Análise dos efeitos biológicos e genômicos em
amostras de sangue submetidas a níveis
controlados de radiação emitida por sistemas de
telefonia celular
Antônio Marini de Almeida*, Cássia de Lourdes Campanho**, Raquel Mary Rodrigues**, Vanessa
Cristina Franco**, Bruno Peres dos Santos**, Juliana K. R. Heinrich**
Este trabalho apresenta a investigação dos efeitos biológicos da radiação eletromagnética produzida por
sistemas CDMA e AMPS de telefonia celular, em culturas de células expostas durante 72 horas a taxas
de absorção específica (SAR) variando de 0,8 a 10 W/kg. Foram investigadas instabilidades genômicas
pela técnica de citogenética convencional e FISH (hibridização in situ por fluorescência) em amostras de
sangue de 10 doadores. A instabilidade genômica é um dos primeiros eventos que ocorrem na iniciação
de tumores e, por essa razão, foram analisadas: a frequência e o tipo de anomalias cromossômicas, a
frequência de micronúcleos, a aneuploidia e o status dos genes TP53, HER-2/neu e C-MYC em linfócitos
submetidos a campos de RF em um sistema de exposição controlado e altamente monitorado. Nossos
resultados demonstram um efeito dose-dependente para a ocorrência de anomalias no DNA e resultados
positivos relevantes foram encontrados apenas acima dos limites de SAR estabelecidos pelas
regulamentações.
Palavras-chave: Radiação não ionizante. Efeitos biológicos. Campos eletromagnéticos.
Introdução
Estudos in vitro são importantes para delinear
possíveis danos causados pela radiação não
ionizante ou campos de radiofrequência (RF) e
suas interações com os sistemas biológicos tais
como células, tecidos e organismos. A principal
vantagem desses estudos é a possibilidade de
controlar quase todas as variáveis e condições
dos testes para descartar interferências e
delinear os alvos da investigação para serem
explorados por estudos in vivo e clínicoepidemiológicos.
Instabilidade genômica (IG) tem sido encontrada
principalmente em células tumorais e é
caracterizada por acúmulo de múltiplas trocas
que convertem o genoma de uma célula normal
em um genoma instável (SMITH et al., 2003).
Essa instabilidade é caracterizada por alterações
genéticas, como rearranjos cromossômicos,
aneuploidia, aumento da frequência de
micronúcleos, instabilidade de microssatélite,
mutações, amplificações gênicas, trocas na
transcrição de genes, transformação e morte
celular na primeira e nas subsequentes gerações
de células após o insulto inicial (HUANG;
SNYDER; MORGAN, 2003).
Investigações in vitro em diferentes sistemas
celulares demonstraram associações tanto
positivas quanto negativas para danos à célula,
levando à IG após exposição à RF, embora
muitos desses resultados tenham sido atribuídos
a efeitos térmicos. Esses grupos sugeriram que a
RF não é mutagênica em si e que os efeitos
adversos dessa exposição devem-se ao
aquecimento causado pela exposição das células
à alta frequência ou a campos de alta intensidade
(IVASHUCK et al., 1997; BRUSICK et al., 1998;
MOULDER et al., 1999; BLETTNER; BERG,
2000).
Por outro lado, a aneuploidia do cromossomo 17
foi observada em vias dose-dependentes com
alterações
relacionadas
à
segregação
cromossômica, sugerindo que a RF pode
interferir no ciclo celular e causar danos
cromossômicos e IG em experimentos com a
temperatura
do
ambiente
controlada
(MASHEVICH et al., 2003). Outros eventos foram
observados e associados com a exposição à RF
dose-dependente como: efluxo de moléculas
transmembrana,
erros
de
transcrição,
transformação celular, mudanças na atividade
enzimática, fosforilação da hsp27 (proteína heat
shock 27) e aumento dos níveis de mRNA do
gene FOS (GOSWANI et al., 1999; PRABHAT et
al., 1999; FRENCH et al., 2001; LESZCYNSKI et
al., 2002; DI CARLO et al., 2002).
Há uma grande preocupação considerando
exposição à RF e tumorigênese e, como a
instabilidade genômica é um dos primeiros
eventos ocorridos na formação do tumor, foi
investigada
a
frequência
de
danos
* Autor a quem a correspondência deve ser dirigida: [email protected]
** Laboratórios Clínicos Especializados – Citogenética – CAISM – Universidade Estadual de Campinas – Unicamp
Cad. CPqD Tecnologia, Campinas, v. 5, n. 1, p. 63-68, jan./jun. 2009
Análise dos efeitos biológicos e genômicos em amostras de sangue submetidas a níveis controlados de
radiação emitida por sistemas de telefonia celular
A população do estudo consistiu em 10
indivíduos saudáveis, homens e mulheres, não
fumantes, que não haviam sido submetidos a
exames de raio-X nos últimos 12 meses. O
estudo foi aprovado pela Universidade e pelo
Comitê de Ética Nacional (CONEP). Os
participantes foram informados dos objetivos do
estudo e foi solicitada a assinatura do termo de
consentimento livre e esclarecido. Amostras de
sangue venoso foram coletadas em tubos
heparinizados codificados e divididas para serem
utilizadas em diferentes técnicas como amostras
teste, sham-exposed e controle.
foram analisadas. Para a análise FISH, foram
utilizadas sondas gene específicas e para o
respectivo centrômero do cromossomo de
origem, para os genes TP-53, HER-2/neu e CMYC (Qbiogene), de acordo com as instruções
do fabricante, em forma de minipreparação.
Células com mais de dois sinais de hibridização
foram reportadas com amplificação. Para os
ensaios de aumento da frequência de
micronúcleos, as culturas de linfócitos de curta
duração foram estabelecidas como descritas
anteriormente para a análise citogenética
convencional.
No
entanto,
adicionou-se
citocalasina B (Sigma) após 44 horas do estímulo
inicial. As células foram submetidas ao choque
hipotônico e fixadas apenas em metanol, em três
lavagens sucessivas. As células foram coradas
em Giemsa-Wright a 5% por 6 minutos. Para
cada doador, 1.000 células foram analisadas e
as frequências médicas para cada tipo de
exposição foram obtidas.
1.2 Análises citogenéticas
1.3 Sistema de exposição
Citogenéticas: culturas de curta duração foram
estabelecidas utilizando 0,5 ml de sangue
periférico em meio de cultura HAM F-10
(Nutricell) suplementado com fitohemaglutinina
(Invitrogen) e 10% de soro fetal bovino (Nutricell).
As células foram coletadas após 72 horas de
estímulo e colcemid (Invitrogen) foi adicionado às
culturas aproximadamente uma hora antes da
fixação e processamento finais. As culturas
foram submetidas ao choque hipotônico em
solução de KCl 0,075 M por 10 minutos a 37 oC e
fixadas em metanol: ácido acético (3:1) em três
lavagens sucessivas. Para a análise citogenética
convencional, os linfócitos foram corados em
corante Giemsa-Wright a 5% por 6 minutos.
Foram analisadas aberrações estruturais como:
quebras e gaps cromossômicos e cromatídicos,
fragmentos acêntricos e dicêntricos, double
minutes e aumento de satélites. Cada anomalia
foi registrada como um evento diferente. As
frequências médias foram obtidas para cada tipo
de exposição. Para cada doador, 200 células
O setup de exposição foi especialmente
desenvolvido para este projeto. Uma TEM Cell
(Transverse Electromagnetic Cell) foi utilizada
para irradiar amostras em uma incubadora a
37oC (Figura 1A) por 72 horas, que é o tempo
preconizado para obtenção de metáfases para
análise citogenética. A temperatura foi corrigida
pela insuflação de ar, quando necessária,
especialmente em níveis altos de SAR. Todos os
parâmetros de exposição foram controlados e as
condições para obtenção dos níveis desejáveis
de SAR foram medidas e estabelecidas
anteriormente, em experimentos conduzidos no
equipamento robótico Dasy4 (Figura 1B). As
culturas foram submetidas a níveis de 0,8; 2,0;
5,0 e 10,0 W/kg, nas tecnologias AMPS e CDMA.
Amostras do tipo sham-exposed (nas mesmas
condições de transporte e armazenamento, mas
sem exposição à radiação) e amostras-controle
(controle do paciente, sem as mesmas condições
de transporte e armazenamento e sem exposição
à radiação) foram incluídas.
cromossômicos, a formação de micronúcleos e a
aneuploidia em linfócitos submetidos a campos
de RF em um sistema de exposição controlado e
altamente monitorado.
1
Materiais e métodos para análise
1.1 Amostra
A.
B.
Figura 1 Setup de exposição: (A) Diagrama do sistema de exposição
(B) Sistema robótico Dasy 4 utilizado para caracterização das calibrações do sistema
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radiação emitida por sistemas de telefonia celular
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controles, 0,8 W/kg AMPS, 10 W/kg AMPS e
sham-exposed. As frequências de micronúcleos
aumentaram em níveis de SAR de 10 W/kg
enquanto os resultados observados com o nível
de SAR de 0,8 W/kg – realisticamente próximo
ao nível de exposição a que uma pessoa é
submetida – foram muito similares à frequência
obtida com as amostras do tipo sham-exposed,
podendo demonstrar algum efeito técnico e não
da radiação propriamente dita.
Um efeito dose-dependente foi claramente
notado em todos os parâmetros investigados,
uma vez que as anomalias tornavam-se mais
frequentes de forma proporcional aos valores de
SAR a que foram submetidas as amostras.
Entre as
anomalias
citogenéticas
mais
frequentemente observadas, notaram-se quebras
cromatídicas (envolvendo as cromátides dos
cromossomos) e outros eventos como deleção
de fragmentos e amplificação, assim como
cromossomos em anel, conforme Figura 2.
Resultados
Com relação aos resultados obtidos com a
técnica FISH (hibridização in situ por
fluorescência),
foram
obtidas
frequências
máximas para cada caso, dadas pela
porcentagem de células alteradas, para um dos
genes, para cada uma das classes de amostra,
conforme resumido na Tabela 1.
Apesar de as frequências máximas obtidas e
observadas na Tabela 1 terem se apresentado
sensivelmente maiores que os controles,
observou-se que os resultados eram confirmados
em um número maior de casos apenas acima do
limite de 5 W/kg, tendo chegado à totalidade de
casos alterados quando as células foram
submetidas ao limite de 10 W/kg, conforme
Tabela 2.
Os resultados obtidos com o teste da frequência
de micronúcleos revelou porcentagens de 4,07%,
8,93%, 13,36% e 8,74% respectivamente para:
Tabela 1 Frequências máximas das alterações
CDMA
AMPS
Gene
Controle
2 W/kg
5 W/kg
10 W/kg
2 W/kg
5 W/kg
10 W/kg
CMYC
0
1,97 %
2,32 %
3,97 %
4,82 %
4,97 %
1,33 %
HER2
4,13 %
2,54 %
2,86 %
3,81 %
2,57 %
18,87 %
2,00 %
TP53
6,61 %
5,40 %
6,98 %
9,52 %
3,93 %
14,24 %
2,33 %
Tabela 2 Número de casos alterados acima dos resultados dos controles
CDMA
Gene
AMPS
2 W/kg
5 W/kg
10 W/kg
2 W/kg
5 W/kg
10 W/kg
CMYC
0 de 6
4 de 7
7 de 7
4 de 7
4 de 7
7 de 7
HER2
0 de 6
1 de 7
5 de 7
1 de 7
2 de 7
5 de 7
TP53
0 de 6
2 de 7
5 de 7
1 de 7
4 de 7
7 de 7
A
B
C
D
E
F
G
H
Figura 2 Anomalias cromossômicas: (A) Aumento de satélite, (B/C) Quebras cromossômicas, (D) Gap
cromatídico, (E) Deleção, (F) Cromossomo em anel, (G) Fragmento acêntrico, (H) Amplificação
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Análise e discussão dos resultados
Uma preocupação geral para as pessoas que
são submetidas a campos de radiofrequência,
especialmente com o aumento drástico do
número de usuários da tecnologia celular, é a
“conexão” entre radiação e câncer. A
instabilidade genômica é largamente encontrada
em células tumorais e existe uma evidência forte
de que altos níveis de SAR, muito acima dos
limites preconizados pelas legislações vigentes,
possam ter um efeito genotóxico e induzir dano
ao DNA em algum nível.
É interessante notar que a aneuploidia e as
anomalias
cromossômicas
têm
sido
consideradas dois dos eventos mais notórios
relacionados aos processos de tumorigênese –
iniciação tumoral, uma vez que precede a
transformação maligna em muitos tumores. A
aneuploidia no câncer e outras anomalias afetam
a dosagem gênica e um grande número de
proteínas, incluindo aquelas envolvidas no
aparato do fuso mitótico, necessário para os
processos de divisão celular, fazendo com que
essas anomalias tornem-se perpetuáveis (BIALY,
2001). Mesmo detectando anomalias genômicas
em células de sangue submetidas a níveis
diferentes de SAR, ainda resta identificar se
essas células são capazes de escapar para uma
via apoptótica, de morte celular programada,
para exterminar os clones desbalanceados e
preservar a integridade tecidual. Foram
observados muito mais eventos relacionados a
translocações e cromossomos marcadores do
que a fragmentos dicêntricos, acêntricos e
cromossomos
em
anel,
estes
últimos
considerados menos estáveis e com rápido
desaparecimento in vivo (JOHNSON et al., 1998;
LALIC et al., 2001).
Em resposta ao efeito genotóxico da radiação,
várias moléculas químicas, metabólitos celulares
reativos e checkpoints de controle do ciclo celular
podem ser ativados, permitindo que uma célula
se autorrepare ou evite a transmissão de
cromossomos anormais. O equilíbrio entre os
eventos de ciclo celular, reparo de danos e início
da morte celular programada são eventos que
podem determinar se o dano à célula ou ao DNA
é compatível com a sobrevivência da célula ou
se requer eliminação por via apoptótica. Defeitos
nesses
processos
podem
levar
à
hipersensibilidade ao estresse celular e
susceptibilidade ao dano ao DNA, defeitos
genômicos
e
resistência
à
apoptose,
características marcantes das células tumorais.
Quando indivíduos expostos à radiação em um
ambiente de trabalho foram avaliados, foi
demonstrado que outros fatores podem
potencializar os efeitos clastogênicos da radiação
como a deprivação de luz, resultando em um
distúrbio na secreção de melatonina (CASSONE
et al., 1993). Essas observações podem explicar
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o fato de que nossas amostras do tipo shamexposed demonstraram médias maiores de
anomalias quando comparadas às amostrascontrole. É necessário considerar também que
fatores epigenéticos e ambientais podem atuar
fortemente como potencializadores dos efeitos
no DNA. Nossos achados apoiam os resultados
de outros grupos, uma vez que foi possível
demonstrar
um
efeito
dose-dependente,
particularmente com níveis de SAR acima de
5 W/kg (TICE et al., 2002).
O sistema de exposição utilizado nesses ensaios
foi cuidadosamente proposto para atender às
necessidades descritas no Projeto EMF
Internacional da Organização Mundial da Saúde.
Parâmetros como temperatura, potência e a
caracterização da TEM Cell foram estudados em
testes de dosimetria, para que resultados
confiáveis pudessem ser atingidos em condições
isotermais.
Nossos resultados demonstram a importância da
análise genômica, especialmente através de
técnicas de citogenética convencional e
molecular e sugerem a utilização da análise
citogenética contínua, especialmente para os
profissionais
submetidos
à
irradiação
ocupacional (LALIC et al., 2001).
Conclusão
O efeito genotóxico da radiação no DNA das
células do sangue somente pôde ser verificado
quando estas foram submetidas a limites muito
superiores aos preconizados nas legislações e
literatura técnica. A análise citogenética de rotina
pode ser uma ferramenta importante para o
acompanhamento da saúde do trabalhador
envolvido em operações com altas doses de RF.
Referências
BRUSICK,
D.
et
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radiofrequency radiation. Environmental and
Molecular Mutagenesis, 1998; 32: 1-16.
HUANG, L.; SNYDER, A.R.; MORGAN, W. F.
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factor-treated PC12 rat pheochromacytoma cells
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MOULDER, J. E. et al. Cell phones and cancer:
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Radiation Research, 1999; 151: 513-531.
SMITH, L. E. et al. Radiation-induced genomic
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Cad. CPqD Tecnologia, Campinas, v. 5, n. 1, p. 63-68, jan./jun. 2009
Análise dos efeitos biológicos e genômicos em amostras de sangue submetidas a níveis controlados de
radiação emitida por sistemas de telefonia celular
Abstract
In this work we have investigated the biological effects in cultured cells exposed to electromagnetic
radiation produced by mobile systems with CDMA and AMPS technologies during 72 hours with a SAR
ranging from 0.8 to 10 W/kg. Using conventional and molecular cytogenetics (FISH – Fluorescent in situ
hybridization) techniques we investigated the genomic instability in cultured blood samples from 10
donors. The samples were exposed to RF fields in a controlled and monitored system. Genomic instability
is frequently related to tumorigenesis and in that way we analyzed: the frequency and type of
chromosomal abnormalities, micronuclei frequency, aneuploidy and gene status of the TP53, HER-2/neu
and C-MYC genes. Our results have shown a dose-dependent effect on those DNA abnormalities and
relevant positive results were found only above the regulatory SAR limits.
Key words: Non ionizing radiation. Biological effects. Electromagnectics fields.
Cad. CPqD Tecnologia, Campinas, v. 5, n. 1, p. 63-68, jan./jun. 2009
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