LIDIANE ROBERTA CRUZ DA SILVA
FUNGOS ISOLADOS DE CULTIVOS DO CAMARÃO Litopenaeus
vannamei BOONE E CARACTERIZAÇÃO QUANTO A PRODUÇÃO
DE QUITINASE, PROTEASE E AFLATOXINA
RECIFE
Fevereiro, 2009.
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE MICOLOGIA
PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA DE FUNGOS
FUNGOS ISOLADOS DE CULTIVOS DO CAMARÃO Litopenaeus vannamei
BOONE E CARACTERIZAÇÃO QUANTO A PRODUÇÃO DE QUITINASE,
PROTEASE E AFLATOXINA
LIDIANE ROBERTA CRUZ DA SILVA
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Biologia de Fungos do
Departamento de Micologia do Centro de
Ciências Biológicas da Universidade
Federal de Pernambuco, como parte dos
requisitos para a obtenção do título de
Mestre em Biologia de Fungos.
Área de Concentração: Micologia Aplicada
Orientador: Profª. Drª. Cristina
Maria de Souza Motta
Co-orientador: Profª. Drª. Ana
Lúcia Figueiredo Porto
RECIFE
Fevereiro, 2009.
Silva, Lidiane Roberta Cruz da
Fungos isolados de cultivos do camarão Litopenaeus vannamei Boone
e caracterização quanto a produção de quitinase, protease e aflatoxina /
Lidiane Roberta Cruz da Silva. – Recife: O Autor, 2009.
97 folhas : il., fig., tab.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal de
Pernambuco. CCB. Pós-Graduação em Biologia de Fungos, 2009.
Inclui bibliografia.
1. Fungos 2. Camarão – Criação 3. Proteínas 4. Enzimas
proteolíticas I. Título.
579.5
CDD (22.ed.)
UFPE/ CCB – 2010- 066
Vem me pedir
além do que eu posso dar
É aí que o aprendizado está
Vem de onde não sonhei
me presentear...
Quando chega o fim da linha
e já não há aonde ir
Num passe de mágica
A vida nos traz sonhos pra seguir
Queima meus navios
pr'eu me superar
às vezes pedindo
que ela vem nos dar
o melhor de si
E quando vejo,
a vida espera mais de mim
mais além, mais de mim
O eterno aprendizado é o próprio fim
Já nem sei se tem fim!!!
De elástica, minha alma dá de si
Mais além, mais de mim
Cada ano a vida pede mais de mim...
Jorge Vercilo
DEDICO A Deus de infinita bondade e misericórdia, que me guia e ilumina sempre. Aos meus pais Roberto (in memorian) e Célia pelos valores transmitidos e incansável amor e a minha doce avó Chica (in memorian) por todo amor, zelo e companheirismo materno, minha eterna saudade. ______________________________________________________________________ OFEREÇO À minha filha Brennda Heloísa e ao meu amado esposo Paulo Freitas, luz e razão da minha vida. Amo vocês! _______________________________________________________________________ AGRADECIMENTOS
A Deus pelas bênçãos derramadas sobre mim e por cumprir mais uma promessa em minha vida.
Ao Profº Drº Paulo Antônio Padovan, pelos ensinamentos, carinho, confiança e incentivo a minha
jornada científica.
Ao Profº Severino do Monte Prazeres (in memorian) pelo exemplo de amor ao ensino, deixando-me
valores que incorporei e os levarei sempre comigo.
À Profª Drª Norma Buarque de Gusmão que me recebeu em seu laboratório, despertando em mim o
amor pelo “fantástico mundo dos fungos”.
À minha querida orientadora Profª Drª Cristina Maria de Souza-Motta, pelos ensinamentos,
paciência e amizade incansáveis.
Às professoras Débora Maria Massa Lima e Maria José dos Santos Fernandes pela enorme
colaboração e identificação de muitos de meus fungos.
À minha querida co-orientadora Profª Drª Ana Lúcia Figueiredo Porto, pela colaboração no
desenvolvimento da pesquisa.
À Profª Drª Rosalie Reed Rodrigues Coelho, pela colaboração e carinhosa atenção, principalmente
durante o início do desenvolvimento do trabalho.
À Profª Drª Oliane Magalhães, pelas orientações, atenção e carinho sobretudo durante o processo
de seleção de mestrado.
À Profª Drª Rejane Pereira Neves, pela torcida, ensinamentos e amizade.
A todos os professores do Programa de Pós Graduação em Biologia de Fungos que contribuíram
diretamente em minha formação. Um privilégio ter vocês como mestres.
Ao meu amado esposo Paulo Freitas, pelo amor paciente, cumplicidade e parceria durante todos os
momentos de realização deste trabalho. Sem você ficaria difícil conseguir!
À minha amada filha Brennda Heloísa, pela admiração, companheirismo e amor sempre.
Aos familiares que sempre me apoiaram e incentivaram, minha mãe, minha filha, meu Paulo, meu
tio “Biu” e minha irmã Cybelle.
Aos amigos da Micoteca-URM, por todos os momentos compartilhados, auxílio, carinho e
paciência: Carlos, Eliane, Hanilma, Herbert Leonardo, Jadson, Kaliny, Liana, Marília, Minelli,
Odacy, Paula, Polyanna, Raquel, Sthefânia, Taísa, Tatiane, Telma, Tereza e Virgínia.
Ao CNPq pela bolsa de estudos concedida durante meus dois anos de estudo.
A todos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste trabalho.
FUNGOS ISOLADOS DE CULTIVOS DO CAMARÃO Litopenaeus vannamei
BOONE E CARACTERIZAÇÃO QUANTO A PRODUÇÃO DE QUITINASE,
PROTEASE E AFLATOXINA
RESUMO
Na carcinicultura Litopenaeus vannamei é a espécie mais cultivada no Nordeste brasileiro. Os
objetivos desta pesquisa foram avaliar a capacidade quitinolítica e proteolítica e produção de
aflatoxinas por fungos isolados da água de viveiros e dos camarões L. vannamei cultivados em duas
fazendas no Rio Grande do Norte, Brasil. Para o isolamento, amostras de água e do camarão foram
plaqueadas em ágar Sabouraud acrescido de cloranfenicol contido em placas de Petri. Após 72 horas,
as colônias foram transferidas para meios de cultura específicos para identificação. Foram obtidos
146 isolados, pertencentes a 46 espécies. Os gêneros mais representativos foram Aspergillus e
Penicillium, além de Phaeoannellomyces werneckii, Rhinocladiella aquaspersa, Syncephalastrum
racemosum e outros fungos oportunistas. Foram avaliadas a capacidade quitinolítica, proteolítica e
produção de aflatoxina B1. A maioria das espécies apresentou capacidade proteolítica. Dentre os
substratos utilizados para detecção da capacidade em degradar quitina o que apresentou melhores
resultados foi a carapaça de camarão adicionada de sais, sendo uma importante alternativa para
selecionar fungos quitinolíticos. A. fumigatus, A. niveus, A. parasiticus, Penicillium lividum e S.
racemosum foram excelentes decompositoras de quitina em meio líquido, liberando Nacetilglicosamina após 96h de fermentação, sendo indicadas para serem aplicadas em processos
biotecnológicos. Dentre trinta e três isolados testados, vinte e um de A. flavus e três de A. parasiticus
foram capazes de produzir aflatoxina B1, sendo todas procedentes da fazenda com sistema de cultivo
inorgânico.
Palavras-chave: Fungos, Litopenaeus vannamei, quitinase.
FUNGI ISOLATED FROM CULTURE OF SHRIMP Litopenaeus vannamei BOONE AND
CHARACTERIZATION ON THE PRODUCTION OF CHITINASES, PROTEASES AND
AFLATOXIN
ABSTRACT
In shrimp Litopenaeus vannamei is the species most cultivated in the Brazilian Northeast. The
objectives of this research were to evaluate the ability and proteolytic chitinolytic and production of
aflatoxins by fungi isolated from water in nurseries and shrimps L. vannamei cultured in two farms
in Rio Grande do Norte, Brazil. For the isolation, samples of water and the shrimp were plated on
Sabouraud agar plus chloramphenicol contained in Petri dishes. After 72 hours, the colonies were
transferred to culture media for specific identification. 146 isolates were obtained, belonging to 46
species. The most representative genera were Aspergillus and Penicillium, and Phaeoannellomyces
werneckii, Rhinocladiella aquaspersa, Syncephalastrum racemosum and other opportunistic fungi.
We evaluated the ability chitinolytic, proteolytic and production of aflatoxin B1. Most species had
proteolytic capacity. Among the substrates used to detect the ability to degrade chitin which showed
better results was the carapace of shrimp added salts, and an important alternative to select
quitinolíticos fungi. A. fumigatus, A. niveus, A. parasiticus, Penicillium lividum and S. Racemosum
were excellent decomposers of chitin in liquid medium, releasing N-acetilglucosamine after 96h of
fermentation, and indicated to be applied in biotechnological processes. Among thirty-three isolates
tested, twenty-one plus and three A. parasiticus were able to produce aflatoxin B1, are all from the
farm system with artificial feeding.
Key-words: Fungi, Litopenaeus vannamei, chitinases.
LISTA DE FIGURAS
Páginas
Figura 1
Camarão Litopenaeus vannamei Boone com aproximadamente
200 dias.
18
Figura 2 Fazenda de criação com sistema de alimentação artificial situada
19
no município de Canguaretama-RN/Brasil.
Figura 3
Fazenda de criação com sistema de alimentação orgânica situada
20
no município de Tibau de Sul/RN-Brasil.
Figura 4 Estrutura primária da quitina.
24
Figura 5
Estrutura química da Aflatoxina B1.
29
LISTA DE TABELAS
Páginas
Tabela 1
Dados de produção da carcinicultura brasileira por estado
21
em toneladas.
Tabela 2
Principais Mercados Importadores de Camarão nos anos
2000 e 2006.
21
SUMÁRIO
Páginas
1
INTRODUÇÃO GERAL
13
1.1 AQUICULTURA
14
1.2 CARCINICULTURA
15
1.3 O CAMARÃO Litopenaeus vannamei Boone
16
1.4 TIPOS DE ALIMENTAÇÃO NOS SISTEMAS
DE CULTIVO
18
1.5 FUNGOS FILAMENTOSOS E LEVEDURAS
ISOLADOS EM ÁGUA
22
1.6 ATIVIDADE QUITINOLÍTICA DE
MICRORGANISMOS
24
1.6.1 QUITINA
24
1.6.2 QUITINASES
25
1.6.3 PRODUÇÃO DE QUITINASES
26
1.7 ATIVIDADE PROTEOLÍTICA DE FUNGOS
27
1.8 AFLATOXINAS
29
1.9 COLEÇÕES DE CULTURAS DE
MICRORGANISMOS
31
2
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
33
3
DIVERSIDADE E DETECÇÃO PROTEÁSICA DE
FUNGOS PRESENTES EM ÁGUA DE VIVEIROS
E NO CAMARÃO Litopenaeus vannamei BOONE,
CULTIVADO EM DUAS FAZENDAS DO RIO
GRANDE DO NORTE, BRASIL
RÁPIDO SCREENING PARA DETECÇÃO DA
CAPACIDADE QUITINOLÍTICA POR FUNGOS,
UTILIZANDO SUBSTRATO DE BAIXO CUSTO
DETECÇÃO DA CAPACIDADE DE PRODUÇÃO
DE AFLATOXINA B1 POR Aspergillus flavus E A.
parasiticus ISOLADOS DA ÁGUA DE VIVEIROS
E DO CAMARÃO Litopenaeus vannamei BOONE,
CULTIVADO EM DUAS FAZENDAS DO RIO
GRANDE DO NORTE, BRASIL
CONCLUSÕES GERAIS
42
4
5
6
69
85
97
Silva, L.R.C. F u n g o s i s o l a d o s d e c u l t i v o s . . .
13
1. INTRODUÇÃO GERAL
Ecologicamente, os fungos são classificados como organismos “redutores”, participando
ativamente dos processos de biodeterioração e biodegradação e atuando desta forma na ciclagem
dos nutrientes e manutenção dos ecossistemas. É através da ação de enzimas produzidas pelos
fungos que a matéria orgânica é transformada em produtos naturais mais simples e assimiláveis
(Mangiarotti & Careta, 1984).
Os fungos filamentosos possuem quitina como principal componente da parede celular e
produzem quitinases em todos os estágios ativos de seu desenvolvimento, desde a germinação de
esporos até o crescimento micelial. Estas enzimas proporcionam maleabilidade às extremidades
apicais das hifas, permitindo assim o crescimento do fungo (Gooday 1990 e 1992; Souza et al.,
2003).
A quitina é um homopolímero linear e insolúvel formado por moléculas de N-acetil-Dglucosamina (Glc-NAc) unidas entre si por ligações β-1,4. Está presente na parede celular da
maioria dos fungos, no exoesqueleto de inúmeros invertebrados, crustáceos, como o camarão, em
algumas algas, moluscos, protozoários e em ovos de nematóides, tornando-se assim, o segundo
biopolímero natural mais abundante da Terra, logo após a celulose (Rattanakit et al., 2002; Chang et
al., 2003; Matsumoto et al., 2004).
Industrialmente as quitinases são empregadas na degradação de resíduos do processamento
de crustáceos e são de extrema importância também no controle biológico de pragas da lavoura, tais
como fungos entomopatogênicos. Desta forma, a utilização de quitinase pode ser uma alternativa
interessante para a reciclagem dos rejeitos da carcinicultura, bem como no manejo de doenças em
plantas sem o impacto negativo dos insumos químicos, que são geralmente caros e podem causar
poluição ambiental e induzir a resistência de microrganismos fitopatogênicos (Chang et al., 2003;
Matsumoto et al. 2004).
As proteases, mais especificamente peptídeo-hidrolases, são enzimas que catalisam a
hidrólise de proteínas, possuem ampla variedade de aplicações, estando entre os três maiores grupos
de enzimas industriais. Constituem um dos mais importantes grupos de enzimas industriais e têm
aplicação em diferentes indústrias, como de alimentos, bebidas, têxtil, farmacêutica e de
detergentes. Estas enzimas são responsáveis por 30% do total de enzimas produzidas no mundo
(Soares et al., 1999).
As aflatoxinas são micotoxinas provenientes do metabolismo secundário, de algumas
espécies de fungos do gênero Aspergillus. Os seres humanos e várias espécies de animais são
Silva, L.R.C. F u n g o s i s o l a d o s d e c u l t i v o s . . .
14
sensíveis aos seus efeitos tóxicos que podem ser agrupados como: agudos, mutagênicos,
neoplásicos e teratogênicos (Harrison et al., 1993). A carcinogênese hepática representa o mais
importante efeito de toxicidade crônica das aflatoxinas. Esta capacidade tem sido demonstrada
extensivamente, sobretudo em relação à AFB1, inclusive em peixes e camarões (Divakaran &
Tacon 2000; Bintvihok et al., 2003; Lopes et al., 2005).
A carcinicultura é o ramo da aqüicultura no qual camarões são cultivados em cativeiro e
vem se destacando mundialmente nas últimas décadas pelo avanço da produção, rentabilidade e
utilização de terras. O camarão é um crustáceo decápode, de abdomem longo, que possui um
exoesqueleto para proteção mecânica e microbiológica, constituído principalmente por quitina e
proteínas. A família de camarão mais utilizada em viveiros é a Penaideae, sendo Litopenaeus
vannamei Boone, a espécie mais cultivada no Nordeste brasileiro, sobretudo no estado do Rio
Grande do Norte (Figueiredo et al., 2003; Ferreira et al., 2004).
Diante do exposto, é de extrema importância o conhecimento de fungos quitinolíticos,
proteolíticos e produtores de aflatoxina B1, que ocorrem em águas de viveiros e no camarão L.
vannamei, cultivado no Rio Grande do Norte, uma área nunca explorada no Brasil quanto a este
aspecto.
1.1 AQÜICULTURA
A aqüicultura é o cultivo de organismos aquáticos sob monitoramento para benefícios
econômicos. Esta atividade consiste na produção de organismos com habitat predominantemente
aquático em qualquer estágio de desenvolvimento (Valenti & Daniels, 2000). De acordo com
Organização das Nações Unidas para Agricultura e Alimentação-FAO (2008), três fatores
caracterizam essa atividade: o organismo produzido é aquático; existe manejo na produção; a
criação é propriedade de alguém, ou seja, não se trata de um bem coletivo como os recursos
pesqueiros explorados.
Esta atividade divide-se em:
▪ Aqüicultura de águas interiores: Piscicultura (peixes), Ranicultura (rãs) e Carcinicultura
(camarões);
▪ Aqüicultura marinha: Cultivo de Moluscos: Miticultura (marisco), Ostreicultura (ostras), outros
(vieiras, berbigões, etc.), Cultivo de Algas, Carcinicultura (camarões) e outros crustáceos
(caranguejos, siris, etc.).
Silva, L.R.C. F u n g o s i s o l a d o s d e c u l t i v o s . . .
15
1.2. CARCINICULTURA
A carcinicultura é o ramo da aqüicultura no qual camarões são cultivados em viveiros (Brito
et al., 2006). No ano 2003, a produção mundial do camarão cultivado em mais de 50 países emergentes
girou em torno de 1.630.800 toneladas, cujo volume anual se mantém em torno de 4.450.000 toneladas,
sendo o hemisfério oriental responsável pela produção de 1.258.000 toneladas correspondentes a 77,14% do
total mundial, sendo o principal centro produtor o Sudoeste da Ásia, que inclui, por ordem de importância:
China, Tailândia, Vietnã, Indonésia, Índia, e Bangladesh. No hemisfério ocidental, a produção de 2003
chegou a 224.400 toneladas, representando 13,76% do total; a diferença de 148.800 toneladas, que representa
9,10%, pertence a outros produtores mundiais. O Brasil, com 89.000 toneladas, consolidou a posição de líder
do hemisfério, superando o Equador e o México, que, radicionalmente, ocupavam o primeiro e o segundo
lugar, respectivamente. Outros países produtores incluem Colômbia, Venezuela, Peru, Panamá, Honduras e
Nicarágua (Carvalho, 2005). Segundo Brito et al. (2006) foi com a introdução da espécie Litopenaeus
vannamei Boone, na década de 90 que a carcinicultura brasileira passou a ter um desenvolvimento
extraordinário.
De acordo com dados da ABCC - Associação Brasileira dos Criadores de Camarão (2008),
a criação de camarão no Brasil é desenvolvida principalmente por nove estados nordestinos e cinco
de outras regiões (Santa Catarina, Paraná, Espírito Santo, Pará e Rio Grande do Sul), sendo os
maiores volumes de produção da região Nordeste, provenientes pela ordem decrescente, do Rio
Grande do Norte, Ceará, Bahia, Pernambuco, Paraíba, Piauí, Sergipe, Maranhão e Alagoas (Tabela
1). Rio Grande do Norte, Ceará, Bahia e Pernambuco detêm 85,80% da produção brasileira. Este
expressivo desenvolvimento deve-se principalmente à introdução da espécie L. vannamei que
facilmente se adaptou às condições naturais típicas do nordeste brasileiro: água, sol e temperaturas
ideais para a sua reprodução (Brito et. al, 2006; Campos & Campos, 2006).
Segundo a ABCC (2008) os principais importadores do camarão produzido no Brasil, além
da União Européia são os Estados Unidos, Japão, Ásia, dentre outros (Tabela 2).
A iniciativa de se cultivar camarão no Brasil partiu do governo do Rio Grande do Norte,
com o objetivo principal de apresentar alternativa econômica para salinas desativadas, criando-se o
projeto Camarão. Por dispor de terras litorâneas baixas, o Rio Grande do Norte situado na
confluência das costas setentrional e oriental do Brasil, apresenta grandes potencialidades para a
produção de camarão marinho, sendo atualmente o maior produtor da região nordeste, o que tem
atraído a atenção de muitos investidores para este estado (Pinheiro et al., 2007).
Silva, L.R.C. F u n g o s i s o l a d o s d e c u l t i v o s . . .
16
Recentemente, com o crescimento do número de fazendas produtoras, verificou-se um
aumento da área física ocupada pela atividade. Além disso, a introdução de novas tecnologias, em
toda a cadeia produtiva, modificou positivamente os níveis de sobrevivência final, proporcionando
incremento na produtividade e, conseqüentemente, na produção total de camarão cultivado no
estado do Rio Grande do Norte (Brito et al., 2006).
No entanto, a rápida expansão do setor tem gerado grande concentração de fazendas de
produção em alguns estuários. A questão da distribuição geográfica das unidades de cultivo
implantadas e em implantação, somada à intensificação dos cultivos, tem levado o setor a
preocupar-se com a capacidade de suporte dos estuários, no que diz respeito à qualidade da água.
Por outro lado, a ameaça constante de doenças exógenas faz com que medidas de biossegurança
necessitem ser efetivamente implantadas (Pinheiro et al., 2007).
1.3 O CAMARÃO Litopenaeus vannamei Boone
O camarão branco L. vannamei Boone (Figura 1), pertence ao grupo dos Artrópodes de
corpo segmentado: cefalotórax mais abdômen, protegido por um exoesqueleto espesso e rígido,
composto principalmente por quitina e proteínas; apresenta apêndices (patas e antenas) articulados.
Possui simetria bilateral: triblásticos, celomados e protostômios (Valenti, 1998).
Há aproximadamente 38.000 espécies de crustáceos catalogadas, que ocorrem nos
ecossistemas aquáticos (dulcícola, marinho e salobro) e terrestres. O camarão L. vannamei está
enquadrado à família Penaideae e ordem Decapoda (Castro & Pagani, 2004).
Esta espécie é exótica no Brasil, tendo como origem as regiões equatorial e tropical do
Pacífico na costa do continente americano. Apresenta uma grande capacidade de adaptação às
variáveis ambientais que envolvem o meio de cultivo (pH, salinidade e alimentação) e está entre as
cinco espécies de camarões marinhos mais cultivados no mundo (Nunes, 2001). Em ambiente
natural pode ser encontrado nas regiões bentônicas cuja profundidade pode atingir até 72 metros
com temperaturas que variam de 26 a 28°C. Sua produção ocorre em alto mar e as pós-larvas
geradas migram para a costa, completando o seu desenvolvimento (Wyban & Sweeney, 1989).
Em termos nutricionais Dall (1992) afirma que o camarão é herbívoro nas primeiras fases
larvais e modifica gradativamente sua nutrição à medida que se desenvolve, tornando-se animais
carnívoros.
Na fase juvenil e adulta são onívoros, alimentando-se principalmente de
microinvertebrados aquáticos e organismos vegetais. Além disso, estes animais apresentam
Silva, L.R.C. F u n g o s i s o l a d o s d e c u l t i v o s . . .
17
comportamento detritívoro, alimentando-se principalmente de material orgânico presente no
substrato (Rosas et al., 2001).
No desenvolvimento desses organismos, a muda ou ecdise, processo comum a todos os
crustáceos, consiste na substituição do exoesqueleto por um novo, no qual ocorre a expulsão da
carapaça (exúvia), necessária para o crescimento corpóreo desses animais. Essa carapaça serve de
proteção mecânica e imunológica para o camarão (Promwikorn et al., 2004).
O cultivo de camarão é geralmente realizado em tanques e/ou viveiros em áreas próximas a
cursos d’água e estuários, o que pode propiciar a degradação ambiental se for realizado de modo
indiscriminado e sem o manejo adequado. O acúmulo de matéria orgânica provenientes de restos de
alimentação e carapaças, podem contaminar tanto a água e o solo do cultivo quanto áreas adjacentes
(Nunes et al., 1996; Paquotte et al., 1998).
Segundo Stickney (2000) o dano ambiental decorrente do cultivo está fortemente associado
aos tipos de cultivos desenvolvidos. Para Stickney, os tipos de cultivos de camarões são
caracterizados em termos de densidade populacional (tamanho da população por unidade de espaço)
e oferta de alimento:
•
Extensivo: sem alimentação adicional e densidade de 1 a 3 animais/m2;
•
Semi-intensivo: com alimentação adicional e densidade de 10 a 50 animais/m2;
•
Intensivo: alimentação exclusiva e densidade populacional de 10 a 50 animais/m2;
•
Super-intensivo: alimentação exclusiva e densidade populacional de até 160
animais/m2.
De acordo com Odum (1988) a densidade populacional é um fator limitante, importante à
sobrevivência dos animais no ambiente natural, porém sua elevação pode acarretar no aumento da
competição intra-específica, maior atração de predadores, surgimento de parasitas como
microrganismos e maior disseminação de doenças na população.
Silva, L.R.C. F u n g o s i s o l a d o s d e c u l t i v o s . . .
18
Figura 1. Camarão Litopenaeus vannamei
Boone com aproximadamente 200 dias.
Fonte: Amasa, 2008.
1.4 TIPOS DE ALIMENTAÇÃO NOS SISTEMAS DE CULTIVO
De acordo com os carcinicultores, existem dois tipos alimentação em viveiros de cultivo de
camarões:
• Alimentação artificial – Neste sistema (Figura 2), os principais elementos da dieta
alimentar dos camarões são a ração balanceada, industrialmente fabricada, composta por
grãos de milho e trigo triturados, aditivados com proteínas, vitaminas, antibióticos e sais e a
artêmia, um microcrustáceo cujos ovos são recolhidos na natureza, comercializados sob a
forma de cistos desidratados e, posteriormente, eclodidos em laboratórios (Brito et al.,
2006). Os náuplios de artêmia, recém eclodidos são ricos em proteínas, lipídios, carboidratos
e ácidos graxos essenciais. Porém não superam todas as necessidades nutricionais das larvas
e pós-larvas, sendo necessário o uso de rações para complementá-las. A ração, principal
item do custo da carcinicultura, incorpora tecnologias de formulação e de processo que lhe
confere atributos nutricionais e físicos, com influência na dieta de engorda do camarão e nos
impactos ambientais provocados pelos restos de nutrientes que se acumulam nos viveiros e
em seus entornos (Campos & Campos, 2006). A qualidade da água dos viveiros é um fator
de extrema importância para o sucesso desta atividade, podendo afetar desde o hábito
alimentar até a própria sobrevivência dos animais no viveiro. Alguns parâmetros precisam
ser monitorados diariamente, como temperatura, pH, oxigênio dissolvido, transparência e
salinidade. O cultivo pode ser comprometido por ocasião de água de qualidade inferior, pois
os camarões estão em ambiente fechado, no caso dos cultivos em viveiros, tendo os
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19
criadores que tornar o ambiente o mais favorável para o bom desenvolvimento dos camarões
durante o ciclo, evitando problemas sérios como mortalidade, lento crescimento, queda da
conversão alimentar que vai cada vez mais aumentar os custos com ração e aparecimento de
doenças que vão diminuir a qualidade do produto (Pinheiro et al., 2007).
Figura 2. Fazenda de criação com sistema de
alimentação artificial situada no município de
Canguaretama-RN/Brasil.
Fonte: Camanor (2008).
• Alimentação orgânica - Segundo Chellapa et al. (2007), este cultivo é realizado apenas por
uma fazenda brasileira (Figura 3), situada no estado do Rio Grande do Norte, onde seus
viveiros são isentos de produtos químicos, pesticidas, transgênicos, antibióticos e
hormônios. Neste sistema os viveiros são mais espaçosos, pois há uma densidade de apenas
6 camarões/m2, diferentemente da maioria das fazendas com sistema inorgânico ou
convencional, em que há densidade de 50 a 60 camarões/m2. O fundo dos viveiros é
fertilizado com húmus de minhoca e uma cobertura biológica formada por algas e
microcrustáceos que servem de alimento aos camarões. Não há adição de ração, havendo
assim o cuidado em reproduzir nos viveiros um habitat semelhante ao habitat natural dos
organismos cultivados, reduzindo o “stress”, proporcionando seu desenvolvimento de forma
saudável e aumentando a capacidade de sobrevivência. Nos primeiros estágios do ciclo de
vida do camarão, o fitoplâncton é o alimento-base de sua dieta e no segundo estágio (zoea),
é preferencialmente baseada em microalgas. Nesta forma de cultivo o carcinicultor não
Silva, L.R.C. F u n g o s i s o l a d o s d e c u l t i v o s . . .
20
monitora as condições físico-químicas da água dos viveiros, pois pretende manter o
ambiente o mais natural possível. Cada animal que se cria ocupa um nicho ecológico dentro
do ecossistema dos viveiros, diminuindo a competição.
Figura 3. Fazenda de criação com sistema de
alimentação orgânica situada no município de
Tibau de Sul/RN-Brasil.
Fonte: Primar Orgânica (2008).
Silva, L.R.C. F u n g o s i s o l a d o s d e c u l t i v o s . . .
21
Tabela 1. Dados de produção da carcinicultura brasileira por estado em toneladas
Estado
REGIÃO NORTE
Pará
REGIÃO NORDESTE
Rio Grande do Norte
Ceará
Bahia
Pernambuco
Paraíba
Piauí
Sergipe
Maranhão
Alagoas
REGIÂO SUDESTE
Espírito Santo
REGIÃO SUL
Santa Catarina
Paraná
Rio Grande do Sul
TOTAL
2004
242
242
70.695
30.807
19.405
7.577
4.351
2.963
2.541
2.543
226
102
370
370
4.597
4.267
310
20
75.904
2005
280
280
61.300
25.000
19.500
6.000
3.600
1.700
2.350
2.800
230
120
350
350
3.070
2.500
550
20
65.000
2006
250
250
63.700
26.400
22.000
6.000
3.850
1.450
1.400
2.300
200
150
50
50
950
480
450
20
65.000
2007
200
200
63.500
27.000
21.500
6.000
3.000
1.200
1.200
3.000
300
300
300
300
1.000
580
400
20
65.000
Fonte: ABCC (2008)
Tabela 2. Principais mercados importadores de camarão nos anos 2000 e 2006
MERCADO
União Européia
Estados Unidos
Japão
Ásia
Outros
Total
Ano2000
Ano2006
(X 1000
Toneladas)
(X 1000
Toneladas)
564,22
345,00
246,60
142,20
112,90
1.410,92
814,48
590,29
301,00
296,00
158,75
2.160,53
Fonte: Eurostat (2008).
Crescimento
médio anual
(%)
6,50
9,36
3,32
13,00
5,34
7,39
Valor/2006
(US$ milhões)
5.165,00
4.115,00
3.490,00
920,00
810,00
14.500,00
Silva, L.R.C. F u n g o s i s o l a d o s d e c u l t i v o s . . .
22
1.5 FUNGOS FILAMENTOSOS E LEVEDURAS ISOLADOS DE ÁGUA
Os fungos desempenham importante papel nos ecossistemas, atuando como sapróbios,
simbiontes ou parasitas de vegetais e animais. Suas estruturas de propagação podem ser encontradas
no ar, em ambientes terrestres, ou aquáticos. (Alexopoulos et al., 1996). Fungos potencialmente
patogênicos já foram isolados de vários ambientes aquáticos (mar, estuário, rios, lagos, lagoas etc.)
e áreas de contato como areia e lama. Entretanto trabalhos com isolamento de fungos em água de
viveiros de camarão são inexistentes. No trabalho de Dabrova et al. (1964), analisando a água do
mar da Califórnia e isolaram várias espécies potencialmente patógenas ao homem: Hormodendrum
(Phialophora) compactum Bonort, Monosporium apiospermum Barclai, Scopulariopsis brevicaulis
(Saac.) Bainer e Sporothrix schenckii Kektoen & Perkins. Além destas, foram isoladas outras
espécies classificadas como de baixo potencial patogênico, pertencentes aos gêneros: Absidia,
Mucor, Penicillium, Rodhotorula e Trichosporon.
Snellman et al. (1988) analisaram amostras de água do oceano Atlântico e do oceano
Pacífico e obtiveram espécies de Acremonium, Alternaria, Aspegillus, Beauveria, Cercosporidium,
Cladosporium, Cunninghamella, Epicoccum, Graphium, Humicola, Penicillium, Scopulariopsis,
Syncephalastrum e Tetracoccosporium.
De acordo com Khulbe et al. (1993) Achlyan debaryana Kanouse, A. klebsiana Kanouse,
Aphanomyces laevis Minden, Saprolegnia declina Humphrey, S. ferax (Gruith) Thuret, S.
parasitica Coker e Pythium sp. causaram grande mortandade em peixes de um lago na Índia.
Ochromis humicola de Hoog & Von Arx (Hyphomycetes) foi isolado de amostras de
tecido muscular de salmão (Salmo solar L.) por Schaumann et. al. (1994). Segundo os autores
esporos desse fungo também podem ser encontrados em águas salgadas.
Analisando amostras de água das torneiras de hospitais e comparando-as com amostras de
água potável residenciais da Grécia, Arvanitidou et al. (1999) observaram a presença de fungos
filamentosos em 104 das 126 amostras de água dos hospitais e a presença de leveduras em 14
amostras. Foi obtido um total de 27 gêneros de fungos filamentosos com destaque para os gêneros
Aspergillus e Penicillium, além de um total de três gêneros de leveduras, com destaque para o
gênero Candida.
Arvanitidou et al. (2000) analisaram a água utilizada em 85 unidades de hemodiálise na
Grécia e isolaram espécies de Aspergillus, Absidia, Acremonium, Alternaria, Aureobasidium,
Basidiobolus, Botrytis, Chaetomium, Cladosporium, Cryptococcus, Chrysosporium, Curvularia,
Geotrichum, Gliogladium, Helmintosphorium,
Mucor, Phoma, Pyrenocheta, Rhizopus,
Silva, L.R.C. F u n g o s i s o l a d o s d e c u l t i v o s . . .
23
Scopulariopsis, Sepedonium, Penicillium, Trichothecium e Verticillium, sendo os gêneros mais
representantivos Penicillium e Aspergillus com 33 e 26 isolados, respectivamente.
Varo et al. (2007), isolaram fungos filamentosos de água utilizada em uma unidade de
hemodiálise na cidade de São Paulo, Brasil, e obtiveram 21 isolados, dentre estes os gêneros
Aspergillus, Cladosporium, Exophiala, Fonsecaea, Fusarium, Micelia Sterilia, Penicillium e
Trichoderma, sendo mais representativos os gêneros Aspergillus e Cladosporium.
Analisando sedimentos aquosos na Índia Katiyar & Kushwaha (2000), obtiveram 183
isolados, pertencentes aos gêneros Acremonium, Aphanoascus, Chrysosporium, Gymnoascus,
Geomyces, Geotrichum, Malbranchea, Microsporum, Myceliophthora e Verticillium.
Molitoris et al. (2000) testaram características fisiológicas, como crescimento em várias
temperaturas e detecção por métodos semi-quantitativos da produção das enzimas protease, amilase,
e celulase por métodos semi-quantitativos, dos primeiros fungos filamentosos isolados do mar
morto, sendo eles: Aspergillus phoenicis, Chaetomium nigricolor, Emericella nidulans,
Gymnascella marismortui, Paecilomyces farinosus, Penicillium variable, P. westligii, Acremonium
sp., Stachybotrys chartarum e Ulocladium chlamydosporum, verificando que os isolados foram
bons produtores de todas as enzimas analisadas.
Masuma et al. (2001) isolaram fungos da água do mar das Ilhas Palau - Micronésia,
obtendo os seguintes gêneros: Aspergillus, Aureobasidium, Chaetomium, Trichoderma e
Penicillium.
Hapcioglu et al. (2005), analisaram amostras de água do sistema de distribuição de água de
um grande hospital em Stambul e detectaram a presença dos gêneros Acremonium, Aspergillus e
Penicillium, além de outros gêneros de fungos não identificados.
Analisando água potável de Portugal, Gonçalves, et. al. (2006) isolaram um total de 340
táxons, no qual prevaleceram os gêneros Penicillium e Acremonium. Além destes gêneros,
Alternaria, Aspergillus, Chaetomium, Cladosporium, Phialophora e Rhizopus foram isolados.
Cavalcanti & Milanez (2007), analisando água dos açudes Vale do Prata e do Meio, na
Reserva Florestal de Dois Irmãos, Recife, Pernambuco, Brasil, isolaram as seguintes espécies de
Hyphomycetes:
Curvularia
tuberculata,
Dendrosporium
nymphaearum, Phaeoisaria glauca e Trichurus spiralis.
lobatum,
Dichotomophthoropsis
Silva, L.R.C. F u n g o s i s o l a d o s d e c u l t i v o s . . .
24
1.6 ATIVIDADE QUITINOLÍTICA DE MICRORGANISMOS
1.6.1 Quitina
A quitina foi isolada em 1881 por Braconnot, trinta anos antes do isolamento da celulose,
mas a falta de conhecimento básico sobre suas propriedades, incluindo a reatividade química,
limitou severamente suas aplicações industriais até o início dos anos 1970 (Roberts, 1992).
Quitina é um polímero linear no qual a unidade repetitiva é o dissacarídeo formado por 2acetamido-2-desoxi-D-glicopiranose e 2-amino-2-desoxi-D-glicopiranose unidos por ligação
glicosídica (Figura 4). Assim como na celulose as ligações são do tipo β(1→4), definindo-se assim
os terminais redutor e não-redutor das cadeias poliméricas, os quais correspondem às extremidades
que contêm grupo hidroxila livre ligado ao carbono 1 (terminal redutor) e carbono 4 (terminal nãoredutor) do anel de glicopiranose. A quitina contém uma quantidade pequena, usualmente 5-10%,
de unidades 2-amino-2-desoxi-D-glicopiranose. Segundo Richard (1951), a quitina nativa, tal como
ocorre associada a outros materiais para constituir as carapaças de caranguejos e exoesqueletos de
camarões, é produto natural de composição variável quanto ao comprimento das cadeias, conteúdo
de unidades de glicosamina acetiladas e desacetiladas e sua distribuição ao longo das cadeias.
Adicionalmente, também podem ocorrer variações em função da espécie considerada, bem como do
estágio de desenvolvimento. A única exceção conhecida é a quitina obtida a partir de algas
diatomáceas (Thalassiosira fluviatilis e Cytlotella cryptica), cuja análise revela que se constitui
exclusivamente de unidades 2-acetamido-2-desoxi-D-glicopiranose (Abram & Higuera, 2004).
Figura 4. Estrutura primária da quitina.
Fonte: Polymar (2008).
A quitina é a segunda substância orgânica mais abundante na biosfera sendo superada
apenas pela celulose. Quitina e celulose possuem características estruturais semelhantes e atuam
como invólucros protetores e materiais de suporte e defesa nos organismos em que ocorrem. A
Silva, L.R.C. F u n g o s i s o l a d o s d e c u l t i v o s . . .
25
quitina encontra-se na matriz da estrutura esquelética de invertebrados, como artrópodes, anelídeos,
moluscos e celenterados, e na parede celular da maioria dos fungos (Patil et al., 2000).
Em função do organismo considerado, mas também do papel que desempenha, a quitina
adota estruturas polimórficas denominadas α-, β- e γ-quitina. As configurações dos polímeros
dependerão das características químicas, físicas, como massa molecular (número de unidades por
molécula), conformação e função no organismo. A α-quitina é encontrada em estruturas rígidas e
resistentes, como o exoesqueleto de camarões, e nesses casos ocorre fortemente associada a
proteínas e sais. As formas β- e γ-quitina ocorrem em estruturas flexíveis embora também
resistentes, como é o caso da parede celular dos fungos, nas quais encontramos β-quitina. Nas lulas
do gênero Loligo a α-quitina constitui uma fina capa que reveste as paredes do esôfago e do
estômago, a β-quitina ocorre como o principal componente dos gládios, ou plumas, e a γ-quitina
integra uma espessa cutícula que recobre outras zonas do estômago (Abram & Higuera, 2004).
1.6.2 Quitinases
Quitinases são enzimas que clivam ligações β-1,4 entre unidades de N-acetilglucosaminas
da quitina. As quitinases são produzidas principalmente por organismos que possuem quitina na sua
parede celular ou exoesqueleto como insetos, crustáceos, fungos, algas entre outros (Patil et al.,
2000).
As
enzimas
quitinolíticas
dividem-se
em
endoquitinases
e
exoquitinases.
As
endoquitinases clivam a quitina em posições aleatórias gerando multímeros de N-acetil-Dglicosamina (GlcNAc). As exoquitinases podem ser divididas em dois grandes grupos: as
quitinabiosidade e as β(1,4) N-acetil-glicosaminases. As quitinabiosidases (EC 3.2.1.29) quebram
as extremidades não reduzidas da cadeia de quitina 1,4-β− quitobiosidases liberando
diacilquitobiose. Já as N-acetil-glicosaminases (GlcNAcase, EC 3.2.1.30) utilizam como substrato
as diacetilquitobioses liberando como produto monômeros de GlcNAc (Cannon et al., 1994).
As enzimas microbianas podem ser intracelulares ou extracelulares, as extracelulares, ou
excretadas, são normalmente mais estáveis e produzidas em maiores quantidades em relação às
intracelulares. Estes biocatalisadores têm a função principal de degradar macromoléculas presentes
no meio ambiente, como a quitina e as proteínas, para absorção de seus componentes como
nutrientes (Bon et al., 2008).
Em fungos e crustáceos as quitinases são essenciais para síntese da parede celular e do
exoesqueleto, respectivamente (Patil et al., 2000). Em plantas está relacionada com a defesa contra
Silva, L.R.C. F u n g o s i s o l a d o s d e c u l t i v o s . . .
26
fungos fitopatogênicos. Por outro lado, em fungos, protozoários e invertebrados, a presença de
quitinase está envolvida na morfogênese (Gooday, 1990; Flach et. al., 1992; Sahai & Manocha,
1993; Graham & Sticklen, 1994; Gooday, 1996). Segundo Gooday (1990) mais especificamente em
fungos, as quitinases possuem função na divisão da parede celular, autólise, germinação de esporos,
desenvolvimento de micélios e ramificações, separação de células, nutrição e parasitismo. A
produção desta enzima por fungos pode caracterizar o potencial patogênico da espécie (Lacaz et al.,
2002; Duo-Chuan, 2005).
Industrialmente, as quitinases são empregadas no controle biológico de pragas da lavoura,
como em fungos entomopatogênicos. Além disto, podem ser uma alternativa interessante para a
reciclagem de carapaças de camarões, que na maioria das vezes, são descartadas no meio ambiente,
sem tratamento prévio, causando grandes impactos ambientais (Chang et al., 2003).
1.6.3 Produção de quitinases
Para a detecção da produção de quitinases por microrganismos a quitina comercial pura é o
substrato mais utilizado em trabalhos científicos (Tweddell et al., 1994; Escott et al., 1998; Matsuo
et al., 1999; Giambattista et al., 2001), entretanto trata-se de um substrato de alto custo
(Giambattista et al., 2001). Visando baratear os custos desta metodologia, alguns autores
trabalharam com carapaça de camarão tratada e triturada, como única fonte de carbono e nitrogênio
para o crescimento de microrganismos produtores de quitinase (Wang et. al., 1995, 1997, 1999 e
2002a, 2002b). Este substrato pode ser uma importante ferramenta, quando se pretende otimizar e
maximizar a produção da enzima, atingindo uma produção em escala industrial (Coelho & Pires,
2008).
El-Katatny et al. (2000), testaram quanto à produção de quitinase 24 isolados de
Trichoderma harzianum procedentes de uma coleção de culturas no Egito, e após a seleção do
melhor produtor da enzima, identificaram seu antagonismo contra o fungo fitopatogênico
Sclerotium rolfsii, concluindo que T. harzianum produz quitinase com efeito antagônico contra S.
rolfsii podendo ser utilizada no controle biológico deste parasita.
Analisando a capacidade quitinolítica de Penicillium janthinelllum contra os fungos
fitopatogênicos Fusarium solanii e Cladosporium cladosporioides, Giambattista et al. (2001)
observaram que P. janthinellum produz quitinase capaz de lisar a parede celular destes fungos, a
qual pode ser empregada no controle biológico dos fungos testados.
Kim et al. (2003) avaliaram a produção de quitinase pela bactéria Streptomyces sp. e
observaram seu elevado potencial antifúngico contra o fungo Botrytis cinerea.
Silva, L.R.C. F u n g o s i s o l a d o s d e c u l t i v o s . . .
27
Wang et al. (2002a), testaram a atividade antifúngica de cinco espécies de Monascus
contra Fusarium oxysporum em meio de cultura contendo casca de camarão e comparando-o com
meio basal adicionado de quitina coloidal. Os autores observaram maior atividade antifúngica das
espécies de Monascus em meio contendo casca de camarão triturada.
Duo-Chuan et al. (2005), analisaram a produção de quitinases por Talaromyces flavus,
cultivado na presença de quitina comercial. Segundo os autores, T. flavus produziu dois tipos de
quitinases. As enzimas foram testadas contra a parede celular dos fungos Verticillium dahliae,
Sclerotinia sclerotiorum e Rhizoctonia solani, apresentando excelente capacidade de lise da parede
celular. Além disso, as enzimas foram testadas contra Alternaria alternata, Fusarium moniliforne e
Magnaporthe grisea, os quais tiveram a germinação inibida.
Bougoure & Cairney (2006) testaram o potencial quitinolítico de Hymenoscuphus ericae,
fungo micorrízico associado à Ecapris pulchella, em meio líquido, observando a produção de
endoquitinase e exoquitinase por este fungo.
Novotná et al. (2008), avaliaram a produção de endoquitinase e exoquitinase por
Orpinomyces sp. e Anaeromyces, verificando que os isolados foram melhores produtores de
endoquitinase.
Zhu et al. (2008) clonaram o gene que codifica a quitinase do fungo Verticillium lecanii,
promissor agente no controle do pulgão e da mosca branca.
1.7 ATIVIDADE PROTEOLÍTICA DE FUNGOS
De acordo com Lacaz et al. (2002); Sidrim & Rocha (2004), proteases são enzimas que
catalisam a hidrólise de proteínas. As proteases executam grande variedade de funções nos
organismos vivos, compreendendo a ativação e a participação em cascatas biológicas, como na
digestão, homeostasia e inflamação em diversos sistemas, sendo imprescindíveis para o perfeito
funcionamento celular (Gavrilescu & Chisti, 2005).
Proteases extracelulares são secretadas primariamente para garantirem nutrientes para as
células, porém nos fungos patogênicos, facilitam a adesão e invasão do tecido hospedeiro,
adquirindo papel significante na destruição de membranas e paredes celulares que são compostas,
principalmente, de lipídios e proteínas (Ghannoum, 2000).
Grande número de microrganismos como bactérias, fungos filamentosos e leveduras são
produtores de proteases (Potumarthi et al., 2007). Nos fungos, sua ação é importante tanto para o
Silva, L.R.C. F u n g o s i s o l a d o s d e c u l t i v o s . . .
28
crescimento quanto para a invasão do tecido hospedeiro, bem como para sua disseminação após
ruptura da barreira de proteção tecidual (Sana et al., 2006).
A detecção da atividade enzimática de fungos através de métodos semi-quantitativos é
interpretada pela hidrólise do substrato específico, facilmente evidenciada pela formação de halos
transparentes ou opacos ao redor das colônias (Neder, 1992). Diversos substratos são utilizados em
testes de detecção de proteases: gelatina, soro albumina bovina, caseína, entre outros (Lacaz et al.,
2002).
As proteases fúngicas são aplicadas biotecnologicamente, compreendendo as enzimas de
maior relevância industrial (Gavrilescu & Chisti, 2005), representando cerca de 60% do total de
enzimas comercializadas mundialmente (Sana et al., 2006). Estas enzimas possuem grande
variedade de aplicações, sendo utilizadas em indústrias de alimentos (Casaburi et. al., 2008),
farmacêuticas (Daviet & Colland, 2008), de curtumes (Kumar et al., 2008) e de detergentes
(Mukherjee et al., 2008).
Muhsin et al. (1997) detectaram em 123 isolados de dermatófitos e leveduras a atividade
de protease, elastase, queratinase, lipase e fosfolipase em meio sólido e constataram resultados
variáveis na produção dessas enzimas, sendo a protease produzida apenas pelos dermatófitos.
Assis et al. (1999) investigaram a produção de protease e fosfolipase em 20 isolados de
Paracoccidioides brasiliensis, utilizando soro albumina bovina e gema de ovo, respectivamente,
como substrato. Os resultados mostraram que todos os isolados tiveram a capacidade de produzir
proteinase e fosfolipase.
Chakrabarti et al. (2000) purificaram protease produzida por Aspergillus terreus, utilizando
caseína como substrato. A enzima purificada pertence ao grupo das serina proteases.
Mushsin & Salih (2001) estudaram a atividade de quatro enzimas (protease, queratinase,
lipase e amilase), em 182 isolados de fungos pertencentes aos gêneros Alternaria, Aspergillus,
Chaetomium, Chrysosporium, Curvularia, Dreschlera, Epidermophyton, Geotrichum, Microsporum,
Paecillomyces, Scytalidium e Trichophyton. Os resultados revelaram que a queratinase foi produzida
por todos os fungos, com exceção de P. variottii e S. lignicola, sendo altamente expressada pelas
espécies T. mentagrophytes e M. gypseum. A maioria das espécies não-dermatofíticas revelaram
atividade proteásica maior que a dos dermatófitos, sendo as espécies de Curvularia, as que
mostraram atividade mais alta.
Santos et al. (2001) caracterizaram quanto à produção de protease, fosfolipase e
queratinase, dentre outras enzimas, 53 isolados de Trichophyton rubrum procedentes de São Paulo e
Silva, L.R.C. F u n g o s i s o l a d o s d e c u l t i v o s . . .
29
Florianópolis, Brsail. Os autores observaram que alguns produziram protease, todos os isolados
produziram queratinase, e nenhum produziu fosfolipase.
Khan et al. (2003), detectaram a capacidade da produção de protease por Paecilomyces
lilacinus, além de sua capacidade de produzir quitinase, comprovando que esta espécie pode ser
aplicada no controle biológico contra nematódeos parasitas de vegetais.
Alves et al. (2005) avaliaram a capacidade de produção de proteases extracelulares em 13
isolados de Mucor distribuídos em oito espécies, em três diferentes faixas de pH (ácido, neutro e
básico). Os autores conseguiram detectar elevada atividade proteolítica em todos os isolados, em
cada faixa, um grupo de isolados obteve maior produção.
1.8 AFLATOXINAS
As aflatoxinas são micotoxinas provenientes do metabolismo secundário, de algumas
espécies de fungos do gênero Aspergillus, principalmente A. flavus e A. parasiticus, os quais se
desenvolvem naturalmente em produtos alimentícios, como amendoim, milho, feijão, arroz e trigo,
entre outros. As espécies de Aspergillus, produtoras de aflatoxinas, e a conseqüente contaminação
de grãos e outros alimentos com aflatoxinas são freqüentes em áreas geográficas com clima quente
e úmido. O Brasil, por ser um país de clima predominantemente tropical apresenta condições
favoráveis ao desenvolvimento destes fungos (Rossetto et al., 2005).
Em relação às propriedades físicas e químicas, as aflatoxinas apresentam-se na forma de
cristais com coloração que vai de incolor a amarelo pálido; são muito pouco solúveis em água (10 a
30 μg/mL); são solúveis em solventes orgânicos como clorofórmio, metanol e dimetilsufóxido; são
instáveis sob radiação ultravioleta, na presença de oxigênio e em condições extremas de pH (pH < 3
e pH > 10), e também na presença de agentes oxidantes; pertencem a uma classe de compostos
denominados furanocumarinas e todas apresentam um núcleo cumarina associado com o furano e a
lactona. As quatro toxinas B1, B2, G1 e G2 têm estruturas bastante semelhantes: as aflatoxinas do
grupo B possuem anel ciclopentenona e as do grupo G, lactona insaturada, enquanto as do grupo M
são derivados hidroxilados de B1 e B2 (Figura 5) (Araújo,1995).
Figura 5. Estrutura química da
Aflatoxina B1.
Fonte: Terra Nova Indústria e
Comércio, 2009.
Silva, L.R.C. F u n g o s i s o l a d o s d e c u l t i v o s . . .
30
Atualmente são conhecidos 17 compostos similares, denominados de aflatoxinas, porém os
principais tipos de interesse médico-sanitário são identificados como B1, B2, G1 e G2, dentre estes,
destaca-se a aflatoxina B1, pelo elevado poder toxigênico. A biotransformação da AFB1, em
diversas espécies animais, resulta na produção de M1 e M2. As aflatoxinas M1 e M2 foram isoladas
inicialmente no leite e urina de animais que consumiram alimentos contaminados por AFLs
(Oliveira & Germano, 1997).
Os seres humanos e várias espécies de animais são sensíveis aos seus efeitos tóxicos que
podem ser agrupados como agudos, mutagênicos, neoplásicos e teratogênicos (Harrison et al.,
1993). A carcinogênese hepática representa o mais importante efeito de toxicidade crônica das
aflatoxinas. Esta capacidade tem sido demonstrada extensivamente, sobretudo em relação à AFB1,
inclusive em peixes e camarões (Divakaran & Tacon 2000; Bintvihok et al., 2003; Lopes et al.,
2005).
Divakaran & Tacon (2000), determinaram a quantidade de aflatoxina presente no músculo
e fezes de camarões Penaeus vannamei, cultivados em tanques. Os camarões foram alimentados
com dietas contendo três níveis de aflatoxina B1 (300, 400 e 900 ppb) durante oito semanas.
Através do uso de cromatografia, foram analisados músculos e fezes dos animais, sendo detectada 2
ppb de aflatoxina B1 apenas no músculo. Os autores concluíram que a toxicidade em seres humanos
através do consumo de camarões alimentados com ração contaminada é limitada.
De acordo com Dorner & Cole (2002), Aspergillus flavus e A. parasiticus acometem
plantações durante o período de maturação do campo ou após a colheita, liberando aflatoxinas,
sobretudo se o vegetal apresenta alguma lesão ocasionada por insetos. As culturas comumente
acometidas são milho, amendoim, algodão dentre outros. O uso de alimentos contaminados por
aflatoxina para fabricar rações, tem sido relatado como um problema importante e com sérias
implicações econômicas para a indústria avícola, bem como de outras espécies de interesse
econômico (Batina et al., 2005).
Bintvihok et al. (2003) analisaram 150 amostras de camarão tigre preto Penaeus monodon,
das regiões leste e sul da Tailândia, alimentados com ração contaminada por aflatoxina B1 (AFB1).
Dividiram os camarões em três grupos, além de um grupo controle. Os animais foram alimentados
durante 10 dias com ração contendo, para cada grupo, 5, 10 ou 20 ppb de AFB1. Após os dez dias
da dieta, os camarões foram pesados e sacrificados para exame laboratorial. No músculo dos
camarões dos grupos testados, não foram detectados AFB1 nem seus metabólitos, porém na
hemolinfa do hepatopâncreas dos grupos contaminados, foram encontradas alterações bioquímicas,
além da taxa de mortalidade destes camarões ter sido mais alta do que a dos camarões controle. Os
Silva, L.R.C. F u n g o s i s o l a d o s d e c u l t i v o s . . .
31
autores concluíram que em sistema de cultivo camarões alimentados com ração contaminada por
aflatoxina pode haver diminuição da produção, causando perdas econômicas.
Lopes et al. (2005), avaliaram o efeito das aflatoxinas sobre o crescimento de alevinos de
jundiá Rhamdia quelen e a deposição no fígado e no músculo de peixes alimentados com ração com
diferentes teores da micotoxina. Foram utilizados 960 alevinos, em dois experimentos, o primeiro
os teores de 41, 90 e 204 ppb de aflatoxinas kg-1 e o segundo, 350, 757 e 1.177 ppb de aflatoxinas
kg-1 de alimento. Os autores concluíram que a concentração de aflatoxinas de 204 ppb kg-1 de ração por
45 dias, causa redução no crescimento de alevinos de jundiá. Concentrações de aflatoxinas de 350, 757 e
1.177 ppb kg-1 de ração, com ingestão por 35 dias, provocam alterações macroscópicas no fígado.
Concentrações de aflatoxinas superiores a 350 ppb kg-1 de ração acarretam deposição residual no fígado e nos
músculos do peixe.
1.9 COLEÇÕES DE CULTURAS DE MICRORGANISMOS
Os microrganismos são essenciais para o meio ambiente, contribuindo para a estabilidade
de ecossistemas, atuando em diferentes níveis tróficos, em interações bióticas e abióticas em todos
os ecossistemas aquáticos ou terrestres. Estes constituem a principal forma de ciclagem de
compostos químicos na biosfera, incluindo a degradação e a transformação de poluentes industriais
(Tiedje, 1994). Nas indústrias, a grande maioria dos processos biotecnológicos empregados na
produção de compostos comerciais ou na transformação de substratos em produtos de maior valor
agregado emprega linhagens microbianas (Bull et. al., 1992).
A compreensão do papel de microrganismos no meio ambiente fornece subsídios para o
desenvolvimento de aplicações biotecnológicas, além de ser fundamental no estabelecimento de
políticas de biossegurança, de projetos em agricultura sustentável e de programas de
desenvolvimento industrial (Canhos et al., 1999).
Coleções de culturas são centros de excelência de conservação ex-situ, que mantêm e
estudam um “pool” genético para gerações futuras, oferecendo serviços fundamentais para a
comunidade científica e tecnológica (Canhos, 2003).
A Coleção de Culturas - Micoteca URM, do Departamento de Micologia, do Centro de
Ciências Biológicas, da Universidade Federal de Pernambuco, foi fundada em 1954, pelo Professor
Augusto Chaves Batista e está registrada no Commonwealth Mycological Institute (CMI) sob a
sigla URM (University Recife Mycologia). É filiada ao World Federation for Culture Collection
(WFCC) sob o número 604, sendo citada em vários catálogos, destacando-se os do American Type
Silva, L.R.C. F u n g o s i s o l a d o s d e c u l t i v o s . . .
32
Culture Collection (ATCC) nos Estados Unidos, do Institute for Fermentation em Osaka no Japão
(IOF) e do World Data Center for Microorganisms (WDCM) no Japão (Cavalcanti et al., 1996).
O acervo da Micoteca URM consta de aproximadamente 9000 culturas de fungos, sendo
cerca de 1.600 leveduras e 7.400 fungos filamentosos, provenientes dos mais diversos substratos,
todas identificadas ao nível de espécie e mantidas em duplicata por dois métodos de preservação
(Micoteca URM, 2008).
Atualmente, a Micoteca URM está caracterizando culturas de fungos pertencentes ao
acervo quanto à produção de metabólitos de interesse para agricultura, industrial, farmacêutico e
ambiental. São incorporadas ao acervo culturas identificadas ao nível de espécie procedentes de
diversos ambientes, substratos e hospedeiros (Micoteca URM, 2008).
Silva, L.R.C. F u n g o s i s o l a d o s d e c u l t i v o s . . .
33
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Silva, L.R.C. F u n g o s i s o l a d o s d e c u l t i v o s . . .
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3 DIVERSIDADE E DETECÇÃO PROTEÁSICA DE FUNGOS PRESENTES EM ÁGUA
DE VIVEIROS E NO CAMARÃO Litopenaeus vannamei BOONE, CULTIVADO EM DUAS
FAZENDAS DO RIO GRANDE DO NORTE, BRASIL
ARTIGO SUBMETIDO EM 06/12/2008 A AQUACULTURE
Silva, L.R.C. F u n g o s i s o l a d o s d e c u l t i v o s . . .
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Diversidade e detecção proteásica de fungos presentes em água de viveiros e no camarão
Litopenaeus vannamei Boone, cultivado em duas fazendas do Rio Grande do Norte, Brasil
*Lidiane Roberta Cruz da Silva, Odacy Camilo de Souza, Débora Maria Massa Lima, Maria José
Fernandes, Cristina Maria de Souza-Motta
Departamento de Micologia, Centro de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Pernambuco,
Recife, Pernambuco, Brasil
* Autor correspondente: Lidiane Roberta Cruz da Silva.
Endereço: Rua João Manoel, nº 91, Curado II, Jaboatão dos Guararapes, PE, Brasil. Cep 54220715.
Telefone: (+5581) 3452-0593
Fax: (+5581) 3255-9115
E-mail address: [email protected], [email protected]
Silva, L.R.C. F u n g o s i s o l a d o s d e c u l t i v o s . . .
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Resumo
O Brasil é atualmente o segundo maior produtor de camarão do ocidente, sendo a espécie
Litopenaeus vannamei Boone a mais cultivada no nordeste brasileiro. Este crustáceo quando
cultivado em viveiros é muito susceptível a doenças causadas por agentes como vírus, bactérias,
protozoários, fungos que se propagam muito rapidamente em suas populações, afetando
acentuadamente a produtividade, e preocupando os criadores. Há relatos de estudos de bactérias,
vírus e protozoários em camarões, sendo inexistentes os estudos sobre fungos em água de viveiros e
em camarões. Os fungos são classificados como organismos redutores, participando ativamente dos
processos de biodeterioração e biodegradação, através da liberação de enzimas sobre o substrato. A
carapaça do camarão é constituída basicamente por quitina, proteína e lipídio. Proteases são
enzimas produzidas por fungos que degradam proteínas, podendo facilitar assim, a sua adesão e
invasão no tecido hospedeiro, adquirindo papel significante na destruição das membranas celulares
que são compostas, principalmente, de proteínas e lipídeos. A capacidade proteolítica que algumas
espécies de fungos possuem é considerada um fator indicativo de patogenicidade. O objetivo deste
trabalho foi conhecer a micota presente em água de viveiros e em camarões de duas fazendas
brasileiras. Os camarões alimentados de modo inorgânico em uma das fazendas e de modo orgânico
na outra fazenda. A capacidade proteolítica destes fungos foi avaliada, sugerindo um fator de
patogenicidade aos camarões. Foram obtidos 146 isolados de fungos, sendo 46 espécies
identificadas. Não houve similaridade entre as espécies de diferentes viveiros de uma mesma
fazenda, nem entre as fazendas estudadas. A maioria das espécies isoladas é descrita na literatura
como potencialmente patógenas ao homem e a outros animais. Das 46 espécies, 33 produziram
protease, sugerindo que estes fungos estão com o metabolismo secundário em atividade, podendo se
tornar patógenos aos camarões e conseqüentemente a seus consumidores.
Palavras-chave: camarão, Litopennaeus vannamei, fungos, água, protease.
Silva, L.R.C. F u n g o s i s o l a d o s d e c u l t i v o s . . .
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Introdução
A carcinicultura é o ramo da aqüicultura no qual camarões são cultivados em cativeiro,
sendo o Brasil segundo maior produtor ocidental, principalmente por deter características naturais
que favorecem esta atividade por sua posição geográfica, clima, água, tecnologia e grande mercado
consumidor. A família de camarão mais utilizada em viveiros é a Penaideae, sendo Litopenaeus
vannamei Boone, a espécie mais cultivada no Nordeste brasileiro, sobretudo no estado do Rio
Grande do Norte (Campos et al., 2007).
O camarão cultivado em viveiros é muito susceptível a doenças - causadas por agentes
como vírus, bactérias, protozoários, fungos que se propagam muito rapidamente em suas
populações, afetando acentuadamente a produtividade, e preocupando os criadores. Entretanto,
poucos estudos são realizados no sentido de investigar os agentes que acometem este invertebrado,
sendo conhecidos apenas alguns vírus, bactérias e protozoários (Pontes & Arruda, 2005), sendo
raros ou inexistentes os estudos sobre fungos em camarões.
Ecologicamente, os fungos são classificados como organismos redutores, participando
ativamente dos processos de biodeterioração e biodegradação e atuando desta forma na ciclagem
dos nutrientes e manutenção dos ecossistemas. É através da ação de enzimas produzidas pelos
fungos que a matéria orgânica é transformada em produtos naturais mais simples e assimiláveis
(Mangiarotti & Caretta, 1984). Por outro lado, várias espécies são patógenas, causando doenças nas
plantas, no homem e em outros animais (Alexopoulos et al., 1996).
Dentre os principais grupos de enzimas produzidas por fungos, destacam-se o das
proteases. Estas representam uma classe de enzimas com importantes papéis em processos
fisiológicos e biotecnológicos (Gouka et al., 1997). Alguns fungos secretam proteases
primariamente para garantirem nutrientes para as células; entretanto, nos fungos patogênicos estes
metabólitos facilitam a adesão e invasão no tecido hospedeiro, adquirindo papel significante na
destruição das membranas celulares que são compostas, principalmente, de proteínas e lipídeos
(Ghannoum, 2000).
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46
Em viveiros inorgânicos, o camarão alimenta-se de ração em cuja composição estão
presentes farelo de milho, soja e trigo, entre outros. Estes grãos, quando mal condicionados, podem
ser contaminados por espécies de fungos com potencial patogênico. Já nos viveiros orgânicos, os
camarões são alimentados com algas e pequenos crustáceos, reproduzindo similarmente o habitat
natural destes animais, o que possivelmente pode abrigar uma comunidade fúngica peculiar (Pontes
& Arruda, 2005).
Com a finalidade de conhecer a micota de água de viveiros e dos camarões, os objetivos
deste trabalho foram isolar, purificar e identificar fungos presentes na água de viveiros e no
camarão Litopenaeus vannamei Boone, cultivado no Rio Grande do Norte, Brasil, proceder estudo
comparativo entre as espécies isoladas em uma fazenda com sistema de alimentação artificial e
outra com sistema de alimentação orgânica, bem como detectar a capacidade proteolítica destes
fungos, avaliando assim seu possível potencial patogênico.
2. Materiais e métodos
2.1 Coleta de amostras de água e dos camarões
Foram analisadas amostras de água de viveiros de camarão jovem com até 10 dias de
desenvolvimento pós-larva e de camarão adulto com aproximadamente 202 dias de
desenvolvimento, bem como do camarão adulto de duas fazendas de criação, uma com sistema de
alimentação artificial e outra com sistema de alimantação orgânica, localizadas nos municípios de
Canguaretama e Tibau do Sul - Rio Grande do Norte-Brasil, respectivamente.
Foram realizadas três coletas por fazenda e em cada coleta, três amostras de água, de
pontos eqüidistantes de cada viveiro estudado, totalizando 6 amostras de água por coleta e uma
amostra dos camarões adultos. As coletas foram realizadas em maio, agosto e dezembro de 2007.
As amostras de água e dos camarões foram coletadas em recipientes previamente esterilizados e
transportadas para o Laboratório da Coleção de Culturas Micoteca URM, do Departamento de
Micologia da Universidade Federal de Pernambuco, sendo manipuladas no mesmo dia.
Silva, L.R.C. F u n g o s i s o l a d o s d e c u l t i v o s . . .
47
Os camarões coletados em cada fazenda possuíam características da espécie e não
apresentavam lesões externas.
2.2 Isolamento dos fungos da água e dos camarões
Para o isolamento dos fungos da água dos viveiros foi semeado, em triplicata, 1 ml de cada
amostra na superfície do meio de cultura ágar Sabouraud, acrescido de cloranfenicol (50 mg/l)
contido em placas de Petri (Ali-Shtayeh et al., 2003).
Para o isolamento dos fungos dos camarões, foram pesados 25 g de camarões inteiros
suspensos em 225 mL de água destilada esterilizada e após agitações foram semeados, em triplicata,
0,1 mL de cada amostra da água de suspensão na superfície do meio de cultura ágar Sabouraud,
acrescido de cloranfenicol (50 mg/l) contido em placas de Petri (Lacaz et al., 2002).
As placas foram mantidas a temperatura ambiente (T.A 28ºC ±2ºC), até o crescimento dos
fungos, por aproximadamente 10 dias.
2.3 Purificação dos fungos
Para purificação, após o crescimento dos fungos, fragmentos das colônias foram
transferidos separadamente para meio ágar Sabouraud acrescido de cloranfenicol (50 mg/L) contido
em placas de Petri. Após a confirmação da pureza, os fungos foram transferidos para meios
específicos ágar Czapeck (sacarose 30 g, nitrato de sódio 3,0 g, sulfato de magnésio 0,5 g, cloreto
de potássio 0,5 g, sulfato ferroso 0,01 g, fosfato de hidrogênio di-potássio 1,0 g, ágar 16,0 g, água
destilada 1000 mL) (Pitt, 1988), Batata Dextrose ágar (batata inglesa 140,0 g, glicose 20,0 g, ágar
16,0 g, água destilada 1000 mL) (BDA) e ágar Extrato de Malte (dextrose 20,0 g, peptona 1,0g,
extrato de malte 20,0 g, ágar 16,0 g, água destilada 1000 mL.) (Lacaz et al., 2002), contidos em
tubos de ensaio.
2.4 Identificação dos fungos
Para identificação, foram observadas características macroscópicas (coloração, aspecto e
diâmetro das colônias) e microscópicas (microestruturas somáticas e reprodutivas) de acordo com
literatura especializada (Carmichael et al., 1980; Domsch et al., 1993; Ellis, 1971, 1976; Klick,
Silva, L.R.C. F u n g o s i s o l a d o s d e c u l t i v o s . . .
48
2002; Pitt, 1988, 1991; Raper & Fennel, 1977; Rifai, 1969; Samson, 2004; Leslie & Summerell,
2006) através de cultivo sob lamínula (Ridell, 1950), e para identificação de espécie de Aspergillus
e Penicillium, os isolados foram inoculados no centro do meio ágar Czapeck contido em placas de
Petri e mantidos a temperatura ambiente por até 10 dias. Em seguida, foram montadas lâminas,
utilizando azul de Aman como corante e as microestruturas, observadas ao microscópio de luz. A
identificação das espécies de levedura foi procedida de acordo com Barnet et al. (2000) e Lacaz et
al. (2002).
2.5 Avaliação da similaridade
Para avaliar o grau de similaridade entre as espécies isoladas na água dos viveiros e do
camarão das duas fazendas, foi utilizado o Coeficiente de Sorensen (Ss= 2a/b+c; onde a = número
de espécies comuns em dois viveiros/camarões, b= número de espécies no viveiro/camarão da
fazenda I e c= número de espécies no número de espécies no viveiro/camarão da fazenda II) (Zar,
1999).
2.6 Detecção da capacidade proteolítica dos fungos isolados da água e dos camarões
Fragmentos das culturas foram transferidas com o auxílio de uma alça de platina para o
centro do meio de caseína (leite desnatado 50g, ágar 10g e de água destilada 1000 mL), contido em
placa de Petri, e incubadas a TA durante 10 dias. A atividade proteolítica foi evidenciada pela
formação de halo transparente ao redor da colônia. Para distinguir entre a hidrólise da caseína e a
produção de metabólitos ácidos e alcalinos contidos no leite, foi utilizada uma solução acidificada
de cloreto de mercúrio (cloreto de mercúrio 12 g, ácido clorídrico concentrado 16 mL e de água
destilada 100 mL) na placa durante 10 minutos (Lacaz et al., 2002).
3. Resultados
Da água dos viveiros criadouros de camarão e dos camarões adultos, foram obtidos 146
isolados de fungos, destes, 26 foram isolados da água do viveiro de camarão jovem da fazenda I, 27
da água do viveiro de camarão jovem da fazenda II (Tabela 1), 23 da água do viveiro de camarão
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adulto da fazenda I e 19 da água do viveiro de camarão adulto da fazenda II (Tabela 2). Das
amostras do camarão adulto, foram obtidos 26 isolados da fazenda I e 25 da fazenda II (Tabela 3).
Foram identificadas 16 espécies da água do viveiro de camarão jovem da fazenda I e 15 da
água do viveiro de camarão jovem da fazenda II (Tabela 1). Tanto da água do viveiro de camarão
adulto da fazenda I quanto da fazenda II, foram identificadas 12 espécies (Tabela 2). Das amostras
de camarões adultos da fazenda I foram identificadas 16 espécies e dos camarões adultos da fazenda
II, 18 espécies (Tabela 3).
Os gêneros Aspergillus e Penicillium destacaram-se com o maior número de espécies,
ambos com 9, para a fazenda I. Entretanto, para a fazenda II o gênero Aspergillus apresentou o
maior número de 11 (onze). Aspergillus flavus ocorreu em todas as coletas, tanto na água dos
viveiros da fazenda orgânica quanto na água da fazenda inorgânica (Tabela 04).
De acordo com o coeficiente de Sorensen (Ss) não houve similaridade entre as espécies de
diferentes viveiros de uma mesma fazenda, nem entre as fazendas estudadas. (Tabela 05).
Das 46 espécies isoladas, 33 produziram protease. Do gênero Aspergillus apenas A.
fumigatus e A. japonicus não foram produtores. Do gênero Penicillium, apenas P. simplicissimum
não produziu protease (Tabela 06).
Um representante de cada espécie isolada, que após os processos de identificação e
detecção da produção de protease, manteve a capacidade de esporulação, foi incorporado ao acervo
da Micoteca URM da Universidade Federal de Pernambuco, Recife-PE (Tabela 07).
4. Discussão
Trabalhos com isolamento de fungos conidiais, Ascomycota e leveduras em água utilizada
na aquicultura são escassos ou inexistentes, entretanto, resultados similares foram obtidos por
Saraiva (1998), que isolou 31 espécies da água da Lagoa do Araçá, Recife-PE, Brasil, tendo se
destacado os gêneros Aspergillus e Penicillium com 9 e 5 espécies, respectivamente, sendo
Aspergillus flavus a espécie presente em todas as coletas. Analisando a qualidade da água utilizada
Silva, L.R.C. F u n g o s i s o l a d o s d e c u l t i v o s . . .
50
em uma unidade de hemodiálise de Franca-SP, Brasil, Varo et al. (2007), obtiveram 49 isolados,
destacando-se os gêneros Fusarium, Cladosporium e Trichoderma.
A qualidade da água nos sistemas de cultivo do camarão é um fator de extrema
importância para o sucesso desta atividade, podendo afetar desde o hábito alimentar até a própria
sobrevivência dos animais no viveiro. Em viveiros, o fornecimento de alimentos é a principal causa
da diminuição da qualidade da água e do acúmulo de matéria orgânica (Pinheiro et al., 2007), o que
pode explicar a expressiva diversidade de espécies fúngicas isoladas.
Há relatos de estudos sobre a diversidade de vírus (Vidal et al., 2007), bactérias (Cheng et
al., 2005; Moss et al., 2007) e protozoários (Jiménez et al., 2002) que acometem o camarão
Litopenaeus vannamei cultivado em viveiros, porém estudos sobre a micota presente nos viveiros
são raros ou inexistentes.
De acordo com o coeficiente de Sorensen (Ss), só há similaridade entre espécies quando os
coeficientes são iguais ou ultrapassam 50% (Zar, 1999). Não houve similaridade entre as espécies
de diferentes viveiros de uma mesma fazenda, nem entre as fazendas estudadas. Isto pode estar
relacionado com as diferenças nutricionais dos camarões, selecionando as espécies, bem como com
a localização geográfica das fazendas (Tabela 5).
Todas as espécies isoladas, tanto da água quanto dos camarões, possuem o solo como
habitat, podendo tornar-se, dependendo das condições, potencialmente patógenas ao homem e a
outros animais (Hoog et al., 2000; Lacaz et al., 2002).
Aspergillus fumigatus, A. flavus A. niger e A. terreus, são reportados como agentes de
aspergilose pulmonar. A flavus é a mais potente das espécies, produtoras de aflatoxinas,
conseqüentemente carcinogênica (Lacaz et al., 2002). Estas micotoxinas podem contaminar os
camarões e conseqüentemente serem transferidas aos consumidores. Esta espécie ocorreu em todas
as coletas das duas fazendas, tanto na água quanto nos camarões (Tabela 6). Isto provavelmente
ocorreu devido à disponibilidade de matéria orgânica favorável ao desenvolvimento desta espécie.
Silva, L.R.C. F u n g o s i s o l a d o s d e c u l t i v o s . . .
51
Dos camarões alimentados principalmente por ração, foram isoladas espécies
referenciadas como agente etiológico de micoses em humanos: Phaeoannellomyces werneckii,
causador da Tinea nigra e Rhinocladiella aquaspersa, agente etiológico da cromoblastomicose. Dos
camarões alimentados com algas e pequenos crustáceos, dentre outras espécies de relevância
médica, foi isolado Syncephalastrum racemosum, causador de infecção cutânea (Hoog et al., 2000;
Lacaz et al., 2002). Este o primeiro relato de isolamento de fungos conidiais, Ascomycota e
leveduras em água de cultivo e em camarões.
De acordo com Lacaz et al. (2002), proteases são enzimas que catalisam a hidrólise de
proteínas e sua ação é importante tanto para o crescimento do fungo quanto para a invasão do tecido
hospedeiro. A carapaça do camarão é composta principalmente por quitina, proteínas e lipídios. Os
resultados demonstram uma expressiva diversidade de fungos, onde na maioria delas, tanto as da
água quanto dos camarões, foi detectada a atividade proteolítica, sugerindo que estas espécies estão
com o metabolismo secundário ativado, podendo ser possíveis patógenas, tanto aos camarões,
quanto aos seus consumidores.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico (CNPq). Os autores são gratos a Nogueira, E.B.S. e Torres, K.B. pelo apóio técnico.
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55
Tabela 1. Número de isolados das espécies de fungos presentes nas amostras de água dos
viveiros de camarões jovens cultivados no Sistema de Alimentação Artificial (SAA) e
Sistema de Alimentação Orgânico (SAO).
ESPÉCIES
FAZENDA I
FAZENDA II
(SAA)
(SAO)
C1
C2
C3 TI C1
C2
C3 TI Aspergillus caespitosus
-
-
-
0
-
-
1
1
A. flavus
2
1
1
4
1
3
1
5
A. fumigatus
-
3
-
3
3
-
-
3
A. japonicus
1
-
-
1
-
-
1
1
A. niger
-
1
-
1
1
1
-
2
A. niveus
-
-
-
0
1
-
-
1
A. ochraceus
1
-
1
2
-
-
-
0
A. parasiticus
-
-
1
1
1
-
1
2
A. sydowi
-
-
-
0
-
-
1
1
A. terreus
-
-
-
0
1
-
-
1
Aureobasidium pullulans
2
-
-
2
-
-
-
0
Cladosporium
-
1
1
2
3
-
-
3
Eurotium chevalieri
-
-
-
0
-
3
-
3
Fusarium lateritium
2
-
-
2
-
-
-
0
F. moniliforme
2
-
-
2
-
-
-
0
Paecilomyces variotii
1
-
-
1
-
-
-
0
Penicillium chrysogenum
-
-
-
0
-
-
1
1
cladosporioides
Silva, L.R.C. F u n g o s i s o l a d o s d e c u l t i v o s . . .
56
Tabela 1. (Cont.)
FAZENDA I
FAZENDA II
(SAA)
(SAO)
ESPÉCIES
C1
C2
C3 TI C1
C2
C3 TI P. decumbens
-
-
-
0
-
-
1
1
P. funiculosum
-
-
1
1
-
-
-
0
P. griseofulvum
-
-
-
0
-
-
1
1
P. lividum
-
-
1
1
-
-
-
0
P. simplicissimum
1
-
-
1
-
-
-
0
P. waksmanii
-
-
1
1
-
-
-
0
Phaeoanellomyces
1
-
-
1
-
-
-
0
-
-
-
0
-
-
1
1
Total de isolados
13
06
07
26
11
07
09
27
Total de espécies por coleta
09
04
07
07
03
09
Total de espécies por fazenda
16
werneckii
Phialophora radicicola
15
a) C1: coleta 1 (maio/2007); b) C2: coleta 1 (agostot/2007); c) C3: coleta 3 (novembro/2007);
d) (-): não ocorrência da espécie; e) TI= total de isolados.
Silva, L.R.C. F u n g o s i s o l a d o s d e c u l t i v o s . . .
57
Tabela 2. Número de isolados das espécies de fungos presentes nas amostras de água dos viveiros
de camarões adultos cultivados no Sistema de Alimentação Artificial (SAA) e Sistema de
Alimentação Orgânica (SAO).
FAZENDA I
FAZENDA II
(SAA)
(SAO)
ESPÉCIES
C1
C2
C3 TI C1
C2
C3 TI Absidia blakesleeana
-
-
1
1
-
1
-
1
Acremonium fusidioides
1
-
-
1
-
-
-
0
Alternaria alternata
-
-
-
0
-
1
-
1
Aspergillus flavus
4
3
2
9
4
1
1
6
A. ochraceus
-
-
-
0
-
1
-
1
A. oryzae
-
-
1
1
-
-
-
0
A. parasiticus
1
-
-
1
1
-
-
1
A. sydowii
-
1
-
1
-
-
-
0
Cladosporium
-
-
-
0
-
1
-
1
Cunninghamella elegans
-
-
-
0
-
1
-
1
Eurotium chevalieri
-
3
-
3
-
-
-
0
Penicillium
1
-
-
1
1
-
-
1
P. commune
-
-
-
0
-
-
1
1
P. corylophilum
-
-
-
0
-
-
1
1
P. griseofulvum
2
-
-
2
1
2
-
3
cladosporioides
aurantiogriseum
Silva, L.R.C. F u n g o s i s o l a d o s d e c u l t i v o s . . .
58
Tabela 2. (Cont.)
FAZENDA I
FAZENDA II
(SAA)
(SAO)
ESPÉCIES
C1
C2
C3 TI C1
C2
C3 TI P. implicatum
-
1
-
1
-
-
-
0
P. janthinellum
-
1
-
1
-
-
-
0
P. pinophilum
-
-
-
0
-
-
1
1
Phialophora radicícola
-
-
1
1
-
-
-
0
Total de isolados
09
09
05
23
07
08
04
19
Total de espécies por coleta
05
05
04
04
07
04
Total de espécies por fazenda
12
12
a) C1: coleta 1 (maio/2007); b) C2: coleta 1 (agostot/2007); c) C3: coleta 3
(novembro/2007); d) (-): não ocorrência da espécie; e) TI= total de isolados.
Silva, L.R.C. F u n g o s i s o l a d o s d e c u l t i v o s . . .
59
Tabela 3. Número de isolados de espécies de fungos presentes em amostras do camarão adulto
de ambas as fazendas.
FAZENDA I
FAZENDA II
(SAA)
(SAO)
ESPÉCIES
C1
C2
C3 TI C1
C2
C3 TI Aspergillus flavipes
-
-
-
0
-
1
-
1
A. flavus
6
-
-
6
1
2
-
3
A. niger
-
1
-
1
-
-
-
0
A. ochraceus
-
-
-
0
-
1
-
1
A. oryzae
-
-
1
1
-
-
-
0
A. parasiticus
-
-
-
0
1
1
-
2
A. terreus
-
1
-
1
-
-
1
1
Aureobasidium pullulans
-
-
-
0
-
-
2
2
Drechslera rostrata
-
-
-
0
1
-
-
1
Eurotium chevalieri
1
-
-
1
1
-
-
1
Fusarium lateritium
-
-
3
3
-
-
1
1
F. oxysporum
-
1
-
1
-
-
-
0
Mucor hiemalis
-
-
-
0
-
-
1
1
Paecilomyces variotii
-
-
1
1
-
1
-
1
Penicillium
-
-
1
1
-
-
-
0
-
-
-
0
3
-
-
3
aurantiogriseum
P. citrinum
Silva, L.R.C. F u n g o s i s o l a d o s d e c u l t i v o s . . .
60
Tabela 3. (Cont.)
FAZENDA I
FAZENDA II
(SAA)
(SAO)
ESPÉCIES
C1
C2
C3 TI C1
C2
C3 TI P. commune
-
-
-
0
-
2
-
2
P. corylophilum
-
-
1
1
1
-
-
1
P. funiculosum
-
-
1
1
-
-
-
0
P. griseofulvum
-
-
-
0
-
-
1
1
P. waksmanii
3
-
-
3
-
-
-
0
Pestalotiopsis guepinii
-
1
-
1
-
-
1
1
Phaeoanellomyces
1
-
1
1
-
-
-
0
Rhinoclediella aquaspersa
-
-
-
0
-
1
-
1
Rhizopus oryzae
-
-
-
0
-
1
-
1
Rhodotorula glutinis
-
-
1
1
-
-
-
0
Syncephalastrum
-
1
-
1
-
-
-
0
Total de isolados
11
05
10
26
08
10
07
25
Total de espécies por coleta
04
05
08
06
08
06
Total de espécies por fazenda
16
werneckii
racemosum
18
a) C1: coleta 1 (maio/2007); b) C2: coleta 1 (agosto/2007); c) C3: coleta 3
(novembro/2007); d) (-): não ocorrência da espécie; e) TI= total de isolados.
Silva, L.R.C. F u n g o s i s o l a d o s d e c u l t i v o s . . .
61
Tabela 4. Ocorrência de espécies isoladas da água dos camarões jovens e adultos e do camarão
adulto das fazendas com Sistema de Alimentação Artificial (SAA) e Sistema de Alimentação
Orgânica (SAO).
ESPÉCIES
ÁGUA
CJFI
CAMARÕES
CJFII CAFI
CAFII
FI
FII
Absidia blakesleeana
-
-
X
X
-
-
Acremonium fusidioides
-
-
X
-
-
-
Alternaria alternata
-
-
-
X
-
-
Aspergillus caespitosus
-
X
-
-
-
-
A. flavipes
-
-
-
-
-
X
A. flavus
X
X
X
X
X
X
A. fumigatus
X
X
-
-
-
-
A. japonicus
X
X
-
-
-
-
A. niger
X
X
-
-
X
-
A. niveus
-
X
-
-
-
-
A. ochraceus
X
-
-
X
-
X
A. oryzae
-
-
X
-
X
-
A. parasiticus
X
X
X
X
-
X
A. sydowii
-
X
X
-
-
-
A. terreus
-
X
-
-
X
X
Aureobasidium pullulans var.
X
-
-
-
-
X
Cladosporium cladosporioides
X
X
-
X
-
-
Cunninghamella elegans
-
-
-
X
-
-
Drechslera biseptata
-
-
-
-
-
X
pullulans
Silva, L.R.C. F u n g o s i s o l a d o s d e c u l t i v o s . . .
62
Tabela 4. (Cont.)
ESPÉCIES
ÁGUA
CAMARÕES
CJFI
CJFII
CAFI
CAFII
FI
FII
Eurotium chevaliere
-
X
X
-
X
X
Fusarium lateritium
X
-
-
-
X
X
F. moniliforme
X
-
-
-
-
-
F. oxysporum
-
-
-
-
X
-
Mucor hiemalis
-
-
-
-
-
X
Paecilomyces variotii
X
-
-
-
X
X
Pencicillium aurantiogriseum
-
-
X
X
X
-
P. citrinum
-
-
-
-
-
X
P. commune
-
-
-
X
-
X
P. chrysogenum
-
X
-
-
-
-
P. corylophilum
-
-
-
X
X
X
P. decumbens
-
X
-
-
-
-
P. funiculosum
X
-
-
-
X
-
P. griseofulvum
-
X
X
X
-
X
P. implicatum
-
-
X
-
-
-
P. janthinellum
-
-
X
-
-
-
P. lividum
X
-
-
-
-
-
P. pinophilum
-
-
-
X
-
-
P. simplicissimum
X
-
-
-
-
-
Silva, L.R.C. F u n g o s i s o l a d o s d e c u l t i v o s . . .
63
Tabela 4. (Cont.)
ESPÉCIES
ÁGUA
CAMARÕES
CJFI
CJFII
CAFI
CAFII
FI
FII
P. waksmanii
X
-
-
-
X
-
Pestalotiopsis guepinii
-
-
-
-
X
X
Phaeoanellomyces werneckii
X
-
-
-
X
-
Phialophora radicicola
-
X
X
-
-
-
Rhinocladiella aquaspersa
-
-
-
-
-
X
Rhizopus oryzae
-
-
-
-
-
X
Rhodotorula glutinis
-
-
-
-
X
-
Syncephalastrum racemosum
-
-
-
-
X
-
X= ocorrência das espécies; (–) = não ocorrência das espécies; CJFI= camarão jovem fazenda I;
CJFII= camarão jovem fazenda II; CAFI= camarão adulto fazenda I; CAFII= camarão adulto
fazenda II; FI= fazenda I; FII=Fazenda II. Silva, L.R.C. F u n g o s i s o l a d o s d e c u l t i v o s . . .
64
Tabela 5. Coeficiente de similaridade de Sorensen (Ss) relativo às espécies de fungos isoladas da
água dos viveiros e dos camarões nas fazendas I e II.
SUBSTRATO-
AVCJ-I
AVCJ-II
AVCA-I
AVCA-II
CA-I
CA-II
FAZENDA
(%)
(%)
(%)
(%)
(%)
(%)
AVCJ-I
-
43,7
20,6
20,6
30,36
37,5
AVCJ-II
-
-
34,4
29,6
25,80
24,24
AVCA-I
-
-
-
41,6
28,57
28,57
AVCA-II
-
-
-
-
21,42
40,00
CA-I
-
-
-
-
-
41,17
CA-II
-
-
-
-
-
-
a) AVCJ-I: água do viveiro camarão jovem - fazenda I; b) AVCJ-II: água do viveiro camarão
jovem - fazenda II; c) AVCA-I: água do viveiro camarão adulto - fazenda I; d) AVCA-II: água do
viveiro camarão adulto - fazenda II; e) CA-I: camarão adulto fazenda - I; f) CA-II: camarão
adulto fazenda - II. Silva, L.R.C. F u n g o s i s o l a d o s d e c u l t i v o s . . .
65
Tabela 6. Caracterização enzimática das espécies isoladas quanto à habilidade de produzir
protease.
Nº
ESPÉCIE
PROTEASE
1
Absidia blakesleeana Lendn.
+
2
Acremonium fusidioides (Nicot) W. Gams
-
3
Alternaria alternata (Fr.) Keissler
-
4
Aspergillus caespitosus Raper & Thom
-
5
A. flavipes (Bain. and Sart.) Thom
+
6
A. flavus Link
+
7
A. fumigatus Fresenius
-
8
A. japonicus Saito
-
9
A. niger V. Thieg.
+
10
A. niveus Blochwitz
+
11
A. ochraceus Wilhelm
+
12
A. oryzae (Ahlb.) Cohn
+
13
A. parasiticus Speare
+
14
A. sydowii (Bain. & Start.)Thom and Church
+
15
A. terreus Thom
+
16
Aureobasidium pullulans var. pullulans
+
(de Bary) Arn.
17
Cladosporium cladosporioides (Fres) de Vries
+
18
Cunninghamella elegans Lendner
+
19
Drechslera biseptata (Sacc & Roum)
-
20
Eurotium chevaliere L. Mangin
-
21
Fusarium lateritium Nees
-
22
F. moniliforme Wr. & Rg.
-
23
F. oxysporum (Smith) Wr. & Rg.
-
Silva, L.R.C. F u n g o s i s o l a d o s d e c u l t i v o s . . .
66
Tabela 6. (Cont.)
Nº
ESPÉCIE
24
Mucor hiemalis for. Hiemalis Schipper
+
25
Paecilomyces variotii Bain.
+
26
Penicillium aurantiogriseum Dierckx
+
27
P. citrinum Thom
+
28
P. commune Thom
+
29
P. chrysogenum Thom
+
30
P. corylophilum Dierck.
+
31
P. decumbens Thom
+
32
P. funiculosum Thom
+
33
P. griseofulvum Dierck.
+
34
P. implicatum Biourge
+
35
P. janthinellum Biourge
+
36
P. lividum Westling
+
37
P. pinophilum Hedgcock
+
38
P. simplicissimum (Oudemans)
-
39
P. waksmanii Zaleski
+
40
Pestalotiopsis guepinii (Desm.) Steyaert
-
41
Phaeoanellomyces werneckii (Horta) McGinnis
+
42
et Schell
Phialophora radicicola Cain
-
43
Rhinocladiella aquaspersa Shell
+
44
Rhizopus oryzae Went. & Prinsen Geere
+
45
Rhodotorula glutinis (Fr.) Harrison
+
46
Syncephalastrum racemosum (Cohn.)Scroet.
+
(+) = Positivo; (-) = Negativo.
PROTEASE
Silva, L.R.C. F u n g o s i s o l a d o s d e c u l t i v o s . . .
67
Tabela 7. Número de registro dos fungos depositados na Coleção de Culturas -Micoteca URM,
Universidade Federal de Pernambuco, Recife, PE-Brasil.
ESPÉCIES
Absidia blakesleeana
NÚMERO DE REGISTRO
5610/5665
Acremonium fusidioides
5409
Alternaria alternata
5657
A. flavipes
5406
A. flavus
5405/5600/5647/5659/5662/5663
A. fumigatus
5404/5410
A. japonicus
5721/5723
A. niveus
5612/5607
A. ochraceus
5512/5661
A. oryzae
5638
A. parasiticus
5408
A. terreus
Aureobasidium pullulans
Cladosporium cladosporioides
5513/5514
5500
5379/5660/5737
Cunninghamella elegans
5656
Eurotium chevaliere
5624
Drechslera biseptata (Sacc & Roum)
5704
Fusarium lateritium
5521/5697
F.moniliforme
5411
Mucor hiemalis for. Hiemalis
5739
Silva, L.R.C. F u n g o s i s o l a d o s d e c u l t i v o s . . .
68
Tabela 7. (Cont.)
ESPÉCIES
Paecilomyces variotii
NÚMERO DE REGISTRO
5421/5518
Penicillium aurantiogriseum
5637
P. citrinum
5623
P. commune
5407
P. corylophillum
5613
P. decumbens
5738
P. funiculosum
5518/5519
P. griseofulvum
5670
P. implicatum
5667/5668
P. janthinellum
5671/5750
P. lividum
5699
P. pinophilum
5666
P. wakmanii
5707
Pestalotiopsis guepinii
5515
Phaeoanellomyces werneckii
5345/5346
Phialophora radicicola
5713
Rhinocladiella aquaspersa
5430
Rhizopus oryzae
5554
Rhodotorula glutinis
5722
Syncephalastrum racemosum
5499
Silva, L.R.C. F u n g o s i s o l a d o s d e c u l t i v o s . . .
69
4 RÁPIDO SCREENING PARA DETECÇÃO DA CAPACIDADE QUITINOLÍTICA POR
FUNGOS UTILIZANDO SUBSTRATO DE BAIXO CUSTO
ARTIGO A SER SUBMETIDO AO JOURNAL OF BASIC MICROBIOLOGY
Silva, L.R.C. F u n g o s i s o l a d o s d e c u l t i v o s . . .
70
Rápido screening para detecção da capacidade quitinolítica por fungos, utilizando substrato
de baixo custo
*Lidiane Roberta Cruz da Silva, Minelli Albuquerque Sousa, Marília de Holanda Cavalcanti
Maciel, Polyanna Nunes Herculano, Keila Aparecida Moreira, Rosalie Reed Rodrigues Coelho,
Ana Lúcia Figueiredo Porto, Cristina Maria de Souza-Motta
Departamento de Micologia, Centro de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Pernambuco,
Recife, Pernambuco, Brasil.
Palavras-chave: quitinase, fungos, camarão, Litopenaneus vannamei.
*Autor correspondente: Lidiane Roberta Cruz, Mestranda em Micologia.
Endereço: Rua João Manoel, 91, Curado II, Jaboatão dos Guararapes, Pernambuco, Brasil. Cep
54220-715.
Telefone: (+5581) 3452-0593
Fax: (+5581) 3255-9115
E-mail: [email protected], [email protected]
Silva, L.R.C. F u n g o s i s o l a d o s d e c u l t i v o s . . .
71
Resumo
Visando baratear os custos do processo de degradação de resíduos contendo quitina, este
trabalho teve como objetivo detectar a capacidade quitinolítica 41 espécies de fungos isolados da
água de viveiros e do camarão Litopenaeus vannamei Boone, através do desenvolvimento de meio de
cultura para rápido screening. Foram utilizados diferentes meios de cultura: Meio C+ (controle
positivo) ágar Czapeck modificado; Meio QC (Quitina Coloidal); Meio CC (carapaça de camarão) e
Meio CC+S, contendo carapaça de camarão adicionado de sais. Sete espécies foram selecionadas
para caracterização em meio CC+S líquido onde foi evidenciada visualmente a degradação da
carapaça. Após 96 horas de incubação a 28 °C, as culturas foram analizadas quanto ao
desaparecimento ou não da carapaça comparando com o tempo zero, filtradas e o filtrado analisado
quanto ao teor de proteínas e de N-acetilglicosamina. Das 41 espécies, 40 foram capazes de hidrolisar
quitina, contida nos três meios sólidos testados. Dentre as 26 espécies que apresentaram maior taxa
de crescimento no meio sólido CC+S, Aspergillus fumigatus URM5410, A. niveus URM5612, A.
parasiticus URM5408, Penicillium lividum URM5699 e Syncephalastrum racemosum URM5499
degradaram completamente a carapaça do camarão em suspensão, produzitam proteínas e liberaram
N-acetilglicosamina, sendo indicadas como excelentes decompositoras de resíduos ricos em quitina,
podendo ser aplicadas em processos biotecnológicos para o tratamento de resíduos da carcinicultura.
Está sendo indicado também um meio para um rápida seleção de fungos decompositores de quitina.
Palavras-chave: quitinase, fungos, camarão.
Silva, L.R.C. F u n g o s i s o l a d o s d e c u l t i v o s . . .
72
1 Introdução
Quitina é um polímero linear que possui como unidade repetitiva o dissacarídeo formado
por 2-acetamido-2-desoxi-D-glicopiranose e 2-amino-2-desoxi-D-glicopiranose, unidos por ligação
glicosídica [1].
Trata-se da segunda substância orgânica mais abundante na biosfera sendo precedida
apenas pela celulose. Encontra-se na matriz da estrutura esquelética de invertebrados, como
artrópodes, dentre eles os camarões, anelídeos, moluscos e celenterados, e na parede celular da
maioria dos fungos, atuando como invólucros protetores e materiais de suporte e defesa destes
organismos [2].
Quitinases são enzimas que quebram ligações β-1,4 entre unidades de Nacetilglucosaminas da quitina. As quitinases são produzidas principalmente por organismos que
possuem quitina no exoesqueleto ou parede celular como insetos, crustáceos, algas e fungos [2].
Industrialmente, as quitinases são empregadas no controle biológico de pragas da lavoura,
tais como as produzidas por fungos entomopatogênicos. Além disto, estas enzimas podem ser uma
alternativa interessante para a reciclagem de carapaças de camarões, que na maioria das vezes, são
descartadas no meio ambiente, sem tratamento prévio, tornando-se poluentes ambientais [3]. As quitinases fúngicas podem ser detectadas através de ensaios no formato “highthroughput screening” (triagem de alto desempenho-HTS), os quais permitem a prospecção da
atividade enzimática em grande número de amostras, com rápidos resultados sobre uma
determinada atividade biocatalítica dos fungos. Para detecção da atividade quitinolítica por fungos,
o substrato mais utilizado em trabalhos científicos é a quitina comercial pura, entretanto trata-se de
substrato de alto custo [4, 5, 6, 7].
Visando baratear os custos desta metodologia, alguns autores trabalharam com carapaça
de camarão tratada e triturada, como única fonte de carbono e nitrogênio para o crescimento de
microrganismos produtores de quitinase [8, 9, 10, 11, 12]. Este substrato pode ser uma importante
Silva, L.R.C. F u n g o s i s o l a d o s d e c u l t i v o s . . .
73
ferramenta, quando se pretende otimizar e maximizar a produção da enzima, atingindo produção em
escala industrial [13].
Este trabalho teve como objetivo detectar a capacidade quitinolítica das espécies de fungos
isolados da água de viveiros e do camarão Litopenaeus vannamei Boone através do
desenvolvimento do meio de cultura para um rápido screening de culturas de fungos, utilizando
substrato de baixo custo.
2 Material e Métodos
Fungos
Foram testadas 41 espécies de fungos, isoladas de água de viveiros e do camarão
Litopenaeus vannamei Boone, cultivado em duas fazendas no Rio Grande do Norte Brasil. As
espécies foram procedentes da Coleção de Culturas – Micoteca URM, do Departamento de
Micologia, da Universidade Federal de Pernambuco, Recife-PE, Brasil (Tabela 1).
Caracterização enzimática em meio sólido das amostras de fungos quanto à degradação da
quitina de diferentes procedências
As amostras dos fungos foram mantidas em ágar Czapeck (sacarose 30g, NaNO3 3g,
MgSO4 0,5g, KCl, 0,5g FeSO4 + 7H2O 0,01g, K2HPO4 1g, ágar 16g e água destilada 1000ml q.s.p.),
para Aspergillus e Penicillium e em BDA – Batata Dextrose Ágar (batata inglesa 140g, glicose 20g,
ágar 16g e água destilada 1000ml q.s.p.) [14], para os demais gêneros. Para caracterização
enzimática, fragmentos das culturas com sete dias de crescimento foram transferidos para o centro
de diferentes meios de cultura contidos em placas de Petri: Meio C+ (controle positivo) em que o
meio ágar Czapeck foi modificado pela substituição da sacarose, por glicose 10g l -1; Meio QC
(Quitina Coloidal), em que a sacarose do meio ágar Czapeck foi substituída por quitina coloidal
[15]; Meio CC (carapaça de camarão), contendo carapaça de camarão como única fonte de carbono
e nitrogênio (10g de carapaça de camarão, 16g de ágar e água destilada 1000ml q.s.p., pH 5,5) [12]
e Meio CC+S, contendo casca de camarão adicionada de sais (10g de carapaça de camarão,
Silva, L.R.C. F u n g o s i s o l a d o s d e c u l t i v o s . . .
74
K2HPO4 2,8g, KH2PO4 1,2g, MgSO4 2,0g, 16g de ágar e água destilada 1000ml q.s.p., pH 5,5). As
placas foram mantidas à temperatura ambiente e o diâmetro das colônias foi aferido após sete dias
para avaliar o crescimento das amostras fúngicas nos meios QC, CC e CC+S, com a finalidade de
comparar com os resultados obtidos no Meio C+. A taxa de crescimento das colônias nos meios
com quitina comercial (coloidal) e natural, comparada à do meio contendo glicose, foi calculada a
partir da fórmula TX= Q x 100/G, onde Q representa o diâmetro da colônia nos meio contendo
quitina, e o G o diâmetro da colônia em meio C+, que possui glicose como única fonte de carbono,
considerando ainda este diâmetro equivalente a 100% [16].
Para os cálculos da taxa de crescimento foram consideradas como capazes de produzir
quitinase, as amostras que apresentaram nos meios QC, CC e CC+S, colônias com diâmetro,
aspecto do micélio e esporulação iguais ou próximos aos obtidos no meio de glicose (Meio C+); e
não capazes as que não cresceram nos meios QC, CC e CC+S, ou aquelas que apresentaram
colônias com diâmetro equivalente, porém com micélio tênue e esporulação reduzida nestes meios
em relação ao Meio C+.
Caracterização enzimática em meio líquido das amostras de fungos quanto à degradação da
carapaça de camarão
Espécies que apresentaram maiores taxas de crescimento em meio CC+S foram
selecionadas para caracterização em meio líquido, contendo a mesma composição do meio, sem
adição do ágar, para evidenciar a degradação da carapaça do camarão. O pH do meio foi ajustado
para 5,5 com HCl 1N. Erlenmeyers de 250 mL contendo 50 mL de meio foram inoculados com 1 x
107 esporos mL-1 de suspensões em solução de NaCl adicionado de Tween 80 (0,1%), procedentes
de culturas com sete dias de crescimento, incubados a 120 rpm a 28 °C por 96 horas. Após este
período, as culturas foram analizadas visualmente quanto ao desaparecimento ou não da carapaça
comparando com o tempo zero. O conteúdo dos Erlenmeyers foi filtrado em seis camadas de gaze
esterilizada, sendo o filtrado considerado como extrato enzimático e analisado quanto ao teor de
proteínas [17] e de N-acetilglicosamina [18].
Silva, L.R.C. F u n g o s i s o l a d o s d e c u l t i v o s . . .
75
3 Resultados
Das 41 espécies de fungos testadas, 40 foram capazes de degradar quitina, contida nos três
meios sólidos testados, com exceção de Eurotium chevaliere que não apresentou crescimento em
nenhum dos meios testes (Tabela 2). Dentre as espécies, 26 (Absidia blakesleeana, Acremonium
fusidioides, Aspergillus caespitosus, A. fumigatus, A. japonicus, A. ochraceus, A. oryzae, A.
parasiticus, A. terreus, Aureobasidium pullulans var. pullulans, Cladosporium cladosporioides,
Cunninghamella elegans, Drechslera biseptata, F. moniliforme, Mucor hiemalis for. hiemalis, P.
commune, P. corylophilum, P. funiculosum, P. implicatum, P. janthinellum, P. lividum,
pinophilum,
P.
waksmanii,
Phaeonellomyces
wernekii,
Rhynocladiela
P.
aquaspersa,
Syncephalastrum racemosum) apresentaram maior taxa de crescimento no Meio CC+S. Em 11
espécies (Alternaria alternata, A niveus, Fusarium lateritium, F. oxysporum, Paecilomyces variotii,
Pencillium aurantiogriseum, P. citrinum, P. decumbens, Pestalotiopsis guepinni, Phialophora
radicicola, Rhizopus oryzae), tanto no meio CC quanto no meio CC+S as taxas de crescimento
foram iguais, porém maiores que no meio QC. Apenas Aspergillus flavus e Rhodotorula glutinis,
apresentaram maior taxa de crescimento no meio CQ. Aspergillus flavipes apresentou a mesma taxa
de crescimento nos meios CQ e CC+S. Penicillium griseofulvum apresentou maior taxa de
crescimento no meio CC (Tabela 2).
Dentre as 26 espécies que apresentaram maior taxa de crescimento no meio sólido CC+S,
Aspergillus fumigatus URM5410, A. niveus URM5612, A. parasiticus URM5408, Penicillium
lividum URM5699, P. pinophilum URM5666, P. waksmanii URM5707 e Syncephalastrum
racemosum URM5499 foram aleatoriamente selecionados para verificar a capacidade de
degradação da carapaça do camarão em meio líquido. Penicillium pinophilum URM5666 e P.
waksmanii URM5707 degradaram parcialmente a carapaça do camarão. Entretanto, Aspergillus
fumigatus URM5410, A. niveus URM5612, A. parasiticus URM5408, Penicillium lividum
URM5699 e Syncephalastrum racemosum URM5499 degradaram completamente a carapaça do
camarão em suspensão (Figura 01, Tabela 2).
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Na Tabela 2 constam os resultados da vizualização da degradação da carapaça do camarão
e os conteúdos de proteínas e de N-acetilglicosamina, no tempo zero e nos extratos enzimáticos. No
tempo zero o conteúdo protéico foi de 0,005mg/mL e não havia N-acetilglicosamina.
A B C
D Figura 01. Caracterização quanto à capacidade de degradar a carapaça do camarão. A. Meio de
fermentação; B. Meio de fermentação após filtração em gaze; C. Extrato enzimático
após fermentação por 96 horas por Penicillium waksmanii URM5707 (degradação
parcial); D. Extrato enzimático após fermentação por 96 horas por Syncephalastrum
racemosum URM5499 (degradação total).
4 Discussão
Os resíduos provenientes da carcinicultura, principalmente as carapaças de camarões, têm
recebido maior atenção devido aos danos que causam ao meio ambiente, sendo as quitinases
fúngicas excelente alternativa para reciclagem destes resíduos. Além desta utilidade, quitinases
produzidas por fungos têm se tornado importantes ferramentas contra a ação de espécies fúngicas
fitopatogênicas. Wang et al. (2002b) [10], testaram a atividade antifúngica de cinco espécies de
Monascus contra o fitopatógeno Fusarium oxysporum, em meio contendo 1% de carapaça de
camarão triturada, confirmando a atividade antifúngica de todas as amostras testadas, porém foi
melhor evidenciada com a adição de 3% de sacarose ao meio de cultura. Os autores, ao analisarem
o antagonismo dos fungos, observaram drástica diminuição do micélio de F. oxysporum em
comparação com o de Monascus sp.
Silva, L.R.C. F u n g o s i s o l a d o s d e c u l t i v o s . . .
77
A quitina comercial apresenta-se como um bom indutor para a produção de quitinase, já que
40 das 41 espécies testadas conseguiram degradá-la, entretanto as taxas de crescimento foram, na
maioria delas, mais baixas que as em meios com quitina natural, procedentes de carapaças de
camarão (Tabela 2).
Excelentes resultados de taxas de crescimento das colônias fúngicas foram obtidas no meio
CC+S, resultados semelhantes aos obtidos por Wang et al. (1997) [9], que testando a atividade
antifúngica de Pseudomonas aeruginosa K-187 contra 36 linhagens de fungos, observaram uma
máxima atividade inibitória quando a bactéria foi inoculada em meio constituído de 4,75% de
carapaça de camarão e caranguejo, carboximetil celulose 0,75%, K2HPO4 0,1%, MgSO4 7H2O
0,05%, NaCl 0,3%, extrato de levedura 0,35%, pH 6,0.
Embora a carapaça do camarão contenha pequena concentração de sais, o meio de cultura
CC+S (carapaça de camarão adicionada de sais) apresentou melhores resultados com maiores taxas
de crescimento das colônias analisadas, tanto em relação ao meio CQ, quanto em relação ao meio
CC (meio contendo apenas carapaça de camarão). As concentrações de sais adicionadas à carapaça
de camarão atuam de forma a induzir melhor produção e conseqüente liberação de quitinases,
evidenciada por maior taxa de crescimento do fungo.
Nem todas as espécies com bom crescimento no meio sólido contendo carapaça do camarão, sais e
ágar (CC+S) degradaram totalmente a carapaça suspensa neste mesmo meio líquido. Logo, sugerese que para selecionar fungos que degradem este substrato, além da primeira etapa de seleção em
meio sólido, deve ser utilizada uma segunda etapa de seleção em meio líquido, pois Penicillium
waksmanii URM5707 e P. pinophilum URM5666 degradaram parcialmente a carapaça do camarão
suspensa no meio líquido.
Todas as amostras foram capazes de liberar N-acetilglicosamina após 96 horas de
fermentação quando comparados ao tempo zero em que não foi detectado este carboidrato. Logo,
com o aumento da concentração de proteínas e a liberação de N-acetiliglicosamina no meio de
fermentação, podemos sugerir que houve produção de quitinase pelas amostras testadas. Algumas
Silva, L.R.C. F u n g o s i s o l a d o s d e c u l t i v o s . . .
78
amostras como Syncephalastrum racemosum URM5499 e Aspergillus fumigatus URM5410,
produziram menores concentrações de proteínas e maiores de N-acetil glicosamina e, como foi
obervada vizualmente a degradação total da carapaça suspensa no meio, sugere-se que a proteína
produzida tinha alta especificidade a quitina presente na carapaça.
Aspergillus fumigatus URM5410, A. niveus URM5612, A. parasiticus URM5408,
Penicillium lividum URM5699 e Syncephalastrum racemosum URM5499 estão sendo indicadas
como excelentes decompositoras de resíduos ricos em quitina, podendo ser aplicadas em processos
biotecnológicos para o tratamento de resíduos da carcinicultura. Entretanto, A. fumigatus URM5410
e S. racemosum URM5499 provavelmente produzem enzimas com maior especificidade para
degradar estes resíduos.
O meio CC+S constitui importante alternativa na tentativa de diminuir custos laboratoriais,
bem como na obtenção de melhores resultados qualitativos, para a seleção de fungos com atividade
quitinolítica.
Agradecimentos
Os autores agradecem ao CNPq pelo financiamento da pesquisa.
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82
Tabela 1. Taxa de crescimento (%) das espécies de fungos filamentosos isoladas da água de
viveiros e do camarão, em meios de cultura contendo quitina.
N º Espécie
URM
5610 Absidia blakesleeana Lendn.
Meio QC Meio CC Meio CC+S
113,8
119,4
125
5409
Acremonium fusidioides (Nicot) W. Gams
90,9
104,5
113,6
5657
Alternaria alternata (Fr.) Keissler
96,7
116,1
116,1
5859
Aspergillus caespitosus Raper & Thom
83,3
102,7
113,8
5406
A. flavipes (Bain. and Sart.) Thom
85
50
85
5405
A. flavus Link
103,3
87
100
5410
A. fumigatus Fresenius
102,8
105,7
108,5
5723
A. japonicus Saito
102
104,1
106,2
5612
A. niveus Blochwitz
100
102,7
102,7
5661
A. ochraceus Wilhelm
100
90,3
106,4
5638
A. oryzae (Ahlb.) Cohn
93,9
100
109
5408
A. parasiticus Speare
100
75
112,5
5514
A. terreus Thom
90
76,6
100
5500
Aureobasidium pullulans var. pullulans
95,4
100
104,5
(de Bary) Arn.
5737
Cladosporium cladosporioides (Fres) de Vries
97,5
102,4
104,8
5656
Cunninghamella elegans Lendner
100
103
120
5704
100
103,3
113,3
5624
Drechslera rostata (Drechsler) Richardson &
Frazer
Eurotium chevaliere L. Mangin
0,0
0,0
0,0
5697
Fusarium lateritium Nees
96,8
103,1
103,1
5411
F. moniliforme Wr. & Rg.
97
102,9
105,8
5739
Mucor hiemalis for. Hiemalis Schipper
90,9
109
120
5518
Paecilomyces variotii Bain.
97,8
102,1
102,1
Silva, L.R.C. F u n g o s i s o l a d o s d e c u l t i v o s . . .
83
Tabela 1 (Cont.)
N º Espécie
URM
5637 Penicillium aurantiogriseum Dierckx
Meio QC Meio CC Meio CC+S
94,7
102,6
102,6
5623
P. citrinum Thom
88
104
104
5407
P. commune Thom
103,2
112,9
119,3
5613
P. corylophilum Dierck.
96,1
115,3
123
5738
P. decumbens Thom
95,2
109,5
109,5
5519
P. funiculosum Thom
105
105
110
5670
P. griseofulvum Dierck.
100
106,6
71,3
5668
P. implicatum Biourge
96,4
89,2
107,1
5750
P. janthinellum Biourge
90
105
125
5699
P. lividum Westling
96,7
106,4
112,9
5666
P. pinophilum Hedgcock
92
100
120
5707
P. waksmanii Zaleski
93
100
122
5515
Pestalotiopsis guepinni (Desm.)Steyaert
96,7
103,2
103,2
5346
100
103,5
107,1
5713
Phaeonellomyces wernekii (Horta) McGinnis et
Schell
Phialophora radicicola Cain
94
103,1
103,1
5430
Rhynocladiela aquaspersa Shell
100
107,1
114,2
5554
Rhizopus oryzae Went. & Prinsen Geere
98,2
105,3
105,3
5722
Rhodotorula glutinis (Fr.) Harrison
100
90
90
5499
Syncephalastrum racemosum (Cohn.) Scroet.
100
101,7
115,5
a) 0= negativo; b) N º URM= número de registro Coleção de Culturas – Micoteca URM; c) Meio
QC= meio composto de quitina coloidal; d) Meio CC= meio composto de carapaça de camarão; e)
Meio CC+S= meio composto de carapaça de camarão adicionada de sais.
Silva, L.R.C. F u n g o s i s o l a d o s d e c u l t i v o s . . .
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Tabela 2. Degradação da carapaça, conteudos protéico e de N-acetilglicosamina produzidos pelas
amostras de fungos, após 96 horas de fermentação em meio líquido contendo carapaça de camarão
adicionado de sais.
Amostras
Degradação da
Carapaça do
Camarão
Conteúdo
Protéico
Conteúdo de Nacetilglicosamina
mg/mL
µg/mL
Tempo zero
-
0,005
0,000
Branco
-
0,539
0,002
Aspergillus fumigatus Fresenius
DT
0,007
0,021
A. niveus Blochwitz
DT
0,018
0,021
A. parasiticus Speare
DT
0,024
0,011
Penicillium lividum Westling
DT
0,018
0,024
P. pinophilum Hedgcock
DP
0,024
0,021
P. waksmanii Zaleski
DP
0,045
0,027
DT
0,009
Syncephalastrum racemosum
(Cohn.) Scroet.
a) - = não detectado; b) DT= degradação total; c) DP= degradação parcial.
0,024
Silva, L.R.C. F u n g o s i s o l a d o s d e c u l t i v o s . . .
85
5 DETECÇÃO DA CAPACIDADE DE PRODUÇÃO DE AFLATOXINA B1 POR Aspergillus
flavus E A. parasiticus ISOLADOS DA ÁGUA DE VIVEIROS E DO CAMARÃO
LITOPENAEUS VANNAMEI BOONE, CULTIVADO EM DUAS FAZENDAS DO RIO
GRANDE DO NORTE, BRASIL
ARTIGO A SER SUBMETIDO A BRAZILIAN JOURNAL OF MICROBIOLOGY
Silva, L.R.C. F u n g o s i s o l a d o s d e c u l t i v o s . . .
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Detecção da capacidade de produção de aflatoxina B1 por Aspergillus flavus e A. parasiticus
isolados da água de viveiros e do camarão Litopenaeus vannamei Boone, cultivado em duas
fazendas do Rio Grande do Norte, Brasil
Lidiane R. Cruz da Silvaa*, Hanilma da Silva Rodrigues a e Cristina M. Souza-Mottaa
a
Departamento de Micologia, Centro de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Pernambuco,
Av. Prof. Nelson Chaves s/n, Recife, Pernambuco, Brasil, 50670-420.
*
e-mails: [email protected]
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*Tel.: 81-2126-8948
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Detecção da capacidade de produção de aflatoxina B1 por Aspergillus flavus e A. parasiticus
isolados da água de viveiros e do camarão Litopenaeus vannamei Boone, cultivado em duas
fazendas no NE do Brasil
RESUMO
Aflatoxinas são micotoxinas com potencial carcinogênico, provenientes do metabolismo
secundário de Aspergillus flavus e A. parasiticus, que podem comprometer a saúde do homem e
outros animais que consumirem alimentos contaminados. Os principais alimentos contaminados por
aflatoxinas são os grãos, como milho, soja, amendoim, trigo, dentre outros. Foram testadas 33
amostras de A. flavus e sete de A. parasiticus isolados de água de viveiros e de camarões
Litopenaeus vannamei cultivados em duas fazendas no RN, sendo uma com sistema de alimentação
orgânico e a outra com sistema de alimentação artificial, no qual os camarões são alimentados com
ração em cuja composição estão presentes grãos processados. Para detecção da produção de
aflatoxina B1 pelas amostras, discos de três mm de diâmetro das culturas foram transferidos para o
meio MAC (Meio de Ágar Côco) com pH ajustado para 6,9 e incubadas a 28ºC durante 6 a 7 dias.
A presença de aflatoxina B1 foi verificada observando-se a presença de um halo azulado a violeta
fluorescente observado no reverso da colônia nas placas quando foram submetidos a ondas longas
(365nm) de luz UV. Das 33 amostras de A. flavus e sete de A. parasiticus testadas, 21 e três
respectivamente, produziram aflatoxina B1. Todas as espécies produtoras de aflatoxina B1 foram
procedentes da água e dos camarões da fazenda com sistema de alimantação artificial, ou seja,
camarões alimentados com ração, podendo comprometer o sistema de cultivo, bem como vir a
prejudicar a saúde dos consumidores destes camarões.
Palavras-chave: Aflatoxinas, Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus, camarão.
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INTRODUÇÃO
Aflatoxinas (AFLs) são micotoxinas provenientes do metabolismo secundário dos fungos
Aspergillus flavus, A. parasiticus e A. nominus (4, 25). Várias espécies de animais, inclusive os
seres humanos são sensíveis aos efeitos tóxicos das aflatoxinas que podem ser agrupados como
agudos, mutagênicos, neoplásicos e teratogênicos (9, 10). Pertencem a uma classe de compostos
denominados furanocumarinas e todas apresentam um núcleo cumarina associado com o furano e a
lactona (1). Existem vários tipos de aflatoxinas, dentre estas, destacam-se quatro, B1, B2, G1 e G2;
a biotransformação destas toxinas, em diversas espécies de animais, resulta na produção de
aflatoxinas M1 e M2, as quais foram isoladas inicialmente no leite e urina de animais que
consumiram alimentos contaminados por AFLs (17).
Os fungos toxigênicos podem contaminar os alimentos nas diferentes fases de produção e
beneficiamento, desde o cultivo até o transporte e armazenagem. Conforme relatado por Sabino
(22), o Brasil, por apresentar clima tropical, propicia condições ideais para a proliferação dos
fungos responsáveis pela produção de micotoxinas. Além disso, as condições inadequadas de
plantio, colheita, secagem, transporte e armazenamento de produtos agrícolas favorecem o
crescimento fúngico. No grupo das aflatoxinas, especial atenção deve ser dada à B1, por ser a de
maior incidência e a mais tóxica, provocando alterações orgânicas que levam a hemorragias através
da inibição dos fatores II e VII da coagulação sangüínea, além de lesões no hematócrito. A ingestão
de baixas quantidades por longo período determina baixa conversão alimentar nos animais,
imunodepressão e câncer hepático (26). Seus efeitos no homem são verificados através da ingestão
direta de alimentos contaminados derivados de animais que receberam ração contaminada (24).
O camarão branco Litopenaeus vannamei Boone é o mais cultivado em viveiros no Brasil.
Esta espécie possui hábito alimentar onívoro, necessitando de proteínas, lipídios, carboidratos,
vitaminas e sais minerais para a construção e manutenção de seus tecidos, bem como para o
suprimento de energia. Na grande maioria das fazendas de cultivo, os camarões são alimentados
com rações, compostas principalmente por grãos de milho e trigo triturados, aditivados com
proteínas, vitaminas e sais (16). Entretanto, uma fazenda no nordeste do Brasil cultiva seus
camarões sem adição de ração aos viveiros, alimentando-os com recursos naturais como algas e
pequenos crustáceos (6).
Diante do exposto, o objetivo do presente estudo foi detectar a capacidade de produção de
aflatoxina B1 por 33 isolados de Aspergillus flavus Link e sete de A. parasiticus Speare, isolados da
água e do camarão Litopenaeus vannamei Boone, produzido em duas fazendas do Rio Grande do
Norte, sendo uma com alimentação processada ou artificial (ração) e outra com alimentação
orgânica (pequenos crustáceos e algas).
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MATERIAIS E MÉTODOS
Culturas de Aspergillus
Foram testadas 33 amostras de Aspergillus flavus e sete de A. parasiticus (Tabela 1).
Confirmação taxonômica
Após processo clássico de identificação das espécies isoladas, para confirmação taxonômica,
foi utilizado o meio ADM- Aspergillus Differential Medium (Triptona 15g, Extrato de levedura
10g, Citrato férrico 5g, ágar 16g) descrito por Bhotast e Fennel (4) que diferencia espécies do grupo
flavus. As culturas foram incubadas por 72 horas a 28oC, em estufa sem luz para visualização
macroscópica da presença da pigmentação amarela-laranja a amarelo-oliva no verso da colônia o
que confirmaria que os isolados pertenciam ao grupo flavus, pois A. flavus e A. parasiticus
produzem ácido aspergílico ou noraspergílico, que reagem com o citrato férrico amoniacal presente
no ADM, induzindo a formação de uma pigmentação amarelo-laranja no reverso das colônias.
Detecção da Produção de Aflatoxina B1
Após 2 ou 3 dias de crescimento no meio ADM foram retirados discos de 3 mm de
diâmetro das culturas e transferidos para o meio MAC (Meio de Ágar Côco) com pH ajustado para
6,9 [12] e incubadas a 28ºC durante 6 a 7 dias.
A presença de aflatoxina B1 foi verificada observando-se a presença de um halo azulado a
violeta fluorescente observado no reverso da colônia nas placas contendo o fungo crescido em meio
MAC quando foram submetidos a ondas longas (365nm) de luz ultravioleta em câmara escura
ultravioleta (Tecnal, modelo: TE-540).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Em todas as culturas analisadas macroscopicamente a presença da pigmentação amarelalaranja a amarelo-oliva no verso da colônia o que confirmou que os isolados pertenciam ao grupo
flavus [4]. Das 40 amostras de Aspergillus flavus e A. parasiticus testadas, 20 apresentaram um halo
azul-violeta sob ondas de 365 nm – ultravioleta fluorescente (Figura 1), indicando produção de
aflatoxina B1, sendo 18 de A. flavus e duas de A. parasiticus (Tabela 1).
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A
B Figura 1: Culturas de Aspergillus flavus em meio MAC, crescidas por 6 dias a 28°C em
estufa BOD. (A) positivo para a produção de aflatoxina B1; (B) negativo para produção
de aflatoxina B1, sob luz ultravioleta – 365nm.
De acordo com os resultados, as amostras de Aspergillus flavus e A. parasiticus isolados de
água de viveiros e do camarão Litopenaeus vannamei alimentado com ração, em cuja composição
estão presentes grãos de milho e trigo, estão produzindo aflatoxina B1. Já as amostras de A. flavus e
A. parasiticus isoladas da água e do camarão alimentados de forma orgânica (sem ração), não estão
produzindo aflatoxina B1, o que sugere que a ração potencialize a produção de aflatoxina por estes
fungos (Tabela 2).
A ocorrência de aflatoxinas no Brasil tem sido observada com grande freqüência em
alimentos destinados ao consumo humano e animal . Caldas et al. (5) analisaram 366 amostras de
alimentos (amendoim cru e derivados, milho de pipoca, milho em grão e castanha do Pará)
consumidos no Distrito Federal e detectaram aflatoxinas em 19,6% das amostras, a AFB1 estava
presente em 98,5% das amostras positivas. Em Belo Horizonte [18] foi observada uma freqüência
de contaminação de 46,6% em amendoim e produtos derivados de amendoim. Levantamentos,
sobre os níveis de aflatoxinas encontrados em ingredientes para rações e em rações prontas, também
indicam um elevado potencial de amostras positivas, principalmente em rações prontas, sendo
descritos valores de 10,4 a 56,9% para estes produtos [20, 22, 23, 24], o que pode justificar a
produção de aflatoxina B1 por Aspergillus flavus e A. parasiticus isolados de água de viveiros e dos
camarões alimentados com ração.
Giacomini et al. (8) avaliaram o desempenho e plumagem de frangos de corte alimentados
com ração contaminada por aflatoxina B1 e observaram que as aves apresentaram sinais
característicos de intoxicação por aflatoxinas, como desuniformidade da estatura, redução no
consumo de ração e ganho de peso e alterações microscópicas e macroscópicas em órgãos e tecidos.
Observou-se que o coração e o fígado das aves intoxicadas apresentaram um incremento
significativo no peso médio relativo, a massa de penas foi reduzida significativamente (33,8%),
além de um baixo desempenho.
Silva, L.R.C. F u n g o s i s o l a d o s d e c u l t i v o s . . .
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Divakaran & Tacon (7), determinaram a quantidade de aflatoxina presente no músculo e
fezes de camarões Penaeus vannamei, alimentados com ração contaminada. Os camarões foram
alimentados com dietas contendo três níveis de aflatoxina B1 durante oito semanas. A presença de
AFB1 foi evidenciada apenas no músculo. Os autores concluíram que a toxicidade em seres
humanos através do consumo de camarões alimentados com ração contaminada é limitada.
Bintvihok et al. (2) analisaram 150 amostras de camarão tigre preto (Penaeus monodon),
das regiões leste e sul da Tailândia, alimentados com ração contaminada por aflatoxina B1 (AFB1).
Após os dez dias da dieta, os camarões foram pesados e sacrificados para exame laboratorial. No
músculo dos camarões dos grupos testados, não foram detectados AFB1 nem seus metabólitos,
porém a taxa de mortalidade dos camarões testados foi mais alta do que a dos camarões controle. Os
autores concluíram que em sistema de cultivo camarões alimentados com ração contaminada por
aflatoxina pode haver diminuição da produção, causando perdas econômicas.
Lopes et al. (13), avaliaram o efeito das aflatoxinas sobre o crescimento de alevinos de
jundiá (Rhamdia quelen) e sua deposição no fígado e no músculo de peixes alimentados com ração
com diferentes teores da micotoxina concluíram que concentrações de aflatoxinas superiores a 350 ppb
kg-1 presentes na ração de peixes acarretam deposição residual no fígado e nos músculos do animal,
ocasionado lesões no fígado dos mesmos.
As aflatoxinas caracterizam-se pela elevada toxicidade que apresentam. Em saúde animal,
várias espécies domésticas e de experimentação são sensíveis aos seus efeitos tóxicos agudos,
mutagênicos e carcinogênicos, sendo o fígado o principal órgão atingido [15] de modo análogo, em
saúde pública, as aflatoxinas são identificadas como fatores envolvidos na etiologia do câncer
hepático no homem, em conseqüência da ingestão de alimentos contaminados [18]. Lopez et al.
(14) analisaram amostras de sangue de 20, pacientes tratados em um hospital na Argentina, com
problemas hepáticos (hepatite, cirrose, dentre outros) e detectaram a presença de aflatoxina B1 em
apenas um paciente. Através de dados clínicos do paciente, concluíram que o mesmo adquiriu
aflatoxina B1 através de alimentação possivelmente contaminada.
Embora os camarões de ambas as fazendas estivessem aparentemente saudáveis, a
presença de Aspergillus flavus e A. parasiticus produtores de aflatoxina B1, em água de viveiros e
no camarão alimentado com ração, pode afetar a produtividade desta atividade aqüicola, bem como
significar um fator de risco para a população que consome camarão regularmente.
Silva, L.R.C. F u n g o s i s o l a d o s d e c u l t i v o s . . .
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Silva, L.R.C. F u n g o s i s o l a d o s d e c u l t i v o s . . .
95
Tabela 1. Número de amostras de Aspergillus flavus e A. parasiticus testadas quanto à capacidade
de produzir aflatoxina B1.
Aspergillus
FAZENDA
INORGÂNICA
Água de
Camarão
viveiros
13
6
FAZENDA
ORGÂNICA
Água de
Camarão
viveiros
11
03
TOTAL
33
flavus
Aspergillus
02
-
03
02
07
15
06
14
05
40
parasiticus
TOTAL
Silva, L.R.C. F u n g o s i s o l a d o s d e c u l t i v o s . . .
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Tabela 2. Detecção da produção de aflatoxinas pelas amostras de Aspergillus flavus e A. parasiticus
isoladas da água dos viveiros e dos camarões das duas fazendas no Rio Grande do Norte, Brasil.
Nº
Espécie
Substrato
Fazenda
1
Aspergillus flavus
Água
I
Detecção
produção
aflatoxina
+
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
A. flavus
A. flavus
A. flavus
A. flavus
A. flavus
A. flavus
A. flavus
A. flavus
A. flavus
A. flavus
A. flavus
A. flavus
A. flavus
A. flavus
A. flavus
A. flavus
A. flavus
A. flavus
A. flavus
A. flavus
A. flavus
A. flavus
A. flavus
A. flavus
A. flavus
A. flavus
A. flavus
A. flavus
A. flavus
A. flavus
A. flavus
A. flavus
A. parasiticus
A. parasiticus
A. parasiticus
A. parasiticus
A. parasiticus
A. parasiticus
A. parasiticus
Água
Água
Água
Água
Água
Água
Água
Água
Água
Água
Água
Água
Camarão
Camarão
Camarão
Camarão
Camarão
Camarão
Água
Água
Água
Água
Água
Água
Água
Água
Água
Água
Água
Camarão
Camarão
Camarão
Água
Água
Água
Água
Água
Camarão
Camarão
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
II
II
II
II
II
II
II
II
II
II
II
II
II
II
I
I
II
II
II
II
II
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
da
de
(+)= positivo; (-)= negativo; Fazenda I= camarões alimentados com ração; Fazenda II= camarões
alimentados com algas e pequenos crustáceos.
Silva, L.R.C. F u n g o s i s o l a d o s d e c u l t i v o s . . .
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6. CONCLUSÕES GERAIS
Com base nos resultados obtidos pode-se concluir que:
¾ Em viveiros de camarão são encontradas espécies de fungos anamorfos (Deuteromycota) e
Ascomycota;
¾ Aspergillus e Penicillium são os gêneros mais freqüentes com maior número de espécies,
tanto na água quanto em camarões cultivados em viveiros;
¾ Aspergillus flavus ocorre em água de viveiros de camarões jovens, água de camarões
adultos, bem como nos camarões adultos, que se alimentam através de ração e nos que se
alimentam de algas e pequenos crustáceos;
¾ Em camarões cultivados em viveiros são encontradas espécies de fungos relatadas como
agentes de micoses em humanos;
¾ Aspergillus flavus e A. parasiticus isolados de água de viveiros e dos camarões alimentados
com ração possuem o seu metabolismo secundário ativado para a produção de aflatoxina
B1;
¾ A maioria das espécies de fungos presentes em viveiros criadouros de camarão possui
capacidade proteolítica e/ou quitinolítica;
¾ Para selecionar fungos que degradem a carapaça do camarão, além de uma primeira etapa de
seleção em meio sólido, deve ser utilizada uma segunda etapa de seleção em meio líquido;
¾ Aspergillus fumigatus URM5410, A. niveus URM5612, A. parasiticus URM5408,
Penicillium lividum URM5699 e Syncephalastrum racemosum URM5499 estão sendo
indicadas como excelentes decompositoras de resíduos ricos em quitina, podendo ser
aplicadas em processos biotecnológicos para o tratamento de resíduos da carcinicultura.
¾ O meio CC+S (carapaça de camarão adicionada de sais) constitui uma importante
ferramenta para a detecção da capacidade quitinolítica por fungos.