Encontro ABRASP 2011
Métodos Microbiológicos
Rápidos
Adriana Bugno
Instituto Adolfo Lutz
Métodos microbiológicos
A história da Microbiologia é uma estória de pessoas comuns e
indivíduos peculiares, de zeladores, donas de casa, químicos,
médicos, botânicos em buscas de descobertas.
Não eram mentes investigativas conscientemente em busca de
desenvolver novos métodos para um novo campo da ciência
Exploradores guiados
pelo acaso ou pela curiosidade
por problemas do dia-a-dia, para os quais não se
tinham respostas
por imensa compaixão pelo sofrimento humano
Métodos microbiológicos
Porém, não foi o sofrimento humano que inicialmente motivou os
investigadores, mas os estudos básicos e aplicados dos processos
industriais, os quais abriram caminho para as aplicações médicas
É uma história de eventos e fenômenos para os quais não se tinham
explicação, seguidos de observações para as quais não se tinham aplicações
óbvias, de eventual associação de causa e efeito, tudo em um vasto campo
de investigação.
As Eras da Microbiologia
Alguns pesquisadores dividem a história da Microbiologia em Eras:
5000 a.C.
Era dos
MMR
Era da Especulação
Os micro-organismos interagem com o homem e seu ambiente desde o início da
humanidade, de forma positiva ou negativa.
Eventos e fenômenos para os quais não se tinham
explicação ocorriam
Se não adicionar porções de pão ou bebida fermentada no próximo lote de produção, o
pão não crescia e as uvas não fermentavam.
542 d.C.: epidemia atingiu Constantinopla e se espalhou pela
Pessoas
doentes
ficavam
sem
Europa e Ásia.
que
Século 14: a mais famosa das epidemias, a Peste Negra,
houvesse qualquer pista
causou a morte de 30-50% da população da Europa e de ~
sobre a natureza ou a
40 milhões no mundo.
causa de seus males 
Século 15: a Europa foi atingida por uma epidemia de sífilis.
castigo dos deuses
Século 16: epidemia de sarampo causou a morte de 100
milhões de pessoas no mundo.
Era da Observação
A humanidade compreendeu que um mundo desconhecido e invisível
estava ao seu redor. A partir do século 17, tem início a busca por enxergar
este mundo e aprender a lidar com ele.
Esta foi a era dos avanços no campo da microscopia
Em meados do século 17, Anton van Leeuwenhoek preparou lentes muito melhores
que as de seu tempo, sem qualquer intenção de encontrar fontes de vida, mas
somente movido pela curiosidade de poder ver pequenas coisas: insetos, tecidos,
poeiras. Até que, por algum motivo, resolveu ver a água da chuva e encontrou
“pequenas criaturas”
Lazzaro Spallanzani – conceito de autoclavação, anaerobiose
Giovanni Battista Amici – lentes objetivas acromáticas
Carl Zeiss
Ernst Abbe – lentes de imersão em óleo
Era do cultivo
Com algumas ferramentas básicas e alguns conceitos, a microbiologia
emergiu do período da simples observação.
Apesar das descobertas feitas até então, a causa das doenças infecciosas continuava
sendo totalmente desconhecida.
Louis Pasteur: em 1857, interessa-se por desvendar as razões dos processos de
fermentação que transformavam açúcar de beterraba em álcool, mas algumas vezes
em ácido. Somente após compreender o papel dos micro-organismos no processo de
fermentação, sua atenção se volta ao estudo das doenças infecciosas.
Joseph Lister: iniciou as práticas de antissepsia para prevenir a contaminação
microbiana durante cirurgias e partos.
Robert Koch: “detetive de micróbios” durante uma epidemia de cólera. Em 1873
começou os estudos com anthrax e deduziu que os micro-organismos eram a causa
da morte de animais. Também fez as primeiras fotomicrografias de bactérias
Era do cultivo
Com algumas ferramentas básicas e alguns conceitos, a microbiologia
emergiu do período da simples observação.
Desenvolvimento das técnicas de coloração:
Ferdinand Cohn: coloração de cortes histológicos com corantes vegetais
Robert Koch: técnica de fixação de bactérias e coloração com azul de
metileno
Erlich: técnica de diferenciação de bacilos da tuberculose por coloração
Gram: técnica de diferenciação de bactérias
Avanços em imunologia, com a descoberta e produção de vacinas
Início dos estudos sobre insetos vetores e do desenvolvimento da quimioterapia
Era dos estudos fisiológicos e moleculares
O século 20 testemunhou grandes avanços: metabolismo microbiano, genética
microbiana, biologia molecular, terapia antimicrobiana, desenvolvimento de
meios de cultura seletivos e diferenciais, virologia, ...
Além dos conhecimentos básicos de bioquímica microbiana, os estudos do
metabolismo microbiano tornaram possíveis o desenvolvimento de muitos métodos
diagnósticos para selecionar ou diferenciar micro-organismos;
A taxonomia microbiana deixou de ser baseada puramente em características
morfológicas e passou a considerar as características metabólicas;
Reclassificação de espécies e gêneros resultou do estudos de biologia molecular;
O papel e a natureza do DNA nasceu de estudos para compreender a variação
microbiana e a resistência a antibióticos - Em 1983, o DNA transformou-se em
ferramenta quando Karry Mullis desenvolveu a técnica de PCR, que tornou possível a
amplificação de DNA
Métodos microbiológicos
Todo conhecimento adquirido é o fundamento dos métodos analíticos
utilizados até hoje
Os métodos microbiológicos clássicos ou de referência são:
Amplamente acessíveis;
Harmonizados;
Aceitos por agências regulatórias;
Demandam
grande quantidade de materiais
alta capacitação técnica
tempo longo tanto na execução analítica como para
obtenção dos resultados
Custos relativamente altos
Exigem crescimento microbiano da ordem de 106 células para ser
macroscopicamente visível
E....
Métodos microbiológicos
Ofereceu a base para o desenvolvimento de novas aplicações da ciência
e de tecnologias inovadoras com potenciais vantagens sobre os métodos
clássicos
Os métodos microbiológicos rápidos são desenvolvidos para:
Obter resultados analíticos confiáveis que assegurem de forma mais eficaz a
segurança do produto
Reduzir o tempo de detecção
Melhorar o isolamento, enumeração e caracterização de micro-organismos,
além de melhorar o fluxo para análise de múltiplas amostras
Possibilitar automação, miniaturização e de intervenção durante o processo
de fabricação – real time
Produtos estéreis
O controle de produtos estéreis visa assegurar a ausência de
Micro-organismos viáveis
Toxinas microbianas
Substância pirogênica
Pirogênio
Endotoxina bacteriana
Teste do Pirogênio
Método clássico, oficializado em 1942 na USP XII
Método in vivo
Alto custo
Manutenção de biotério
Alta capacitação técnica
Analistas capacitados na técnica analítica
Habilidade para o manuseio de animais
Demanda tempo excessivo
Preparação do teste
Obtenção de resultados (3 horas)
Ensaio limite
Endotoxinas bacterianas
O teste do LAL é o primeiro MMR implantado na indústria
farmacêutica para avaliação de produtos estéreis (1974)
Método in vitro
Menor custo
Menor capacitação técnica dos analistas
Demanda menor tempo para a preparação do teste e para obtenção de
resultados (1 hora)
Maior eficiência, especificidade, sensibilidade, exatidão
Ensaios: qualitativos (formação de gel) e quantitativos (cinético)
Portable Test System
Nova tecnologia para quantificação de endotoxinas bacterianas,
baseada no teste cinético do LAL
Maior facilidade analítica
Menor tempo para a preparação do teste e para obtenção de resultados
(15 minutos)
Possibilidade de monitoramento durante processo produtivo
Fonte: www.criver.com
Teste de Esterilidade
Verificar a presença de micro-organismos viáveis em produtos que
tenham sido submetidos a algum processo esterilizante, pela inoculação
em meio de cultura nutriente, que permite a detecção de bactérias,
bolores e leveduras, incubado por temperatura e tempos adequados
Oficializado:
em 1932 na British Pharmacopeia e
em 1936 USP XI
Teste de Esterilidade
Inoculação
direta
Inoculação
indireta
Inoculação
Indireta em
sistema fechado
Fonte: www.millipore.com
Teste de Esterilidade
Inoculação
direta
Caldo
peptonado
Inoculação
indireta
Caldo
Meio
peptonado
Tioglicolato
+ gelatina
+ solução de Litmus
Caldo peptonado
+ mel
Caldo
Sabouraud
Inoculação
Indireta em
sistema fechado
Caldo
Caseína
de soja
Teste de Esterilidade
Inoculação
direta
Caldo peptonado
5 dias
Inoculação
indireta
Caldo peptonado
+ gelatina
+ solução de Litmus
Meio Tioglicolato
Inoculação
Indireta em
sistema fechado
Caldo peptonado + mel
Caldo Sabouraud
10 dias
14 dias
A partir de 2000, 14 dias
Caldo Caseína de soja
07 dias
14 dias
Limitações do Teste de esterilidade
Quanto aos aspectos analíticos, observa-se uma evolução na metodologia
do Teste de Esterilidade, porém persistem algumas limitações no que diz
respeito à segurança de informações
A falta de certeza absoluta quanto a esterilidade de todas as unidades do lote,
considerando que a análise é realizada em uma amostra representativa (limitação
estatística)
Escopo limitado à detecção de bactérias e fungos – não adequado à detecção de
vírus, micobactérias, micoplasmas, micro-organismos psicrófilos ou termófilos
Além disso:
Demandam
quantidades expressivas de material e equipamentos
tempo longo para detecção (visual) do crescimento microbiano
capacitação técnica
Métodos microbiológicos rápidos aplicáveis ao
Teste de esterilidade
Correspondem:
à automação de métodos existentes
ou
estão baseados em tecnologias novas
Objetivo de oferecer melhorias significativas em termos de rapidez, exatidão,
precisão e especificidade
Crescimento microbiano
Viabilidade microbiana
RMM baseado no crescimento microbiano
Medida de parâmetros bioquímicos ou fisiológicos que refletem o
crescimento microbiano
Bioluminescência do ATP
Fonte: www.celsis.com
Detecção colorimétrica da produção de CO2
Fonte: www.biomerrieux.com
Fonte: www.celsis.com
Bioluminescência do ATP
ATP é um conhecido marcador de viabilidade celular e o potencial de
seu uso para detecção de bactérias foi inicialmente descrito por Levin e
Chapelle, em 1968
O processo depende de reação enzimática aeróbica entre luciferina, luciferase e ATP,
que emite luz, entre outros produtos, a qual é medida por um luminômetro ou por
câmara com dispositivo de carga acoplada.
Fonte: www.biomerrieux.com
Detecção colorimétrica do CO2
Detecção do CO2 produzido pelo metabolismo ativo dos microorganismos
Frascos de cultura contém um sensor colorimétrico de CO2,
recoberto por uma membrana permeável apenas ao CO2
CO2 gerado atravessa a membrana e atinge o sensor, que
saturado com solução sensível ao pH, tem a cor alterada
de verde para amarelo a medida que o nível de CO2
aumenta. Os detectores produzem sinal proporcional à
intensidade de cor e à concentração de CO2 e os
transdutores eletrônicos mudem as mudanças de pressão
positivas ou negativas provocadas pela produção ou
consumo do gás durante o crescimento microbiano
Fonte: www.biomerrieux.com
RMM baseado na viabilidade celular
Detecção microbiana através do uso de marcadores de viabilidade
(substrato de viabilidade)
Citometria de fase sólida
Fonte: www.aeschemunex.com
Independe da proliferação microbiana
Baseia-se no uso de corantes vitais dos componentes bioquímicos de células
microbianas viáveis
A amostra é escaneada por um detector laser e o número de células marcadas
(fluorescentes) é obtido
Métodos microbiológicos rápidos na indústria farmacêutica
Entre as vantagens dos MMRs podemos citar:
Confiabilidade e especificidade
Rapidez e agilidade na liberação de resultados
Diminuição do número de etapas de trabalho
Diminuição do erro analítico
Melhoria da qualidade dos processos
Redução de custos
A área clínica e a indústria de alimentos estão a frente na aplicação
de MMR em relação à indústria farmacêutica, provavelmente por
uma regulamentação mais restritiva que exige demonstrar a
equivalência aos métodos de referência e o atendimento dos
parâmetros de validação analítica
Validação de MMR
Pode ser realizada segundo procedimentos descritos na USP (Capítulo
<1223>) e demais compêndios farmacopeicos ou no documento PDA
Technical Report 33
Parâmetros de validação
Teste Qualitativo
Teste Quantitativo
Exatidão
Não
Sim
Precisão
Não
Sim
Especificidade
Sim
Sim
Limite de detecção
Sim
Sim
Limite de quantificação
Não
Sim
Linearidade
Não
Sim
Faixa
Não
Sim
Repetibilidade
Sim
Sim
Robustez
Sim
Sim
Equivalência
Sim
Sim
Validação de MMR para Teste de Esterilidade
PDA Technical Report 33, 2010
Micro-organismos teste
Gram +
Gram –
Nível de contaminação
Levedura
20 UFC/mL
Fungo filamentoso
2 UFC/mL
Anaeróbio
0,2 UFC/mL
50 a 100 testes pelo
Esporulado
0,02 UFC/mL
método convencional
Replicatas
50 a 100 testes pelo
método alternativo
Validação de MMR aplicado ao Teste de Esterilidade
Nível de
inóculo
Proporção esperada de
N resultados
positivos em
N=100
negativos
positivos
20
< 0,001
>0,999
100
2
0,135
0,865
87
0,2
0,819
0,181
18
0,02
0,980
0,020
2
Avaliação estatística
Os métodos são equivalentes quando a proporção de
resultados positivos e negativos obtidos em cada um
deles
não
significativa
apresenta
diferença
estatisticamente
Dificuldades na implantação de MMR
Apesar das vantagens, devem ser consideradas algumas dificuldades na
utilização de MMR:
Custo inicial de aquisição das tecnologias
Disponibilidade limitada de alguns insumos específicos
Necessidade de revisão dos critérios regulatórios por agências como
FDA, ANVISA
Treinamento
Necessidade de recursos suficientes e expertise tecnológica para
realização dos estudos de validação e equivalência
Considerações finais
A utilização de MMR corresponde a novas oportunidades na garantia da
qualidade e segurança de uso de produtos farmacêuticos
Uma variedade de novas possibilidades estão sendo disponibilizadas, com vantagens
e dificuldades que devem ser consideradas na escolha da tecnologia mais adequada
à finalidade pretendida.....
..... facilidades, praticidade, rapidez....
..... Porém nenhuma tecnologia será tão perfeita que irá prescindir da avaliação dos
dados por um microbiologista!
Adriana Bugno
Centro de Medicamentos, Cosméticos e Saneantes
Instituto Adolfo Lutz
Av. Dr. Arnaldo, 355 – Cerqueira Cesar
São Paulo/SP
Tel/Fax: 11 30682926
[email protected]