Cultura dinâmica de células osteoprogenitoras em compósitos hidroxiapatita-colágeno para
aplicações biomédicas
Doris Moura Campos1,2*, Karine Anselme2, Glória de Almeida Soares1
*[email protected], bolsista de doutorado do CNPq
1Laboratório
de Bioengenharia óssea, PEMM-COPPE-UFRJ
2IS2M,
UHA, France
CP 68505, 21941-972, Rio de Janeiro, RJ
Resumo
Compósitos baseados em hidroxiapatita (HA) e colágeno (Col) vêm sendo desenvolvidos atualmente e
podem ser considerados biomiméticos por permitirem sua degradação gradual dentro do organismo.
Entretanto, arcabouços tridimensionais (3-D) apresentam má oxigenação em seu interior, dificultando a
colonização celular e diminuindo sua eficácia em aplicações biomédicas. Arcabouços compósitos 3-D HA-Col
foram produzidos e reticulados para serem avaliados como suporte para a colonização e diferenciação
celular. Células osteoprogenitoras estromais (STRO+1A) foram cultivadas em condição estática e dinâmica
(usando duas velocidades diferentes) durante 21 dias. Apesar da boa adesão e morfologia das células
submetidas às diferentes condições, observou-se que os comportamentos de proliferação e diferenciação
celular são influenciados pela condição de cultivo.
Palavras-chave: compósito hidroxiapatita-colágeno, células STRO+1A, cultura dinâmica.
Introdução
A engenharia de tecidos pode ser considerada
como um importante recurso em aplicações
biomédicas atualmente. Para tecido ósseo e
dentes, compósitos baseados em fosfatos de
cálcio e colágeno vêm sendo classificados como
biomiméticos, pois permitem uma substituição
gradual do biomaterial pelo tecido naturalmente
formado (1,2). Entretanto, arcabouços tridimensionais (3-D) vêm apresentando problemas
em relação à oxigenação e difusão de nutrientes
em cultura de células estática (3,4). Com o
objetivo de aperfeiçoar as condições de cultura,
células osteoprogenitoras estromais (STRO+1A)
foram cultivadas em arcabouços 3-D dentro de
bioreatores em cultura dinâmica, o que permite
um fluxo constante. O objetivo deste trabalho foi
de avaliar a capacidade de colonização e o
comportamento de adesão, proliferação e
diferenciação das células STRO+1A em
compósitos hidroxiapatita-colágeno (HA-Col), sob
diferentes condições de cultura.
Materiais e métodos
Soluções de Ca(NO 3)2, H3PO 4 e atelocolágeno
de origem bovina foram utilisados para a
produção do arcabouço HA-Col (Ca/P igual a
1,67) (50/50 wt%). Os arcabouços 3-D foram
reticulados
com
solução
aquosa
de
glutaraldeído
(0,125%),
lavados
sucessivamente, liofilizados e esterilizados por
radiação gamma (25kGy). Para a cultura de
células, os arcabouços foram rehidratados com
meio de cultura Iscove's (suplementado com
10% de soro fetal bovino, 100U/mL de
penicilina e 100µg/mL de estreptomicina)
durante 24 horas antes da inoculação celular.
Células STRO+1A (5x105cels/amostra) foram
inoculadas e cultivadas em estufa úmida à
37°C e 5% CO 2. Anterior à aplicação do fluxo
dentro dos bioreatores, as células foram
incubadas sob o compósito por 24 horas em
condição estática, para a adesão celular. Após
a total adesão, fluxos constantes de 0.03 (baixa
velocidade) e de 0.3ml/min (alta velocidade)
foram usados para o cultivo das células durante
21 dias. O comportamento celular de
proliferação foi mensurado pelo método do MTT
e a morfologia das células por microscopia
eletrônica de varredura (MEV). A diferenciação
celular foi quantificada através da dosagem de:
fosfatase alcalina (ALP), osteocalcina (OC) e
pró-colágeno tipo I (PIP). A migração celular foi
Painel PEMM 2011 – 10 e 11 de novembro de 2011 – PEMM/COPPE/UFRJ, Rio de Janeiro, RJ, Brasil
avaliada em seções histológicas (15µm) após a
marcação dos núcleos celulares por DAPI.
Fosfatase alcalina
(ng/ml)/10000cels
Resultados e discussão
O arcabouço compósito HA-Col demonstrou ser
um bom suporte para a proliferação e
diferenciação celular. Na condição de cultivo
dinâmico em alta velocidade, o número de
células aumenta durante os 21 dias de cultivo,
apesar do decréscimo observado após 7 dias
na condição dinâmica em baixa velocidade e na
estática (Fig.1). A partir das figuras de MEV, as
células apresentam-se bem aderidas e
espraiadas na superfície do arcabouço 3-D
após os 21 dias de cultivo em todas as
condições. Adicionalmente, foi observada a
produção de matriz extracelular pelas células
submetidas à alta velocidade de cultivo
dinâmico (Fig.2). Em relação ao processo de
diferenciação celular, as células cultivadas em
condição dinâmica apresentaram significante
acréscimo nos níveis de ALP, OC e PIP,
quando comparadas aos resultados do cultivo
estático (Fig.3).
0,2
Estático
0,15
Dinâmico baixa velocidade
Dinâmico alta velocidade
0,1
0,05
0
Osteocalcina (ng/ml)/10000cels
7d
14d
21d
Dias
1,8
B
1,6
1,4
1,2
Estático
1
Dinâmico baixa velocidade
0,8
Dinâmico alta velocidade
0,6
0,4
0,2
0
7d
14d
21d
Dias
C
PIP (ng/ml)/10000cels
0,06
0,05
0,04
Estático
0,03
Dinâmico baixa velocidade
Dinâmico alta velocidade
0,02
0,01
0
7d
14d
21d
Dias
Figura 3 – Níveis de fosfatase alcalina (a), osteocalcina
(b) e pró-colágeno I (c) secretados pelas células
STRO+1A durante 21 dias de cultivo.
450000
Conclusões
400000
Número de células
A
0,3
0,25
350000
300000
Estático
250000
Dinâmico baixa velocidade
200000
Dinâmico alta velocidade
150000
100000
50000
0
1d
3d
7d
14d
21d
Dias
Figura1 - Número de células STRO +1A cultivadas
sob o arcabouço compósito HA/Col durante 21 dias.
A
B
C
A síntese do compósito HA-Col permitiu a
produção de uma estrutura tridimensional
satisfatória para o uso em cultura de células.
Células STRO+1A demonstraram uma rápida
adesão e espraiamento na superfície do
arcabouço em condições estática e dinâmica.
Entretanto, a diminuição do comportamento
proliferativo foi observado em condição estática
e em dinâmica de baixa velocidade. O processo
de diferenciação celular mostrou-se também
ser influenciado pela condição de cultura. As
células foram capazes de sobreviver dentro do
arcabouço 3-D somente na condição de cultivo
dinâmico em alta velocidade (0.3ml/min).
Agradecimentos
Figura 2 – Micrografias das células STRO+1A após
21 dias de cultivo. (a) Estático, (b) baixa velocidade,
(c) alta velocidade. Magnificação: 2000x
Através de seções histológicas, núcleos
celulares foram observados na superfície do
compósito após as primeiras 24 horas de
cultivo em todas as condições. Após 21 dias,
núcleos celulares foram visualizados dentro do
arcabouço 3-D submetido ao cultivo dinâmico
em alta velocidade (0.3ml/min). Entretanto,
esse resultado não é homogêneo entre todas
as
amostras
estudadas
(dados
não
demonstrados).
Este trabalho foi financiado pelas agências de
fomento: CAPES, CNPq e FAPERJ, Brasil;
CNRS, COFECUB (projeto Sv628/09), França.
Referências
[1] R.Z. Legeros, CRC Press, Boca Raton, 1998, 328.
[2] S.J. Kalita, et al., Mater Sci and Eng C. 2007, 27,
441-449.
[3] B David, et al. Tissue Engineering: Part C. 2011,
17(5), 505-516.
[4] R.J. McCoy, F.J. O’Brien, Tissue Engineering:
Part B. 2010, 16(6), 587-601.
Painel PEMM 2011 – 10 e 11 de novembro de 2011 – PEMM/COPPE/UFRJ, Rio de Janeiro, RJ, Brasil