INNO-LiPA HLA-C Amplification
Manufactured by:
INNOGENETICS N.V.
Technologiepark 6
9052 Ghent
Belgium
+32 9 329 1329
Distributed by:
INNOGENETICS GmbH
Lembecker Straβe 19
46359 Heiden (Westfalen)
Germany
+49 2867 99 07 0
INNOGENETICS S.r.l
Via del Mare 36
00040 Pomezia (Roma)
Italy
+39 0691 180375
Innogenetics © 2004
INNOGENETICS N.V.
Technologiepark 6
9052 Ghent
Belgium
+32 9 329 1329
INNOGENETICS s.a.r.l.
8, Rue du Maréchal de Lattre-de-Tassigny
59800 Lille
France
+33 1 49 93 26 18
INNOGENETICS Diagnostica y
Terapeutica (IDT) S.A.
Calle Botánica 146
08908 Hospitalet de Llobregat (Barcelona)
Spain
+34 93 600 8000
25015 v2
2004-03-10
INNOGENETICS®*
TABLE OF CONTENTS
English
Symbols used . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .5
Intended use . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .5
Test Principle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .6
Reagents . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .6
Description, preparation for use and recommended storage
conditions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .6
Materials required but not provided . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .7
Safety and environment . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .7
Specimen (preparation and storage) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .7
DNA extraction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .8
PCR mix preparation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .8
PCR cycling . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .8
Remarks and precautions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .8
Test procedure . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .9
Results . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .10
Visualization . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .10
Validation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .11
Limitations of the procedure . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .11
Test performance . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .11
Français
Symboles utilisés . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .12
But du test . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .12
Principe du test . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .13
Réactifs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .13
Description, préparation et conditions de conservation . . . . .13
Matériel nécessaire non fourni . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .14
Consignes de sécurité . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .14
Echantillons (préparation et conservation) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .14
Extraction ADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .14
Préparation du mélange PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .15
Amplification PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .15
Remarques et précautions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .15
Procédures . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .16
Résultats . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .18
Visualisation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .18
Validation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .18
Limites du test . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .18
2 * INNOGENETICS® is a Registered Trademark of Innogenetics N.V.
INNO-LiPA HLA-C Amplification
Performances . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .19
Deutsch
Verwendete Symbole . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .19
Beabsichtigter Verwendungszweck . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .20
Funktionsweise des Tests . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .20
Gelieferte Materialien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .20
Beschreibung, Vorbereitung, Lagerung und Haltbarkeit . . . . .20
Zusätzlich benötigte Materialien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .21
Sicherheitshinweise und Entsorgung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .22
Herstellung und Aufbewahrung der Proben . . . . . . . . . . . . . . . . . . .22
DNA-Extraktion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .22
Herstellen des PCR-Mix . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .22
PCR-Cycling . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .23
Hinweise und Vorsichtsmaßnahmen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .23
Arbeitsablauf . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .23
Ergebnisse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .25
Visualisierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .25
Validierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .26
Einschränkungen des Verfahrens . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .26
Leistungsfähigkeit des Tests . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .26
Italiano
Simboli utilizzati . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .27
Uso previsto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .27
Principio del test . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .28
Reagenti . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .28
Descrizione, preparazione per l'uso e condizioni di
conservazione raccomandate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .28
Materiali richiesti ma non forniti . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .29
Sicurezza e ambiente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .29
Campioni (preparazione e conservazione) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .30
Estrazione del DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .30
Preparazione della mix di PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .30
Protocollo di PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .30
Note e precauzioni . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .30
Procedura del test . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .31
Risultati . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .33
Visualizzazione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .33
Validazione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .34
Limiti della procedura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .34
3
INNOGENETICS®
Performance del test . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .35
Español
Símbolos utilizados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .35
Uso al que está destinado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .36
Principios del ensayo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .36
Reactivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .36
Descripción, preparación para el uso y condiciones de
almacenamiento recomendadas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .36
Materiales necesarios pero no suministrados . . . . . . . . . . . . . . . . . .37
Seguridad y medio ambiente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .37
Recogida (preparación y almacenamiento de muestras) . . . . . . . . .38
Extracción de ADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .38
Preparación de la mezcla para la PCR (reacción en cadena de
la polimerasa) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .38
Ciclos de PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .38
Observaciones y precauciones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .39
Procedimiento del ensayo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .39
Resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .41
Visualización . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .41
Validación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .42
Limitaciones del procedimiento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .42
Eficacia del ensayo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .42
Português
Símbolos utilizados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .43
Indicações de uso . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .43
Princípio do Teste . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .44
Reagentes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .44
Descrição, preparação e condições de conservação
recomendadas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .44
Materiais necessários mas não fornecidos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .45
Segurança e meio ambiente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .45
Amostras (preparação e conservação) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .46
Extracção do ADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .46
Preparação da mistura de PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .46
Ciclos de PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .46
Observações e precauções . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .46
Procedimento do teste . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .47
Resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .49
Visualização . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .49
4
INNO-LiPA HLA-C Amplification
Validação . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .50
Limites do procedimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .50
Performance do Teste . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .50
English
Symbols used
Amplification kit
Manufactured by
In vitro diagnostic medical device
Lot number
Catalogue number
Use by
Consult instructions for use
Temperature limitation
Contains sufficient for <n> tests
Primer Solution
Amplification Buffer
LiPA-Taq
Intended use
The INNO-LiPA HLA-C Amplification kit, for in vitro use, is intended for
the nucleic acid amplification of the second and third exons of the human
5
INNOGENETICS®
leukocyte antigen (HLA) C locus. The reaction is performed by means of
the polymerase chain reaction (PCR)*.
Test Principle
The DNA sample to be amplified by PCR*, is introduced in a reagent
mixture containing an excess of deoxynucleoside 5'-triphosphates
(dNTPs), biotinylated primers, and thermostable DNA polymerase. The
primers will amplify exon 2 and exon 3 of the HLA-C locus, and are
therefore called "HLA-C primers". By heating, the two strands of the
DNA helix are separated (denaturation) in order to expose the target
sequences to the primers. These primers are complementary to the regions
flanking the target sequence. Therefore, upon cooling to a specific
temperature, the primers will bind to their target region (annealing).
At another temperature, and utilizing the dNTPs, the thermostable DNA
polymerase will extend the annealed primers along the target template
(extension). This way, two exact biotinylated copies of the template
sequence are produced after one cycle of denaturation, annealing and
extension. After 35 cycles, a multi-amplified biotinylated target sequence
is obtained.
*
The use of this product is covered by a license of F. Hoffmann - La
Roche Ltd and Roche Molecular Systems, Inc.
Reagents
Description, preparation for use and recommended storage conditions
-
-
6
If kept at -15/-25°C and stored in the original vials, the reagents are
stable until the expiry date from the kit. However it is recommended
to aliquot reagents after first use (except for LiPA-Taq) and then
store at -15/-25°C. Do not use the reagents beyond the expiry date.
All reagents should be brought to room temperature (20 - 25°C)
approximately 60 minutes before use and should be returned to the
freezer immediately after use.
The reagents should be stored isolated from any source of
contaminating DNA, especially amplified products.
Alterations in physical appearance of the kit reagents may indicate
instability or deterioration.
INNO-LiPA HLA-C Amplification
Reagents supplied:
Quantity
Ref.
Description
1 x 0.3 ml
56722
Primer Solution 1 x 0.3 ml
57028
Containing all dNTPs and 0.05%
NaN3 as preservative.
Containing biotinylated primers,
MgCl2, DMSO and 0.05% NaN3
as preservative.
Taq DNA Polymerase and 0.05%
NaN3 as preservative.
Component
Amplification
Buffer
LiPA Taq
1 x 0.035 ml 56723
Materials required but not provided
-
Materials for DNA extraction
Disposable gloves
Disposable sterile pipette tips (preferably cotton-plugged)
Sterile microtubes
Microtube racks
Microtube centrifuge
DNA Thermal Cycler and equipment
Pipettes adjustable to deliver 1 - 20 µl, 20 - 200 µl, and 200 - 1000 µl
Mineral Oil, Silicone Grease (if required)
Autoclaved distilled water
Safety and environment
-
Please refer to manufacturer's safety data sheet and product
labeling for information on potentially hazardous components.
Specimens should always be handled as potentially infectious.
Use of personal protective equipment is necessary: gloves and safety
spectacles when manipulating dangerous or infectious agents.
Waste should be handled according to the institution's waste disposal
guidelines. All federal, state, and local environmental regulations
should also be observed.
Specimen (preparation and storage)
NOTE:
Reagents are not supplied
7
INNOGENETICS®
DNA extraction
Commonly used salting-out DNA extraction methods or methods based on
spin columns can be used to prepare genomic DNA starting from acidcitrate-dextrose (ACD)- or ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)anticoagulated whole blood samples.
Store the DNA samples -15/-25°C.
The extracted DNA should have a concentration ≥ 0.02 µg/µl. The
purity (A260nm/A280nm) should be ≥ 1.5.
PCR mix preparation
Each component must be added, and supplied in the right amount. Too
much or too little sample or reagents might result in aspecific
amplification or even in no amplification at all.
PCR cycling
The right temperature profile for the INNO-LiPA HLA-C Amplification
should be selected.
Remarks and precautions
-
8
In order to avoid DNA contamination, a maximum physical
separation between the pre- and post-amplification steps is
recommended: separate rooms, separate pipettes and other lab
material, separate lab coats and gloves (and their stock) are minimum
precautions for good laboratory practice. The reagents should be
isolated from any source of contaminating DNA, especially amplified
DNA products. Also avoid microbial contamination of reagents.
Avoid any return from the post-amplification room to the preamplification room.
All pipette tips and tubes used for the amplification process should
be autoclaved. Pipette tips with cotton plugs are recommended.
Use a new sterile pipette tip for each aliquoted specimen.
The reagents for amplification processes should be handled in a
room free of amplified DNA. Autoclaved tubes and pipette tips
(preferably cotton-plugged) should be used.
After thawing, vortex Amplification Buffer and Primer Solution, and
spin down all reagents, especially LiPA-Taq.
INNO-LiPA HLA-C Amplification
Test procedure
NOTE:
This protocol for the amplification of exon 2 to exon 3 of the HLA-C
alleles was designed for optimal amplification using GeneAmp™
PCR tubes (0.5 ml) and PE-480 (Perkin Elmer Cetus) thermal
cyclers, or MicroAmp® PCR tubes (0.2 ml) and PE-2400 or PE-9600
(Perkin Elmer Cetus) thermal cyclers, and LiPA-Taq.
This protocol can be used for most commercial types of thermal
cyclers, but may require some modifications indicated by the
manufacturer of the cycler.
Prior to use, determine whether the protocol is compatible with the
thermal cycler in use at your laboratory. Ensure the thermal cycler
is calibrated prior to use.
Take the necessary precautions to avoid non-specific amplification
and primer-dimer formation, which may impair the results:
•
Perform the pipetting steps on ice and without delay.
•
Preheat (96°C) the heating block of the thermal cycler before
inserting the samples, and immediately start the cycling process
afterwards.
•
Keep the LiPA-Taq at -15/-25°C until immediately before use.
1.
2.
3.
Dilute each genomic DNA to a concentration between 0.02 and
0.25 µg/µl in TE buffer.
Determine the number of vials to be prepared (N) as:
N = number of DNA samples + 1 (negative control; no DNA) + 1
Using cotton-plugged pipette tips prepare a mastermix in an
autoclaved 1.5 ml tube:
(N x 23.75 µl)
autoclaved distilled water
+ (N x 10 µl)
Amplification Buffer
+ (N x 10 µl)
HLA-C Primer Solution
+ (N x 1.25 µl)
LiPA-Taq (N x 2.5 U)
The total volume of this amplification mix is now (N x 45 µl).
Vortex briefly and aliquot 45 µl of this mastermix into (N-1)
autoclaved amplification tubes.
Add 2 drops (~ 40 µl) of mineral oil into each tube if required
(e.g. when using the PE-480). Pipette 5 µl (0.10 to 1.25 µg) of the
genomic DNA preparation (through the mineral oil if required). Add
5 µl of distilled water (no DNA) to the negative control tube.
9
INNOGENETICS®
NOTE:
•
Do not vortex or mix!
•
Check that the amplification mixture is at the bottom of the tube!
Place the samples into the preheated and calibrated thermal block
(see instructions indicated by the manufacturer of the thermal cycler).
Start the amplification program designed for the HLA-C amplification.
HLA-C amplification profile (cycler type: PE-480, PE-2400, PE-9600):
4.
5.
1.
step
denature
temp
96°C
time
5 min.
2.
3.
4.
denature
anneal primers
extend primers
96°C
64°C
72°C
30 sec.
50 sec.
50 sec.
repeat cycle
step 1 to 4
5 times
5.
6.
7.
denature
anneal primers
extend primers
96°C
62°C
72°C
30 sec.
50 sec.
50 sec.
repeat cycle
step 5 to 7
5 times
8.
9.
10.
denature
anneal primers
extend primers
96°C
60°C
72°C
30 sec.
50 sec.
50 sec.
repeat cycle
step 8 to 10
10 times
11.
12.
13.
denature
anneal primers
extend primers
96°C
55°C
72°C
30 sec.
50 sec.
50 sec.
repeat cycle
step 11 to 13
15 times
14.
elongate
72°C
10 min.
NOTE:
•
The same amplification profile is used for all INNO-LiPA HLA
class I products.
After the amplification process, use the samples immediately with
the INNO-LiPA HLA-C test strips or store the samples at -15/-25°C.
NOTE:
•
Do not store the amplified DNA products together with unused
amplification reagents.
Results
Visualization
-
10
The presence of the amplified product can be checked in a 2%
agarose gel. Load 10 µl of the amplified product per slot.
The amplicon should appear as a single band with a length of 904 bp.
INNO-LiPA HLA-C Amplification
-
In-house observations indicate that, if a band with length 904 bp is
visible after checking 10 µl of a 1/10 dilution of the amplified
product on a 2% agarose gel, an interpretable result should be given
by the LiPA assay.
Validation
-
-
Include at least one positive and one negative control each time an
amplification is performed. As with any new laboratory procedure,
the inclusion of additional positive and negative controls should be
considered until a high degree of confidence is reached in the ability
to correctly perform the test procedure. If the inclusion of an
additional positive control is desirable, use a known positive sample.
If a positive band is obtained in the gel for the negative control, the entire
run should be discarded and the complete procedure should be repeated.
Limitations of the procedure
-
-
Use of this product should be limited only to personnel well trained
in the techniques of amplification.
Polymerase inhibition (e.g. by heparin, haemoglobin) might be the
reason for complete failure of the assay!
Powder from disposable gloves and sodium hypochlorite have an
inhibiting effect on amplification.
Repeated freezing/thawing of the DNA samples might result in less
efficient amplification.
The sequence at the primer binding site is not known for all alleles. The
risk of mismatch at the primer site is considered to be very low as primer
failure has never been observed and significant numbers of alleles
spanning all groups have been tested. However, the possibility of allelic
drop-out should be considered in the event of a homozygous result.
Good laboratory practice and careful performance of the procedures
previously specified allow specific amplification.
Test performance
LiPA HLA-C has been evaluated in seven European tissue typing
laboratories on routine typing samples.
During the study a total of 269 samples were tested with LiPA HLA-C.
All the samples were successfully amplified.
11
INNOGENETICS®
Français
Symboles utilisés
Trousse d'amplification
Fabriqué par
Produit pour diagnostic in vitro
Numéro du lot
Référence catalogue
Utiliser avant
Instructions d'emploi
Température de stockage
Conditionnement suffisant pour x tests
Solution Primers
Tampon Amplification
LiPA-Taq
But du test
Le kit INNO-LiPA HLA-C Amplification, à usage in vitro, est destiné à
l'amplification des acides nucléiques des exons 2 et 3 du locus HLA-C
(human leukocyte antigen). La réaction est réalisée par des réactions en
chaîne de polymérisation (PCR)*.
12
INNO-LiPA HLA-C Amplification
Principe du test
L'ADN de l'échantillon à amplifier par PCR est introduit dans un milieu
réactionnel contenant en excès des désoxynucléosides 5'-triphosphates
(dNTPs), des primers biotinylés et de l'ADN polymérase thermostable. Les
primers amplifient les exons 2 et 3 du locus HLA-C et sont donc dénommés «
primers HLA-C ». Par chauffage, les deux brins de l'hélice ADN se séparent
(dénaturation) ouvrant les séquences cibles aux primers. En abaissant la
température à une température spécifique, les primers vont se fixer aux régions
de séquences complémentaires encadrant la séquence cible (annealing).
A une autre température spécifique, l'ADN polymérase va utiliser les dNTPs
en excès pour faire une élongation des primers fixés le long du brin d'ADN
cible (extension). Ainsi, deux copies biotinylées de la séquence d'ADN cible
sont produites après un cycle. Après 35 cycles, un nombre important de
copies biotinylées de la séquence cible sont obtenues.
*
L'utilisation de ce produit est couverte par une licence de F.
Hoffmann - La Roche Ltd et Roche Molecular Systems, Inc.
Réactifs
Description, préparation et conditions de conservation
-
Maintenus entre -15/-25°C, dans le flacon d'origine, les réactifs sont
stables jusqu'à la date de péremption du kit. Après la première
utilisation, il est recommandé d'aliquoter les réactifs (A l'exception
de LiPA Taq) et de les conserver entre -15/-25°C. Ne pas utiliser audelà de la date de péremption du kit.
Tous les réactifs doivent être ramenés à température ambiante
(20 - 25°C) environ 60 minutes avant utilisation et recongelés
aussitôt après usage.
Les réactifs doivent être stockés isolés de toute source d'ADN
contaminant, spécialement des produits ADN amplifiés.
L'altération de l'apparence physique des réactifs peut indiquer une
instabilité ou une détérioration.
Composant
Quantité
Réf.
Description
Tampon
Amplification 1 x 0.3 ml
56722 Contient tous les dNTPs et 0.05%
NaN3 comme conservateur.
13
INNOGENETICS®
Solution Primers1 x 0.3 ml
LiPA-Taq
57028
1 x 0.035 ml 56723
Contient les primers biotinylés,
MgCl2, DMSO et NaN3 comme
conservateur.
Contient la Taq ADN polymérase
et 0.05% NaN3 comme
conservateur.
Matériel nécessaire non fourni
-
Matériels pour extraction ADN
Gants jetables
Embouts de pipette stériles jetables (de préférence, avec filtre coton)
Microtubes stériles
Portoirs pour microtubes
Centrifugeuse pour microtubes
Thermocycleur et équipement
Pipettes ajustables pour les volumes 1 - 20 µl, 20 - 200 µl, 200 - 1000µl
Huile minérale (si besoin)
Eau distillée autoclavée
Consignes de sécurité
-
Se référer aux fiches de sécurité du fabricant et à l'étiquetage du
produit pour toute information sur les risques potentiels des
composants.
Les échantillons doivent toujours être manipulés comme
potentiellement dangereux.
Utiliser un équipement de protection: gants et écrans de protection
lors de la manipulation d'agents dangereux ou infectieux.
Les déchets devront être éliminés selon les directives en vigueur et
les règlements pour la préservation de l'environnement.
Echantillons (préparation et conservation)
NOTE:
Les réactifs ne sont pas fournis.
Extraction ADN
Les méthodes d'extraction ADN communément utilisées, précipitation ou
sur colonne, peuvent être utilisées pour préparer l'ADN génomique à
14
INNO-LiPA HLA-C Amplification
partir d'échantillons de sang recueilli sur ACD (acide -citrate-dextrose) ou
EDTA (acide ethylenediaminetetraacétique).
Conserver les extraits ADN entre -15/-25°C.
Les extraits ADN doivent avoir une concentration ≥ 0.02 µg/µl. La
pureté (A260nm/A280nm) devra être ≥ 1.5.
Préparation du mélange PCR
Chaque composant doit être ajouté et présent à la bonne concentration.
Trop ou pas assez d'échantillon ou de réactifs peut conduire à une
amplification aspécifique ou même à une absence d'amplification.
Amplification PCR
Le programme d'amplification défini pour INNO-LiPA HLA-C
Amplification doit être sélectionné.
Remarques et précautions
-
-
Pour éviter toute contamination ADN, une séparation physique maximale
est recommandée entre les étapes de pré- et post-amplification: pièces
séparées, pipettes et matériel de laboratoire distincts, gants et blouses (et
leur stock) séparés sont des précautions minimum pour une bonne
pratique de laboratoire. Les réactifs doivent être isolés de toute source de
contamination ADN, plus particulièrement de produits amplifiés. Eviter
aussi les contaminations microbiennes des réactifs.
Eviter de retourner en zone pré-amplification après un passage en
post-amplification.
Les tubes et les embouts de pipette doivent être autoclavés. Des
embouts avec filtre coton sont recommandés. Utiliser un nouvel
embout stérile à chaque aliquote d'échantillon.
Les réactifs utilisés lors de l'amplification doivent être manipulés
dans une pièce dépourvue de matériel amplifié. Utiliser des tubes
autoclavés et des embouts de pipettes avec filtre coton.
Après décongélation, homogénéiser au vortex le tampon
Amplification et la solution Primers, puis centrifuger brièvement tous
les réactifs, spécialement LiPA-Taq.
15
INNOGENETICS®
Procédures
NOTE:
Ce protocole pour amplification des exon 2 à 3 du gène HLA-C a été
préparé pour une amplification optimale en utilisant les tubes PCR
GeneAmp™ (0.5 ml) et thermocycleur PE-480 (Perkin Elmer) ou les
tubes PCR MicroAmp® (0.2 ml) et thermocycleur PE-2400,
PE-9600 ou PE-9700 (Perkin Elmer) et l'ADN polymérase LiPA-Taq.
D'autres thermocycleurs peuvent être employés mais peuvent
nécessiter des modifications selon les indications du fabricant.
Avant utilisation, déterminer si le protocole est compatible avec le
thermocycleur du laboratoire. S'assurer que le thermocycleur est
correctement calibré.
Pendre les précautions nécessaires pour éviter toute amplification
non-spécifique et la formation de primer-dimers qui peuvent affecter
les résultats :
•
Réaliser les étapes de pipetage en maintenant les tubes dans de
la glace, et sans interruption.
•
Préchauffer le bloc chauffant du thermocycleur (96°C) avant
d'insérer les tubes et démarrer immédiatement le programme
d'amplification.
•
Maintenir LiPA Taq entre -15/-25°C jusqu'à utilisation.
1.
2.
3.
16
Diluer chaque extrait ADN à une concentration entre 0.02 et
0.25 µg/µl en tampon TE.
Déterminer le nombre de tubes (N) nécessaires
N = Nombre d'échantillons + 1 Contrôle négatif (sans ADN) + 1
Avec des embouts stériles munis de filtre coton, préparer un
mastermix dans un tube (1.5 ml) autoclavé:
(N x 23.75 µl)
eau distillée autoclavée
+ (N x 10 µl)
Tampon Amplification
+ (N x 10 µl)
Solution Primers HLA-C
+ (N x 1.25 µl)
LiPA-Taq (N x 2.5 U)
Le volume total du Mastermix est de N x 45 µl.
Vortexer brièvement et aliquoter 45 µl de ce mastermix dans N-1
tubes autoclavés pour amplification.
Si nécessaire, ajouter 2 gouttes (~40 µl) d'huile minérale dans chaque
tube (e. g. PE-480).
Introduire 5 µl (0.10 à 1.25 µg) d'ADN génomique extrait (à travers
l'huile minérale si présente) et 5 µl d'eau distillée dans le tube
Contrôle Négatif (sans ADN).
INNO-LiPA HLA-C Amplification
NOTE:
•
Ne pas mélanger !
•
Vérifier que le mélange réactionnel est au fond du tube.
Placer immédiatement les tubes dans le bloc préchauffé et calibré du
thermocycleur (voir les instructions fournies par le fabricant du
thermocycleur). Démarrer le programme d'amplification INNO-LiPA
HLA-C Amplification.
Programme d'amplification INNO-LiPA HLA-C Amplification:
4.
5.
1.
Etape
Dénaturation
Température Temps
96°C
5 min.
Nb. cycles
2.
3.
4.
Dénaturation
Annealing
Extension
96°C
64°C
72°C
30 sec.
50 sec.
50 sec.
Répéter cycle
<1+2+3+4>
5 fois
5.
6.
7.
Dénaturation
Annealing
Extension
96°C
62°C
72°C
30 sec.
50 sec.
50 sec.
Répéter cycle
<5+6+7>
5 fois
8.
9.
10.
Dénaturation
Annealing
Extension
96°C
60°C
72°C
30 sec.
50 sec.
50 sec.
Répéter cycle
<8+9+10>
10 fois
11.
12.
13.
Dénaturation
Annealing
Extension
96°C
55°C
72°C
30 sec.
50 sec.
50 sec.
Répéter cycle
<11+12+13>
15 fois
14.
Elongation
72°C
10 min.
NOTE:
•
Le même programme pour amplification est utilisable pour tous
les produits INNO-LiPA HLA classe I.
Après l'amplification, procéder immédiatement au test INNO-LiPA
HLA-C ou conserver les échantillons entre -15/-25°C.
NOTE:
•
Ne pas conserver les produits amplifiés avec des réactifs pour
amplification non utilisés.
17
INNOGENETICS®
Résultats
Visualisation
-
La présence des amplicons peut être vérifiée en gel d'agarose 2%.
Déposer 10 µl de chaque produit amplifié dans un puits sur le gel.
L'amplification INNO-LiPA HLA-C produit un amplicon de 904 pb.
Sur la base d'observations internes, si une bande est visible après dépôt
de 10 µl de produit amplifié dilué au 1/10ème sur un gel d'agarose à
2%, un résultat interprétable peut être obtenu par test LiPA.
Validation
-
-
Inclure au moins un contrôle négatif et un contrôle positif dans
chaque série d'amplification. Comme pour toute nouvelle procédure,
l'inclusion de contrôles négatifs et positifs supplémentaires peut être
envisagée jusqu'à maîtrise parfaite du test avec un niveau de
confiance élevé. Si l'inclusion d'un contrôle positif est envisagée,
utiliser un échantillon positif connu.
Si une bande positive est obtenue sur le gel pour le contrôle négatif,
la série entière doit être invalidée et une procédure complète doit être
recommencée.
Limites du test
-
18
L'utilisation de ce test doit être restreinte au personnel ayant reçu une
formation pour les techniques d'amplification génomique.
Une inhibition de la polymérase (e.g. héparine, hémoglobine) peut
conduire à un échec complet d'amplification.
Le talc des gants jetables et l'hypochlorite de sodium ont un effet
inhibiteur sur l'amplification.
Les cycles répétés de congélation/décongélation des extraits ADN
peuvent affecter le rendement d'amplification.
La séquence au site de fixation des primers n'est pas connue pour
tous les allèles. Le risque de mésappareillement au site de fixation
des primers est considéré comme extrêmement faible puisque l'échec
d'amorçage des primers n'a jamais été observé et que des nombres
significatifs d'allèles couvrant tous les groupes ont été testés.
Cependant, la possibilité d'un manquement d'allèle ne peut pas être
totalement exclue face à un résultat homozygote.
Les bonnes pratiques de laboratoire et le respect des précautions de
manipulation spécifiées assurent une amplification spécifique.
INNO-LiPA HLA-C Amplification
Performances
INNO-LiPA HLA-C ont été évaluées dans sept laboratoires européens
d'histocompatibilité sur des échantillons de routine à typer.
Au total, 269 échantillons ont été analysés avec INNO-LiPA HLA-C. Tous
les échantillons ont été amplifiés avec succès.
Deutsch
Verwendete Symbole
Amplifikationskit
Hersteller
Hilfsmittel für die medizinische In vitro
Diagnostik
Chargennummer
Katalognummer
Durchführung durch
Siehe Bedienungsanleitung
Temperaturlimits
Inhalt ausreichend für <n> Tests
Primerlösung
Amplifikationspuffer
LiPA Taq
19
INNOGENETICS®
Beabsichtigter Verwendungszweck
Der INNO-LiPA HLA-C Amplification Testkit ist für die in-vitroVerwendung bestimmt. Er dient der Amplifikation der Nukleinsäuren des
zweiten und dritten Exons des humanen Leukozytenantigen (HLA) Locus C.
Die Reaktion wird mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion (PCR)*
durchgeführt.
Funktionsweise des Tests
Die DNA-Probe, die mittels PCR* amplifiziert werden soll, wird in eine
Reaktionsmischung gegeben, die einen Puffer mit einem Überschuss an
Desoxynukleosid-5'-Triphosphaten (dNTPs), biotinylierten Primern und
hitzestabiler DNA-Polymerase enthält. Die Primer amplifizieren Exon 2
und 3 des HLA-C-Lokus und tragen daher den Namen „HLA-C-Primer".
Durch Erhitzen werden beide Stränge der DNA-Doppelhelix voneinander
getrennt (Denaturierung), sodass die Zielsequenzen für die Primer
freiliegen. Die Primer haben eine Sequenz, die der der Regionen, die die
Zielsequenz flankieren, komplementär ist. Bei Abkühlung auf eine
bestimmte Temperatur binden diese Primer an die Zielregion (Annealing).
Bei einer anderen bestimmten Temperatur verlängert die thermostabile
DNA-Polymerase mit Hilfe der dNTPs die gebundenen Primer längs der
Zielsequenz (Verlängern). Auf diese Weise entstehen nach einem Zyklus
aus Denaturieren, Annealing und Verlängern zwei exakte, biotinylierte
Kopien der Zielsequenz. Nach 35 Zyklen hat sich eine sehr große Zahl
biotinylierter Kopien der Zielsequenz gebildet.
*
Die Verwendung dieses Produkts ist durch eine Lizenz F. Hoffmann La Roche Ltd. und Roche Molecular Systems, Inc. lizensiert.
Gelieferte Materialien
Beschreibung, Vorbereitung, Lagerung und Haltbarkeit
-
20
Alle Reagenzien sind bei Aufbewahrung in den Originalgefäßen bei
-15/-25°C bis zum angegebenen Verfallsdatum stabil. Um
Kontamination und Zersetzung zu vermeiden, wird empfohlen,
alle Reagenzien mit Ausnahme von LiPA-Taq zu aliquotieren und bei
-15/-25°C einzufrieren. Verwenden Sie den Kit nicht nach
Überschreitung des Verfallsdatums.
INNO-LiPA HLA-C Amplification
-
Alle Reagenzien sollten ca. 60 Minuten vor Gebrauch auf
Raumtemperatur (20 - 25°C) gebracht und nach Gebrauch
unmittelbar wieder im Tiefkühlschrank gelagert werden.
Der Kit muss so aufbewahrt werden, dass er auf keinen Fall mit
anderer DNA, vor allem mit amplifizierter DNA, kontaminiert
werden kann.
Alle Änderungen im physischen Erscheinungsbild der KitReagenzien können auf Instabilität oder Zersetzung hinweisen.
Gelieferte Materialien:
Bestandteil
Menge
Katalog- Beschreibung
nummer
Amplifikationspuffer
1 x 0,3 ml
56722
Primerlösung
1 x 0,3 ml
57028
LiPA-Taq
1 x 0,035 ml 56723
Enthält alle dNTPs und 0,05%
Natriumazid als
Konservierungsmittel.
Enthält biotinylierte Primer,
MgCl2, DMSO und 0,05%
Natriumazid als
Konservierungsmittel.
Enthält Taq DNA-Polymerase
(2 U/µl) und 0,05% Natriumazid
als Konservierungsmittel.
Zusätzlich benötigte Materialien
-
Materialien für die DNA-Extraktion.
Einmalhandschuhe.
Sterile Einmalpipettenspitzen (möglichst mit Wattestopfen).
Sterile Mikrogefäße.
Racks für Mikrogefäße.
Mikrozentrifuge.
DNA-Thermocycler und Zubehör.
Pipetten mit variablem Volumen: 1 - 20 µl, 20 - 200 µl und
200 - 1000 µl.
Autoklaviertes destilliertes Wasser.
Gegebenenfalls Mineralöl und Silikonfett.
21
INNOGENETICS®
Sicherheitshinweise und Entsorgung
-
-
Bitte beachten Sie die Sicherheitsdatenblätter des Herstellers
und die Produktkennzeichnung bezüglich gefährlicher
Substanzen.
Behandeln Sie alle Proben als potenziell infektiös.
Bei Beseitigung der Chemikalien sind neben hausinternen
Vorschriften die entsprechenden Gesetze bzw. Verordnungen der EGMitgliedsländer, der Bundesrepublik Deutschland und der
Bundesländer zu beachten.
Verwenden Sie Schutzkleidung, wenn notwendig: bei der Arbeit mit
infektösen oder gefährlichen Substanzen Handschuhe und
Schutzbrille tragen.
Herstellung und Aufbewahrung der Proben
HINWEIS:
Die hierfür benötigten Reagenzien sind nicht im Lieferumfang des
Kits enthalten.
DNA-Extraktion
Zur Herstellung genomischer DNA können Blutproben verwendet werden,
die ACD (=Acid-Citrat-Dextrose) oder EDTA
(Ethylendiamintetraessigsäure) als Gerinnungshemmer enthalten. Zur
Isolation von DANN können die bekannten Methoden (DANN Fällung
durch Aussalzen oder Säulenextraktion) verwendet werden.
DNA-Proben bei -15/-25°C aufbewahren.
Die extrahierte DNA muss in einer Konzentration von 0,02 µg/µl
vorliegen. Die Reinheit (A260nm/A280nm) muss ≥ 1,5 sein.
Herstellen des PCR-Mix
Alle Bestandteile müssen in den angegebenen Mengen zugegeben werden.
Bei Zugabe von zuviel oder zuwenig Probe oder Reagens kann die
Amplifizierungsreaktion unspezifisch ablaufen oder möglicherweise
vollständig inhibiert sein.
22
INNO-LiPA HLA-C Amplification
PCR-Cycling
Für den INNO-LiPA HLA-C Amplification muss das angegebene
Temperaturprofil eingestellt werden.
Hinweise und Vorsichtsmaßnahmen
-
-
-
-
Zur Vermeidung von Kontamination müssen die Arbeitsschritte vor
und nach der Amplifikation räumlich voneinander getrennt werden.
Zur Einhaltung der Guten Laborpraxis (GLP) wird dringend die
Verwendung getrennter Gefäße, Pipetten etc. und auch das Tragen
getrennter Laborkittel und -handschuhe empfohlen. Der Kit muss so
aufbewahrt werden, dass er auf keinen Fall mit anderer DNA, vor
allem mit amplifizierter DNA, kontaminiert werden kann. Die
Reagenzien dürfen nicht mikrobiell kontaminiert sein.
Vermeiden Sie, zwischen den beiden Arbeitsplätzen hin- und
herzugehen.
Alle für die Amplifikation verwendeten Reaktionsröhrchen und
Pipettenspitzen (möglichst mit Wattestopfen) müssen autoklaviert
sein. Verwenden Sie Einmalprodukte, und verwerfen Sie diese nach
einmaligem Gebrauch.
Die Reagenzien für die Amplifikation müssen in einem Raum
hergestellt werden, in dem kein amplifizierte DNA vorhanden ist.
Reaktionsröhrchen und Pipettenspitzen (möglichst mit Wattestopfen)
müssen autoklaviert sein.
Mischen Sie Amplifikationslösung und Primerlösung nach dem
Auftauen kurz auf einem Vortex-Mischer durch. Zentrifugieren Sie
alle Reagenzien kurz, vor allem LiPA-Taq.
Arbeitsablauf
HINWEIS:
Das hier beschriebene Amplifikationsprotokoll für die Amplifikation
der Exons 2 und 3 der HLA-C-Allele ist optimiert für das Arbeiten
mit GeneAmp™ PCR-Gefäßen (0,5 ml) und einem Thermocycler
PE-480 (Perkin Elmer) oder MicroAmp® PCR-Röhrchen (0,2 ml)
und einem Thermocycler PE-2400 oder PE-9600 (Perkin Elmer)
unter Verwendung von LiPA-Taq.
Das Arbeitsprotokoll ist für die meisten handelsüblichen
Thermocycler geeignet, muss aber unter Umständen für den
jeweiligen Gerätetyp optimiert werden.
23
INNOGENETICS®
-
-
1.
2.
3.
4.
24
Vor der Testdurchführung muss überprüft werden, inwieweit das
Arbeitsprotokoll für den von Ihnen verwendeten Thermocycler
geeignet ist. Vor Verwendung muss der Thermocycler kalibriert
werden.
Treffen Sie die erforderlichen Vorsichtsmaßnahmen, um
unspezifische Amplifikation und die Bildung von Primer-Dimeren zu
verhindern, weil dadurch die Qualität der Versuchsergebnisse
beeinträchtigt werden könnte:
•
Alle im folgenden beschriebenen Pipettierschritte müssen
unverzüglich und im Eisbad durchgeführt werden.
•
Vor Einsetzen der Proben den Thermocycler auf 96°C erhitzen
und sofort mit der ersten Amplifikationsrunde beginnen.
•
LiPA-Taq bis unmittelbar vor Verwendung eingefroren (-15/-25°C)
lassen.
Genomische DNA mit TE-Puffer auf Konzentration zwischen 0,02
und 0,25 µg/µl verdünnen.
Anzahl der benötigten Gefäße (N) bestimmen:
N = Anzahl DNA-Proben + 1 (Negativkontrolle ohne DNA) + 1.
Mit Hilfe einer Pipette mit Baumwollstopfen wird in einem
autoklavierten 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen eine Gesamtlösung
(Mastermix) hergestellt:
(N x 23,75 µl)
autoklaviertes destilliertes Wasser
+ (N x 10 µl)
Amplifikationspuffer
+ (N x 10 µl) )
HLA-C-Primerlösung
+ (N x 1,25 µl)
LiPA-Taq (N x 2,5 U).
Das Gesamtvolumen beträgt nun (N x 45 µl).
Kurz auf Vortex durchmischen und 45-µl-Aliquots der Gesamtlösung
in (N - 1) in autoklavierte Amplifikationsgefäße einpipettieren.
Gegebenenfalls (z.B. bei Versuchsdurchführung mit PE-480) 2
Tropfen (~ 40 µl) Mineralöl in jedes Röhrchen geben. 5 µl (0,1 bis
1,25 µg) der genomischen DNA zugeben (gegebenenfalls durch die
Mineralölschicht hindurch). In das Röhrchen für die Negativkontrolle
(ohne DNA) 5 µl destilliertes Wasser geben.
WICHTIG:
•
Nicht schütteln (Vortex) oder mischen.
•
Sicherstellen, dass die Amplifikationsmischung sich auf dem
Röhrchenboden befindet!
INNO-LiPA HLA-C Amplification
5.
6.
Proben in beheizten und kalibrierten Thermoblock stellen
(Hinweise des Geräteherstellers beachten). Das spezifische
Amplifikationsprogramm für die HLA-C-Amplifikation starten.
Amplifikationsprofil für HLA-C(für Thermocycler PE-480, PE-2400
und PE-9600):
1.
Schritt
Denaturieren
Temperatur
96°C
2.
3.
4.
Denaturieren
96°C
Annealing der Primer 64°C
Primer verlängern
72°C
30 sec.
50 sec.
50 sec.
Schritte
1-4
5-mal wiederholen
5.
6.
7.
Denaturieren
96°C
Annealing der Primer 62°C
Primer verlängern
72°C
30 sec.
50 sec.
50 sec.
Schritte
5-7
5-mal wiederholen
8.
9.
10.
Denaturieren
96°C
Annealing der Primer 60°C
Primer verlängern
72°C
30 sec.
50 sec.
50 sec.
Schritte
8 - 10
10-mal wiederholen
11.
12.
13.
Denaturieren
96°C
Annealing der Primer 55°C
Primer verlängern
72°C
30 sec.
50 sec.
50 sec.
Schritte
11 - 13
15- mal wiederholen
14.
Verlängern
10 min.
72°C
Zeit
5 min.
HINWEIS:
•
Die hier aufgeführten Amplifikationsschritte sind für alle
INNO-LiPA HLA Klasse-I-Produkte geeignet.
Sofort nach der Amplifikation die Proben auf die INNO-LiPA HLA-CTeststreifen auftragen oder bei -15/-25°C einfrieren.
WICHTIG:
•
Amplifizierte DNA-Produkte nicht mit unbenutzten
Amplifikationsreagenzien zusammen aufbewahren.
Ergebnisse
Visualisierung
-
Die Präsenz von amplifiziertem Material kann durch Trennung in
einem 2%-igen Agarosegel geprüft werden. Jede Bahn wird mit 10
µl Amplifikationsprodukt beladen. Die bei der INNO-LiPA HLA-CPCR enstandenenen Produkte migrieren als einzelne Bande mit einer
Größe von 904 bp.
25
INNOGENETICS®
-
Interne Untersuchungen haben ergeben, dass die erhaltenen
Amplifikationsprodukte für den LIPA-Test geeignet sind, wenn bei
Durchführung des oben angegebenen Verfahrens (10 µl
Amplifikationsprodukt, Verdünnung 1:10, 2%-iges Agarosegel) eine
Bande mit einer Größe von 904 bp zu sehen ist.
Validierung
-
-
Bei jeder Amplifikationsserie müssen mindestens je eine Positiv- und
eine Negativkontrolle mitgeführt werden. Wie bei jedem neuen
Laborverfahren müssen so lange Positiv- und Negativkontrollen
mitgeführt werden, bis die Erfahrung zeigt, dass deren Durchführung
zu zuverlässigen Ergebnissen führt. Auf Wunsch kann auch
zusätzlich eine bekannt positive Probe mitgeführt werden.
Tritt bei der Negativkontrolle im Gel eine positive Bande auf, muss
die gesamte Serie verworfen werden, und der gesamte Ablauf muss
wiederholt werden.
Einschränkungen des Verfahrens
-
-
Der Test darf nur von Laborpersonal ausgeführt werden, das die
Technik der DNA-Amplifikation bereits beherrscht.
Der Test kann vollständig zu negativen Ergebnissen führen, wenn die
Polymerase z.B. durch Heparin oder Hämoglobin inhibiert wurde.
Pulver von Einmalhandschuhen und Natriumhypochlorit inhibieren
die Amplifikation.
Wiederholtes Einfrieren und Auftauen der DNA-Proben kann die
Effizienz der DNA-Proben beeinträchtigen.
Die Sequenz an der Primerposition ist nicht für alle Allele bekannt.
Die Gefahr von Fehlpaarungen an dieser Stelle ist sehr gering. Bisher
wurden keine Fehlpaarungen beobachtet, obwohl eine große
Probenzahl getestet wurde. Jedoch sollte im Fall eines homozygoten
Ergebnisses die Möglichkeit in Betracht gezogen werden, dass ein
Allel ausgefallen ist.
Die Einhaltung der Guten Laborpraxis (GLP) und sorgfältige
Durchführung aller Arbeitsschritte werden dringend empfohlen, um
spezifische Amplifikationsergebnisse zu erzielen.
Leistungsfähigkeit des Tests
Der LiPA HLA-C-Test wurde in 7 europäischen
Gewebetypisierungslabors mit Routinetypisierungsproben evaluiert.
26
INNO-LiPA HLA-C Amplification
Bei dieser Studie wurden insgesamt 269 Proben mit Hilfe des LiPA HLA-C
getestet. Alle Proben wurden erfolgreich amplifiziert.
Italiano
Simboli utilizzati
Kit de amplificación
Prodotto da
Dispositivo medico - diagnostico in vitro
Numero di lotto
Codice
Uso
Consultare le istruzioni per l'uso
Limiti di temperatura
Contenuto sufficiente per n test
Primer Solution
Amplification Buffer
LiPA Taq
Uso previsto
Il kit (per uso diagnostico in vitro) INNO-LiPA HLA-C Amplification è
stato progettato per l'amplificazione del secondo e del terzo esone del
27
INNOGENETICS®
locus C dell'antigene leucocitario umano (HLA). La reazione è condotta
per mezzo della reazione polimerasica a catena (PCR)*.
Principio del test
Il campione di DNA da amplificare mediante PCR* viene aggiunto ad una
miscela di reagenti contenente un eccesso di deossinucleosidi 5' trifosfati
(dNTP), primers biotinilati e DNA polimerasi termostabile. I primers
amplificheranno l'esone 2 e l'esone 3 del locus HLA-C, e sono quindi
chiamati "HLA-C primers".
Mediante riscaldamento, le due catene dell'elica di DNA vengono separate
(denaturazione) in modo da esporre le sequenze target ai primers.
Questi primers sono complementari alle regioni che fiancheggiano la
sequenza target. Quindi, con il raffreddamento ad una specifica temperatura, i
primers si legheranno alla loro regione target (appaiamento).
Ad un'altra temperatura, la DNA polimerasi termostabile, utilizzando i
dNTP, estenderà i primers appaiati lungo il templato target (estensione).
In tal modo vengono prodotte dopo un ciclo di denaturazione,
appaiamento ed estensione due copie identiche biotinilate della sequenza
template. Dopo 35 cicli, si ottiene un gran numero di copie biotinilate
della sequenza target.
*
L'utilizzo di questo prodotto è coperto da licenza di F. Hoffmann - La
Roche Ltd e Roche Molecular Systems, Inc.
Reagenti
Descrizione, preparazione per l'uso e condizioni di conservazione
raccomandate
-
-
28
Se mantenuti a -15/-25°C e conservati nei flaconi originali, i reagenti
sono stabili fino alla data di scadenza del kit. Tuttavia si raccomanda
di aliquotare i reagenti dopo il primo utilizzo (tranne per la LiPA -Taq)
e poi di conservarli a -15/-25°C. Non utilizzare i reagenti dopo la
data di scadenza del kit.
Tutti i reagenti dovrebbero essere portati a temperatura ambiente
(20 - 25°C) 60 minuti circa prima dell'uso e dovrebbero essere riposti
in congelatore immediatamente dopo l'uso.
I reagenti dovrebbero essere conservati lontano da sorgenti di DNA
contaminante, specialmente da prodotti amplificati.
INNO-LiPA HLA-C Amplification
-
Alterazioni nell'aspetto fisico dei reagenti del kit possono indicare
instabilità o deterioramento.
Componente Quantità
Rif.
Descrizione
Amplification
Buffer
1 x 0.3 ml
56722 Contiene tutti i dNTPs e 0.05%
NaN3 come conservante.
Primer Solution 1 x 0.3 ml
57028 Contiene primers biotinilati,
MgCl2, DMSO e 0.05% NaN3
come conservante.
LiPA-Taq
1 x 0.035 ml 56723 Contiene Taq DNA polymerasi e
0.05% NaN3 come conservante.
Materiali richiesti ma non forniti
-
Materiali per l'estrazione del DNA
Guanti monouso
Puntali sterili monouso (preferibilmente con filtro).
Provette sterili
Porta provette
Microcentrifuga
Thermal cycler e accessori
Pipette regolabili per volumi da 1 - 20 µl, da 20 - 200 µl,
e da 200 - 1000 µl.
Olio minerale o olio di silicone (se richiesto)
Acqua distillata autoclavata
Sicurezza e ambiente
-
Si prega di fare riferimento alla scheda di sicurezza del
produttore e alle etichette del prodotto per informazioni relative
ai componenti potenzialmente pericolosi.
I campioni devono essere sempre maneggiati come potenzialmente
pericolosi.
É necessario l'uso di dispositivi di protezione: guanti e occhiali di
sicurezza quando si manipolano agenti pericolosi o infettivi.
I rifiuti devono essere smaltiti secondo le linee guida disposte dalle
istituzioni. Osservare anche tutte le disposizioni nazionali e locali.
29
INNOGENETICS®
Campioni (preparazione e conservazione)
NOTA:
I reagenti non sono forniti
Estrazione del DNA
Per preparare DNA genomico partendo da campioni di sangue intero con
acido-citrato-destrosio (ACD) o acido etilendiamminotetracetico (EDTA)
come anticoagulante, possono essere utilizzati i comuni metodi di estrazione
del DNA salting-out, o i metodi basati sull'estrazione da colonnine.
Conservare i campioni di DNA a -15/-25°C.
Il DNA estratto dovrebbe avere una concentrazione ≥ 0.02 µg/µl. La
purezza (A260nm/A280nm) dovrebbe essere ≥1.5.
Preparazione della mix di PCR
Ogni componente deve essere aggiunto e dosato nella corretta quantità.
Una quantità maggiore o minore di campione o reagenti può causare
amplificazioni aspecifiche o anche nessuna amplificazione.
Protocollo di PCR
Deve essere impostato e selezionato il corretto profilo per INNO-LiPA
HLA-C amplification.
Note e precauzioni
-
-
30
Per evitare contaminazioni da DNA, si raccomanda la massima
separazione fisica fra i passaggi di pre- e post-amplificazione: stanze
separate, pipette e altro materiale di laboratorio dedicati, camici e guanti
separati (e loro scorte) sono le minime precauzioni per una buona
pratica di laboratorio. I reagenti devono essere isolati da qualsiasi
sorgente di DNA contaminante, specialmente dai prodotti di DNA
amplificati. Evitare anche la contaminazione microbica dei reagenti.
Evitare qualsiasi rientro dalla stanza di post-amplificazione alla
stanza di pre-amplificazione.
Tutti i puntali e le provette utilizzati devono essere autoclavati.
Sono consigliati puntali con filtro. Utilizzare un nuovo puntale sterile
per ogni campione aliquotato.
INNO-LiPA HLA-C Amplification
-
I reagenti per i processi di amplificazione dovrebbero essere
manipolati in stanze prive di DNA amplificato. Dovrebbero essere
utilizzate provette e puntali (preferibilmente con filtro) autoclavati.
Dopo lo scongelamento, vortexare l'Amplification Buffer e la Primer
Solution, e centrifugare brevemente i reagenti, particolarmente la
LiPA-Taq.
Procedura del test
NOTA:
Questo protocollo per l'amplificazione dell'esone 2 e dell'esone 3 degli
alleli HLA-C è stato disegnato per una ottimale amplificazione usando
provette GeneAmp™ PCR (0.5 ml) e thermal cyclers PE-480 (Perkin
Elmer Cetus), o provette MicroAmp® PCR (0.2 ml) e thermal cyclers
PE-2400 o PE-9600 (Perkin Elmer Cetus), e LiPA-Taq.
Questo protocollo può essere usato anche per la maggior parte dei
thermal cyclers commerciali, ma può richiedere alcune modifiche
indicate dal produttore dello strumento.
Prima dell'uso determinare se il protocollo è compatibile con il
thermal cycler in uso nel vostro laboratorio. Prima dell'uso,
assicurarsi che il thermal cycler sia calibrato.
Adottare le necessarie precauzioni per evitare amplificazioni non
specifiche, che possono inficiare il risultato:
•
Eseguire i passaggi di pipettamento in ghiaccio e senza ritardi.
•
Preriscaldare (a 96°C) il blocco riscaldante del thermal cycler
prima di inserire i campioni e far partire immediatamente il
programma di amplificazione.
•
Conservare la LiPA Taq a -15/-25°C fino al momento
immediatamente prima dell'uso.
1.
Diluire ciascun DNA alla concentrazione compresa tra 0.02 e
0.25 µg/µl in tampone TE.
31
INNOGENETICS®
2.
3.
4.
32
Determinare il numero di provette da preparare (N):
N = numero di campioni di DNA + 1 (controllo negativo; no DNA) + 1
Usando puntali con filtro preparare la miscela di amplificazione in
una provetta autoclavata da 1.5 ml:
(N x 23.75 µl)
acqua distillata autoclavata
+ (N x 10 µl)
Amplification Buffer
+ (N x 10 µl)
HLA-C Primer Solution
+ (N x 1.25 µl)
LiPA-Taq (N x 2 U)
Il volume totale di questa miscela di amplificazione è ora (N x 45 µl).
Vortexare brevemente e aliquotare 45 µl di questa miscela in (N-1)
provette di amplificazione autoclavate.
Aggiungere, se necessario (ad es. quando si usa PE-480) 2 gocce di
olio minerale (~ 40 µl) in ogni provetta.
Pipettare 5 µl (da 0.10 a 1.25 µg) di DNA genomico estratto (al di là
dell' l'olio minerale, se presente).
Aggiungere 5 µl di acqua distillata (no DNA) alla provetta del
controllo negativo.
NOTA:
•
Non vortexare o miscelare.
•
Controllare che la miscela di amplificazione sia sul fondo della
provetta.
Posizionare i campioni nel blocco del thermal cycler, preriscaldato
e calibrato (vedere le istruzioni indicate dal produttore del thermal
cycler). Far partire il programma di amplificazione designato per
l'amplificazione di HLA-C.
INNO-LiPA HLA-C Amplification
Profilo di amplificazione HLA-C (thermal cycler: PE-480, PE-2400,
PE-9600):
5.
1.
step
denaturazione
temp
96°C
tempo
5 min.
2.
3.
4.
denaturazione
appaiamento
estensione
96°C
64°C
72°C
30 sec.
50 sec.
50 sec.
Ripetere gli
step da 1 a 4
5 volte
5.
6.
7.
denaturazione
appaiamento
estensione
96°C
62°C
72°C
30 sec.
50 sec.
50 sec.
Ripetere gli
step da 5 a 7
5 volte
8.
9.
10.
denaturazione
appaiamento
estensione
96°C
60°C
72°C
30 sec.
50 sec.
50 sec.
Ripetere gli
step da 8 a 10
10 volte
11.
12.
13.
denaturazione
appaiamento
estensione
96°C
55°C
72°C
30 sec.
50 sec.
50 sec.
Ripetere gli
step da 11 a 13
15 volte
14.
estensione
72°C
10 min.
NOTA:
•
Si utilizza lo stesso profilo di amplificazione per tutti i prodotti
INNO-LiPA HLA di classe I.
Dopo il processo di amplificazione, usare immediatamente i
campioni con le strisce del test INNO-LiPA HLA-C o conservare i
campioni a -15/-25°C.
NOTA:
•
Non conservare i prodotti di DNA amplificato insieme ai
reagenti di amplificazione non ancora utilizzati.
Risultati
Visualizzazione
-
La presenza del prodotto di amplificazione può essere verificata su
un gel di agarosio al 2%. Caricare 10 µl di prodotto amplificato per
pozzetto. L'amplicone dovrebbe apparire come singola banda di
lunghezza di 904 bp.
33
INNOGENETICS®
-
Osservazioni interne indicano che se è visibile una banda di
lunghezza di 904 bp dopo aver caricato 10 µl di prodotto amplificato
diluito 1/10 su un gel di agarosio al 2%, si dovrebbe ottenere con il
LiPA un risultato interpretabile.
Validazione
-
-
Includere almeno un controllo positivo e uno negativo ogni volta che
viene eseguita un'amplificazione. Come per ogni nuova procedura di
laboratorio, dovrebbe essere preso in considerazione l'inserimento di
un controllo positivo e negativo aggiuntivi fino al raggiungimento di
un alto grado di confidenza nell'esecuzione del test. Se si desidera
includere un controllo positivo aggiuntivo, utilizzare un campione
positivo conosciuto.
Se si ottiene sul gel una banda positiva per il controllo negativo,
l'intera seduta deve essere scartata e deve essere ripetuta la procedura
completa.
Limiti della procedura
-
-
34
L'uso di questo prodotto dovrebbe essere limitato solo al personale
addestrato alle tecniche di amplificazione.
L'inibizione della Polimerasi (es. mediante eparina) può essere la
causa di un completo fallimento del test.
Il talco dei guanti monouso e l'ipoclorito di sodio hanno effetti di
inibizione sull'amplificazione.
Ripetuti congelamenti/scongelamenti possono portare ad
amplificazioni meno efficienti.
La sequenza a livello del sito di legame del primer non è conosciuta
per tutti gli alleli. Il rischio di mismatch a livello del sito di legame
del primer è da considerarsi molto basso, tanto che un fallimento del
primer non è mai stato osservato e sono stati testati numerosi alleli
appartenenti a tutti i gruppi. Tuttavia nel caso di un risultato
omozigote deve essere presa in considerazione la possibilità di una
perdita allelica (drop-out).
Le buone pratiche di laboratorio e un'accurata esecuzione delle
procedure precedentemente specificate permetteranno
un'amplificazione specifica.
INNO-LiPA HLA-C Amplification
Performance del test
L'INNO-LiPA HLA-C è stato valutato in sette laboratori europei di
tipizzazione tissutale su campioni tipizzati in routine.
Nello studio è stato testato con INNO-LiPA HLA-C un totale di 269
campioni. Tutti i campioni sono stati amplificati con successo.
Español
Símbolos utilizados
Kit di amplificazione
Fabricado por
Producto sanitario para diagnóstico in vitro
Número de lote
Número de catálogo
Para ser usado por
Consulte las instrucciones de uso
Limitaciones de temperatura
Contiene suficiente producto para n ensayos
Solución de primers
Tampón de amplificación
LiPA Taq
35
INNOGENETICS®
Uso al que está destinado
El kit INNO-LiPA HLA-C Amplification, de uso in vitro, está diseñado
para la amplificación de los ácidos nucleicos de los exones 2 y 3 del locus
C del antígeno leucocitario humano (HLA). La reacción se lleva a cabo
mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)*.
Principios del ensayo
La muestra de ADN a amplificar mediante la PCR se introduce en una
mezcla de reactivos que contiene un tampón con un exceso de
desoxinucleósido 5'-trifosfatos (dNTPs), "primers" (oligonucleótidos
cebadores) biotinilados, y ADN polimerasa termoestable. Los primers
amplifican los exones 2 y 3 del locus C del HLA y por esa razón se
denominan "primers HLA-C". Las dos cadenas de la hélice de ADN se
separan (desnaturalización) por calentamiento, exponiendo las secuencias
diana a los primers. Tras enfriar la mezcla a una temperatura concreta,
estos primers se ligan a regiones complementarias de secuencias que
flanquean a la secuencia diana (anillamiento).
A otra temperatura concreta, la ADN polimerasa termoestable utiliza el
exceso de dNTPs, extendiendo los primers anillados a lo largo del ADN
molde diana (extensión). De esta forma, tras un ciclo se obtienen dos
copias exactas, biotiniladas, de la secuencia diana. Tras 35 ciclos se
obtiene un número mayor de copias biotiniladas de la secuencia diana.
*
La utilización de este producto está cubierta por una licencia F.
Hoffmann - La Roche Ltd y Roche Molecular Systems, Inc.
Reactivos
Descripción, preparación para el uso y condiciones de almacenamiento
recomendadas
-
36
Si se mantienen a una temperatura de -15/-25°C en sus botellas
originales, los reactivos son estables hasta la fecha de caducidad
indicada. No obstante, se recomienda alicuotar los reactivos (excepto
el LiPA-Taq) tras el primer uso, y luego almacenarlos a una
temperatura de -15/-25°C. No utilice los reactivos más allá de su
fecha de caducidad.
Todos los reactivos deben ser llevados a temperatura ambiente
(20 - 25ºC) aproximadamente 60 minutos antes de ser usados y
devueltos al congelador inmediatamente después de su uso.
INNO-LiPA HLA-C Amplification
-
Los reactivos deben almacenarse completamente aislados de
cualquier fuente de ADN contaminante, especialmente productos de
ADN amplificado.
Las alteraciones de la apariencia física del kit de reactivos pueden
ser signos de inestabilidad o deterioro.
Componente Cantidad
Ref.
Descripción
Tampón de
amplificación 1 x 0,3 ml
56722 Contiene todos los dNTPs y NaN3
al 0,05% como conservante.
Solución de
primers
1 x 0,3 ml
57028 Contiene los primers biotinados,
MgCl2, tampón Tris, y NaN3 al
0,05% como conservante.
LiPA Taq
1 x 0,035 ml 56723 Contiene Taq ADN polimerasa
(2 U/µl) y NaN3 al 0,05% como
conservante.
Materiales necesarios pero no suministrados
-
Materiales para la extracción de ADN.
Guantes desechables.
Puntas de pipeta estériles desechables (preferiblemente taponadas
con algodón).
Microtubos esterilizados.
Racks de microtubos.
Centrifugadora de microtubos.
Ciclador térmico de ADN y equipo.
Pipetas ajustables para pipetear de 1 - 20 µl, de 20 - 200 µl,
y de 200 - 1000 µl.
Aceite mineral, silicona (en caso necesario).
Agua destilada esterilizada en autoclave.
Seguridad y medio ambiente
-
Por favor, consulte la hoja de datos sobre seguridad del
fabricante y el etiquetado del producto para obtener información
acerca de componentes potencialmente peligrosos.
Las muestras deben manipularse siempre como productos
potencialmente peligrosos.
Es imprescindible el uso de equipo protector personal: guantes y gafas
de seguridad cuando manipule agentes peligrosos o infecciosos.
37
INNOGENETICS®
-
Deseche los residuos de acuerdo con las normas de manejo de
residuos de su institución. Asimismo, cumpla con todas las normas
medioambientales nacionales, autonómicas y locales.
Recogida (preparación y almacenamiento de muestras)
NOTA:
Los reactivos no se suministran.
Extracción de ADN
Para preparar ADN genómico a partir de muestras de sangre entera
tratadas con los anticoagulantes ácido-citrato-dextrosa (ACD) o ácido
etilendiaminotetraacético (EDTA) pueden utilizarse los métodos comunes
de extracción del ADN por desalación o métodos basados en columnas
centrífugas.
Almacene las muestras de ADN a una temperatura de -15/-25ºC.
El ADN extraído debería tener una concentración de 0,02 µg/µl. La
pureza (A260nm/A280nm) debería ser ≥ 1,5.
Preparación de la mezcla para la PCR (reacción en cadena de la
polimerasa)
Debe agregarse cada uno de los componentes, y en la cantidad correcta.
Si agrega demasiada cantidad o una cantidad insuficiente de muestra o de
reactivos, puede producirse una amplificación no específica o incluso no
producirse ninguna amplificación.
Ciclos de PCR
Debe seleccionar el perfil de temperatura correcto para el INNO-LiPA
HLA-C Amplification.
38
INNO-LiPA HLA-C Amplification
Observaciones y precauciones
-
-
-
A fin de evitar la contaminación del ADN, se recomienda utilizar una
máxima separación física entre los pasos de pre y posamplificación:
salas separadas, pipetas (y demás material de laboratorio) separadas,
trajes y guantes de laboratorio (y sus recambios) separados, son las
precauciones mínimas para las buenas prácticas de laboratorio. Los
reactivos deben aislarse de cualquier fuente de ADN contaminante,
especialmente productos de ADN amplificado. Evite también la
contaminación microbiana de los reactivos.
Una vez en la sala de posamplificación evite volver a la sala de
preamplificación.
Todas las puntas de pipeta y tubos utilizados para el proceso de
amplificación deben haberse esterilizado en autoclave antes de su
uso. Se recomienda utilizar puntas de pipeta taponadas con algodón.
Utilice una punta nueva por cada alícuota de muestra que pipetee.
Los reactivos para procesos de amplificación deben guardarse en una
habitación libre de DNA amplificado. Se deberían usar tubos
eppendorf y puntas de pipeta (preferiblemente con filtro) autoclavados.
Tras la descongelación, vortee la solución de amplificación y la
solución de primers, y centrifugue brevemente todos los reactivos,
especialmente la LiPA-Taq.
Procedimiento del ensayo
NOTA:
Este protocolo para la amplificación de los exones 2 y 3 del gen del
HLA-C está diseñado para proporcionar una amplificación óptima
utilizando tubos GeneAmp™ (de 0,5 ml) para PCR y cicladores
térmicos PE-480 (Perkin Elmer Cetus), o tubos MicroAmp®
(de 0,2 ml) para PCR y cicladores térmicos PE-2400 y PE-9600
(Perkin Elmer Cetus), y LiPA-Taq.
Este protocolo puede utilizarse con la mayoría de los tipos de
cicladores térmicos comerciales, aunque es posible que deba
modificarse en función de las indicaciones del fabricante del ciclador.
Antes de utilizarlo, determine si el protocolo es compatible con el
ciclador térmico que utilice en su laboratorio. Asegúrese de calibrar
el ciclador térmico antes de utilizarlo.
Tome las precauciones necesarias para evitar la amplificación no
específica y la formación de dímeros de primers, ya que, de lo
contrario, los resultados se verían comprometidos:
•
Lleve a cabo los pasos de pipeteado en hielo y sin demora.
39
INNOGENETICS®
•
•
1.
2.
3.
4.
40
Precaliente (a 96°C) el bloque de calentamiento del ciclador
térmico antes de insertar las muestras e inicie de inmediato el
proceso de ciclado.
Guarde la LiPA-Taq a -15/-25ºC inmediatamente después de su uso.
Diluya cada ADN genómico a una concentración comprendida entre
0,02 y 0,25 µg/µl en tampón TE.
Determine el número de viales que se deben preparar (N) utilizando
la siguiente fórmula:
N = número de muestras de ADN + 1 (control negativo; sin ADN) + 1.
Utilizando puntas taponadas con algodón, prepare la mezcla maestra
en un tubo de 1,5 ml esterilizado en autoclave:
(N x 23,75 µl)
agua destilada esterilizada en autoclave
+ (N x 10 µl)
Tampón de amplificación
+ (N x 10 µl)
Solución de primers HLA-C
+ (N x 1,25 µl)
LiPA-Taq (N x 2,5 U)
El volumen total de esta mezcla de amplificación es ahora igual a
(N x 45 µl). Procese brevemente en vórtice y pipetee 45 µl de esta
mezcla maestra en (N-1) tubos de amplificación esterilizados en
autoclave.
Añada 2 gotas (~ 40 µl) de aceite mineral en cada tubo si es
necesario (por ejemplo, si utiliza PE-480).
Pipetee 5 µl (0,1 a 1,25 µg) del preparado de ADN genómico
(si es necesario, a través del aceite mineral).
Añada 5 µl de agua destilada (sin ADN) al tubo de control negativo.
NOTA:
•
No lo vortee ni lo mezcle
•
Compruebe que la mezcla de amplificación esté en el fondo del
tubo.
Inserte las muestras en el bloque térmico precalentado y calibrado
(consulte las instrucciones del fabricante del ciclador térmico). Inicie
el programa de amplificación diseñado para la amplificación INNOLiPA HLA-C.
INNO-LiPA HLA-C Amplification
Perfil de la amplificación INNO-LiPA HLA-C (termociclador
PE-480, PE-2400, PE-9600):
5.
1.
Paso
desnaturalizar
Temperatura Tiempo
96°C
5 min
2.
3.
4.
desnaturalizar
anillar los primers
extender los primers
96°C
64°C
72°C
30 s
50 s
50 s
Repetir 5 veces
las fases 1 a 4
5.
6.
7.
desnaturalizar
anillar los primers
extender los primers
96°C
62°C
72°C
30 s
50 s
50 s
Repetir 5 veces
las fases 5 a 7
8.
9.
10.
Desnaturalizar
anillar los primers
extender los primers
96°C
60°C
72°C
30 s
50 s
50 s
Repetir 10 veces
las fases 8 a 10
11.
12.
13.
Desnaturalizar
anillar los primers
extender los primers
96°C
55°C
72°C
30 s
50 s
50 s
Repetir 15 veces
las fases 11 a 13
14.
Elongar
72°C
10 min
NOTA:
•
Se utiliza el mismo perfil de amplificación para todos los
productos INNO-LiPA HLA de la clase I.
Concluido el proceso de amplificación, utilice las muestras de
inmediato con tiras INNO-LiPA HLA-C o almacénelas a una
temperatura de -15/-25°C.
NOTA:
•
No almacene los productos de ADN amplificado junto a los
reactivos de amplificación que no se hayan utilizado.
Resultados
Visualización
-
La presencia de amplicones puede comprobarse en gel de agarosa al
2%. Cargue 10 µl del producto amplificado por ranura. El producto
amplificado debe aparecer como una única banda de 904 pb.
Las observaciones realizadas en nuestros laboratorios muestran que
si es visible una banda de 904 pb tras sembrar en gel de agarosa al
2% 10 µl de una dilución 1/10 del producto amplificado puede
obtenerse un resultado interpretable con el ensayo LiPA.
41
INNOGENETICS®
Validación
-
-
Incluya al menos un control negativo y uno positivo cada vez que
realice una amplificación. Como con cualquier nuevo procedimiento
de laboratorio, deberían incluirse controles positivos y negativos
adicionales hasta que el procedimiento de ensayo se consiga
desarrollar correctamente con un elevado grado de confianza. En
caso de que sea aconsejable incluir un control positivo adicional,
utilice una muestra positiva conocida.
Si se obtiene una banda positiva correspondiente al control negativo
en el gel, debe desecharse la totalidad de la prueba y repetirse todo el
procedimiento.
Limitaciones del procedimiento
-
-
Este producto sólo debe ser utilizado por personal especializado en
técnicas de amplificación.
La inhibición de la polimerasa (por ejemplo, por la heparina o por la
hemoglobina) puede anular el ensayo.
Asimismo, el polvillo de los guantes desechables y el hipoclorito
sódico tienen un efecto inhibidor sobre la amplificación.
Una congelación/descongelación repetida de las muestras de ADN
puede ocasionar una amplificación menos eficiente.
No se conoce la secuencia del lugar de unión del primer para todos
los alelos. El riesgo de unión no deseada en el lugar del primer se
considera muy bajo, ya que nunca se ha observado un fracaso del
primer y se han probado un número significativo de alelos que
abarcan todos los grupos. Sin embargo, en caso de un resultado
homocigótico debe considerarse la posibilidad de un fallo de
amplificación alélica.
La amplificación específica se asegura mediante las buenas prácticas
de laboratorio y una cuidadosa ejecución de los procedimientos que
se han descrito.
Eficacia del ensayo
El LiPA HLA-C ha sido evaluado en siete laboratorios europeos de tipaje
de tejido en muestras de rutina.
Durante el ensayo se probaron 269 muestras con el LiPA HLA-C. Todas
las muestras fueron amplificadas con éxito.
42
INNO-LiPA HLA-C Amplification
Português
Símbolos utilizados
Kit de amplificação
Fabricado por
Dispositivo médico de diagnóstico In vitro
Número de lote
Número de Catálogo
Utilizar por
Consultar instrucções de utilização
Limites de Temperatura
Conteúdo suficiente para <n> testes
Solução de primer
Tampão de Amplificação
LiPA Taq
Indicações de uso
O kit INNO-LiPA HLA-C Amplificação, para utilização in vitro, é
concebido para a amplificação de ácidos nucleicos do Segundo e terceiro
exons do locus C do antigénio leucocitário humano (HLA). A reacção é
realizada mediante a reacção em cadeia da polimerase (PCR)*.
43
INNOGENETICS®
Princípio do Teste
A amostra de AND a ser amplificada por PCR*, é introduzida numa
mistura de reagentes contendo um excesso de desoxinucleósido 5'trifosfatos (dNTPs), primers biotinilados e ADN polimerase termoestável.
Os primers amplificam o exon 2 e o exon 3 do locus HLA-C, e são por
isso chamados "HLA-C primers".
Por aquecimento, as duas cadeias da hélice de ADN separam-se
(desnaturação), de modo a expor as sequências alvo aos primers.
Estes primers são complementares às regiões que flanqueiam a sequência
alvo. Portanto, após arrefecimento a uma temperatura específica, os
primers ligam-se à sua região alvo (annealing).
A outra temperatura e utilizando os dNTPs, a ADN polimerase termoestável
estenderá os primers ao longo do molde alvo (extensão). Deste modo, após
um ciclo de desnaturação, annealing e extensão, são produzidas duas cópias
exactas, biotiniladas da sequência alvo. Após 35 ciclos, obtém-se um grande
número de cópias biotiniladas da sequência alvo.
*
A utilização deste produto depende de licença de F. Hoffmann - La
Roche Ltd and Roche Molecular Systems, Inc.
Reagentes
Descrição, preparação e condições de conservação recomendadas
-
-
44
Se conservados a temperaturas de -15/-25°C e guardados nos frascos
originais, os reagentes mantêm-se estáveis até ao fim do prazo de
validade do kit. No entanto, recomenda-se a alíquota dos reagentes
(excepto para LiPA-Taq) depois da primeira utilização e, então,
conservá-los de -15/-25°C. Não usar reagentes para além da data de
validade do kit.
Todos os reagentes devem ser colocados à temperatura ambiente
(20 - 25ºC) aproximadamente 60 minutos antes de usar e devem ser
recolocados no congelador imediatamente após a sua utilização.
Os reagentes devem ser conservados, isolados de qualquer fonte de
contaminação do ADN, especialmente de produtos de ADN
amplificado.
Alterações na aparência física dos reagentes do kit podem indicar
instabilidade ou deterioração.
INNO-LiPA HLA-C Amplification
Reagentes fornecidos:
Quantidade Ref.
Descrição
1 x 0.3 ml
56722
Solução de
Primer
Contém todos os dNTPs and
0.05% NaN3 como conservante.
1 x 0.3 ml
57028
LiPA Taq
1 x 0.035 ml 56723
Contém os primers biotinilados,
MgCl2, e 0.05% NaN3 como
conservante
Taq ADN Polimerase e 0.05%
NaN3 como conservante.
Componente
Tampão de
Amplificação
Materiais necessários mas não fornecidos
-
Materiais para extracção de ADN.
Luvas descartáveis.
Pontas de pipeta descartáveis, esterilizadas (de preferência com filtro
de algodão).
Microtubos esterilizados.
Suportes de microtubos.
Centrífuga de microtubos.
Termociclador de ADN e equipamento.
Pipetas ajustáveis para dispensar 1 - 20 µl, 20 - 200 µl, e 200 - 1000 µl.
Óleo mineral, gordura de silicone (se necessário).
Água destilada esterilizada em autoclave.
Segurança e meio ambiente
-
Consultar a folha de dados de segurança do fabricante e a
rotulagem do produto para obter informação sobre componentes
potencialmente perigosos.
As amostras devem sempre ser manipuladas como potencialmente
perigosas.
É imprescindível o uso de equipamento de protecção pessoal: luvas e
óculos de segurança quando manusear agentes perigosos ou infecciosos.
Os resíduos devem ser tratados de acordo com as regras da
instituição, relativas ao tratamento de resíduos. Respeitar também
todos os regulamentos oficiais, locais e ambientais.
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INNOGENETICS®
Amostras (preparação e conservação)
NOTA:
Os reagentes não são fornecidos.
Extracção do ADN
Para preparar o ADN genómico a partir de amostras de sangue total
tratadas com os anticoagulantes ácido-citrato-dextrose (ACD) ou ácido
etilenodiaminotetracético (EDTA) podem utilizar-se os métodos comuns
de extracção do ADN por dessalinização (salting-out) ou os métodos
baseados em colunas.
Guardar as amostras de ADN de -15/-25°C.
O ADN extraído deve ter uma concentração ≥ 0.01 µg/µl. A pureza
(A260nm/A280nm) deve ser ≥1.5.
Preparação da mistura de PCR
Cada componente deve ser adicionado na quantidade certa. Se se
adicionar demasiada quantidade ou uma quantidade insuficiente de
amostras ou reagentes, pode produzir-se uma amplificação não específica
ou mesmo uma não amplificação.
Ciclos de PCR
Deve ser seleccionado o perfil correcto de temperatura para o INNO-LiPA
HLA-C.
Observações e precauções
-
46
A fim de evitar a contaminação do ADN, recomenda-se utilizar a
máxima separação física entre os passos de pré e pós amplificação:
salas separadas, pipetas (e restante material de laboratório)
separadas, batas e luvas de laboratório (e o seu stock) separadas, são
precauções mínimas para uma boa prática laboratorial. Os reagentes
devem ser isolados de qualquer fonte de contaminação do ADN,
especialmente produtos de ADN amplificado. Evitar também a
contaminação microbiana dos reagentes.
Uma vez na sala de pós-amplificação, evite regressar à sala de préamplificação.
INNO-LiPA HLA-C Amplification
-
-
-
Todas as pontas de pipeta e todos os tubos usados para o processo de
amplificação devem ser esterilizados em autoclave antes do uso.
Recomenda-se o uso de pontas de pipeta com filtros de algodão.
Utilizar uma nova ponta de pipeta esterilizada para cada alíquota da
amostra.
Os reagentes para os processos de amplificação devem ser
manipulados numa sala isenta de ADN amplificado. Devem ser
usados tubos e pontas de pipeta (de preferência com filtros de
algodão) esterilizados em autoclave.
Após a descongelação, agitar em vortex o Tampão Amplificação e a
Solução de Primers e centrifugar brevemente todos os reagentes,
especialmente LiPA-Taq.
Procedimento do teste
NOTA:
Este protocolo para a amplificação do exon 2 e do exon 3 dos alelos de
HLA-C foi concebido para uma amplificação óptima usando tubos para
PCR GeneAmp™ (de 0.5 ml) e termocicladores PE-480 (Perkin Elmer
Cetus), ou tubos para PCR MicroAmp® (de 0.2 ml) e termocicladores
PE-2400 ou PE-9600 (Perkin Elmer Cetus) e LiPA-Taq.
Este protocolo pode ser usado com a maioria dos tipos de
termocicladores comerciais, embora possam ser necessárias algumas
modificações em função das indicações do fabricante do ciclador.
Antes de usar, determinar se o protocolo é compatível com o
termociclador utilizado no seu laboratório. Assegurar-se de que o
termociclador foi calibrado antes de usar.
Tomar as precauções necessárias para evitar amplificação não
específica que pode comprometer os resultados:
•
Realizar os passos de pipetagem no gelo, sem demora.
•
Preaquecer (96°C) o bloco de aquecimento do termociclador
antes de juntar as amostras e começar imediatamente o processo
de ciclagem.
1.
Diluir cada ADN genómico numa concentração compreendida entre
0.01 e 0.02 µg/µl em tampão TE.
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INNOGENETICS®
2.
3.
4.
48
Determinar o número de frascos a ser preparados (N) utilizando a
seguinte fórmula:
N = número de amostras de ADN + 1 (controlo negativo, sem ADN) + 1.
Utilizando pontas de pipeta com filtro de algodão, preparar uma
mastermix num tubo de 1.5 ml, esterilizado em autoclave:
(N x 23.75 µl)
água destilada esterilizada em autoclave
+ (N x 10 µl)
Tampão de Amplificação
+ (N x 10 µl)
Solução de Primers DRB1
+ (N x 1.25 µl)
LiPA-Taq (N x 2 U)
O volume total desta mistura de amplificação é agora de (N x 45 µl).
Vortex brevemente e aliquote 45 µl desta mastermix em (N-1) tubos
de amplificação esterilizados em autoclave.
Juntar 2 gotas (~ 40 µl) de óleo mineral a cada tubo, se necessário
(por ex. se utiliza o PE-480).
Pipetar 5 µl (0.5 a 7.5 µg) da preparação de ADN genómico (através
do óleo mineral, se necessário). Juntar 5 µl de água destilada (sem
ADN) ao tubo de controlo negativo.
NOTA:
•
Não agitar ou misturar.
•
Verificar que a mistura de amplificação está no fundo do tubo.
Colocar as amostras no bloco térmico pré-aquecido e calibrado
(ver instruções do fabricante do termociclador). Iniciar o programa
de amplificação concebido para a amplificação com o HLA-C.
INNO-LiPA HLA-C Amplification
Perfil do HLA-C amplificação (tipo de ciclador: PE-480, PE-2400,
PE-9600):
5.
1.
Passo
Desnaturação
temperatura
96°C
2.
3.
4.
Desnaturação
96°C
Annealing de primers 64°C
Extensão de primers 72°C
30 seg.
50 seg.
50 seg.
Repetir os ciclos
passos 1 a 4
5 vezes
5.
6.
7.
Desnaturação
96°C
Annealing de primers 62°C
Extensão de primers 72°C
30 seg.
50 seg.
50 seg.
Repetir os ciclos
passos 5 a 7
5 vezes
8.
9.
10.
Desnaturação
96°C
Annealing de primers 60°C
Extensão de primers 72°C
30 seg.
50 seg.
50 seg.
Repetir os ciclos
passos 8 a 10
10 vezes
11.
12.
13.
Desnaturação
96°C
Annealing de primers 55°C
Extensão de primers 72°C
30 seg.
50 seg.
50 seg.
Repetir os ciclos
passos 11 a 13
15 vezes
14.
Elongação
10 min.
72°C
tempo
5 min.
NOTA:
•
Os mesmos perfis de amplificação são utilizados para todos os
produtos INNO-LiPA HLA classe I.
Depois do processo de amplificação, usar de imediato as amostras
com as tiras de teste de INNO-LiPA HLA-C ou conservar as
amostras de -15/-25°C.
NOTA:
•
Não armazenar produtos de ADN amplificado juntamente com
reagentes de amplificação que não tenham sido ainda utilizados.
Resultados
Visualização
-
A presença de produto amplificado pode ser verificada num gel de
agarose a 2%. Carregar 10 µl de produto amplificado em cada
ranhura. O amplicon deve aparecer como uma banda única com um
comprimento de 904 bp.
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INNOGENETICS®
-
Observações realizadas nos nossos laboratórios mostraram que pode
ser obtido um resultado interpretável com o ensaio LiPA se for
visível uma banda com o comprimento de 904 bp após verificação de
10 µl de uma diluição 1/10 dilution de produto amplificado em gel
de agarose a 2%.
Validação
-
-
Incluir, pelo menos, um controlo negativo e um positivo de cada vez
que se realiza uma amplificação. Tal como em qualquer novo
procedimento laboratorial, devem incluir-se controlos positivo e
negativo adicionais, até que se atinja um alto grau de confiança na
capacidade de realizar correctamente o procedimento do teste.
No caso de ser aconselhável a inclusão de um controlo positivo
adicional, usar uma amostra positiva conhecida.
Se se obtiver uma banda positiva no gel correspondente ao controlo
negativo, toda a operação deve ser desprezada e o procedimento deve
ser repetido por completo.
Limites do procedimento
-
-
A utilização deste produto deve ser limitada a pessoal bem treinado
em técnicas de amplificação.
A inibição da polimerase (por ex. pela heparina ou pela
hemoglobina) pode ser razão para a completa anulação do ensaio.
O pó das luvas descartáveis e o hipoclorito de sódio têm um efeito
inibidor da amplificação.
A congelação e descongelação repetida das amostras de ADN pode
resultar em amplificações menos eficazes.
A sequência do local de ligação dos primers não é conhecida para
todos os alelos. O risco de mismatch no local de ligação do primer é
considerado muito baixo, uma vez que nunca se observou uma falha do
primer e foi testado um número significativo de alelos abarcando todos
os grupos. No entanto, no caso de um resultado homozigótico, deve ser
considerada a possibilidade de uma falha de amplificação alélica.
A amplificação específica é assegurada mediante as boas práticas de
laboratório e uma cuidadosa execução dos procedimentos descritos.
Performance do Teste
LiPA HLA-C foi avaliado em sete laboratórios Europeus de tipagem de
tecidos em amostras de rotina.
50
INNO-LiPA HLA-C Amplification
Durante o estudo foram testadas no total de 269 amostras com LiPA
HLA-C. Todas as amostras foram amplificadas com sucesso.
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