COMBINAÇÃO DE SOLVENTES ORGÂNICOS PARA
PERMEABILIZAÇÃO DE CÉLULAS DE KLUYVEROMYCES
MARXIANUS VISANDO OBTENÇÃO DE β-GALACTOSIDASE
Luciane Padilha Mena
Acadêmica do curso de Engenharia de Alimentos. Universidade Federal do Pampa – Campus
Bagé
[email protected]
Caroline Costa Moraes
Professora do curso de Engenharia de Alimentos. Universidade Federal do Pampa – Campus
Bagé
[email protected]
Ana Paula Manera
Professora do curso de Engenharia de Alimentos. Universidade Federal do Pampa – Campus
Bagé
[email protected]
Resumo. As enzimas, biocatalisadores de
interesse industrial, podem ser obtidas a
partir de micro-organismos. A βgalactosidase é uma enzima intracelular que
pode ser obtida a partir da levedura
Kluyveromyces
marxianus.
A
permeabilização celular emprega agentes
permeabilizantes para tornar a célula
porosa, permitindo a passagem de
moléculas e acesso aos compostos
intracelulares. Solventes orgânicos ou suas
combinações são relatados como bons
agentes permeabilizantes. O objetivo deste
trabalho foi testar a mistura de 4 solventes
em acetato de etila, para obtenção de
células permeabilizadas de Kluyveromyces
marxianus CCT 7082. A acetona 35% (p/v) e
o isopropanol 50% (p/v), preparados em
acetato de etila, apresentaram os melhores
resultados. Ambos são aceitos pela Agência
Nacional de Vigilância Sanitária para uso
em alimentos, nas concentrações estudadas
e seu custo atual assemelha-se. A acetona
35% (p/v) foi definida como o melhor agente
permeabilizante com atividade enzimática
média de 1,4 U/mg de biomassa.
Palavras-chave: Lactase. Lactose. Enzimas
microbianas.
1.
INTRODUÇÃO
Avanços na biotecnologia tornaram
possível a obtenção de diversos produtos a
partir de micro-organismos (PANESAR,
2007). As enzimas industriais são, em sua
maioria, obtidas a partir de fontes
microbianas e seu emprego apresenta
vantagens frente aos catalisadores químicos,
como alta especificidade, condições suaves
de reação e a redução de problemas
ambientais
e
toxicológicos
(BON;
FERRARA; CORVO, 2008; COELHO;
SALGADO; RIBEIRO, 2008).
A β-galactosidase, ou lactase, é uma
promissora enzima empregada na indústria
de alimentos. Dentre suas principais
aplicações destaca-se a hidrólise da lactose
do leite, tornando esse produto e derivados,
próprios ao consumo por pessoas
intolerantes a este carboidrato. Além disso,
essa enzima possui a capacidade de produzir
galactooligossacarídeos (GOS), os quais
podem auxiliar na absorção de alguns
nutrientes e na eliminação de compostos
tóxicos ao organismo (PANESAR, 2007).
A levedura Kluyveromyces marxianus
produz essa enzima com maiores atividades
catalíticas em valores de pH entre 6,0 e 7,0,
tornando-a ideal para tratar o leite e produtos
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derivados, os quais possuem pH próximo a
neutralidade (KONDO et al., 2000;
HUSAIN, 2010). Além disso, esse microorganismo é aceito como seguro (KAUR et
al., 2009).
Quando obtida a partir desta levedura a
β-galactosidase é uma enzima intracelular e
faz-se necessário o emprego de técnicas para
sua obtenção. Métodos químicos, físicos e
enzimáticos podem ser empregados, porém
não são adequados, pois os drásticos
tratamentos aplicados podem levar a
degradação do composto de interesse
(COELHO; SALGADO; RIBEIRO, 2008;
PANESAR et al., 2007).
A permeabilização celular é uma técnica
alternativa que visa o acesso aos compostos
intracelulares. Este método consiste no
emprego de agentes permeabilizantes, os
quais atuam removendo os fosfolipídios da
camada e tornando a célula porosa,
permitindo a passagem de pequenas
moléculas e solutos (PANESAR et al., 2007;
SISO; DOVAL, 2007).
Solventes orgânicos e detergentes tem
sido estudados em diferentes concentrações
e
combinações
como
agentes
permeabilizantes. No entanto, os solventes
tem se mostrado mais vantajosos, uma vez
que apresentam bons resultados e possuem
custo mais baixo que os detergentes
(PANESAR et al; 2007; MENA et al. 2013).
Mena e colaboradores (2013) testaram
diferentes
solventes
orgânicos
na
permeabilização
de
células
de
Kluyveromyces marxianus CCT 7082. Os
solventes foram testados separadamente, em
diferentes concentrações (20, 35, 50 e 100%)
preparados em tampão fosfato de potássio
0,1 M, pH 7,0. Os melhores resultados
foram obtidos quando se empregou acetona
35% (p/v), álcool metílico 35% (p/v), etanol
35% (p/v), isopropanol 50% (p/v) e acetato
de etila 100%.
O objetivo deste trabalho foi avaliar
quatro diferentes misturas de solventes
orgânicos, empregando acetona, álcool
metílico, isopropanol e etanol preparados em
acetato de etila, para permeabilização das
células
da
levedura
Kluyveromyces
marxianus CCT 7082, em
atividade da β-galactosidase.
2.
relação
à
MATERIAL E MÉTODOS
A enzima foi produzida por cultivo
submerso, em meio complexo, utilizando
lactose como substrato, a 30°C, 150 rpm
durante 48 horas (MANERA et al., 2008). O
meio de fermentação foi inoculado com 10%
de inóculo feito com o mesmo meio,
incubado por 24 h a 30ºC e 150 rpm.
Foram testados os solventes orgânicos:
acetona, isopropanol, álcool metílico e
etanol, preparados utilizando acetato de etila
como diluente.
As misturas contendo acetona, etanol e
álcool metílico foram preparadas na
concentração de 35% (p/v). Já, para o
isopropanol utilizou-se a concentração de
50% (p/v). Essas condições foram escolhidas
em função destes solventes apresentarem
máxima atividade enzimática quando
preparados
isoladamente,
nestas
concentrações, em tampão fosfato de
potássio (MENA et al., 2013).
Para a permeabilização celular foram
utilizados 15 mg de células (peso seco) do
caldo fermentado. As células foram
coletadas por centrifugação (5000 rpm, por 5
min a 5°C), lavadas duas vezes com água
destilada e ressuspendidas em 2 mL do
agente permeabilizante. A suspensão foi
mantida durante 5 min a 25°C. Decorrido
este tempo, as células foram novamente
centrifugadas e lavadas duas vezes com
tampão fosfato de potássio 0,1 M, pH 7,0
para a retirada do agente permeabilizante.
Após a permeabilização
celular
realizou-se a determinação da atividade
enzimática por método espectrofotométrico,
usando o-nitrofenil-β-D-galactopiranosideo
(oNPG)
como
substrato,
segundo
metodologia descrita por Inchaurrondo,
Yantorno e Voget (1994). Realizou-se
também um ensaio para células não
permeabilizadas. Os resultados foram
expressos em U por mg de biomassa.
Uma unidade de atividade enzimática
(U) é definida como a quantidade de enzima
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que hidrolisa 1μmol de oNPG por minuto,
sob as condições do ensaio.
Todos os testes foram realizados em
triplicata. Os gráficos foram construídos
utilizando-se editor de gráficos e para a
análise estatística utilizou-se programa
estatístico. Foi realizada a análise de
variância (p<0,05) e o teste de Tukey com
nível de confiança de 95%.
3.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
cada um dos agentes permeabilizantes, em
suas respectivas concentrações, utilizando
acetato de etila. Em 0% tem-se a atividade
das células não permeabilizadas.
Através da análise de variância
constatou-se haver diferença significativa
entre os tratamentos (p< 0,05). E, de modo a
definir qual o melhor tratamento, dentre os
testados, aplicou-se o Teste de Tukey. Na
Figura 1 o Teste de Tukey está representado
pelas letras.
A Figura 1 apresenta os resultados
obtidos para a atividade enzimática para
Figura 1 – Efeito dos solventes preparados em acetato de etila na permeabilização de células
de Kluyveromyces marxianus CCT 7082. Teste de Tukey, entre os tratamentos, representado
pelas letras. Letras iguais denotam que não houve diferença significativa entre os tratamentos
a 95% de confiança.
As células
não
permeabilizadas
apresentaram atividade enzimática igual a
0,18±0,072 U/mg. A acetona 35% (p/v), o
álcool metílico 35% (p/v), o etanol 35%
(p/v) e o isopropanol 50% (p/v)
apresentaram atividade enzimática igual a
1,40±0,22
U/mg,
0,48±0,02
U/mg,
0,68±0,03 U/mg e 1,46±0,07 U/mg,
respectivamente.
Todos
os
tratamentos
foram
considerados estatisticamente diferentes das
células não permeabilizadas, indicando que
todas as misturas testadas possuem
capacidade de permeabilização das células
da levedura, nas concentrações testadas, em
relação à atividade da enzima βgalactosidase.
No entanto, os melhores resultados
foram obtidos para acetona 35% (p/v) e
isopropanol 50% (p/v). Esses dois
tratamentos
foram
considerados
estatisticamente iguais. Todos os solventes
orgânicos testados neste trabalho podem ser
utilizados em alimentos, segundo a Agência
Nacional de Vigilância Sanitária (BRASIL,
2007).
Atualmente, o custo da acetona e do
isopropanol é semelhante. Assim, a acetona
35% (p/v) preparada em acetato de etila foi
definida como sendo o melhor agente
permeabilizante, dentre os testados neste
trabalho, por utilizar uma concentração
menor do que o isopropanol 50% (p/v),
resultando em economia de reagentes, sem
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atividade
HUSAIN, Q. β-galactosidases and their
potential applications: a review. Critical
Reviews in Biotechnology. India, v. 30, n.
1, p. 41-62, out 2010.
A partir dos resultados obtidos
contatou-se que todas as combinações de
solventes testadas foram eficazes na
permeabilização das células da levedura
Kluyveromyces marxianus CCT 7082, em
relação à atividade da enzima βgalactosidase.
Os melhores resultados foram obtidos
para a acetona 35% (p/v) e para o
isopropanol 50% (p/v), usando como
diluentes acetato de etila. Os resultados de
ambos os tratamentos foram considerados
estatisticamente iguais. Definiu-se a acetona
35% (p/v) como sendo o melhor agente
permeabilizante,
dentre
os
testados,
resultando em uma atividade enzimática
média de 1,4 U/mg.
INCHAURRONDO, V.A.; YANTORNO,
O. M.; VOGET, C. E. Yeast growth and
beta-galactosidase production during aerobic
batch cultures in lactose-limited synthetic
medium. Process Biochemistry. Argentina,
v. 29, n. 1, p. 47-54, 1994.
perdas
significativas
enzimática.
4.
na
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Agradecimentos
Ao
Programa
de
Bolsas
de
Desenvolvimento Acadêmico da Universidade
Federal do Pampa (PBDA), pela bolsa de
iniciação científica.
Ao Laboratório de Microbiologia e
Toxicologia de Alimentos da Universidade
Federal do Pampa – Campus Bagé, pelo local
de realização dos experimentos.
5.
REFERÊNCIAS
BRASIL. Agência Nacional de Vigilância
Sanitária – ANVISA. Resolução RDC n° 2,
de 15 de janeiro de 2007. Brasília: Diário
Oficial da União, 2007.
BON, E. P. S.; FERRARA, M. A.; CORVO,
M. L. Enzimas em biotecnologia:
produção, aplicações e mercado. Editora
Interciência Ltda, Rio de Janeiro, Brasil,
2008.
COELHO, M. A. Z.; SALGADO, A. M.;
RIBEIRO, B. D. Tecnologia enzimática.
Editora EPUB, Rio de Janeiro, Brasil, 2008.
KAUR, G.; PANESAR, P. S.; BERA, M. B.;
KUMAR, H. Hydrolysis of whey lactose
using CTAB-permeabilized yeast cells.
Bioprocess and Biosystems Engineering.
India, v. 32, n. 1, p. 63-67, 2009.
KONDO, A. et al. Preparation of high
activity whole cell biocatalyst by
permeabilization of recombinant flocculent
yeast with alcohol. Enzyme and Microbial
Technology. Japan. v. 27, n. 10, p. 806-811,
2000.
MANERA, A. P. et al. Optimization of the
Culture Medium for the Production of βgalactosidase
from
Kluyveromyces
marxianus CCT 7082. Food Technology
and Biotechnology. Rio Grande. v. 46, n. 1,
p. 66-72, 2008.
MENA, L. P. et al. Influência da
concentração de solventes orgânicos na
permeabilização
de
células
de
Kluyveromyces
marxianus.
Congresso
Regional De Iniciação Científica E
Tecnológica Em Engenharia - CRICTE, v.
1, 2013.
PANESAR,P.S. et al. Permeabilization of
Yeast Cells with Organic Solvents for βgalactosidase Activity. Research Journal of
Microbiology. India, v. 2, n. 1, p. 34-41,
2007.
SISO, M.I.G.; DOVAL, S.S. Kluyveromyces
lactis immobilization on corn grits for milk
whey lactose hydrolysis. Enzyme Microb.
Technology, v. 16, p. 303-310, 1994.
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