UNIVERSIDADE FEDERAL DO TRIÂNGULO MINEIRO - UFTM CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA DANIELA MISSON RIBEIRO PERFIL DE CITOCINAS SÉRICAS DE PACIENTES COM NEOPLASIA INTRAEPITELIAL CERVICAL DE ALTO GRAU TRATADAS COM INTERFERON alfa-2b INTRALESIONAL UBERABA-MG 2010 DANIELA MISSON RIBEIRO PERFIL DE CITOCINAS SÉRICAS DE PACIENTES COM NEOPLASIA INTRAEPITELIAL CERVICAL DE ALTO GRAU TRATADAS COM INTERFERON alfa-2b INTRALESIONAL Tese apresentada ao curso de pósgraduação em Patologia, área de concentração: Patologia Ginecológica e Obstétrica, da Universidade Federal do Triângulo Mineiro, como requisito parcial para obtenção do Título de Mestre em Medicina. Orientador: Professor Dr. Eddie Fernando Cândido Murta Co-Orientadora: Professora Dra. Márcia Antoniazi Michelin UBERABA-MG 2010 Que tudo seja para honra e glória do nome de Jesus Dedico, esse trabalho aos meus pais, Jarbas e Elisete que sempre me incentivaram e me apoiaram a estudar. Às minhas irmãs e cunhados, Isabela e Joca, Gabriela e Cristiano que sempre torceram por mim. Ao Thomas pelo amor e por acreditar em mim. Agradecimentos A realização de um trabalho científico envolve a participação de um grande número de pessoas que oferecem a sua contribuição direta ou indiretamente. Agradeço primeiramente a Deus que sempre esteve na minha vida em todos os momentos. Agradeço à Universidade Federal do Triângulo Mineiro (UFTM) onde pude realizar minha residência médica e tive a oportunidade de fazer a pós graduação. À Disciplina de Ginecologia e Obstetrícia da UFTM. Às pacientes que puderam me auxiliar neste estudo em um momento difícil de suas vidas. Ao Professor Dr. Eddie Fernando Cândido Murta que sempre acreditou em mim e me incentivou muito. À Professora Dra. Márcia Antoniazzi Michelin que sempre foi minha amiga e não deixou que eu desistisse deste trabalho. Às Doutoras Ana Cristina Macêdo Barcelos, Liliam Renata Silveira Santiago e Márcia Maria Mendonça que sempre encaminharam as pacientes com todo carinho e respeito. À Dra. Marília de Carvalho Mardegan e Marisa de Carvalho Ramos que dividiram comigo esse trabalho me avisando sempre das pacientes. Às funcionárias do ambulatório de ginecologia Dóris Lima Dayrell de Carvalho, Heloísa Helena Vieira, Nilva Aparecida da Silva Aveiro e Zelma Rocha Camargos Pereira pela amizade e por diretamente sempre me auxiliar com as pacientes desde o fornecimento de dados até a coleta do sangue. Aos professores do curso de pós graduação especialmente à Dra. Sheila Jorge Adad no auxílio sempre quando solicitado. Ao Celso Tadeu Barbosa dos Santos que me auxiliou na coleta do sangue das pacientes. À Ariana de Melo Borges pela amizade e pelo auxílio desde a coleta do sangue até os resultados da quantificação de citocinas no Elisa com toda paciência e carinho. Ao Douglas Reis Abdalla que me ajudou com os resultados mostrados nos gráficos meus sinceros agradecimentos. Aos funcionários da disciplina e do ambulatório de Ginecologia e Obstetrícia pelo auxílio sempre que foi necessário. A todos os funcionários da UFTM e da Funepu que sempre me trataram com carinho e respeito. RESUMO Introdução: Devido ao maior rastreamento nos dias atuais com a citologia oncológica, a neoplasia intra-epitelial de alto grau do colo uterino tem sido mais diagnosticada e tem sido observada em pacientes cada vez mais jovens como resultado da maior liberdade sexual. O tratamento dessas lesões neoplásicas é basicamente cirúrgico e é seguido algumas vezes de recidivas devido ao tratamento excisional não tratar a causa que geralmente é o HPV e de levar a intercorrências obstétricas indesejadas, por tudo isso nosso trabalho veio estudar a imunoterapia para essas lesões pois sabemos que elas só evoluíram devido à falha do sistema imune. Objetivos: Avaliar a quantificação de citocinas no soro de pacientes com NIC de alto grau antes, durante e após o tratamento com IFN α-2b intralesional e correlacionar à resposta clínica dessas pacientes com a produção de citocinas. Material e métodos: Nosso estudo foi composto por 12 pacientes entre 23 e 51 anos com diagnóstico de neoplasia intra-epitelial de alto grau não submetidas a tratamento prévio. Foi usado neste trabalho o interferon α-2b humano recombinante 3 milhões de UI (Blauferon-B® Blaúsiegel) intralesional (18 aplicações em dias alternados). Na primeira, sexta, décima segunda e décima oitava aplicação foi colhido o sangue dessas pacientes para análise das citocinas o que foi feito por ELISA. Resultados: O diagnóstico inicial foi de 58,3% (n=7) NIC II e 41,6% (n=5) NIC III. Quanto à resposta ao tratamento 50% apresentaram resposta terapêutica e 50% falha terapêutica sendo que das que tiveram resposta terapêutica 16,6% (n=1) fumava e das que tiveram falha terapêutica 66,6% (n=4) fumavam. A média da concentração da IL-12 no soro das pacientes que apresentaram sucesso terapêutico mostrou-se significativamente bem elevada no décimo segundo dia de aplicação do IFN α-2b apresentando diferença estatística quando comparadas com as pacientes que tiveram falha terapêutica. Conclusões: O tratamento das neoplasia intra-epitelial de alto grau com IFN α-2b intralesional apresentou boa resposta clínica nas pacientes não fumantes. A concentração de IL-12 no soro no décimo segundo dia de aplicação é elevada no grupo de pacientes que tiveram resposta terapêutica comparado às que tiveram falha terapêutica, que até apresentaram queda no décimo segundo dia de tratamento e a concentração da IL-10 e TGF β apresentam queda significativa a partir deste mesmo dia nas pacientes que obtiveram sucesso terapêutico mostrando que o aumento da citona do perfil TH1 estimulou a queda das citocinas do perfil TH3. ABSTRACT Introduction: Due a major investigation implemented as a routine at present time by the oncotic cytology, the intra-epithelial neoplasia of high degree of the uterine cervix has been more diagnosed and has appeared more and more in young patients as a result of the actual large sexual freedom. The treatment of these lesions is basically surgical and it is sometimes followed of recurrence owed the treatment excisional not to treat the cause that is usually HPV and of taking the undesired obstetric intercurrences, therefore our work came to study the immunotherapy for these lesions because we know that they only developed due to the flaw of the immune system. Objectives: To evaluate the cytokines quantification in the patients' serum with NIC of high degree before, during and after the treatment with IFNα-2b intralesional and to correlate the clinical answer of these patient ones with the cytokines production. Material and methods: Our study was composed by 12 patient between 18 and 60 years with intra-epithelial neoplasia diagnosis of high degree not submitted to previous treatment. Was it used in this work the interferon α-2b human recombinante 3 million of UI (Blauferon-B® Blaúsiegel) intralesional (18 applications in alternate days). In the first, sixth, twelfth and eighteenth application was picked the serum of these patient ones for analysis of the cytokines that was done by ELISA. Results: The initial diagnosis was of 58,3% (n=7) NIC II and 41,6% (n=5) NIC III. Concerning to the answer to the treatment 50% presented therapeutic answer and 50% therapeutic failure, and of which that had therapeutic answer 16,6% (n=1) used to smoke and of the ones that had therapeutic failure 66,6% (n=4) used to smoke as well. The average of the concentration of the IL-12 in the patients' serum that presented therapeutic success it was shown significantly very high in the twelfth day of application of IFN α -2b presenting statistical differences when compared with the patients that had therapeutic failure. Conclusions: The treatment of the intra-epithelial neoplasia of high degree with intralesional IFN α-2b present good clinical answer in the non smokers patients. The concentration of IL-12 in the serum in the twelfth day of application it is elevated in the patients' group that had therapeutic answer compared to the ones what had therapeutic failure, Inclusively whose presented fall in the twelfth day of treatment and the concentration of the IL-10 and TGF β present significant fall starting from this same day in the patients that obtained therapeutic success showing that the increase of the ketone of the TH1 profile stimulated the fall of the cytokine of the TH3 profile. SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO..................................................................................................... 13 1.1 NEOPLASIA INTRA-EPITELIAL CRVICAL...................................................... 13 1.2 PAPILOMA VÍRUS HUMANO (HPV) .............................................................. 14 1.3 OS TRATAMENTOS UTILIZADOS NA NEOPLASIA INTRA-EPITELIAL CERVICAL DE ALTO GRAU ....................................................................... 16 1.3.1 Alça Diatérmica de Alta Frequência........................................................... 16 1.3.2 Conização..................................................................................................... 17 1.4 O Sistema Imune............................................................................................. 17 1.4.1 Resposta Imune às NICs............................................................................. 20 1.5 Interferon no Tratamento das NICs............................................................... 21 1.6 Citocinas no tratamento das NICs................................................................. 23 2 OBJETIVOS......................................................................................................... 26 3 JUSTIFICATIVA.................................................................................................. 27 4 MATERIAL E MÉTODOS.................................................................................... 28 4.1 APLICAÇÃO DO INTERFERON...................................................................... 28 4.2 AVALIAÇÃO DA RESPOSTA CLÍNICA........................................................... 29 4.3 DOSAGEM DE CITOCINAS............................................................................. 29 4.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA................................................................................... 30 5 RESULTADOS.................................................................................................... 31 6 DISCUSSÃO........................................................................................................ 42 7 CONCLUSÕES.................................................................................................... 49 REFERÊNCIAS...................................................................................................... 50 ANEXOS................................................................................................................. 57 ANEXO A................................................................................................................ 58 LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS NIC neoplasia intra-epitelial cervical HPV papiloma vírus humano DUM data da última menstruação ASCUS atipias em células escamosas LSIL lesão intra-epitelial escamosa de baixo grau HSIL lesão intra-epitelial escamosa de alto grau AGUS atipias em células glandulares IFN Interferon NK natural killer JEC junção escamocolunar IL-2 interleucina 2 IL-4 interleucina 4 IL-6 interleucina 6 IL-10 interleucina 10 IL-12 interleucina 12 TNF fator de necrose tumoral TGF fator de crescimento celular LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Diagnóstico inicial e final por biópsia de todas as pacientes e conduta tomada em cada caso, após o término do tratamento.......................... 32 Tabela 2 - Fatores de risco para o desenvolvimento de NIC e resposta clínica de todas as pacientes................................................................................ 33 LISTA DE GRÁFICOS Gráfico 1-Médias +- DP da concentração de IL-2 no soro das pacientes que obtiveram resposta positiva colhido na primeira, sexta, décima segunda e décima oitava aplicação do IFN α-2b................................. 34 Gráfico 2-Médias +- DP da concentração de IL-2 no soro das pacientes que obtiveram reposta negativa colhido na primeira, sexta, décima segunda e décima oitava aplicação do IFN α-2b................................. 34 Gráfico 3-Médias +- DP da concentração de IL-12 no soro das pacientes que obtiveram resposta positiva colhido na primeira, sexta, décima segunda e décima oitava aplicação do IFN α-2b................................. 35 Gráfico 4-Médias +- DP da concentração de IL-12 no soro das pacientes que obtiveram resposta negativa colhido na primeira, sexta, décima segunda e décima oitava aplicação do IFNα-2b.................................. 35 Gráfico 5-Médias +- DP da concentração de IFN ϒ no soro das pacientes que obtiveram resposta positiva colhidos na primeira, sexta, décima segunda e décima oitava aplicação do IFN α-2b................................. 36 Gráfico 6-Médias +- DP da concentração de IFN ϒ no soro das pacientes que obtiveram resposta negativa colhidos na primeira, sexta, décima segunda e décima oitava aplicação do IFN α-2b................................. 36 Gráfico 7-Médias +- DP da concentração de TNF α no soro das pacientes que obtiveram resposta positiva colhidos na primeira, sexta, décima segunda e décima oitava aplicação do IFN α-2b................................. 37 Gráfico 8-Médias +- DP da concentração de TNF α no soro das pacientes que obtiveram resposta negativa colhidos na primeira, sexta, décima segunda e décima oitava aplicação do IFN α-2b................................. 37 Gráfico 9-Médias +- DP da concentração de IL-4 no soro das pacientes que obtiveram resposta positiva colhidos na primeira, sexta, décima segunda e décima oitava aplicação do IFN α-2b................................. 38 Gráfico 10-Médias +- DP da concentração de IL-4 no soro das pacientes que obtiveram resposta negativa colhidos na primeira, sexta, décima segunda e décima oitava aplicação do IFN α-2b................................. 38 Gráfico 11-Médias +- DP da concentração de IL-6 no soro das pacientes que obtiveram resposta positiva colhido na primeira, sexta, décima segunda e décima oitava aplicação do IFN α-2b................................. 39 Gráfico 12- Médias +- DP da concentração de IL-6 no soro das pacientes que obtiveram resposta negativa colhido na primeira, sexta, décima segunda e décima oitava aplicação do IFN α-2b................................. 39 Gráfico 13-Médias +- DP da concentração de IL-10 no soro das pacientes que obtiveram resposta positiva colhido na primeira, sexta, décima segunda e décima oitava aplicação do IFN α-2b................................. 40 Continuação da Listas de Gráficos Gráfico 14-Médias +- DP da concentração de IL-10 no soro das pacientes que obtiveram resposta negativa colhido na primeira, sexta, décima segunda e décima oitava aplicação do IFN α-2b................................. Gráfico 15-Médias +- DP da concentração de TGF β no soro das pacientes que obtiveram resposta positiva colhido na primeira, sexta, décima segunda e décima oitava aplicação do IFN α-2b................................. Gráfico 16-Médias +- DP da concentração de TGF β no soro das pacientes que obtiveram resposta negativa colhido na primeira, sexta, décima segunda e décima oitava aplicação do IFN α 2b.................................. 40 41 41 LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Colo da paciente 6 que obteve sucesso terapêutico tirada durante colposcopia no dia 11 de setembro de 2009 antes do tratamento com interferon α-2b....................................................................................... 58 Figura 2 - Colo da paciente 6 que obteve sucesso terapêutico tirada durante colposcopia no dia 04 de dezembro de 2010 após o tratamento com interferon α-2b. ..................................................................................... 58 Figura 3 - Colo da paciente 7 que obteve sucesso terapêutico tirada durante colposcopia no dia 15 de setembro de 2009 antes do tratamento com interferon α-2b....................................................................................... 59 Figura 4 - Colo da paciente 7 que obteve sucesso terapêutico tirada durante colposcopia no dia 12 de novembro de 2009 após o tratamento com interferon α-2b....................................................................................... 59 Figura 5 - Colo da paciente 2 que obteve falha terapêutica tirada durante colposcopia no dia 08 de outubro de 2008 antes do tratamento com interferon α- 60 2b........................................................................................ Figura 6 - Colo da paciente 2 que obteve falha terapêutica tirada durante colposcopia no dia 22 de julho de 2009 após o tratamento com interferon α-2b....................................................................................... 60 Figura 7 - Colo da paciente 1 que obteve falha terapêutica tirada durante colposcopia no dia 08 de outubro de 2008 antes do tratamento com interferon α-2b....................................................................................... 61 Figura 8 - Colo da paciente 1 que obteve falha terapêutica tirada durante colposcopia no dia 07 de agosto de 2009 após o tratamento com interferon α-2b....................................................................................... 61 Figura 9 - Colo da paciente 3 que obteve falha terapêutica tirada durante colposcopia no dia 08 de outubro de 2008 antes do tratamento com interferon α-2b....................................................................................... 62 Figura 10 - Colo da paciente 3 que obteve falha terapêutica tirada durante colposcopia no dia 27 de julho de 2009 após o tratamento com interferon α-2b....................................................................................... 62 1 INTRODUÇÃO 1.1 NEOPLASIA INTRA-EPITELIAL CERVICAL A frequência da descoberta de câncer de colo inicial e de condições pré cancerosas é muito alta levando a uma terapia curativa rápida e efetiva, porém cirúrgica principalmente (MATHEVET et al., 2003). A incidência do câncer do colo do útero torna-se evidente na faixa etária de 20 a 29 anos e o risco aumenta rapidamente, até atingir seu pico, geralmente na faixa etária de 45 a 49 anos (INCA, 2009). Grande parte do crédito do diagnóstico precoce pertence à eficácia do teste citológico cérvico vaginal na detecção de pré cânceres cervicais e ao fácil acesso ao colo uterino para colposcopia e a biópsia. As lesões precursoras de câncer cervical invasor já tiveram várias classificações porém a mais atual é a de Bethesda que surgiu como resultado de um consenso realizado pelo Instituto Nacional do Câncer Americano na cidade de Bethesda no Estado de Maryland em 1988, foi modificado em 1991 e novamente em 2001. A classificação de Richart (1967) foi a que introduziu o termo neoplasia intraepitelial cervical (NIC), sendo que: NIC I- presença de células atípicas em até 1/3 do epitélio. NIC II- presença de células atípicas em 1/3 a 2/3 do epitélio. NIC III- presença de células atípicas em mais de 2/3 do epitélio. Quando atinge toda a espessura do epitélio sem ultrapassar a membrana normal chamamos de carcinoma in situ. O sistema de BETHESDA foi desenvolvido com o fim de uniformizar a terminologia diagnóstica, facilitando a comunicação entre o laboratório e o ginecologista. A contribuição mais importante do sistema é a incorporação da avaliação da “ADEQUAÇÃO DA AMOSTRA” como parte integrante do relatório, sendo necessários quatro elementos para que uma amostra seja considerada plenamente satisfatória: 1. Identificação do paciente e do espécime, possibilitando ao laboratório localizar exames anteriores que possam influenciar a avaliação em questão; 2. Informações clínicas pertinentes: idade, data da última menstruação, paridade, uso de método anticoncepcional, sangramento irregular e aspecto do colo no mínimo. 3. Interpretabilidade técnica: vários fatores podem afetar ou impedir a interpretação da lâmina (obscurecimento por sangue, áreas espessas,dessecamento,etc.); 4. Composição celular e amostragem da zona de transformação: uma amostra satisfatória deve conter células escamosas, endocervicais e metaplásicas. Esses elementos formam a base microscópica para que se presuma que a zona de transformação foi adequadamente amostrada. Com base nestes elementos, as amostras podem ser “SATISFATÓRIA”, “SATISFATÓRIA MAS LIMITADA POR...” ou “INSATISFATÓRIA. Os principais fatores de risco para os desenvolvimentos das NICs são: início precoce das relações sexual, primiparidade precoce, multiparidade, infecções virais pelo HPV tipo 16, 18, 31 e 33, pelo herpes vírus tipo 2 e pelo citomegalovírus, tabagismo, uso de anticoncepcionais orais, exposição à irradiação ionizantes, deficiência de vitaminas A e C (SYRJÄNEN, 2008). 1.2 PAPILOMA VÍRUS HUMANO Vários estudos têm demonstrado a importância do Papilomavírus humano na gênese das lesões neoplásicas do colo do útero desde a década de 70. O HPV é um vírus da família Papovaviridae, capazes de induzir lesões de pele ou mucosa, quais mostram um crescimento limitado e habitualmente regridem espontaneamente. Existem mais de duzentos subtipos diferentes de HPV, entretanto, somente os subtipos de alto risco estão relacionados a tumores malignos (PAAVONEN, 2007). A maioria das pessoas sexualmente ativas (mais de 75%) entra em contato com HPV, mas apenas uma minoria apresenta repercussão clínica pois através da ativação do sistema imune mais de 90% dos indivíduos infectados eliminam o vírus no período de 24 meses. O tipo de resposta imune do hospedeiro determina o curso da doença (persistência ou regressão), a extensão e severidade das lesões e o sucesso da terapia. Existem vários estágios diferentes de interação célula-vírus. O primeiro é a fase de incubação, que dura de duas semanas a oito meses ou mais (média de três meses). Esse é o tempo no qual se estabelece a infecção epissômica, com a interação célula-vírus sendo regulada por fatores locais (ex: tabagismo, falha do sistema imune ou, talvez, predisposição genética). Além disso, os períodos de incubação podem ser indefinidos (MUÑOZ et al., 2003). A doença ativamente revelada resultará numa expressão morfológica em células escamosas diferenciadas. Quando isto ocorre, há uma fase de proliferação ativa que dura de três a seis meses. Durante essa fase, a estimulação das células hospedeiras leva a: alteração pronunciada no crescimento da camada basal, replicação viral nas camadas médias, efeitos citopáticos virais nas células superficiais. Tais alterações podem se manifestar como doença óbvia ou campos subclínicos de acetobranqueamento que contém graus variados de neoplasia ou formação de papilomas macroscopicamente aparentes. A integração do DNA transcricionalmente ativo às células do hospedeiro parece necessária para que haja um crescimento maligno. A transformação maligna com replicação viral parece exigir a expressão de proteínas E6 e E7 produzidas pelo HPV. As proteínas E7 interage com o gene supressor tumoral Rb e as E6 ligam-se ao supressor tumoral p53 alterando os mesmos (GARNETT & DUERKSENHUGHES, 2006; NARISAWA-SAITO & KIYONO,2007). O DNA do HPV pode ser detectado na maioria das mulheres com neoplasia cervical. Há um aumento de 10 vezes ou mais do risco de neoplasia cervical associado à detecção de DNA do HPV. O risco relativo de neoplasia associado ao HPV é de até 40 vezes, com um menor limite de segurança de 95% de 15 vezes. Fortes evidências confirmam que a porcentagem de neoplasia intra-epitelial cervical aparentemente atribuída à infecção por HPV aproxima-se de 90% (DE VILLIERS et al.,2004). Os tipos de HPV genital conhecidos ultrapassam um número maior que 20, mas apenas alguns tipos são responsáveis por cerca de 90% das lesões intra epiteliais de alto grau e câncer (HPV-16,18,31,33,39,45,51,52,56 e 58).O tipo de HPV, a carga viral e a detecção persistente do HPV são compreendidos como marcadores importantes para o risco de progressão para câncer invasivo (MUÑOZ et al., 2003). Estudos mostram que infecção com tipos oncogênicos de Papilomavírus Humano (HPV) é o principal fator causador da neoplasia intra-epitelial cervical (NIC) e sua lesão precursora (CLIFFORD et al.,2003). Em trabalho recente sobre a expressão de p16 (NK4a) relacionando a histopatologia e a carga virótica dos tipos de HPV de alto risco para neoplasia intraepitelial cervical, o HPV 16 foi o tipo mais prevalente encontrado com 47%. 1.3 OS TRATAMENTOS UTILIZADOS NA NEOPLASIA INTRA-EPITELIAL CERVICAL DE ALTO GRAU Os dois tratamentos hoje utilizados são: alça diatérmica de alta freqüência e conização como descritos a seguir. 1.3.1 Alça Diatérmica de Alta Freqüência A cirurgia de alta freqüência é um instrumento útil para o diagnóstico e o tratamento da NIC (COPELAND, 1996). O efeito da eletricidade no tecido depende da concentração de elétrons (tamanho do fio), da potência (watts) e do conteúdo de água do tecido. Se for usada baixa potência ou um fio de grande diâmetro, o efeito será de eletrocautério, e o tecido sofrerá extensa lesão térmica. Se a potência for alta (35 a 55 watts) e a alça do fio for pequena (0,5mm), o efeito será eletrocirúrgico, e o tecido sofrerá pequena lesão térmica. O efeito do corte real é resultante de um envoltório de vapor, que se desenvolve na interface entre a alça do fio e o tecido repleto de água. Este envoltório é então empurrado através do tecido, e a combinação de fluxo de elétrons e eventos acústicos separam o tecido. Após a excisão, é usado um eletrodo esférico com 5mm de diâmetro, e a potência é ajustada em 50 watts. A esfera é colocada próxima da superfície, de forma que ocorre uma centelha entre a esfera e o tecido. Este processo é denominado eletrofulguração, e resulta em alguma lesão térmica que produz hemostasia (COPELAND, 1996). A vantagem desta cirurgia é ser capaz de realizar simultaneamente uma operação diagnóstica e uma operação terapêutica durante uma consulta ambulatorial (COPELAND, 1996). 1.3.2 Conização A conização do colo tem papel importante no tratamento da NIC sendo um procedimento diagnóstico e terapêutico e tem a vantagem, em relação aos tratamentos ablativos, de fornecer tecido para avaliação adicional a fim de excluir câncer invasivo (COPELAND, 1996). A conização está indicada para diagnóstico em mulheres com HSIL, com base em um exame de Papanicolaou nas seguintes condições: Os limites da lesão não podem ser visualizados por colposcopia. A junção escamocolunar (JEC) não é observada à colposcopia. Os achados histológicos são positivos para NICII ou NICIII. Não há correlação com os resultados de citologia, colposcopia e biópsia. Há suspeita de microinvasão com base nos resultados de citologia, colposcopia e biópsia. O colposcopista é incapaz de excluir câncer invasivo (COPELAND, 1996). 1.4 O SISTEMA IMUNE O sistema imune ou imunológico tem com função produzir uma resposta contra antígenos que podem causar doenças e levar o hospedeiro ao óbito (WIRA et al., 2005). Temos duas categorias de resposta imune: a inata (ou não-adaptativa) e resposta imune adaptativa. Da inata participam células com capacidade fagocitária como monócitos, macrófagos e neutrófilos que destroem os antígenos de forma inespecífica (primeira linha de defesa humana). Já a adaptativa tem como característica o reconhecimento específico de um antígeno, tendo os linfócitos como células centrais. Dentre elas, podemos destacar os linfócitos T - auxiliares. Eles após reconhecerem um antígeno previamente fagocitado pelas células da resposta inata (monócitos e macrófagos), por meio do processo de apresentação de antígenos, produzem citocinas (proteínas produzidas por muitos tipos celulares, que modulam a função de outras células). As citocinas promovem a ativação de outros componentes do sistema imunológico e outro subgrupo de linfócitos, os linfócitos B, que por sua vez se encarregam de produzir anticorpos específicos para aquele antígeno. No decorrer deste processo, são formadas células de memória, que respondem de forma mais rápida e eficiente a uma reinfecção. A inflamação é a resposta protetora do organismo contra uma lesão celular. Além disso, a resposta inflamatória também cicatriza e reconstitui o tecido lesionado, em processo de reparação, que ocorre no início da inflamação e conclui-se depois que a influência nociva é neutralizada. Ela ocorre no tecido conjuntivo vascularizado e caracteriza-se por um aumento do fluxo sanguíneo para a área lesada (vasodilatação) que causa eritema e calor e aumento da permeabilidade vascular causando edema. As citocinas são proteínas que modulam a função de outras células ou da própria célula que as geraram. São produzidas por diversas células, mas principalmente por linfócitos e macrófagos ativados. Elas dependem da ligação com receptores específicos da membrana celular para desempenharem sua função. Normalmente, há a necessidade da ação de mais de uma citocina para uma resposta imune, por isso elas agem em conjunto, formando uma rede complexa, na qual a produção de uma citocina influenciará a produção ou resposta de outras. São um sistema incrivelmente complexo e inteligente e ainda pouco conhecido (WIRA et al., 2005; ROBBINS, 1994). Caso a célula que produziu a citocina for um linfócito ativado, esta é chamada de linfocina. As interleucinas são citocinas produzidas por células hematopoiéticas e a maioria está envolvida na indução de divisão e diferenciação de outras células. Cada interleucina atua em um grupo específico de células, de acordo com os receptores adequados para cada uma (WIRA et al., 2005; ROBBINS, 1994). IL-1- libertadas nas infecções; promovem inflamação, produzem nos centros cerebrais regulatórios febre, tremores, calafrios e mal-estar através da libertação de prostaglandina E2 e elas estimulam linfócitos T. IL-2- estimula a multiplicação dos linfócitos T e B. IL-4- estimula a multiplicação dos linfócitos B; produção de anticorpos, resposta do tipo TH2. Sintetizada por células T e mastócitos; papel importante na resposta alérgica. IL-6- estimula a secreção de anticorpos. Sintetizada por células T e macrófagos. IL-8- quimiocina; induz a adesão ao endotélio vascular e o extravazamento aos tecidos. Quimiotáticas para neutrófilos e linfócitos T. Sintetizada por macrófagos. IL-10- inibe a produção da citocina TH1, suprime função dos macrófagos e ativa linfócitos B. IL-12- indução das células TH1, estimulação das células NK. Sintetizada por linfócitos B e macrófagos. IFN-gama - ativa os macrófagos, tornando-os mais eficientes e agressivos; promove a inflamação, e estimula a resposta TH1, inibindo a TH2. Sintetizado por linfócitos T ativados e por determinadas células. TNF- é uma citocina envolvida em inflamações sistêmicas e é um membro de um grupo de citocinas que estimulam a reação de fase aguda. Ele causa a morte apoptótica da célula, proliferação celular, diferenciação, inflamação, combate tumores e replicação viral. O TNF alfa é o responsável pela síndrome da caquexia. Essa síndrome é caracterizada por consumos dos estoques de gordura corporal e perda progressiva do apetite (anorexia). TGF-B- controla proliferação e diferenciação celular. Ele estimula células T supressoras (TH3) portanto causam imunossupressão (WIRA et al., 2005; ROBBINS, 1994). 1.4.1 Resposta imune à neoplasia intra-epitelial cervical A resposta imune à neoplasia intra-epitelial cervical é muito peculiar, visto que se trata de um processo iniciado por um vírus e pelo próprio microambiente no qual a lesão se inicia que é o aparelho reprodutor feminino. Um tumor maligno originado no epitélio cervical uterino e confinado a ele, representa um contínuo de mudanças histológicas que vão desde NICI bem diferenciada a NICIII (carcinoma in situ). A lesão origina-se na junção escamocolunar na zona de transformação do canal endocervical, com uma tendência variável de desenvolver carcinoma epidermóide invasivo, tendência esta que é potencializada pela infecção concomitante do papilomavírus humano. A imunidade inata ao HPV é mediada por vários mecanismos, dentre eles, a síntese de interferon (IFN), a ativação de macrófagos e de células NK (STANLEY, 2001) São múltiplos os mecanismos de evasão do vírus: 1. O HPV não tem fase de disseminação sanguínea. 2. O HPV não causa lise de queratinócitos não induzindo assim resposta inflamatória que são citocinas como a interleucina-1 e o TNF sintetizadas por queratinócitos. 3. A produção e liberação do vírus ocorrem nas células escamosas diferenciadas, distantes das citocinas e células imunocompetentes da submucosa (TINDLE et al., 2002). Os macrófagos estão presentes em infecções causadas por HPV, nas neoplasias cervicais intra-epiteliais e no câncer invasivo. Eles são encontrados no epitélio e no estroma e são capazes de matar células que tenham sido transformadas pelo HPV-16 pela mediação de citocinas. As células natural killer são subpopulação de linfócitos que causa apoptose de células infectadas. Elas são encontradas no estroma por isso deficiente na defesa de células epiteliais atingidas por HPV-16. As proteínas E6 e E7 do HPV-16 inibem as células NK de sintetizarem interferon gama in vitro. As células dendríticas são células responsáveis por apresentar antígenos tumorais para linfócitos citotóxicos CD8 e helper CD4. Elas são inibidas por linfócitos Treg. 1.5 INTERFERON NO TRATAMENTO DA NEOPLASIA INTRA-EPITELIAL CERVICAL Isolados por Issac e Lindernmann em 1957, os interferons (IFNs) são parte do sistema natural de defesa do organismo. O interferon é uma glicoproteína de ação endógena e intracelular que inibe a multiplicação da célula virótica e torna as células não-infectadas refratárias à infecção (ação antivirótica). O vírus ao replicar-se, vai ativar o gene codificante do interferon. Após a síntese protéica, a proteína sai da célula e entra na corrente sanguínea, até chegar às células vizinhas que ainda não foram atacadas. A proteína liga-se à membrana celular dessas células o gene codificante de proteínas antivirais. Estas proteínas antivirais, por sua vez, vão impedir a replicação do vírus, quando este tentar replicar-se nessas células. Inibe a multiplicação celular e a proliferação epitelial dos condilomas (ação antiproliferativa) e também estimula as células “natural Killers”, os linfócitos Tcitotóxicos e os macrófagos (ação imunomoduladora). Tipo I- primeira linha de defesa antiviral e produzido por células epiteliais e leucócitos (interferon alfa e beta). Agem contra infecções virais e promovem imunidade mediada por células contra microorganismos intracelulares. Eles inibem a replicação viral, aumentam a expressão de moléculas do MHC de classe I, estimula o desenvolvimento de células TH1 (IL-12) e aumenta a atividade citolítica da NK. Tipo II- produzido por células T e NK (interferon gama) Os interferons são divididos em (RANDALL & GOODBOURN, 2008): IFN alfa: é produzido por tecnologia recombinante, envolvendo DNA, estimulação de leucócitos e células linfoblásticas. Ele é sintetizado e liberado por células leucocitárias em situações como viremia quando desde a penetração do vírus na célula, seu nível aumenta no organismo, causando efeitos colaterais limitando seu uso mais abrangente. Ele ativa células dendríticas para ativar linfócitos T - helper, citotóxico e NK. Os mais comuns são interferon alfa 2a, 2b, n1, n3 e con1. IFN beta: é produzido nos fibroblastos agindo sobre os tecidos, também é produzido após a penetração viral na célula infectada porém seus níveis são baixos e “in loco” dispersando-se pelo sistema linfático, não ocasionando efeitos colaterais. Os mais comuns são interferon beta 1a e 1b. IFN gama: é produzido por combinação de métodos. Ativam NK e linfócitos citotóxicos. Eles ativam a destruição de células tumorais por macrófagos e aumentam a expressão de MHC da classe I pelas células tumorais e a sensibilidade à lise por linfócitos T citotóxicos. O mais comum é gama 1b. Eles inibem a expressão de RNA de células do HPV (proteínas E6 e E7). E6 e E7 são capazes de inibir interferon Pacientes com E6 e E7 elevados nos tecidos são mais resistentes ao tratamento com interferons enquanto que pacientes com baixas taxas são mais sensíveis ao tratamento com interferons. O uso dos IFNs podem ser realizados de forma tópica (sob a forma de gel ou pomadas), intralesional (pode ser aplicado na base da lesão tanto do condiloma puro como do associado à neoplasia intra-epitelial ou sistêmico (aplicação intramuscular ou subcutânea). Vários estudos vêm sendo desenvolvidos com interferon no tratamento das neoplasias intra-epiteliais cervicais. Cazorla et al (2005) avaliaram a eficácia do interferon B a longo prazo tratando mulheres com neoplasia intra-epitelial cervical NIC II associado ao papilomavírus humano (HPV) obtendo resultados satisfatórios. Micheletti et al. (1992) estudando 32 mulheres com neoplasia intra-epitelial cervical associado com infecções por HPV tratadas com interferon alfa-2b intralesional, observaram que 60% das pacientes mostraram regressão da lesão. Considerando separadamente as diferenças do grau da NIC para as regressões sendo: 71% NICI, 64% NICII e 45% NICIII. Murta e Tavares Murta (2004) obtiveram resultados tratando com interferon alfa-2b paciente com carcinoma epidermóide invasivo de vagina observando através do Papanicolaou e colposcopia regressão completa da lesão vaginal. Rotola et al (1996) mostraram bons resultados com uso do interferon B no tratamento de pacientes com NIC grau II e III. Grismondi et al (1995) utilizaram Interferon B (IFN) intramuscular em 58 pacientes com papilomavírus humano (HPV) associado à neoplasia intra-epitelial cervical com resultados satisfatórios de 87,9% dos casos. Sikorski et al (2003) trataram 20 pacientes com interferon gama com diagnóstico definido de neoplasia intra-epitelial cervical (NIC) tipos I e II com alto risco para a infecção por HPV e obtiveram 53% de resultados positivos com completa regressão da NIC e remissão da infecção por HPV. 1.6 CITOCINAS NO TRATAMENTO DA NEOPLASIA INTRA-EPITELIAL CERVICAL Citocinas são proteínas secretadas pelas células da imunidade inata (IFN-a, IL-1, IL-12, IFN-y) e da adquirida (IL-2, IL-4, IFN-y) e que mediam muitas das funções dessas células. Elas possuem receptores celulares e podem ativar ou inibir células do sistema imune. As IL-2, IL-12, IFN-y e TNF-alfa ativam resposta celular (TH1) que é a principal resposta nos tumores e contra o HPV (ABBAS & LITCHMAN, 2007). As IL-4, IL-6 ativam resposta humoral (TH2) A IL-10 e o TGF-B paralisa o sistema imune (TH3) As citocinas são produzidas em resposta a micróbios e a outros antígenos, e diferentes citocinas estimulam diversas respostas das células envolvidas na imunidade e na inflamação. Na fase de ativação da resposta imune as citocinas estimulam o crescimento e a diferenciação dos linfócitos, e na fase efetora da imunidade inata e na adquirida elas ativam diferentes células efetoras para eliminar micróbios e outros antígenos. As citocinas estimulam também o desenvolvimento das células hematopoiéticas. Na clínica, elas são importantes como agentes terapêuticos ou como alvos para antagonistas específicos em numerosas doenças imunes e inflamatórias. Foi feito um estudo mostrando a expressão de citocinas em mulheres com neoplasia intra-epitelial cervical de alto grau (NIC II e III) associado com Papilomavírus Humano (HPV) e mulheres com carcinoma cervical invasivo e grupos controle observou-se que IL-10 estava aumentada em pacientes com neoplasia intra-epitelial cervical (NIC) e carcinoma cervical invasivo e IFN gama era significativamente baixo em pacientes com NIC III e carcinoma em relação às pacientes com NIC II e controle e IL-12, IL-4 e TNF alfa não divergiu entre os grupos. No desenvolvimento das neoplasias cervicais intra-epiteliais ocorre a queda de IL-12 e aumento de TGF-B e IL-10 (imunossupressoras) Peghini B.C., Barcelos A.C.M., Murta E.F.C., Michelin M.A. em um estudo do Instituto de pesquisa em oncologia (IPON) da UFTM analisou o perfil de citocinas em neoplasia intra-epitelial cervical por meio de biópsias do colo uterino e concluíram que a porcentagem de citocinas do perfil TH3 foi maior entre o grupo das pacientes que apresentavam NIC III (43,3%),o que reforça portanto a hipótese de que a neoplasia intra-epitelial cervical é mediada por citocinas do perfil TH3. A principal resposta às neoplasias intra-epiteliais cervicais é a celular com os linfócitos T. As células T helper (CD4+) após estimuladas por marófagos ativam células dendríticas e secretam linfocinas como a IL-2, IFN gama,TNF-B e IL-12 que ativam as células T citotóxicas (CD8+), os macrófagos, as células NK e as células B, podendo produzir outras linfocinas, como o fator de necrose tumoral (TNF), que pode ser diretamente lítico para as células tumorais. A célula Natural Killer também é citolítica e seu potencial citolítico é intensificado por linfocinas como IL-2 e IFN. Os macrófagos fazem fagocitose de elementos tumorais e apresentação antigênica a linfócitos T. As linfocinas de células T com atividade de ativação dos macrófagos (MAF) incluem o IFN gama, o TNF, a IL-4 e o fator de estimulação de colônias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF). Quanto à resposta humoral existem três vias que envolvem os anticorpos: lise mediada pelo complemento, opsonização e fagocitose e ADCC. Os efeitos locais de níveis elevados de diversas citocinas têm sido estudados usando células tumorais transfectadas para produzir grandes quantidades de certas citocinas. Algumas citocinas como GM-CSF, IL-2, IL-4, IFN-gama e TNF quando secretadas em quantidades suficientemente grandes pelas células tumorais transfectadas, podem conduzir a uma inibição significativa do crescimento tumoral, mesmo na ausência de células T, mas com algumas citocinas em menor quantidade de secreção. Porém a inibição do crescimento tumoral pode ser dependente da presença de células T. Os pesquisadores estão apenas começando a compreender os mecanismos que conduzem esta inibição do crescimento tumoral, e esses mecanismos são muito variáveis para diferentes citocinas (GONÇALVEZ & DONALDI, 2004). Os mecanismos de escape das células tumorais são variáveis e são os seguintes: A expressão do MHC de classe I poderá ser regulada negativamente nas células tumorais de modo que não possa ser reconhecida pelos linfócitos T. Os tumores perdem a expressão dos antígenos que provocam resposta imune. Os tumores podem deixar de induzir linfócitos T porque a maioria das células tumorais não expressam co-estimuladores nem moléculas do MHC de classe II. Os produtos das células tumorais podem suprimir a resposta imune antitumoral. Os antígenos tumorais podem induzir tolerância imunológica específica. Os antígenos de superfície das células tumorais podem se ocultar do sistema imune por meio de moléculas do glicocálice. A imunoterapia possui as seguintes funções: Aumentar a resposta imune ativa contra tumores e administrar efetores imunes tumor-específicos aos pacientes. Os tipos de imunoterapia são vacinação com células ou antígenos tumorais, administração de tumores modificados, administração sistêmica de citocinas, administração de anticorpos antitumorais, administração de anticorpos conjugados a imunotoxinas e células T e NK isoladas do paciente e expandidas em cultura com fatores de crescimento. A função dos mecanismos imunológicos na defesa antitumoral está cada vez mais evidente, particularmente estes são mais efetivos durante as etapas iniciais do estabelecimento do tumor e no controle das micrometástases. Uma vez que o tumor se estabelece no organismo, aumentando seu tamanho, infiltrando tecidos vizinhos e invadindo sítios distantes, gera mecanismos que inibem a resposta imune. Apesar destes inconvenientes existirem há uma grande esperança no estabelecimento de imunoterapias, como um novo pilar para o tratamento do câncer; sendo que muitas estratégias estão sendo estudadas para chegar a este objetivo. 2 OBJETIVOS Avaliar a quantificação de citocinas no soro de pacientes com NIC de alto grau antes, durante e após o tratamento com interferona alfa-2b intralesional. Relacionar a resposta clínica destas pacientes com a produção de citocinas no soro das mesmas antes, durante e após o tratamento. 3 JUSTIFICATIVA Avaliar as respostas imunológicas ocorridas no soro das pacientes, que permitirá entender os mecanismos imunes sistêmicos responsáveis pela regressão tumoral para aprimorar as técnicas disponíveis de imunoterapia. 4 MATERIAL E MÉTODOS Realizamos um estudo prospectivo, no Ambulatório Maria da Glória do Hospital Escola da Universidade Federal do Triângulo Mineiro, pelas disciplinas de Ginecologia e Imunologia no período de 2007 a 2009. Os grupos de estudo foram compostos por 12 pacientes com idade entre 20 e 51 anos com diagnósticos de Neoplasia intra-epitelial Cervical de alto grau não submetidas a tratamento prévio. De cada paciente foram obtidas informações sobre idade, hábitos e condições de vida (tabagismo, uso drogas, número de parceiros), métodos contraceptivos usados, história de doenças sexualmente transmissíveis e uso de terapia de reposição hormonal. Todos os procedimentos realizados obedeceram aos critérios propostos pelo Comitê de Ética. Os critérios para inclusão foram a ausência de sangramento durante o exame, não utilização de antibióticos orais, fungicidas ou cremes vaginais durante os 30 dias anteriores; nenhuma atividade sexual por pelo menos dois dias antes do dia da coleta das amostras; e nenhuma história prévia de tratamento para HPV. Foram critérios de exclusão, pacientes portadoras de doenças imunodepressoras, cardiopatias graves, alteração da função hepática ou renal, gestantes, relato de intolerabilidade ao interferon ou ausência de lesão visível à colposcopia. 4.1 APLICAÇÃO DO INTERFERON Foi usado neste trabalho o Interferon alfa-2b humano recombinante 10.000.000 U (alfainterferona 2b-Blauferon-B®) na dose de 3.000.000 U.I. por cm2 de lesão (frasco-ampola com pó liófilo que foi diluído com 1,0 ml de diluente antes de cada aplicação) que foi aplicado intralesional. As aplicações foram realizadas utilizando seringa de 1,0 ml e agulha 13 x 0,45 três vezes por semana em dias alternados perfazendo um total de 18 aplicações. A exposição do colo uterino foi realizada através da introdução de espéculo vaginal. Após foi feito antissepsia do colo e paredes vaginais com gaze embebida em polvidine tópico usando para isso pinça de Sheron. Então foi feita a aplicação da medicação. Após aplicação foi observado a presença de reação local. Antes da primeira, da sexta, da décima segunda e da décima oitava aplicação foram colhido o sangue das pacientes e após separado o soro das mesmas para avaliação das citocinas do soro posteriormente. 4.2 AVALIAÇÃO DA RESPOSTA CLÍNICA Foi considerada resposta completa o desaparecimento da lesão confirmado com estudo histológico. Resposta parcial foi considerada quando houve regressão de 50% ou mais da lesão e falha terapêutica quando a regressão da lesão for inferior a 50% ou houver progressão da mesma. Todas as pacientes com NIC de alto grau que apresentaram resposta incompleta ou falha terapêutica foram encaminhadas imediatamente para tratamento cirúrgico. 4.3 DOSAGEM DE CITOCINAS As citocinas: IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, IFN gama,TNF α e TGF β presentes no soro das pacientes foram dosadas por Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) utilizando pares de anticorpos monoclonais comerciais disponíveis da BD OptEIATM. O procedimento foi realizado conforme protocolo fornecido pelo fabricante. Placas de 384 poços de fundo chato, foram sensibilizadas com 25 µl anticorpos monoclonais específicos para a captura da citocina desejada diluída em coating buffer. Às fileiras 1 e 2 de cada placa foram adicionados 50µl de citocina padrão recombinante seguindo diluições seriadas 1:2 em Assay diluente a partir das concentrações iniciais diluída. Às outras fileiras foram adicionados 25 µl/poço do soro das pacientes no qual continha a citocina a ser dosada. As placas foram incubadas a temperatura ambiente por duas horas e lavadas por 5 vezes com uma solução contendo PBS-Tween 20% (PBS-T). A seguir, foram adicionados 25 µl/poço do anticorpo detector da citocina a ser dosada. As placas foram incubadas por 1 hora à temperatura ambiente e novamente lavadas por 5 vezes em PBS-T. Após esta etapa, foram adicionadas 25 µl/poço de TMB Substrate Reagent Set (BD OptEIATM) e após 30 minutos foram adicionados 25 µl/poço de Stop Solution (Ácido fosfórico 2N). Após adição de Stop Solution foi realizado a leitura da placa de ELISA através do leitor automático Spectramax 384 Plus, sendo os resultados obtidos pela diferença entre as absorbâncias 450 e 570nm. A concentração de cada citocina do soro das pacientes foram dosadas em pg/ml através da comparação com as absorbâncias obtidas da curva padrão da respectiva citocina, sendo realizada simultaneamente. 4.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA Para análise estastística foi elaborado um banco de dados eletrônico. As variáveis foram analisadas através do programa GraphPad Prism 4.0. Os valores foram submetidos ao teste de Kruskal-Wallis test. As diferenças foram consideradas estatisticamente significantes quando valores menor ou igual a 5% (p ≤ a 0,05). 5 RESULTADOS Foram avaliados o soro de 12 pacientes com HSIL tratadas com interferon alfa 2b- 18 aplicações onde na primeira, na sexta, na décima segunda e na décima oitava aplicação foram colhidos o soro destas pacientes. Das 12 pacientes tratadas com interferon alfa 2b, 50% (n=6) obtiveram resposta positiva e 50% (n=6) obtiveram resposta negativa. A idade das pacientes que obtiveram resposta positiva variou de 23 a 55 anos e das que obtiveram resposta negativa variou de 28 a 50 anos. Das 6 que obtiveram resposta positiva, 4 obtiveram resposta completa e 2 obtiveram resposta parcial passando de lesão de alto grau para lesão de baixo grau e das 4 que obtiveram resposta completa, 2 ainda apresentaram na biópsia infecção por HPV em regressão. Das 6 que obtiveram resposta negativa, 1 apresentou progressão da lesão para NIVA e as outras não obtiveram regressão da lesão. Das 6 que obtiveram resposta negativa, 66,6% (n=4) fumavam e uma era ex fumante e das 6 que obtiveram resposta positiva apenas 16,6% (n=1) fumava e somente 8 cigarros por dia. Todas pacientes negaram o uso de drogas. A média de idade da primeira relação sexual das pacientes foi de 15 anos e da primeira gestação foi de 20 anos. A maioria das pacientes faziam uso de anticoncepcionais como método de anticoncepção. Nenhuma paciente fazia reposição hormonal. Das 12 pacientes, 50% (n=6) eram multíparas, 25% (n=3) eram prímiparas e 25% (n=3) eram nulíparas. Não houve diferença das que tiveram resposta positiva das que tiveram resposta negativa quanto à idade, paridade, anticoncepção e ínicio da vida sexual. Das 12 pacientes, 91,6% (n=11) apresentaram na citologia efeito citopático do HPV, a única que não apresentou teve resposta positiva. Todas pacientes negaram outra doença sexualmente transmissível. As pacientes com bom resultado apresentaram mais efeitos colaterais que as com resultado negativo. Uma das pacientes com bom resultado apresentou herpes simples e outra com boa resposta alopécia e as outras principalmente sintomas como os da gripe febre, cefaléia, fadiga, calafrios e dor muscular e ainda náusea, vômito, alteração no paladar e emagrecimento. Avaliamos 8 citocinas no soro das 12 pacientes colhidos no primeiro, no sexto, no décimo segundo e no décimo oitavo dia de tratamento. As 8 citocinas avaliadas foram a interleucina-2, a interleucina-4, a interleucina-6, a interleucina-10, a interleucina-12, o TNF alfa, a TGF beta e o IFN gama. Tabela 1- Tabela de diagnóstico inicial e final por biópsia de todas as pacientes e conduta tomada em cada caso, após o término do tratamento Paciente Idade 48 29 34 Diagnóstico Inicial NIC II NIC III NIC II Diagnóstico final NIC III NIC II NIC II\NIVA III Resposta\ Falha Falha Falha Falha 1 2 3 Conduta 4 5 6 45 30 36 NIC III NIC II NIC III Falha Falha Resposta 7 8 51 28 NIC II NIC II Resposta Resposta Seguimento Seguimento 9 23 NIC II Resposta Seguimento 10 11 12 20 27 37 NIC III NIC II NIC III NIC III NIC II Alterações celulares benignas NIC I Inflamação crônica Ausência de alterações NIC I NIC III s/ alterações Conização Conização Conização e efurix Conização Conização Seguimento Resposta Falha Resposta Seguimento Conização Seguimento Fonte: Pesquisa de campo /2009 Org. Ribeiro, M. D. (2009) Mostra-se na tabela (ver Tab. 2), dos fatores de risco e das pacientes com resposta terapêutica comparadas à que tiveram falha terapêutica. Tabela 2 - Tabela dos fatores de risco das pacientes com resposta terapêutica comparadas às que tiveram falha terapêutica Paciente Idade Tabagismo Paridade 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 48 29 34 45 30 36 51 28 23 20 27 37 Sim Sim Não Sim Sim Não Não Não Não Não Sim Sim Multípara Prímipara Nuligesta Multípara Prímipara Prímipara Multípara Nuligesta Multípara Nuligesta Multípara Multípara Primeira relação 19 15 33 13 14 17 21 17 14 15 13 17 Resposta\falha Falha Falha Falha Falha Falha Resposta Resposta Resposta Resposta Resposta Falha Resposta Fonte: Pesquisa de campo /2009 Org. Ribeiro, M. D. (2009) Mostraremos o gráfico em linha da média das 8 citocinas dosadas das 12 pacientes avaliadas. Nas ordenadas temos a concentração em pg\ml das citocinas quantificadas e nas abscissas temos os dias de aplicação do interferon (primeiro, sexto, décimo segundo e décimo oitavo dia. Dividimos as citocinas em perfil TH1, TH2 e TH3 para melhor exposição dos resultados. As citocinas IL-2, IL-12, IFN α e TNF α foram colocadas no perfil TH1 por estimularem linfócitos T As citocinas IL4, IL6 foram colocadas no perfil TH2 por estimularem linfócitos B. As citocinas IL-10 e TGFβ foram colocadas no perfil TH3 por inibirem a resposta imune. Pelo Gráfico 1 pode-se perceber que a concentração de IL-2 estava maior no final do tratamento em relação ao ínicio do tratamento Gráfico 1-Médias +- DP da concentração de IL-2 no soro das pacientes que obtiveram resposta positiva colhido no primeiro, sexto, décimo segundo e décimo oitavo dia de tratamento com IFN α 2b. Fonte: Pesquisa de campo /2009 Org.D. M. Ribeiro (2009) O Gráfico 2, das pacientes que tiveram falha de tratamento seguiu os da que tiveram sucesso terapêutico, porém a concentração estava menor no final do tratamento em relação ao ínicio do tratamento, o que não aconteceu nas que tiveram sucesso terapêutico. Gráfico 2- Médias +- DP da concentração de IL-2 no soro das pacientes que obtiveram resposta negativa colhido no sexto, décimo segundo e décimo oitavo dia de aplicação do IFN α 2b. Fonte: Pesquisa de campo /2009 Org.D. M. Ribeiro (2009) O Gráfico 3 mostra que houve aumento da concentração de IL-12 com o tratamento com IFN α 2b nas pacientes que obtiveram resposta positiva principalmente no décimo segundo dia de tratamento. Gráfico 3- Médias +_ DP da concentração de IL-12 no soro das pacientes que obtiveram resposta positiva colhido no primeiro, sexto, décimo segundo e décimo oitavo dia de aplicação do IFN α 2b. Fonte: Pesquisa de campo /2009 Org.D. M. Ribeiro (2009) Neste gráfico 4 percebe-se que a concentração de IL-12 praticamente não mudou com o tratamento com IFN α 2b nas pacientes que tiveram falha terapêutica e no décimo segundo dia de tratamento houve queda da concentração da IL-12 ocorrendo uma diferença estatística em relação às pacientes que tiveram sucesso terapêutico. Gráfico 4-Médias +_ DP da concentração de IL-12 no soro das pacientes que obtiveram resposta negativa colhido no primeiro, sexto, décimo segundo e décimo oitavo dia de aplicação do IFN α 2b. Fonte: Pesquisa de campo /2009 Org.D. M. Ribeiro (2009) O Gráfico 5 mostra que a concentração de IFN α diminuiu nas pacientes que obtiveram sucesso terapêutico durante o tratamento com IFN α 2b. Gráfico 5- Médias +_ DP da concentração de IFN α no soro das pacientes que obtiveram resposta positiva colhido no primeiro, sexto, décimo segundo e décimo oitavo dia de aplicação do IFN α 2b. Fonte: Pesquisa de campo /2009 Org.D. M. Ribeiro (2009) Percebe-se pelo Gráfico 6 que a concentração de IFN α permaneceu mais alta no soro das pacientes que tiveram falha terapêutica em relação às que tiveram sucesso terapêutico durante toda aplicação de IFN α 2b. Gráfico 6- Médias +- DP da concentração de IFN α no soro das pacientes que obtiveram reposta negativa colhido no primeiro, sexto, décimo segundo e décimo oitavo dia de aplicação do IFN α 2b. Fonte: Pesquisa de campo /2009 Org.D. M. Ribeiro (2009) O Gráfico 7 mostra que a concentração de TNF α diminui com o tratamento de IFN α 2b no soro das pacientes que tiveram sucesso terapêutico Gráfico 7- Médias +_ DP da concentração de IFN α no soro das pacientes que obtiveram resposta positiva colhido no primeiro, sexto, décimo segundo e décimo oitavo dia de aplicação do IFN α 2b. Fonte: Pesquisa de campo /2009 Org.D. M. Ribeiro (2009) O Gráfico 8 nos mostra que a concentração de TNF α praticamente não mudou nas pacientes que tiveram falha terapêutica porém a diferença em relação as que tiveram sucesso terapêutico foi no décimo segundo dia que aumentou nas com falha e diminuiu nas com sucesso. Gráfico 8- Médias +_ DP da concentração de TNFα no soro das pacientes que obtiveram resposta negativa colhido no primeiro, sexto, décimo segundo dia e décimo oitavo dia de aplicação do IFN α 2b. Fonte: Pesquisa de campo /2009 Org.D. M. Ribeiro (2009) O Gráfico 9 mostra que a concentração de IL-4 praticamente não mudou durante o tratamento com IFNα 2b nas pacientes que tiveram sucesso terapêutico. Gráfico 9- Médias +_ DP da concentração de IL-4 no soro das pacientes que obtiveram resposta positiva colhido no primeiro, sexto, décimo segundo e décimo oitavo dia de aplicação do IFNα 2b. Fonte: Pesquisa de campo /2009 Org.D. M. Ribeiro (2009) O Gráfico 10 mostra que a concentração de IL-4 permaneceu a mesma no soro das pacientes que tiveram falha terapêutica durante todo tratamento com IFN α 2b. Gráfico 10- Médias +_ DP da concentração de IL-4 no soro das pacientes que obtiveram resposta negativa colhido no primeiro, sexto, décimo segundo e décimo oitavo dia de aplicação do IFN α 2b. Fonte: Pesquisa de campo /2009 Org.D. M. Ribeiro (2009) No Gráfico 11 percebe-se que a concentração de IL-6 também praticamente não mudou nas pacientes que tiveram sucesso terapêutico com o tratamento com IFN α 2b. Gráfico 11- Média +_ DP da concentração de IL-6 no soro das pacientes que obtiveram resposta positiva colhido no primeiro, sexto, décimo segundo e décimo oitavo dia de aplicação do IFN α 2b. Fonte: Pesquisa de campo /2009 Org.D. M. Ribeiro (2009) Já nas pacientes que tiveram falha terapêutica a concentração de IL-6 aumentou com o tratamento com IFN α 2b (Ver Gráfico 12). Gráfico 12- Médias +_ DP da concentração de IL-6 no soro das pacientes que obtiveram resposta negativa colhido no primeiro, sexto, décimo segundo e décimo oitavo dia de aplicação do IFN α 2b. Fonte: Pesquisa de campo /2009 Org.D. M. Ribeiro (2009) O que chama mais a atenção no Gráfico 13 é que esta citocina aumenta de concentração principalmente no décimo segundo dia de tratamento com IFN α 2b para depois apresentar uma queda brusca até o final do tratamento. Gráfico 13- Médias +_ DP da concentração de IL-10 no soro das pacientes que obtiveram resposta positiva colhido no primeiro, sexto, décimo segundo e décimo oitavo dia de aplicação do IFN α 2b. Fonte: Pesquisa de campo /2009 Org.D. M. Ribeiro (2009) O Gráfico 14 mostra o contrário do que ocorreu com as pacientes que tiveram sucesso terapêutico, aqui a concentração da IL-10 apresenta uma queda no décimo segundo dia de aplicação do IFN α 2b. Gráfico 14- Médias +_ DP da concentração de IL-10 no soro das pacientes que obtiveram resposta negativa colhido no primeiro, sexto, décimo segundo e décimo oitavo dia de aplicação do IFN α 2b. Fonte: Pesquisa de campo /2009 Org.D. M. Ribeiro (2009) O Gráfico 15 do TGF β segue a IL-10 nas pacientes que tiveram sucesso terapêutico apresentando um pico no décimo segundo dia de tratamento com IFN-α 2b para a partir de então apresentar uma queda brusca. Gráfico 15- Médias +- DP da concentração de TGF β no soro das Pacientes que obtiveram resposta positiva colhido no primeiro, sexto, décimo segundo e décimo oitavo dia de aplicação do IFN α 2b. Fonte: Pesquisa de campo /2009 Org.D. M. Ribeiro (2009) Pelo Gráfico 16 percebe-se que nas pacientes que tiveram falha terapêutica a concentração de TGF β praticamente não alterou durante todo tratamento com IFN α 2b. Gráfico 16- Médias +_ DP da concentração de TGF β no soro das pacientes que obtiveram resposta negativa colhido no primeiro, sexto, décimo segundo e décimo oitavo dia de aplicação do IFN α 2b. Fonte: Pesquisa de campo /2009 Org.D. M. Ribeiro (2009) 6 DISCUSSÃO A NIC de alto grau têm sido identificada em pacientes cada vez mais jovens e muitas vezes nulíparas ou prímiparas por isso o tratamento excisional é muito agressivo nestes casos sendo necessários estudos para tratamentos como a imunoterapia. Os diagnósticos de HSIL ocorrem preferencialmente em mulheres com idade entre 35 e 40 anos (MOUGEN e colaboradores., 2001).Essas médias de idades descritas são semelhantes às encontradas em nosso estudo. Alguns estudos têm apontado aumento da incidência de intercorrências obstétricas em mulheres previamente submetidas a tratamento excisional (conização e alça diatérmica) como o trabalho de parto pré termo e a ruptura prematura das membranas. O tratamento conservador com interferon intralesional pode estar entre as opções terapêuticas de pacientes em idade fértil uma vez que não altera a anatomia do colo uterino que é o maior fator gerador das complicações durante a gestação. Além disso, os métodos excisionais não atuam diretamente na causa do problema que é na maioria das vezes o HPV. Por este motivo, recorrências são freqüentes (30 a 50%) por meses ou anos devido à replicação viral que ocorre no tecido periférico à lesão tratada. Há evidências de que o câncer do colo uterino é mais agressivo em mulheres jovens, com idade inferior a 40 anos (CHAVES et al., 1984) Diversos fatores aumentam o risco de infecção pelo HPV e o desenvolvimento de NIC, dentre eles pode-se citar a paridade e o tabagismo (SYRJÄNEN et al.,2007), o número de parceiros e o ínicio da atividade sexual antes dos 25 anos (DOMINGO et al., 2008). O início da atividade sexual precoce tem sido identificado em vários estudos como o mais importante fator de risco epidemiológico para o desenvolvimento de neoplasia intra-epitelial cervical porque durante a adolescência, a cérvice, especificamente a zona de transformação é particularmente susceptível à indução de carcinogênese por agentes oncogênicos de transmissão sexual (ECONOMOS et al., 1994). Essa susceptibilidade ocorre em função da metaplasia resultante da ectopia que surge durante a adolescência (Harris et al.,1980). Em nosso estudo a média de idade da sexarca foi de 17 anos. Porém, atualmente, além da sexarca ser precoce o número de parceiros por mulheres aumentou muito em relação ao passado. No nosso estudo das 12 pacientes apenas uma relatou ter tido somente um parceiro. Outro fator epidemiológico importante de associação com carcinoma de colo é a multiparidade porém no nosso estudo e de EDEBIRI (1990) não encontrou diferença estatística entre pacientes nulíparas e multíparas em relação à incidência de NIC. O principal fator associado à neoplasia intra-epitelial cervical é a infecção pelo HPV e no nosso estudo vimos que quase todas as pacientes apresentavam infecção pelo HPV. Por um lado, esta infecção que é muito comum pode ser passageira e assintomática, induzindo uma efetiva resposta imune que permite a cura da infecção; por outro lado, ela pode ser responsável por uma lesão intra-epitelial (RIETHMULLER et al., 2002) Acredita-se portanto que nesses casos outros fatores estariam envolvidos; fatores estes que alteram a imunidade da paciente como o tabagismo e o tipo de HPV (mais oncogênicos) As células malignas se originam como resultado da integração do DNA do HPV ao genoma celular do hospedeiro que induz a expressão dos oncogenes virais E6 e E7 principalmente o HPV 16 e o HPV 18. As células adquirem uma vantagem proliferativa de escapar do controle de crescimento exercido pelos genes p53 e Rb. Ambos são inativados respectivamente pelos oncogenes E6 e E7 (MOUGIN et al., apud PRETET, 2007). O tabagismo contribui para a oncogênese cervical pela exposição direta do DNA de células epiteliais cervicais à nicotina e à cotidina com altas concentrações no muco cervical induzindo mutação e alteração na atividade gênica. e indiretamente essas substâncias inibem a resposta celular do sistema imune, induzindo a replicação viral e a infecção de células adjacentes, aumentando a possibilidade de incorporação do vírus ao genoma celular (RUNOWICZ et at., 1997). O tabagismo portanto, é considerado um dos principais fatores associados à persistência da atividade viral, aumentando o risco de progressão ou recidiva das lesões em pacientes com NIC associada à infecção pelo HPV. O nosso estudo pode comprovar isto pois quase todas pacientes que tiveram falha terapêutica com interferon fumavam e as que tiveram sucesso terapêutico não fumavam. O carcinoma de colo uterino representa um sistema ideal de estudo de carcinogênese em função de possuir um estágio pré canceroso bem definido (BELLINGHAUSEN et al., 1994). A presença do HPV por si só não é suficiente para a evolução da doença (PARKIN et al.,2005). Os estágios pré-invasivos bem definidos, assim como os fatores virais envolvidos ao nível molecular, tornam o carcinoma do colo uterino um bom modelo para investigação de alternativas terapêuticas imunológicas (SCHOELL et al.,1999). Nosso estudo vem justamente trazer uma terapia imunológica para a neoplasia intra-epitelial cervical de alto grau com o interferon alfa-2b intralesional no intuito de sabermos quais as citocinas no soro das pacientes avaliadas seriam as mais responsáveis pela resposta clínica positiva das mesmas. Os benefícios da imunoterapia com IFN já foram descritos em vários trabalhos e entre suas vantagens está a preservação do colo uterino e do futuro reprodutivo de pacientes com NIC de alto grau (PENNA et al.,1994) O IFN interfere na replicação viral mas segundo BORDEN et al. (2007) ele também apresenta ação inibidora do crescimento celular. STELLATO et al. (1992) utilizaram IFN α-2b em pacientes com NIC e obteve resposta completa em 33% dos casos, regressão parcial em 58% dos casos e falha terapêutica em 8 % dos casos e observou efeitos colaterais como febre, cefaléia, mialgia e astenia em 100% dos casos e também CHOO et al. (1986) administrando IFN α-2b induziu remissão completa da lesão em 85,7% dos casos e dessas 50% tiveram recidiva entre 12 e 24 meses e com IFN β a resposta completa ocorreu em apenas 40% dos casos. O nosso estudo mostrou que 16,6% (n=2) das pacientes apresentaram resposta completa, regressão parcial em 33,3% (n=4), falha terapêutica em 41,6% (n=5) e progressão da lesão em 8,3% (n=1) das pacientes. Apesar da resposta imune ao câncer cervical, às NICs e infecções pelo HPV não estar completamente elucidada, estudos provenientes com outras infecções por patógenos intracelulares demonstram a importância das células T e das citocinas, na indução e manutenção de uma resposta imune efetiva contra tais patógenos. No entanto, as citocinas têm um papel relevante na resposta imunológica adaptativa, determinando de forma específica, efetiva e especializada a diferenciação dos linfócitos T CD4. Assim as citocinas podem ser caracterizadas de acordo com os efeitos que causam: estimulantes (pró inflamatórias) ou inibidoras|supressoras (antiinflamatórias) (HAUSER, 1995). A mudança na expressão de citocinas pró inflamatórias para antiinflamatórias pode facilitar a progressão tumoral por subversão dos mecanismos de imunovigilância celular segundo HUANG e colaboradores (1995). No nosso trabalho podemos observar que nas pacientes que tiveram boa resposta enquanto as citocinas do perfil TH1 como IL-2 e a IL-12 (pró inflamatórias) subiam a partir do décimo segundo dia do tratamento com interferon, as citocinas do perfil TH3 como IL-10 e o TGF β (antiinflamatórias) apresentavam queda. Pardo-Govea et al. (2005) concluíram que a resposta imune tipo TH1 é predominante nas lesões pré malignas associadas ou não à infecção pelo HPV e vários estudos observaram decréscimo sistêmico de interleucinas do perfil TH1 relacionados ao aumento do grau da NIC (BAIS et al., 2007; LEE et al., 2004; ELSHERIF et al., 2001 e SCOTT et al.,1999) sugerem que a persistência da infecção viral do HPV se daria por falha em expressar citocinas TH1. Grassegger et al. (1997) também mostrou em seu estudo que a regressão da infecção por HPV está associada a uma resposta imune mediada por citocinas do tipo TH1 que bloqueiam o crescimento de queratinócitos infectados pelo HPV inibindo assim a expressão das oncoproteínas virais promovendo a regressão das lesões de alto grau. Em contraste, lesões por HPV persistentes não exibem inflamação e podem desenvolver tolerância. O decréscimo de citocinas TH1 ocorrem nas HSIL pois essas citocinas estão envolvidas na erradicação de patógenos intracelulares como o HPV e são potentes ativadores da imunidade mediada por células T pois esta resposta é caracterizada por um infiltrado de células mononucleares e regulação positiva de células de adesão além da apoptose de queratinócitos infectados sugerindo que este perfil de resposta imune tem um papel importante na defesa do hospedeiro (EVANS et al.,1997). De acordo com Peters et al. (1996) a diminuição da atividade de células dendríticas devido à baixa produção de TNF e IL-1 no câncer de colo uterino pode ser responsável pela reduzida expressão do RNAm da IL-12 em pacientes com carcinoma cervical. Observamos no nosso estudo que em todas as pacientes com tratamento com interferon as citocinas do perfil TH1 como IL-2 e a IL-12 aumentaram a partir do sexto dia de tratamento porém nas pacientes que obtiveram resposta positiva esse aumento foi muito mais significativo apresentando diferença estatística no décimo segundo dia com a interleucina-12 entre as pacientes com resposta positiva e as pacientes com resposta negativa. Quanto ao TNF α, ele diminuiu de concentração durante o tratamento das pacientes que tiveram resposta terapêutica o que pode ser explicado devido esta citocina promover a progressão do ciclo celular pelo aumento da expressão do RNAm do HPV 16 E6\E7 e conseqüente imortalização de queratinócitos (GAIOTTI et al., 2000) e também segundo Duarte et al. (2005) a expressão elevada do TNF α pode elevar o risco de neoplasia invasiva. A IL-12 é uma citocina multifuncional que promove uma ponte de ligação entre a resposta imune inata e a adaptativa, agindo como molécula chave reguladora da resposta imune mediada por células, através da indução da diferenciação de células T CD4 em células TH1, além de promover reativação e sobrevivência das células T CD4 de memória. A IL-12 induz a proliferação e atividade citolítica de NK e células T CD8, além de ter atividade antiangiogênica mediada pelo IFN α prevenindo infecções virais, progressão tumoral e atividade metastática (DEL VECCHIO et al., 2007). De acordo com nosso estudo o IFN α diminuiu de concentração no final do tratamento com IFN α-2b nas pacientes que obtiveram resposta terapêutica e nas pacientes que obtiveram falha terapêutica o IFN α permaneceu com concentrações maiores durante todo tratamento, nossos dados confirmam o estudo de PardoGovea et al. (2005) que afirmam que há uma relação direta da progressão da lesão cervical e o aumento do IFN α (acredita-se que o IFN α seria produzido pelas células anormais do colo uterino). A associação entre a expressão do RNAm da IL-12 in situ e a regressão das lesões de alto grau do colo uterino sugere que a resposta imune TH1 mediada pela IL-12 esteja relacionada à cura da infecção pelo HPV (DE GRUIJL et al., 1999). Outra função relevante da IL-12, principalmente devido à disfunção tumoral, é sua capacidade de repolarização do perfil TH2 para o TH1, por possuir atividade imunomoduladora e antiangiogênica, por isso ela poder ser usada para tratamentos imunoterápicos contra vários tipos de cânceres (WESA et al.,2007). Evidências sugerem uma regulação antagônica entre diferentes perfis de citocinas na resposta imune. Se por um lado citocinas do perfil TH1 como a IL-12 se mostram efetivas contra infecções virais e neoplasias, por outro lado, citocinas imunoinibitórias como a IL-10, induzem a resposta imune humoral, eficaz contra antígenos extracelulares, entretanto permissiva ao desenvolvimento de tumores. (KIRKPATRICK et al., 2004). β De acordo com Pardo-Govea et al. (2005) o HPV pode induzir citocinas produzidas pelas células TH2 principalmente no ambiente tumoral que podem inibir a ativação de macrófagos, de linfócitos T citotóxicos além de inibir a apresentação de antígenos suprimindo a imunidade pelas células TH1 e ainda segundo Al-Saleh et al., (1998) a progressão da NIC para câncer invasivo está associada a uma resposta imunoregulatória do tipo TH2 com participação das interleucinas 4 e 6. A IL-4, principal estímulo para o desenvolvimento de células TH2, pode antagonizar os efeitos ativadores de IFN α sobre os macrófagos e,desse modo, inibir reações imunes mediadas por células (ABBAS & LITCHMAN, 2005) Pelo nosso trabalho percebemos que as citocinas do perfil TH2 não tiveram mudanças durante o tratamento e a maioria diminuiu de concentração após o tratamento, já as citocinas TH1 aumentaram após o tratamento com IFN α-2b principalmente nas pacientes que tiveram resposta terapêutica. Sabe-se que o aumento da produção de IL-4 e IL-10 pode ser um mecanismo usado pelas células tumorais para escapar do reconhecimento imune (CLERICI et al.,1997) estando esse aumento associado à persistência e à progressão das lesões pré malignas (EL SHERIF et al., 2001; BAIS et al., 2005). Quanto a IL-6, percebemos que sua concentração no final do tratamento era menor que antes do tratamento com IFN α-2b, nas pacientes que obtiveram sucesso terapêutico. De acordo com WEI et al, 2001, a IL-6 promove angiogênese tumoral favorecendo o desenvolvimento do câncer cervical. Segundo Ahmed et al. (2002) a resposta imune na presença do HPV tem um predomínio de citocinas imunossupressoras, sendo que estas podem estar na região cervical ou na circulação periférica e a presença destas propicia um ambiente favorável para transformação maligna, permitindo assim a progressão da NIC para o câncer invasivo. O desenvolvimento da NIC tem sido associado a um padrão TH2 de secreção de citocinas e que a proporção IL12\IL10 está reduzida (CLERICI et al.,1997) (ELSHERIF et al., 2001) e as citocinas imunossupressivas tais como TGF β e IL-10 estão aumentadas (TJIONG et al., 2001). Algumas células reguladoras produzem citocinas como o TGF β e a IL-10, que bloqueiam a ativação dos linfócitos e macrófagos e também podem suprimir outros linfócitos, por mecanismos indefinidos que não envolvem citocinas (ABBAS e LITCHMAN, 2005). Além disso, o TGF β inibe a proliferação celular epitelial e a transcrição dos genes E6\ E7 do HPV. O nosso trabalho mostrou que as citocinas que mais variaram durante todo tratamento foram a IL-12, a IL-10 e o TGF β porém nas pacientes que tiveram resposta positiva a variação foi muito maior e no décimo segundo dia de tratamento todas estas três citocinas tiveram picos porém a partir de então as citocinas imunossupressoras como a IL-10 e o TGF β tiveram grande queda e a IL-12 teve pequena queda se mantendo alta até o final do tratamento. Nessa discussão podemos observar que a expressão de citocinas TH1 em pacientes com resposta satisfatória sugere que esse padrão esteja relacionado à regressão da lesão de alto grau porém só acontecerá sucesso terapêutico caso as citocinas TH3 apresentem queda significativa e as citocinas TH1 apresentem aumento significativo para modular as citocinas TH3. A ampliação do número de pacientes e o aumento de trabalhos com citocinas é importante para que novas estratégias terapêuticas sejam traçadas no tratamento de lesões precursoras do câncer decolo uterino buscando resultados satisfatórios. 7 CONCLUSÕES 1 - O tratamento das NICs de alto grau com IFN α-2b apresentou resposta clínica satisfatória em quase 100% das pacientes não fumantes e falha terapêutica em quase 100% das fumantes. 2 - A IL-12 é a citocina do perfil TH1 que apresentou diferença estatisticamente significante entre as pacientes que tiveram resposta terapêutica com as pacientes que tiveram falha terapêutica. 3 - As citocinas do perfil TH3 apresentaram aumento e depois queda significativa a partir do décimo segundo dia de tratamento com IFN α-2b nas pacientes que apresentaram resposta terapêutica sugerindo a tentativa de imunomodulação do perfil TH3 sendo modulado pelo perfil TH1 nas pacientes com sucesso terapêutico. REFERÊNCIAS ABBAS, A. K.; LICHTMAN, A. H. Imunologia celular e molecular. 5. ed. Rio de Janeiro: Elsevier, 2005. cap.ll. p. 251-280. ______ Imunologia Básica. Funções e Distúrbios do sistema imunológico. 2.ed. Rio de Janeiro:Elsevier, 2007.cap.5.p.91-114. AHMED, S.M.; AL, H.; REID, W.M.; POULTER, L.W. The cellular response associated with cervical intraepithelial neoplasia in HIV+ and HIV- subjects. Scand. Jour. Immunol., v.56, p.204-211, 2002. Al-SALEH, W.; GIANNINI, S.L.; JACOBS, N.; et al. Correlation of T-helper secretory differentiation and types of antigen-presenting cells in squamous intraepithelial lesions of the uterine cervix. Jour. Pathol., v.184, n°3, p. 283-290, 1998. BAIS, A.G.; BECKMANN, I.; EWING, P.C.; EIJKEMANS, M.J.; MEIJER, C.J.; SNIJDERS, P.J.; HELMERHORST, T.J. Cytokine release in HR-HPV(+) women without and with cervical dysplasia (CIN II and III) or carcinoma, compared with HRHPV(-). controls. Mediators Inflamm., suppl. 24147, 2007. BOR-CHING SHEU, RONG-HWA LIN, HUANG-CHUN LIEN, HONG-NERNG HO SU-MING HSU' AND SU-CHENG HUANG. Predominant Th2/Tc2 Polarity of Tumor-Infiltrating Lymphocytes in Human Cervical. Cancer. The Jour. Immunol.. v.167, p.2972-2978, 2001. BORDEN, E. C.; SEM, G. C.; UZE, G.; SILVERMAN, R. H.; RANSOHOFF, R. M.; FOSTER, G. R.; STARK, G. R. Interferons at age 50: past, current and future impact on bio medicine. Nat. Rev. Drug Discov., London, v. 6, n. 12, p. 975-990, Dec. 2007. BRIDEAU-ANDERSEN, A.D.; HUANG, X.; SUN, S.C.; CHEN, T.T.; STARK, D.; SAS, I.J.; et al. Directed evolution of gene-shuffled IFN-alpha molecules with activity profiles tailored for treatment of chronic viral diseases. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., v. 104, n. 20, p. 8269-8274, May 2007. CAZORLA, E.; URGAL, A.; CORDOBA, J.; BOLDO, A.; MARIN, M.; SANCHEZ GUTIERREZ, M.; et al. Immunomodulatory treatment with beta-interferon in patients with cervical intraepithelial neoplasia and human papillomavirus infection: long-term follow-up. Rev. Esp. Quimioter.,v.l8, n.l, p. 26-31, Mar. 2005. CHAVES, J.E, et al. Carcinoma do Colo Uterino. Manual de Avaliação prétratamento e eguimento. Porto Alegre, Centre de Aperfeiçoamento das Equipes de Saúde (CEAPES-HMIPV), 1984. CHOO, Y. C.; SETO, W. H.; HSU, C.; TANY, Y. H.; MA, H. K.; NG, M. H. Cervical intraepithelial neoplasia treated by perilesional injection of interferon. Br. J. Obstet. Gynaecol., London, v. 93, n. 4, p. 372-379, Apr. 1986. CLERICI, M.; MEROLA, M.; FERRARIO, E.; et al. Cytokine production patterns in cervical intraepithelial neoplasia: association with human papillomavirus infection. Jour. Natl. Cancer Inst, v.89, p. 245-250, 1997. CLIFFORD, G. M.; SMITH, J. S.; PLUMMER, M.; MUNOZ, N.; FRANCESCHI, S.Human papillomavirus types in invasive cervical cancer worldwide: a meta analysis. Br. J. Cancer, London, v. 88, n. 1, p. 63-73, Jan. 2003. COPELAND, L. J. Tratado de ginecologia. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1996. 1151 p. ISBN 85-277-0340-1. DE GRUIJL, T.D.; BONTKES, H. J.; VAN DEN MUYSENBERG, A.J.; VAN OOSTVEEN, J.W.; STUKART, M.J.; VERHEIJEN, R.H.; et al. Differences in cytokine mRNA profiles between premalignant and malignant lesions of the uterine cervix. Eur. J. Cancer, v. 35, n. 3, p. 490-497, Mar. 1999. DE VILLIERS, E.M.; FAUQUET, C.; BROKER, T.R.; BERNARD, H.U.; ZUR HAUSEN, H. Classification of papillomaviruses. Virology, v.324, p. 17-27, 2004. DEL VECCHIO, M.; BAJETTA, E.; CANOVA, S.; LOTZE, M.; PARMIANI, A. G.; & ANICHINI, A. Interleukin-12: Biological Properties and Clinical Application. Clin. Cancer Res. v.3, n°16, p. 4677 - 4685, 2007. DOMINGO, E.J.; NOVIANI, R.; NOOR, M.R.; NGELANGEL, C.A.; LIMPAPHAYOM, K.K.; THUAN, T.V.; et al. Epidemiology and prevention of cervical cancer in Indonesia, Malaysia, the Philippines, Thailand and Vietnam. Vaccine, suppl. 12:M719, 2008. DUARTE, L; SANTOS, A.; SOUSA, H.; CATARINO, R.; PINTO, D.; MATOS, A.; PEREIRA, D.; MOUTINHO, J.; CANEDO, P.; MACHADO, JC.; MEDEIROS, R. G-308 TNF-ct polymorphism is associated with an increased risk of invasive cervical cancer. Biochem. Biophys. Res .Commun., New York, v. 334, p. 558-592, 2005. EL-SHERIF, A. M.; SETH, R.; TIGHE, P. J.; JENKINS, D. Quantitative analysis of IL-10 and IFN-gamma mRNA levels in normal cervix and human papillomavirus type 16 associated cervical precancer. J. PathoL, London, v. 195, n. 2, p. 179-185, Sept. 2001. EVANS, E. M.; MAN, S.; EVANS, A. S.; BORYSIEWICZ, L. Z. Infiltration of cervical cancer tissue with human papilomavirus-specific cytotoxic T-lymphocytes. Cancer Res. v.57, p. 29-43, 1997 GAIOTTI, D.; CHUNG, J.; IGLESIAS, M.; NEES, M.; BAKER, P.O.; EVANS, C.H.; WOODWORTH, C.D. Tumor necrosis factor-alpha promotes human papillomavirus (HPV) E6/E7 RNA expression and cyclin-dependent kinase activity in HPV-immortalized keratinocytes by a ras-dependent pathway. Mol. Carcinog.,v.27, n.2, p. 97-109, Feb.2000. GARNETT, T.O.; DUERKSEN-HUGHES, P.J. Modulation of apoptosis by human papillomavirus (HPV) oncoproteins.. Arch. Virol., v.151, n.12, p. 2321-2335, Dec. 2006. GONÇALVEZ, M.A.; DONADI, E.A. Immune cellular response to HPV: current concepts. Braz. J. Infect. Dis., Salvador, v.8, n.l, p. 1-9, Feb.2004. GRISMONDI, G.L.; MASIN, G.; MARINI, A. p-Interferon in the therapy of cervicovaginal papilloma virus (HPV) infection associated with cervical intraepithelial neoplasia (CIN). Minerva Ginecol., Torino, v.47, n.12, p.527-529, Dec.1995. HAUSER, S.L. Tumor necrosis factor: immunogenetics and disease. Ann. Neurol., Boston, v. 38, p. 702-704, 1995. HUANG, S. L; CHAD, A.; HSUEH, S.; CHAO, F. Y.; HUANG, C. C.; YANG, J. E.; LIN, C. Y.; YAN, C. C.; CHOU, H. H.; HUANG, K. G.; HUANG, H. J.; WU, T. L; TSENG, M. J.; QIU, J. T.; LIN, C. T.; CHANG, T. C.; LAI, C. H. Comparison between the Hybrid Capture II Test and an SPF1/GP6+ PCR-Based Assay for Detection of Human Papillomavirus DNA in Cervical Swab Samples. Jour. Clin. MicrobioL.v. 44, n. 5, p. 1733-1739, 2006. INCA - Institute Nacional do Cancer. Ministério da Saúde - Brasil. Estimativas da incidência e mortalidade por câncer de colo de útero, 2008 - 2009. Disponível em: <www.inca.org.br>. Acesso em 20 jul. 2009. KCM-Classificação de BETHESDA-28 jul. 2005 KIRKPATRICK, A.; BIDWELL, J.; VAN DEN BRULE, A.J.C.; MEIJER, C.J.L.M.; PAWADE, J.; GLEW, S. TNF- a polymorphism frequencies in HPV-associated cervical dysplasia. Gynecol. Oncol., New York,v. 92, p. 675-679, 2004. L.M.B.S. Imunologia cellular e molecular. 4ª ed., Editora Revinter, 2004. MATHEVET, P.; CHEMALI, E.; ROY, M.; DARGENT, D. Long-term outcome of a randomized study comparing three techniques of conization: cold knife, laser, and LEEP. Eur. J. Obstet.Gynecol .Reprod. BioL, v.106, n. 2, p.214-218, Feb. 2003. MICHELETTI, L.; BARBERO, M.; PRETI, M.; ZANOTTO VALENTINO, M.C.; NICOLACI, P.; CORBELLA, L.; et al. Intra-lesion administration of beta-interferon in the treatment of CIN associated with HPV infection. Minerva Ginecol., v. 44, n.6, p.329-334, June 1992. MULLER, G.; SALOGA, J.; GERMANN, T.; BELLINGHAUSEN (beel???), L; MOHAMADZADEH, M.; KNOP, J.; et al. Identification and induction of human keratinocyte-derived IL-12. J. Clin. Invest., v.94, n.5, p. 1799-1805, Nov. 1994. MUÑOZ, N.; BOSCH, F.X.; DE SANJOSE, S.; HERRERO, R.; CASTELLSAGUE, X.; SHAH, K.V.; et al. Epidemiologic classification of human papillo ma virus types associated with cervical cancer. N. Engl. J. Med., v.348, n.6, p. 518-527, Feb.2003. MURTA, E.F.C.; TAVARES MURTA, B.M. Successful pregnancy after vaginal cancer treated with interferon. Tumori, v.90, n.2, p.247-248, Mar./Apr. 2004. NARISAWA-SAITO, M.; KIYONO, T. Basic mechanisms of high-risk human papillomavirus-induced carcinogenesis: roles of E6 and E7 proteins. Cancer Sci., v.98, n.10, p. 1505-1511, Oct. 2007. PAAVONEN, J. Human papillo ma virus infection and the development of cervical cancer and related genital neoplasias. Int. J. Infect. Dis., suppl 2:S3-9, 2007. PARDO-GOVEA, T.; CALLEJAS, D.; NUNEZ-TROCONIS, J.; ARAUJO, M.; COSTA, L.; PONS, H.; DELGADO, M.; MONSALVE, F. Gamma interferon (IFN-gamma), tumor necrosis factor alpha (TNF-alpha) and interleukins 2, 4 and 6 (IL-2, IL-4, IL-6) in cervical-uterine cells of intraepithelial neoplasia: a preliminary report. Invest. Clin., Maracaibo, v. 46, n. 1, p. 5-13, Mar. 2005. PETERS, J.H.; GIESELER, R.; THIELE, B.; STEINBACH, F. Dendritic cells: from ontogenetic orphans to myelomonocytic descendants. Immunol. Today, v.17, n. 6, p. 273-278, Jun. 1996. PRETET, J.L.; CHARLOT, J.F.; MOUGIN, C. Virological and carcinogenic aspects of HPV. BulLAcad. Natl. Med., v.191, n.3, p. 611-623, Mar.2007. RANDALL, R. E.; GOODBOURN, S. Interferons and viruses: an interplay between induction, signalling, antiviral responses and virus countermeasures. J. Gen. Virol., London, v. 89, pt. 1, p. 1-47, Jan. 2008. RAMOS, M.C.; DE LORENZO, B.H.; MICHELIN, M.A.; MURTA, E.F. High-grade cervical intraepithelial neoplasia, human papillomavirus and factors connected with recurrence following surgical treatment. Clin. Exp. Obst. & Gyn., n.3, p. 242-247, May 2008. RICHART, R.M. A modified terminology for cervical intraepithelial neoplasia. Obstet. Gynecol., v. 75, n°l, p.131-133,1990. RICHART, R. M.; SHINGLETON, H. M.; WIENER J.; SPIRO, D. Human cervical intraepithelial neoplasia: fine structure of dysplasia and carcinoma in situ. Cancer Res., v.28, n °4, p.695-706, 1968. ROBBINS, S. L.; COTRAN, R. S.; KUMAR, V. Patologia estrutural e funcional. 5ª edição. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan. 1994. 1279 p. ROTOLA, A.; COSTA, S.; Di LUC A, D.; STEFANON, B.; VILLANI, C.; MICHELETTI, L.; MONTEMAGNO, U.; BOLIS, P. F.; CASSAI, E. Beta-interferon treatment of cervical intraepithelial neoplasia: a multicenter clinical trial. Intervirology, Basel, v. 38, n. 6, p. 325-331, 1995. RUNOWICZ, C.D.; LYMBERIS, S.; TOBIAS, D. Cervical Neoplasia and Cigarette Smoking: Are They Linked? Medscape Womens Health, v.2, n.3, p.2. Mar. 1997. SCOTT, M.; STITES, D. P.; MOSCICKI, A. B. Thl cytokine patterns in cervical human papillomavirus infection. Clin. Diagn. Lab. Immunol., Washington, v. 6, n. 5, p. 751755, Sept. 1999. SHEU, B.C.; CHANG, W.C.; LIN, H.H.; CHOW, S.N.; HUANG, S.C. Immune concept of human papillo ma viruses and related antigens in local cancer milieu of human cervical neoplasia. J. Obstet. Gynaecol. Res., v.33, n.2, p.103-113, Apr.2007. SIKORSKI, M.; ZRUBEK, H. Long-term follow-up of patients treated with recombinant human interferon gamma for cervical intraepithelial neoplasia. Int. J. Gynaecol. Obstet., New York, v. 82, n. 2, p. 179-185, Aug. 2003. SIKORSKI, M.; ZRUBEK, H. Recombinant interferon gamma in the treatment of cervical intraepithelial neoplasia(CIN) associated with human papillomavirus (HPV) infection. Eur. J. Gynaecol. Oncol., Padua, v. 24, n. 2, p. 147-150, 2003. STANLEY, M. A. Immunobiology of papillomavirus infeccions. J. Reprod. Immunol., Amsterdam, v. 52, n.1-2, p. 45-49, Oct./Nov. 2001. STELLATO, G. Intralesional recombinant alpha 2B interferon in the treatment of human papillomavirus-associated cervical intraepithelial neoplasia. Sex. Transm. Dis., Philadelphia, v. 19, n. 3, p. 124-126, May/June 1992. SYRJÄNEN, K. New concepts on risk factors of HPV and novel screening strategies for cervical cancer precursors. Eur. J. Gynaecol. Oncol., v.29, n.3, p.205-221, 2008. SYRJÄNEN, K.; SHABALOVA, I.; PETROVICHEV, N.; KOZACHENKO, V.; ZAKHAROVA, T.; PAJANIDI, J.; et al Smoking is an independent risk factor for oncogenic human papillomavirus (HPV) infections but not for high-grade CIN. Eur. J. Epidemiol, v.22, n.10, p. 723-735, Sep.2007. THE 1988 Bethesda System for reporting cervical/vaginal cytological diagnoses. National Cancer Institute Workshop. JAMA 1989; 262; 931. TINDLE, R. W. Immune evasion in human papillomavirus-associated cervical cancer. Nat. Rev. Cancer, London, v. 2, n. 1, p. 59-65, Jan. 2002. TJIONG, M. Y.; VAN DER VANGE, N.; TEN KATE, F. J.; TJONG-A-HUNG, S. P.; TER SCHEGGET, J.; BURGER, M. P.; OUT, T. A. Increased IL-6 and IL-8 levels in cervicovaginal secretions of patients with cervical cancer. Gynecol. Oncol., New York, v. 73, n. 2, p. 285-291, May 1999. WESA, A.; KALINSKI, P.; TATSUMI, T.; et al Polarized type-1 dendritic cells (DC1) producing high levels of IL-12 family members rescue patient Thl-type anti-melanoma CD4+ T cell responses in vitro. Jorn. Immunother. n°30, p.75 - 82, 2007. WIRA, C. R.; FAHEY, J. V.; SENTMAN, C. L.; PIOLI, P. A.; SHEN, L. Innate and adaptive immunity in female genital tract: cellular responses and interactions. Immunol. Rev., Copenhagen, v. 206, p. 306-335, Aug. 2005. ANEXOS ANEXO A Imagens colposcópicas das lesões do colo uterino antes do tratamento e após tratamento com interferon α-2b. Figura 1 - Colo da paciente 6 que obteve sucesso terapêutico tirada durante colposcopia no dia 11 de setembro de 2009 antes do tratamento com interferon α-2b. Autor: D. M. RIBEIRO, set./2009. Figura 2 - Colo da paciente 6 que obteve sucesso terapêutico tirada durante colposcopia no dia 04 de dezembro de 2010 após o tratamento com interferon α-2b. Autor: D. M. RIBEIRO, dez./2010. Figura 3 - Colo da paciente 7 que obteve sucesso terapêutico tirada durante colposcopia no dia 15 de setembro de 2009 antes do tratamento com interferon α-2b. Autor: D. M. RIBEIRO, out./2008. Figura 4 - Colo da paciente 7 que obteve sucesso terapêutico tirada durante colposcopia no dia 12 de novembro de 2009 após o tratamento com interferon α-2b. Autor: D. M. RIBEIRO, nov./2009 Figura 5 - Colo da paciente 2 que obteve falha terapêutica tirada durante colposcopia no dia 08 de outubro de 2008 antes do tratamento com interferon α-2b. Autor: D. M. RIBEIRO, out./2008. Figura 6 - Colo da paciente 2 que obteve falha terapêutica tirada durante colposcopia no dia 22 de julho de 2009 após o tratamento com interferon α-2b. Autor: D. M. RIBEIRO, jul./2008. Figura 7 - Colo da paciente 1 que obteve falha terapêutica tirada durante colposcopia no dia 08 de outubro de 2008 antes do tratamento com interferon α-2b. Autor: D. M. RIBEIRO, out./2008. Figura 8 - Colo da paciente 1 que obteve falha terapêutica tirada durante colposcopia no dia 07 de agosto de 2009 após o tratamento com interferon α-2b. Autor: D. M. RIBEIRO, ago./2008. Figura 9 - Colo da paciente 3 que obteve falha terapêutica tirada durante colposcopia no dia 08 de outubro de 2008 antes do tratamento com interferon α-2b. Autor: D. M. RIBEIRO, out./2008. Figura 10 - Colo da paciente 3 que obteve falha terapêutica tirada durante colposcopia no dia 27 de julho de 2009 após o tratamento com interferon α-2b. Autor: D. M. RIBEIRO, jul./2009.