Zermiani, Ana Lúcia Tasca Gois Ruiz, João Ernesto de Carvalho, Atanasio Pandiella, Valdir Cechinel Filho. Antiproliferative effect of Synadenium grantii Hook f. stems (Euphorbiaceae) and a rare phorbol diterpene ester. Medicinal Chemistry Research (FI 1.402), Julho 2015. 2. Adriana Campos, Débora Barbosa Vendramini-Costa, Giovanna Francisco Fiorito, Ana Lúcia Tasca Gois Ruiz, João Ernesto de Carvalho, Greice Maria Rodrigues de Souza, Franco Delle Monache, Valdir Cechinel Filho. Antiproliferative effect of extracts and pyranonaphthoquinones obtained from Cipura paludosa bulbs. Pharmaceutical Biology (FI 1.241), Junho 2015. Relação indireta com a tese: 1. Adriana Campos, Greice Maria Rodrigues Souza, Franco Delle Monache, Estefanía Butassi, Susana Zacchino, Valdir Cechinel Filho. Antifungal Activity of Pyranonaphtoquinones obtained from Cipura paludosa bulbs. Natural Product Communications (FI 0.924), Fevereiro 2015. (Aceito para publicação). 2. Luciane Angela Nottar Nesello, Adriana Campos, Theodoro Wagner, Arturo San Feliciano, Fátima de Campos Buzzi, Valdir Cechinel Filho. Chemical composition and antinociceptive potential of Campomanesia reitziana fruits. Journal of Medicinal Food (FI 1.626), Março 2015. 3. Luciane Angela Nottar Nesello, Adriana Campos, Karla Capistrano, Fátima de Campos Buzzi, Valdir Cechinel Filho. Chemical composition and antinociceptive activity of Myrcianthes pungens. International Journal of Food Sciences and Nutrition (FI 1.206), Junho 2015. 110 4. Luciane Angela Nottar Nesello, Roseane Leandra da Rosa, Adriana Campos, Sérgio Faloni de Andrade, Valdir Cechinel Filho. Screening of wild fruits with gastroprotective activity in different experimental models. Revista Brasileira de Fruticultura (FI 0.49), Maio 2015. Capítulo de livro publicado – relação direta com a Tese CAMPOS, A.; MALHEIROS, A.; NIERO, R.; CECHINEL FILHO, V. Biodiversidade brasileira (terrestre e marinha): uma vasta fonte de agentes anticâncer. In: SAN FELICIANO, A.; CECHINEL FILHO, V. Descoberta, desenho e desenvolvimento de novos agentes anticâncer no âmbito do programa Iberoamericano CYTED. Itajaí: UNIVALI, 2014. p. 193-218.
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