XXV CONGRESSO BRASILEIRO DE ZOOTECNIA
ZOOTEC 2015
Dimensões Tecnológicas e Sociais da Zootecnia
Fortaleza – CE, 27 a 29 de maio de 2015
Análise da expressão de genes para pluripotência em fibroblastos bovinos cultivados in vitro com 5aza-citidina1
Analysis of pluripotent gene expression in bovine fibroblasts in vitro cultured with 5-aza-cytidine.
Joyla Maria Pires Bernardo 2 , José Jackson do Nascimento Costa 3 , Maria Amélia Soares Araújo 4 , Regislane
Pinto Ribeiro 5 , Glaucinete Borges de Souza 6 , Diana Carla Lima de Lacerda 7 , José Renato de Sousa Passos 8 ,
José Roberto Viana Silva 9
1
Parte da proposta de doutorado de José Jackson do Nascimento Costa, financiado pelo projeto UNIVERSAL
2013, nº 478198/2013-2
2
Graduanda em Biologia, Universidade Estadual Vale do Acaraú –UVA, Sobral-CE, Brasil. E-mail:
[email protected] m
3,4,5
Doutorando em Biotecnologia pelo Programa de Pós -Graduação em Biotecnologia – RENORBIO,
Universidade Federal do Ceará (UFC), Fortaleza-CE, Brasil.
6
Mestranda em Biotecnologia pelo Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Universidade Federal do
Ceará (UFC), Sobral-CE, Brasil.
7
Graduando em Odontologia, Universidade Federal do Ceará – UFC, Sobral-CE, Brasil.
8
Mestre em Biotecnologia pelo Programa de Pós -Graduação em Biotecnologia, Universidade Federal do
Ceará (UFC), Sobral-CE, Brasil.
9
Núcleo de Biotecnologia de Sobral- NUBIS, Universidade Federal do Ceará (UFC), Sobral-CE, Brasil.
Resumo: A 5-aza-citidina é um análogo da citosina que se converte em um nucleotídeo -trifosfato in vivo, o
que possibilita a sua incorporação no DNA e influencia a sua estrutura e estabilidade. Este estudo teve como
objetivo investigar os efeitos do 5-aza-citidina na expressão de genes para pluripotência durante o cultivo in
vitro de fibroblastos bovinos. Para o isolamento dos fibroblastos, foram coletados fragmentos da pele da
orelha de fetos bovinos, cultivados em placas de 24 poços por 7 d ias. Após esse período, os fibroblastos
foram suspensos em tripsina-EDTA e transferidos para garrafas de cultivo. Para análise do efeito do 5-azacitidina, os fibroblastos foram cultivados em placas de cultivo de quatro poços, suplementados com 0,5, 1,0
ou 2,0µM de 5-aza-citidina, por 18h, 36h ou 72h. No final do cultivo, as células foram utilizadas para
extração do RNA, seguido por análise usando PCR em tempo real. Os resultados demonstraram que 2µM de
5-aza-citidina por 72h foi o tratamento mais eficiente na promoção da ativação dos genes indutores da
pluripotência (SOX2 e REX). Em conclusão, o cultivo com 5-aza-citidina foi eficiente na ativação de genes
indutores da pluripotência celular.
Palavras–chave: REX, RNAm, SOX2
Abstract: The 5-azacytidine is a cytosine analogue which is converted into a nucleotide triphosphate in vivo,
which enables the incorporation in DNA and influences its structure and stability. This study aimed to
investigate the effects of 5-azacytidine in the expression of genes for pluripotent during in vitro culture of
bovine fibroblasts. For isolation fibroblast, fragments were collected ear skin of fetuses and 24-well culture
dishes for 7 days. After this period, the fibroblasts were suspended in trypsin -EDTA and transferred to
culture bottles. For the analysis the effect of the 5-azacytidine, fibroblasts were cultured in four-well culture
plates supplemented with 5-azacytidine (0.5, 1.0 or 2.0 µM), for 18h, 36h or 72 hours. At the end of culture,
cells were used for RNA extraction followed by analysis using real-time PCR. The results showed that 2 μM
5-azacytidine for 72h was the most effective treatment in promoting activation of inducing pluripoten t genes
(SOX2 and REX). In conclusion, 5-aza-cytidine the culture was effective at inducing activation of cell
pluripotent genes.
Keywords: mRNA, REX, SOX2
Introdução
Em células de mamíferos, a ausência de expressão dos genes responsáveis pela pluripotênica ocorre
devido à metilação do DNA na região dos promotores destes genes, que condensa a estrutura de cromatina e
leva ao silenciamento dos genes (Cedar & Bergman, 2009). A metilação do DNA ocorre geralmente nos
resíduos de citosina nos dinucleotídeos CpG, que são distribuídos de forma assimétrica no genoma, que
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possui algumas regiões ricas e outras pobres em CpG, sendo que aproximadamente 60% dos promo tores de
genes humanos tem regiões ricas em CpG (Cedar & Bergman, 2009). Assim, a expressão de genes
relacionados com a pluripotênica, tais como Oct4, Nanog, Sox-2, Rex1, é influenciada pela metilação DNA
(Epsztejn-Litman et al., 2008, Feldman et al., 2006). A metilação do DNA em células de mamíferos é
regulada pelas enzimas DNA metiltransferases (DNMTs) que controlam a expressão de vários genes
relacionados com a pluripotência, inclusive em células da linhagem germinativa (Jones & Liang, 2009).
Durante o processo de reprogramação celular, a expressão constante de fatores de pluripotência é essencial
para dar origem a células reprogramadas. Para isto, é necessário alterar as características epigenéticas de um
ou mais loci gênicos. Estudos recentes têm demons trado que o tratamento de células com 5-aza-citidina
promove uma rápida transição para o estágio de pluripotênica (Mikkelsen et al., 2008). Desta forma, o
objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da 5-aza-citidina sobre a expressão de genes indutores da
pluripotência, SOX2 e REX, em fibroblastos bovinos cultivados in vitro por 18, 36 ou 72 horas.
Material e Métodos
Para o isolamento de fibroblastos, foram coletados fragmentos (1-2 mm) da pele da orelha de fetos
bovinos e cultivados em placas de 24 poços contendo 1 mL de DMEM, suplementado 5% de soro fetal
bovino, 2 mM de glutamina e antibióticos (100IU/mL de penicilina e 50µg/mL de estreptomicina), em estufa
com 5% de CO2 e 38,5ºC. Após sete dias, os fragmentos de tecido foram removidos e os fibroblastos
crescidos in vitro foram suspensos em tripsina-EDTA e transferidos para garrafas de cultivo com 6 mL de
DMEM suplementado e cultivadas até alcançar a confluência celular. Para análise do efeito do 5-aza-citidina
sobre a expressão gênica, 15 x 104 fibroblastos foram cultivados em placas de cultivo de quatro poços
revestidos com 0,1% gelatina de pele bovina, o meio consistiu de DMEM suplementado. Foi utilizado 5-azacitidina nas concentrações, 0,5, 1,0 ou 2,0µM, por 18h, 36h ou 72h, à 38,5ºC, em 5% CO2 . No final do
cultivo, as células foram utilizadas para extração do RNA, usando o reagente TRIzol. No tocante a análise
estatística utilizou-se o teste Kruskal-Wallis seguido pelo teste Dunn`s.
Resultados e Discussão
Através da qPCR foi analisada a expressão dos RNAm para SOX2 e REX. Após o cultivo por 18h não
foram observadas diferenças significativas na expressão de SOX2 e REX e nenhuma das concentrações
testadas, quando comparadas ao controle (Fig. 1A, B). No entanto, a expressão de SOX2 e REX aumentou
significativamente em fibroblastos cultivados em 2,0µM de 5-aza-citidina por 36h (Fig. 1C, D), ou por 72h
(Fig. 1E, F) quando comparados ao meio controle. Estudos anteriores mostraram que 5-aza-citidina é
considerada um agente da inibição da metilação do DNA e é amplamente utilizado no estudo da regulação
epigenética da expressão gênica (Jones & Tailor, 1980).
Figuras –
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Figura 1. Expressão de genes para pluripotência em fibroblastos cultivados por (A)
SOX2 e (B) REX por 18 horas, (C) SOX2 e (D) REX por 36 horas, (E)
SOX2 e (F) REX por 72 horas, em diferentes concentrações de 5-azacitidina. Letras maiúsculas distintas (A/B) representam diferenças
significativas (P<0,05).
Conclusões
O cultivo com 5-aza-citidina foi eficiente na ativação de genes indutores da pluripotência celular,
podendo ser utilizado nos processos de indução da pluripotência e diferenciação celular, trazendo grandes
benefícios para o desenvolvimento de terapias celulares que vis em a resolução de problemas de fertilidade
em humanos ou ainda aumentando a eficiência reprodutiva de animais de alto valor zootécnico.
Literatura citada
CEDAR H, BERGMAN Y. Linking DNA methylation and histone modification: patterns and paradigms.
Nat. Rev. Genet. 10:295–304, 2009.
EPSZTEJN-LITMA N, S. et al. De novo DNA methylation promoted by G9a prevents reprogramming of
embryonically silenced genes. Nat. Struct. Mol. Biol. 15, 1176–1183, 2008.
JONES PA, TAYLOR SM. Cellular differentiation, cytidine analogs and DNA methylation. Cell 20:85-93,
1980.
JONES, P.A. LIANG, G. Rethinking how DNA methylation patterns are maintained. Nat. Rev. Genet. 10,
805–811, 2009.
MIKKELSEN TS, HANNA J, ZHANG X, KU M, WERNIG M, SCHORDERET P, BERNSTEIN BE,
JAENISCH R, LANDER ES, MEISSNER A. Dissecting direct reprogramming through integrative genomic
analysis. Nature, 454:49-55, 2008.
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