UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO SEMI-ÁRIDO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MANEJO DE SOLO E ÁGUA
ANA KALINE DA COSTA FERREIRA
AVALIAÇÃO DE MÉTODOS DE ANÁLISES QUÍMICAS
DE NUTRIENTES EM TECIDO VEGETAL
MOSSORÓ – RN
FEVEREIRO DE 2014
ANA KALINE DA COSTA FERREIRA
AVALIAÇÃO DE MÉTODOS DE ANÁLISES QUÍMICAS
DE NUTRIENTES EM TECIDO VEGETAL
Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação em Manejo de Solo e Água da
Universidade Federal Rural do Semi-Árido
(UFERSA), como parte dos requisitos para
obtenção do título de “Mestre em Manejo de
Solo e Água”.
Orientador: Prof. Fábio Henrique Tavares de Oliveira
MOSSORÓ – RN
FEVEREIRO DE 2014
O conteúdo desta obra é de inteira responsabilidade de seus autores
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
Biblioteca Central Orlando Teixeira (BCOT)
Setor de Informação e Referência
F383a
Ferreira, Ana Kaline da Costa.
Avaliação de métodos de análises químicas de nutrientes em
tecido vegetal. / Ana Kaline da Costa Ferreira -- Mossoró, 2014
88f.: il.
Orientador: Prof. Dr. Fábio Henrique Tavares de Oliveira.
Dissertação (Mestrado em Manejo de solo e Água) –
Universidade Federal Rural do Semi-Árido. Pró-Reitoria de PósGraduação.
1. Fertilidade do solo. 2. Análise foliar. 3. Métodos de
digestão. 4. Métodos de extração. I. Titulo.
RN/UFERSA/BCOT /383-14
CDD: 631.42
Bibliotecária: Vanessa Christiane Alves de Souza Borba
CRB-15/452
ANA KALINE DA COSTA FERREIRA
AVALIAÇÃO DE MÉTODOS DE ANÁLISES QUÍMICAS
DE NUTRIENTES EM TECIDO VEGETAL
Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação em Manejo de Solo e Água da
Universidade Federal Rural do Semi-Árido
(UFERSA), como parte dos requisitos para
obtenção do título de “Mestre em Manejo de
Solo e Água”.
Aprovada em: ___18____/___02____/____2014____
Banca examinadora:
______________________________________________________
Prof. Fábio Henrique Tavares de Oliveira – UFERSA
Orientador
______________________________________________________
Profa Eulene Francisco da Silva – UFERSA
Examinadora
______________________________________________________
Dra. Welka Preston Leite Batista da Costa – CAPES/UFERSA
Examinadora
Dr. Gerônimo Ferreira da Silva – CAPES/UFRPE
Examinador
i
Primeiro lugar ao meu Deus por
iluminar meu caminho e me dar
forças para seguir sempre em frente,
aos meus pais, Maurílio Pinheiro da
Costa e Maria de Fátima da Costa,
pela dedicação que dispensaram a
minha pessoa, a meu esposo
Alexandre por sempre está comigo,
minha filha Anne Caroline pela
alegria diuturnamente oferecida,
enfim, a todos meus amigos pela
indispensável companhia.
Dedico
O temor do Senhor é o princípio do
conhecimento; mas os insensatos
desprezam a sabedoria e a instrução
(Provérbios 1.7).
ii
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus, por ter derramado a sua graça por toda a minha
vida.
Agradeço a toda a minha família nas pessoas da minha mãe, Maria de Fátima da
Costa, e do meu pai, Maurílio Pinheiro da Costa, por terem me ensinado a caminhar pelo
caminho da honestidade e da ética cristã.
Agradeço ao meu esposo, Alexandre, pela paciência e por ter aguentado meu mau
humor e reclamações (a respeito da dissertação) nos dias de trabalho, e a minha filha,
Caroline, que a cada dia tem me dado alegria sem medida.
Agradeço ao professor Fábio Henrique Tavares de Oliveira, pela valiosa orientação,
sendo de fundamental importância para o desenvolvimento desse trabalho.
Agradeço aos meus amigos de trabalho, em especial as amigas Ana Cecília da Costa
Sinclair Marinho, Elídio Andrade e Antônia Édna por sempre terem me ajudado, e pela força
em tudo que precisei nessa caminhada.
Agradeço ao meu amigo Gerônimo Ferreira da Silva e as minhas amigas Jeane Cruz
Portela e Ana Cláudia Medeiros por estarem disponíveis sempre que precisei. Obrigada pela
rica troca e cumplicidade.
Agradeço ao Programa de Pós-graduação em Manejo de Solo e Água da UFERSA
pela oportunidade que me foi dada para ingressar no curso.
iii
BIOGRAFIA
ANA KALINE DA COSTA FERREIRA, filha de Maurílio Pinheiro da Costa e
Maria de Fátima da Costa, nasceu em Mossoró – RN, em 09 de novembro de 1978.
Graduou-se em Química/Licenciatura pela Universidade Estadual do Rio Grande do
Norte em março de 2001.
Graduou-se em Matemática/Licenciatura pela Universidade Estadual do Rio Grande
do Norte em março de 2004.
Fez especialização em Química e Biologia pela Universidade Kurios/Ceará em 2007.
Em março de 2012 ingressou no Programa de Pós-Graduação em Manejo de Solo e
Água da Universidade Federal Rural do Semi-Árido.
iv
SUMÁRIO
Página
LISTA DE QUADROS..........................................................................................
viii
LISTA DE FIGURAS............................................................................................
ix
APÊNDICE.............................................................................................................
xi
RESUMO................................................................................................................
xii
ABSTRACT...........................................................................................................
xiii
1. INTRODUÇÃO..................................................................................................
1
2. REVISÃO DE LITERATURA.........................................................................
3
2.1 Avaliação do estado nutricional das plantas..................................................
3
2.2 Diagnose visual..............................................................................................
4
2.3 Análise química de tecido vegetal..................................................................
5
2.3.1 Análise química de tecido foliar............................................................
5
2.4 Métodos de análises químicas de tecido vegetal............................................
6
2.4.1 Extração com soluções de ácidos diluídos (métodos sem digestão)
7
2.4.2 Digestão seca (incineração/calcinação).................................................
8
2.4.3 Digestão úmida em sistemas aberto e fechado com o uso de microondas...................................................................................................
8
2.5 Aspectos gerais dos métodos de análises químicas de nutrientes em tecido
vegetal...........................................................................................................
10
2.5.1 Método de extração via solubilização com adição de HCl...................
11
2.5.2 Método de extração via seca (incineração) em forno tipo mufla e
dissolução posterior do resíduo (cinzas) com adição de HCl 1
mol/L.....................................................................................................
12
2.5.3 Digestão via úmida em sistema aberto e a mistura de HNO3 + H2O2
para digerir a matéria seca.....................................................................
12
2.5.4 Digestão via úmida em sistema aberto e a mistura de H2SO4 + H2O2
para digerir a matéria seca.....................................................................
13
2.5.5 Digestão via úmida em sistema fechado usando forno micro-ondas
como fonte de calor e o HNO3 para digerir a matéria seca...................
14
v
2.5.6 Digestão via úmida em sistema aberto e a mistura de HNO3 +
HClO4 (3:1) para digerir a matéria seca..............................................
15
3. MATERIAL E MÉTODOS...............................................................................
16
3.1 Descrição dos métodos de digestão da matéria seca e de extração dos
nutrientes do tecido vegetal..........................................................................
20
3.1.1 Extração dos nutrientes da matéria seca com o uso de HCl
1mol/L.................................................................................................
20
3.1.2 Digestão via seca (incineração) em forno tipo mufla e dissolução
posterior do resíduo (cinzas) com HCl 1 mol/L..................................
20
3.1.3 Digestão via úmida em sistema aberto usando bloco digestor como
fonte de calor e a mistura de HNO3 + H2O2 para digerir a matéria
seca........................................................................................................
21
3.1.4 Digestão via úmida em sistema aberto usando bloco digestor como
fonte de calor e a mistura de H2SO4 + H2O2 para digerir a matéria
seca........................................................................................................
21
3.1.5 Digestão via úmida em sistema fechado usando forno micro-ondas
como fonte de calor e o HNO3 concentrado para digerir a matéria
seca........................................................................................................
22
3.1.6 Digestão via úmida em sistema aberto usando bloco digestor como
fonte de calor e a mistura de HNO3 + HClO4 (3:1) para digerir a
matéria seca...........................................................................................
22
3.2 Métodos de dosagem dos nutrientes nos extratos provenientes da digestão
ou da extração.................................................................................................
23
3.3 Índices de exatidão e de precisão dos métodos analíticos comparados para
avaliar os teores de nutrientes em tecido vegetal............................................
23
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO.......................................................................
25
4.1 Extração dos nutrientes da matéria seca com o uso de HCl 1 mol/L.............
25
4.2 Digestão via seca (incineração) em forno tipo mufla e dissolução posterior
do resíduo (cinzas) com HCl 1 mol/L.............................................................
30
4.3 Digestão via úmida em sistema aberto usando bloco digestor como fonte
de calor e a mistura de HNO3 + H2O2 para digerir a matéria seca..................
35
4.4 Digestão via úmida em sistema aberto usando bloco digestor como fonte
de calor e a mistura de H2SO4 + H2O2 para digerir a matéria seca...............
39
vi
4.5 Digestão via úmida em sistema fechado usando forno micro-ondas como
fonte de calor e o HNO3 para digerir a matéria seca......................................
43
4.6 Digestão via úmida em sistema aberto usando bloco digestor como fonte
de calor e a mistura de HNO3 + HClO4 (3:1) para digerir a matéria seca......
47
5. CONCLUSÕES..................................................................................................
51
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.............................................................
52
7. APÊNDICE.........................................................................................................
57
vii
LISTA DE QUADROS
Página
Quadro 01 - Resultados das análises químicas das amostras padrão fornecidos
pelo Programa Interlaboratorial de Análise de Tecido
Vegetal...........................................................................................
18
Quadro 02 - Classificação da exatidão de métodos analíticos utilizados para a
análise química de tecido vegetal..................................................
24
Quadro 03 - Classificação do coeficiente de variação dos métodos analíticos
utilizados para a análise química de tecido vegetal.......................
24
Quadro 04 - Índice de exatidão dos métodos analíticos comparados para avaliar
os teores de nutrientes em tecido vegeta............................
27
Quadro 05 - Índice de precisão dos métodos analíticos comparados para avaliar
os teores de nutrientes em tecido vegeta............................
29
viii
LISTA DE FIGURAS
Página
Figura 01 -
Figura 02 -
Figura 03 -
Figura 04 -
Figura 05 -
Figura 06 -
Figura 07 -
Figura 08 -
Teores mínimos e máximos esperados de nitrogênio (A), fósforo (B),
potássio (C), cálcio (D), magnésio (E) e enxofre (F) nas amostraspadrão, e valores observados para os teores desses nutrientes nessas
mesmas amostras pelo método da extração dos nutrientes da matéria
seca com o uso de HCl 1 mol/L......................................................................
26
Teores mínimos e máximos esperados de ferro (A), cobre (B),
manganês (C), zinco (D) e boro (E) nas amostras padrão, e valores
observados para os teores desses nutrientes nessas mesmas amostras
pelo método da extração dos nutrientes da matéria seca com o uso de
HCl 1 mol/L........................................................................................................
28
Teores mínimos e máximos esperados de nitrogênio (A), fósforo (B),
potássio (C), cálcio (D), magnésio (E) e enxofre (F) nas amostras
padrão, e valores observados para os teores desses nutrientes nessas
mesmas amostras pelo método da extração via seca (incineração) com
adição de HCl 1 mol/L .........................................................................
31
Teores mínimos e máximos esperados de ferro (A), cobre (B),
manganês (C), zinco (D) e boro (E) nas amostras padrão, e valores
observados para os teores desses nutrientes nessas mesmas amostras
pelo método da extração via seca (incineração) com adição de HCl 1
mol/L...................................................................................................
33
Teores mínimos e máximos esperados de fósforo (A), potássio (B),
cálcio (C), magnésio (D) e enxofre (E) nas amostras padrão, e valores
observados para os teores desses nutrientes nessas mesmas amostras
pelo método da extração via úmida em sistema aberto com a mistura
de HNO3 + H2O2 para digerir a matéria seca........................................
36
Teores mínimos e máximos esperados de ferro (A), cobre (B),
manganês (C), zinco (D) e boro (E) nas amostras-padrão, e valores
observados para os teores desses nutrientes nessas mesmas amostras
pelo método da extração via úmida em sistema aberto com a mistura
de HNO3 + H2O2 para digerir a matéria seca ........................................
38
Teores mínimos e máximos esperados de nitrogênio (A), fósforo (B),
potássio (C), cálcio (D) e magnésio (E) nas amostras-padrão, e
valores observados para os teores desses nutrientes nessas mesmas
amostras pelo método da digestão via úmida em sistema aberto com a
mistura de H2SO4 + H2O2 para digerir a matéria seca............................
40
Teores mínimos e máximos esperados de ferro (A), manganês (B),
zinco (C) e boro (D) nas amostras-padrão, e valores observados para
os teores desses nutrientes nessas mesmas amostras pelo método da
digestão via úmida em sistema aberto com a mistura de H2SO4 +
H2O2 para digerir a matéria seca............................................................
42
ix
Figura 09 -
Figura 10 -
Figura 11 -
Figura 12 -
Teores mínimos e máximos esperados de fósforo (A), potássio (B),
cálcio (C), magnésio (D) e boro (E) nas amostras-padrão, e valores
observados para os teores desses nutrientes nessas mesmas amostras
pelo método da digestão via úmida em sistema fechado usando forno
micro-ondas como fonte de calor e o HNO3 para digerir a matéria
seca.........................................................................................................
44
Teores mínimos e máximos esperados de ferro (A), cobre (B),
manganês (C), zinco (D) e boro (E) nas amostras-padrão, e valores
observados para os teores desses nutrientes nessas mesmas amostras
pelo método da digestão via úmida em sistema fechado usando forno
micro-ondas como fonte de calor e o HNO3 para digerir a matéria
seca...........................................................................................................
46
Teores mínimos e máximos esperados de fósforo (A), potássio (B),
cálcio (C), magnésio (D) e enxofre (E) nas amostras-padrão, e valores
observados para os teores desses nutrientes nessas mesmas amostras
pelo método da digestão via úmida em sistema aberto com a mistura
de HNO3 + HClO4 ( 3:1) para digerir a matéria seca.............................
48
Teores mínimos e máximos esperados de ferro (A), cobre (B),
manganês (C), zinco (D) e boro (E) nas amostras padrão, e valores
observados para os teores desses nutrientes nessas mesmas amostras
pelo método da digestão via úmida em sistema aberto com a mistura
de HNO3 + HClO4 ( 3:1) para digerir a matéria seca extração dos
nutrientes da matéria seca......................................................................
50
x
APÊNDICE
Página
1. Métodos de dosagem aplicados na obtenção dos macro e micronutrientes do
tecido vegetal.......................................................................................................
58
1.1. Determinação de B (boro)...............................................................................
58
1.2. Determinação de Ca (cálcio) e Mg (magnésio) por espectrofotometria de
absorção atômica (EAA).................................................................................
60
1.3. Determinação de Cu (cobre), Fe (ferro), Zn (zinco) e Mn (manganês) por
espectrofotometria de absorção atômica (EAA).............................................
63
1.4. Determinação de P (fósforo) – método da espectrofotometria com azul de
molibdênio......................................................................................................
65
1.5. Determinação de S (enxofre)...........................................................................
68
1.6. Determinação de K (potássio) por fotometria de chama.................................
71
1.7. Determinação de N (nitrogênio) total – método kjeldahl................................
73
xi
RESUMO
ANA KALINE DA COSTA FERREIRA. Comparação de Métodos de Análise Química de
Nutrientes em Tecido Vegetal. Mossoró - RN, Universidade Federal Rural do Semi-Árido,
Fevereiro de 2014. 88 p.il. Dissertação. Programa de Pós-Graduação em Manejo de Solo e
Água. Orientador: Professor Dr. Fábio Henrique Tavares de Oliveira.
A busca por métodos analíticos rápidos, exatos, precisos, de custo reduzido e que
descarte pouco resíduos após análise, implica no aprimoramento dos métodos de análises
químicas de nutrientes em tecido vegetal, fazendo-se necessário a comparação de métodos
novos com aqueles tradicionalmente utilizados nos laboratórios de rotina. Com este trabalho
objetivou-se comparar a eficiência de seis métodos de análises químicas de tecido vegetal, os
quais diferem entre si quanto aos procedimentos de digestão ou extração dos nutrientes da
matéria seca. Foram utilizadas dez amostras padrão de tecido vegetal (anos 2011 e 2012)
fornecida pelo Programa Inter laboratorial de Análise de Tecido Vegetal (PIATV),
coordenado pela ESALQ/USP, cujos resultados foram previamente conhecidos. Foram
determinados os teores de nitrogênio, fósforo, potássio, cálcio, magnésio, enxofre, boro, ferro,
cobre, manganês e zinco. Os métodos analíticos comparados foram: 1) Extração dos
nutrientes da matéria seca com o uso de HCl 1 mol/L; 2) Digestão via seca (incineração) em
forno mufla e dissolução posterior do resíduo inorgânico (cinzas) com HCl 1 mol/L; 3)
Digestão via úmida em sistema aberto usando bloco digestor como fonte de calor e a mistura
de HNO3+ H2O2 para digerir a matéria seca; 4) Digestão via úmida em sistema aberto usando
bloco digestor como fonte de calor e a mistura de H2SO4 + H2O2 para digerir a matéria seca;
5) Digestão via úmida em sistema fechado usando forno micro-ondas como fonte de calor e o
HNO3 para digerir a matéria seca e 6) Digestão via úmida em sistema aberto usando bloco
digestor como fonte de calor e a mistura de HNO3 + HClO4 (3:1) para digerir a matéria seca.
A eficiência de cada método foi avaliada comparando-se os resultados obtidos para cada
nutriente com os resultados fornecidos pelo PIATV. As análises foram efetuadas no
Laboratório de Fertilidade do Solo e Nutrição de Plantas da Universidade Federal Rural do
Semi-Árido (UFERSA), cada uma das dez amostras padrão foi analisada em quintuplicata
pelos seis métodos analíticos e foram utilizados os mesmos métodos de dosagem para cada
nutriente. Os resultados evidenciaram que, de modo geral, todos os métodos apresentaram boa
à excelente precisão, porém nem todos apresentaram uma exatidão aceitável. Para a extração
do K todos os métodos apresentaram exatidão excelente. A incineração (calcinação) foi o
único método exato, dentre os testados, para a extração de B. A digestão sulfúrica foi o único
método exato, dentre os testados, para a extração de N total. Para a extração de S os métodos
que apresentaram maior exatidão foram a digestão em sistema fechado usando micro-ondas e
o método de digestão nitroperclórica. À exceção dos nutrientes N e B, o método mais exato
para a extração dos macro e micronutrientes avaliados foi nitroperclórico, seguido pelo
método de digestão usando o forno micro-ondas e HNO3 para digerir a matéria seca e pelo
método da digestão usando H2SO4 e H2O2. Para a extração de N, P, K, Ca e Mg pode ser
utilizado o método da digestão sulfúrica. Para a extração de Fe, Cu, Mn e Zn pode ser
utilizado o método da digestão úmida em forno micro-ondas com uso do HNO3.
Palavras Chaves: Análise foliar, métodos de digestão, métodos de extração.
xii
ABSTRACT
ANA KALINE DA COSTA FERREIRA, Comparison Methods of Chemical Analysis of
Nutrients in Tecido Vegetable. Mossoró - RN , Federal Rural University of the Semi - Arid ,
February 2014. 88 p.il. Dissertation. Graduate Program in Management of Soil and Water .
Advisor: Professor Dr. Fábio Henrique Tavares de Oliveira .
The search for rapid analytical methods, accurate, precise, cost-effective and lowwaste disposal after analysis, implies the improvement of methods of chemical analysis of
nutrients in plant tissue, making it necessary to compare new methods with those traditionally
used in routine laboratories. This work aimed to compare the efficiency of six methods of
chemical analysis of plant tissue, which differ in how to nutrient digestion or extraction of the
dry matter. Ten standard plant tissue (years 2011 and 2012) provided by Inter Laboratory
Program Analysis of Plant Tissue (PIATV), coordinated by ESALQ / USP, whose results
were previously known samples were used. Were determined the concentrations of nitrogen,
phosphorus, potassium, calcium, magnesium, sulfur, boron, iron, copper, manganese and zinc.
The analytical methods were compared : 1) extraction of the dry matter of the nutrients with
the use of HCl 1 mol/L, 2) via Digestion dried (incineration) in a muffle furnace and
subsequent dissolution of the inorganic residue (ash) with HCl 1 mol/L ; 3) Digestion wet
processing in open system using block digester as a heat source and a mixture of HNO3 +
H2O2 to digest dry matter; 4) Digestion wet processing in open system using block digester as
a heat source and a mixture of H2SO4 + H2O2 to digest dry matter, 5) via wet digestion in a
closed system using microwave oven as a heat source and HNO3 to digest dry matter and 6)
via wet digestion in an open system using block digester as a heat source and a mixture of
HNO3 + HClO4 (3:1) to digest dry matter . The efficiency of each method was assessed by
comparing the results obtained for each nutrient with the results provided by PIATV. The
analyzes were performed at the Laboratory of Soil Fertility and Plant Nutrition, Federal Rural
University of the Semi -Arid (UFERSA) , each of the ten standard samples was analyzed in
quintuplicate by the six analytical methods and the same methods were used for each dose
nutrient. The results showed that, in general, all methods showed good to excellent accuracy,
but not all showed an acceptable accuracy. For the extraction of K all methods showed
excellent accuracy. Incineration (calcination) was the only accurate method among those
tested for the extraction of sulfuric B. The digestion was the only accurate method among
those tested for extraction of total N. For the extraction of S methods that were more accurate
were the digestion in a closed system using microwave digestion and method nitropercloric.
Except for the N and B, the most accurate method for the extraction of macro and
micronutrient nitroperclóric was followed by a digestion method using the microwave oven
and HNO3 to digest dry matter and the digestion method using H2SO4 and H2O2. For the
extraction of N, P, K, Ca and Mg of sulfuric acid digestion method can be used. For the
extraction of Fe, Cu, Mn and Zn wet digestion method in the microwave oven using HNO3
may be used.
Key Words: Analysis leaf, digestion methods, extraction methods.
xiii
1. INTRODUÇÃO
A avaliação do estado nutricional de uma planta é feita comparando-se os teores de
nutrientes no tecido vegetal diagnosticado nessa planta com valores padrão ou de referência
que são considerados ideais ou recomendados para essa mesma espécie vegetal. Assim, se os
teores dos nutrientes nessa planta forem iguais ou superiores aos teores considerados padrão
ou ideais, considera-se que essa planta está adequadamente nutrida.
A quantificação dos nutrientes no tecido vegetal diagnóstico é feita mediante a
realização da análise química da matéria seca desse tecido vegetal, sendo utilizados diferentes
métodos de análises químicas de tecido vegetal. E a busca por métodos analíticos rápidos,
exatos, precisos, de custo reduzido e que descarte pouco resíduos após análise, implica no
aprimoramento desses, fazendo-se necessário a comparação de métodos novos com aqueles
tradicionalmente utilizados nos laboratórios de rotina.
Todo método de análise química de tecido vegetal é composto de duas etapas. Em
primeiro lugar, realiza-se a digestão ou mineralização da amostra de matéria seca de tecido
vegetal para que todos os nutrientes passem para a solução. Nesse caso, todo o material
orgânico vegetal é digerido ou mineralizado. Alternativamente, alguns métodos não digerem a
matéria seca totalmente, mas faz apenas uma extração ácida dos nutrientes presentes na
matéria seca do tecido vegetal. Na segunda etapa de qualquer método de análise química de
tecido vegetal, procede-se a dosagem ou quantificação da concentração dos nutrientes na
solução obtida após a digestão ou extração realizada na amostra.
A digestão ou mineralização da amostra pode ser realizada por via seca ou úmida
(Almeida, 2007), e ainda por extração. A digestão via seca é mais utilizada para análise de
boro, na qual primeiramente transforma-se a matéria seca vegetal em cinzas mediante a
incineração em mufla e, posteriormente, adiciona-se ácido para dissolver as cinzas e manter
todos os nutrientes em solução. Quanto à digestão via úmida, esta pode ser feita com o auxílio
de ácido (digestão ácida), base (digestão básica) ou fótons (micro-ondas), usando-se
diferentes combinações de substâncias (ácidos, bases, oxidante), temperatura, tempo, entre
outros (Morgano et al., 2002). As digestões via úmida mais utilizada são a sulfúrica, a
nitroperclórica e a nítrica em micro-ondas. Na extração de nutrientes da matéria seca de tecido
vegetal, o procedimento é feito com a utilização de ácidos diluídos, usa-se principalmente o
ácido clorídrico. Esse tipo de mineralização apresenta vantagens em relação aos outros
métodos de digestão, pois não polui o ambiente do laboratório com gases e vapores tóxicos ou
1
corrosivos, devido à utilização de ácidos com concentrações diluídas para extrair os nutrientes
da matéria seca.
Quanto aos métodos de dosagem de nutrientes em solução que são adotados, não há
muita variação entre os laboratórios de análise química de tecido vegetal. No entanto, não há
uniformidade de procedimentos analíticos, assim a grande variação de equipamentos
laboratoriais encontrados no mercado, e as pequenas adaptações desses métodos utilizados
pelos laboratórios podem contribuir para a obtenção de resultados muitas vezes divergentes.
Embora existam diferentes métodos analíticos, cada um desses apresentam vantagens e
desvantagens, e há muita controvérsia quanto ao melhor método para a solubilização das
amostras (Jones & Case, 1990; Hoening, 1995), um ideal para ser adotado nos laboratórios de
rotina, seria aquele exato, preciso, de baixo custo e que descarte poucos resíduos.
Portanto, nos últimos anos, os laboratórios de rotina de análise química de tecido
vegetal têm utilizado novas técnicas de dosagem de nutrientes em extratos de plantas, como
também novos equipamentos e procedimentos para digestão e/ou extração de nutrientes
(Carneiro et al., 2006). Invariavelmente, essas mudanças influenciam diversas características
dos métodos analíticos, como simplicidade, rapidez, exatidão, precisão, custo e geração de
resíduos que causam impactos ambientais.
Diante do exposto, neste trabalho objetiva-se comparar a eficiência de seis métodos
de análises químicas de nutrientes em tecido vegetal, os quais diferem entre si quanto aos
procedimentos de digestão ou extração dos nutrientes da matéria seca, para efeito, foram
utilizadas amostras padrão cujos resultados foram previamente conhecidos.
2
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Avaliação do estado nutricional das plantas
Avaliar o estado nutricional das plantas é conhecer e diagnosticar as suas condições
sob o aspecto da nutrição mineral. O manejo preciso da adubação beneficia o meio ambiente,
diminuindo os níveis de acidificação do solo, eutrofização das águas, poluição do lençol
freático e salinização de áreas. Além disso, os produtores e consumidores se beneficiam com
maior produtividade e qualidade (Fontes, 2001).
A caracterização do desenvolvimento das folhas e dos sintomas de deficiência pode
auxiliar na diagnose de desordens nutricionais e na diferenciação de danos causados por
patógenos, danos químicos ou outros tipos de estresse (Yeh et al., 2000).
O estado nutricional da planta pode ser avaliado utilizando-se procedimentos diretos
e indiretos. Os indiretos estimam a concentração de um nutriente por meio de uma
característica cujos valores possam ser correlacionados com as concentrações do nutriente na
planta. Os diretos são aqueles em que a análise visual e/ou real (análise da massa seca) é
determinada. A análise da massa seca da folha através de procedimentos químicos é
denominada análise foliar (Fontes, 2001).
Para o elemento químico, ou nutriente vegetal, ser considerado essencial ao
crescimento e reprodução da planta, ele precisa satisfazer os seguintes critérios de
essencialidade: a) a planta não é capaz de completar seu ciclo vital na ausência do elemento;
b) a função do elemento não pode ser substituída por outro elemento e, c) o elemento deve
participar diretamente do metabolismo vegetal, fazendo parte de algum constituinte vegetal ou
ser requerido em alguma etapa específica do metabolismo (Arnon e Stout, 1939; Marschner,
1995).
Segundo Barker & Pilbeam, 2007, são conhecidos 14 elementos essenciais,
classificados em macronutrientes (N, P, K, Ca, Mg e S) e micronutrientes (Cu, Zn, Fe, Mn, B,
Cl, Mo e Ni), Porém, a presença do elemento na composição da planta (tecido vegetal) não
implica em essencialidade.
Na análise do tecido vegetal, a concentração do nutriente está diretamente
relacionada com a produção de matéria seca ou produto comercial, e se essa concentração
estiver abaixo do valor adequado para o crescimento ótimo, a planta é dita deficiente
(Marschner, 1995).
A deficiência nutricional produz alterações no metabolismo e crescimento da planta,
inicialmente, retarda os processos metabólicos em que o nutriente participa diretamente e, se a
3
deficiência for agravada, outras etapas do metabolismo serão afetadas indiretamente.
Deficiências severas apresentam sintomas típicos. Entretanto, distúrbios no metabolismo
vegetal, redução de crescimento e de produtividade podem acontecer mesmo sem a
manifestação de sintomas visuais (Epstein & Bloom, 2006).
A diagnose nutricional pode ser feita por meio da observação visual dos sintomas de
distúrbios nutricionais (diagnose visual) ou por meio de procedimentos envolvendo, análise
química de partes particulares da planta. Em ambos os casos há necessidade de se observarem
determinados princípios para que os resultados possam ser devidamente interpretados e
resultem em recomendações com resultados econômicos para os produtores (Malavolta et al.,
1997).
2.2 Diagnose visual
A diagnose visual é um tipo de avaliação do estado nutricional da planta, que
consiste em comparar o aspecto da amostra em questão com uma amostra padrão (Miyazawa
et al., 1992). Havendo falta ou excesso de determinado elemento isto será refletido no aspecto
anormal e visível da planta em relação a uma planta típica (Epstein & Bloom, 2006).
Lembrando que, antes de apresentar sintomas visíveis de deficiência, a planta pode estar com
carência, que pode gerar comprometimento no desenvolvimento e na produção, denominada
fome oculta (Malavolta, 2006).
A análise visual pode ser realizada no campo e não necessita de equipamentos
sofisticados. No entanto, sintomas visuais de toxidez e deficiência observados no campo são
difíceis de serem interpretados devido a interferências e interações diversas. Na maioria das
vezes só é possível diagnosticar sintomas que ocorrem de forma aguda, quando já houve
comprometimento do plantio (Fontes, 2001). Além disso, em condições de campo comumente
tem-se deficiência de mais de um elemento ao mesmo tempo, dificultando ainda mais a
diagnose. Porém são vantagens do método visual: o custo reduzido, a rapidez do diagnóstico e
a pouca dispendiosidade.
De acordo com Bennet (1993), os sintomas foliares podem ser divididos em cinco
classes: a) clorose, uniforme ou interneval; b) necrose, nas pontas, margens ou entre as
nervuras das folhas; c) perda da dominância apical, com morte da gema apical e, ou,
superbrotamento; d) acúmulo de antocianina e desenvolvimento de coloração avermelhada e,
e) deformação, com coloração normal ou amarelecimento.
Os sintomas de deficiências aparecem primeiro nas folhas velhas , quando os
elementos são de alta mobilidade, e nas folhas novas, quando os elementos são de baixa
mobilidade. Caso o elemento seja intermediário, a manifestação dos sintomas poderá ocorrer
4
nas folhas novas ou velhas, dependendo de fatores como grau de deficiência, taxa de
crescimento da planta e espécie. A localização dos sintomas de carência nas folhas, novas ou
velhas depende da mobilidade do nutriente na planta (Fontes, 2001).
São considerados elementos de alta mobilidade: nitrogênio (N), fósforo (P), potássio
(K), magnésio (Mg), cloro (Cl), sódio (Na) e enxofre (S); intermediária: zinco (Zn), cobre
(Cu), molibdênio (Mo), ferro (Fe) e boro (B) e baixa: cálcio (Ca) e manganês (Mn)
(Marschner, 1995).
Para obtenção de melhores resultados durante a diagnose visual, devem ser
observados e analisados os fatores bióticos e/ou abióticos, que podem alterar o estado
nutricional da planta ou induzir padrões de danos que são similares à deficiência ou toxidez de
nutrientes. Os principais fatores são: déficit hídrico ou excesso do suprimento de água, textura
e compactação do solo, variações bruscas de temperatura, reações entre misturas de produtos
fitossanitários, toxidez causada por herbicidas, senescência natural de folhas, ataque de pragas
e doenças e práticas de cultivo inadequadas (Malavolta et al., 1997).
2.3 Análise química de tecido vegetal
A análise de tecidos objetiva a determinação da concentração de nutrientes de uma
porção particular da planta, em determinada ocasião ou estágio de desenvolvimento
morfológico definido. Assim encontra-se quantitativamente e qualitativamente o nutriente,
onde o resultado é expresso com base na matéria seca.
Na análise química de tecido vegetal podem ser empregados os órgãos como folhas,
flores, frutos ou pecíolos. No entanto, a folha surge como o órgão mais indicado para a
maioria das culturas, por ser o fisiologicamente mais ativo, responsável pela produção de
assimilados, e assim nela há maior correlação entre os teores dos nutrientes e a produtividade
das culturas (Cantarutti et al., 2007).
Quando se analisa a parte particular da planta, deve ser definido o método de
diagnose nutricional. O sucesso dessa diagnose depende da escolha do método mais
econômico e apropriado para análise dos nutrientes de interesse, da obtenção de padrões de
referência, da normatização da amostragem, do preparo das amostras, da qualidade das
análises químicas do tecido e da interpretação dos resultados analíticos (Jones, 1981).
2.3.1 Análise química de tecido foliar
O desenvolvimento de um vegetal é muito afetado pela sua nutrição, assim é possível
prevenir morte devido a deficiências ou excessos de nutrientes pela correção dos solos usando
a análise química como critério para recomendação de corretivos e fertilizantes. No entanto,
5
atualmente, é possível usar a própria planta como objetivo de diagnóstico (Bataglia et al.,
1992; Bataglia et al., 1996).
Os diagnósticos nutricionais das plantas são feitos através da análise química das
folhas pela técnica, que de forma ampla, se denomina de diagnose foliar ou, também, análise
química de tecido foliar (Bataglia et al., 1996; Terblanche & Du Plessis, 1992).
Através da análise química de tecido foliar é possível à avaliação do estado
nutricional das plantas, isto é, a identificação do nível de comprometimento da produtividade,
em função da situação nutricional, principalmente em casos extremos (Bataglia, 1996).
A análise química de tecido foliar é uma “ajuda para solução de problemas
nutricionais das plantas crescendo em condições de campo” e, que atualmente é usada em
conjunto com outros métodos, em particular a análise de solo (Malavolta, 2006). Esse tipo de
análise tem sido usado com sucesso, em alguns países, como método para diagnose do estado
nutricional e para a formulação de recomendações de adubação de diversas culturas de
interesse econômico. No Brasil, a utilização desse método, somada à de análise de solo, tem
possibilitado a adubação mineral ou orgânica, com macro e micronutrientes, mais racional
para todas as culturas de exploração comercial (Terra, 2000).
A segurança da análise química de tecido foliar reside no fato desta está baseada no
princípio de que a concentração de nutrientes na planta é um valor integral de todos os fatores
que interagem entre si para afetá-la (Ulrich, 1976; Fregoni, 1980). E a interpretação correta
dos resultados da análise depende de muita experimentação para o estabelecimento de índices
de calibração que reflitam o estado nutricional das plantas (Bataglia, 1996).
2.4 Métodos de análises químicas de tecido vegetal
Na organização de um laboratório devem ser considerados alguns fatores como: tipo
de análises a serem realizadas, métodos analíticos a serem usados, quais os equipamentos
disponíveis, o número de amostras a serem analisadas, o seu custo associado, entre outros
(Tedesco et al.,1995).
A análise química foliar tradicional tem as vantagens de ser rápida e acessível, pois as
rotinas analíticas são relativamente simples e, por isso, são efetuadas por muitos laboratórios,
uma vez que, consiste no preparo dos extratos pela digestão completa da amostra via úmida ou
via seca, com posterior quantificação dos nutrientes no extrato inorgânico (Cazetta et al., 2010).
No
transcorrer
dos
últimos
anos,
pesquisas
e
trabalhos
têm
avançado
significativamente no que diz respeito à análise química de tecidos. Os procedimentos atendem
a uma gama maior de elementos e, as técnicas de determinação ganharam em agilidade e
confiabilidade, tornaram-se mais rápidas e mais precisas (Carneiro et al., 2006).
6
Atualmente os métodos analíticos podem ser caracterizados como digestão de
amostras, ou técnicas de extração, este procedimento pode ser realizado via úmida ou seca, e o
procedimento é realizado com auxílio de ácido (digestão ácida), base (digestão básica) e fótons
(micro-ondas) (Almeida, 2007). O processo por via seca é caracterizado pela transformação do
material em cinzas através da incineração e posterior adição de ácido e a via úmida é realizada
através da utilização dos compostos sem incineração, por métodos com utilização de ácidos ou
bases (Morgano et al., 2002).
Vários métodos de extração foram desenvolvidos a fim de se obter os teores
disponíveis de nutrientes para as plantas (Baumgarten, 2002). Inicialmente, os métodos
utilizados para extração de macro e micronutrientes em extratos (substratos) baseavam-se nos
métodos empregados para solos. Esses métodos foram utilizados por muito tempo, entretanto as
correlações entre as quantidades extraídas dos elementos e as quantidades absorvidas pelas
plantas muitas vezes não foram significativas (Alt, 2001).
Os métodos clássicos utilizados para a extração de elementos químicos do tecido
vegetal são: digestão seca, digestão úmida, digestão úmida em forno micro-ondas e
solubilização em HCl 1mol/L (Silva, 2009).
2.4.1 Extração com soluções de ácidos diluídos (métodos sem digestão)
Os elementos químicos do tecido vegetal são solubilizados na solução de HCl 1 mol/L. A
solução é capaz de extrair elementos químicos do tecido vegetal sem oxidação da matéria
orgânica. O método é aplicável para a determinação total de B, Ca, Cd, Co, Cu, K, Mg, Mn,
Na, Ni, P, Pb e Zn. É possível determinar também o NO3- nesse extrato. A solução de HCl 1
mol/L pode ser substituída por HNO3 1 mol/L , sendo, nesse caso, possível a determinação
além dos elementos citados do Cl-. O método apresenta as seguintes vantagens: não polui o
ambiente do laboratório com gases e vapores tóxicos ou corrosivos; dispensa materiais e
aparelhos específicos, como capelas, mufla, bloco digestor, cadinho e tubo digestor; é
simples, rápido e adaptável em sistema em série; pode utilizar o HCl comercial; tem baixo
custo de extração. A principal desvantagem do método é a extração parcial dos elementos Al,
Fe e S (Miyazawa et al., 1984).
É importante frisar que o método escolhido deve proporcionar segurança e
confiabilidade dos resultados. Adicionalmente, as condições do laboratório devem permitir o
uso seguro para o operador com base nas instalações adequadas que cada método requer.
Somam-se a isto, os aspectos ambientais, como por exemplo, disposição de resíduos sólidos,
líquidos e gasosos (Zagato et al., 1981).
7
2.4.2 Digestão seca (incineração/calcinação)
A digestão seca é a técnica mais antiga e simples de análise de tecido vegetal. Nesta
técnica a matéria orgânica do tecido vegetal é incinerada em mufla elétrica sob temperatura de
450 a 550 °C, e o resíduo inorgânico (cinza) são dissolvidos na solução de ácido diluído,
podendo-se determinar os seguintes elementos nessa solução: Al, B, Ca, Cd, Cl, Cr, Co, Cu,
Fe, K, Mg, Mn, Mo, Na, Ni, P, Pb, S, Se, Si e Zn.
As principais vantagens dessa técnica são: simplicidade de execução, possibilidade
da determinação de vários elementos no material digerido e a não poluição do ambiente do
laboratório com gases ou vapores tóxicos. Entretanto, como desvantagens, o método mostrase: lento (gasta mais de 24 horas), trabalhoso (filtração), dificuldade de automação, com
possibilidade de perdas de elementos por volatilização, mais sujeito à contaminação externa e
mais exigente quanto a materiais especiais (mufla, cadinho de porcelana, cadinho de platina e
outros) (Silva, 2009).
No método da via seca, o oxigênio atmosférico serve como oxidante para a queima
da matéria orgânica, produzindo um resíduo inorgânico. Posteriormente esse resíduo é então
dissolvido por ácidos (Christian, 1994). A via seca, preferida por Bataglia et al., (1983), é um
método simples e permite que se trabalhe com uma quantidade maior de amostra e um melhor
controle das contaminações provenientes de ácidos. No entanto, ela apresenta limitações, pois
muitos elementos podem ser volatilizados, como o enxofre, o arsênio, o selênio o mercúrio
(Jones et al., 1991) e o chumbo, em temperatura superior a 500 °C (Christian, 1994). A
calcinação é também, muitas vezes, limitada, devido a possíveis perdas de elementos voláteis,
a reações dos analitos com o material do cadinho, pela formação de resíduos de combustão de
difícil dissolução e, ainda, a problemas oriundos da contaminação das amostras (Nascentes et
al., 2001).
2.4.3 Digestão úmida em sistemas aberto e fechado com o uso de micro-ondas
O método da via úmida é o mais bem aceito para dissolução de materiais vegetais,
consistindo na destruição da matéria orgânica através da digestão ácida, em alta temperatura.
Os ácidos oxidam a matéria orgânica a dióxido de carbono, água e outros compostos voláteis,
que são eliminados, deixando apenas os sais ou ácidos dos constituintes inorgânicos
(Christian, 1994).
8
A combinação de um ácido oxidante e outro agente oxidante tem sido bastante
empregada, pois o segundo potencializa o poder de oxidação do ácido. Em geral se emprega o
peróxido de hidrogênio como oxidante devido ao seu alto poder de oxidação e ao seu alto
grau de pureza, resultando em baixos valores das amostras em branco. Além disso, o produto
final da sua decomposição é a água. A mistura entre o ácido perclórico e a água oxigenada é
também empregada para amostras de plantas (Clément, 1995), nas quais a água oxigenada é
utilizada na pré-digestão, conforme Abreu (1997).
Com o desenvolvimento da tecnologia de micro-ondas tem havido um crescente
interesse na utilização desse princípio como fonte de aquecimento alternativo na abertura de
amostras. Os resultados têm-se mostrado equivalentes ou melhores que os métodos
tradicionais (Jassie & Kingston, 1988). Um ponto negativo para a análise utilizando microondas é a pequena massa de amostra que se utiliza para digestão, menos de 1,0 g, devido às
altas pressões obtidas por massas superiores. Mas, este valor pode variar um pouco,
dependendo da natureza da amostra. Como é realizado em ambiente fechado, esse
procedimento minimiza riscos de contaminação pela atmosfera e pelos reagentes utilizados
para decomposição, pois estes são requeridos em pequenas quantidades (Korn et al., 2003;
Buldini et al., 2002).
As vantagens da amostra líquida em relação à sólida são: facilidade no preparo de
curvas analíticas com soluções padrão, maior precisão, diluição facilitada, permissão de
análise em fluxo, possibilidade de separar os analitos dos interferentes e/ou concentrados com
solvente orgânico e maior velocidade analítica (Sarruge & Haag, 1974 e Miyazawa et al.,
1992).
Assim um reagente ideal, para dissolução dos elementos das plantas, deve: apresentar
capacidade de dissolução de todos os constituintes químicos do tecido vegetal; ser não
agressivo, não corrosivo e não aderente á superfície dos materiais; oferecer processo simples,
rápido e com o mínimo de etapas analíticas; ser de fácil aquisição no mercado, fácil
purificação e baixo custo; ser de fácil manuseio, não tóxico e não poluente (sem produção de
gases ou vapores tóxicos) Miyazawa et al., 1984; Krug, 1996). Não se conhece, porém até o
momento, um reagente que atenda a todas essas exigências (Silva, 2009).
Em geral, as técnicas convencionais de dissolução por via úmida consomem muito
tempo e algumas marchas analíticas são potencialmente suscetíveis à contaminação e à perda
de elementos químicos por volatilização. A digestão assistida por micro-ondas apresenta
vantagens, pois reduz o tempo de preparação, bem como os riscos associados aos métodos
clássicos, tais como contaminação e perda dos elementos químicos voláteis (Azcue et al.,
1994). Por outro lado, os sistemas abertos de digestão permitem a análise simultânea de um
9
número maior de amostras, facilita a evaporação de ácido, a secagem dos extratos digeridos e
reduzem os problemas analíticos em etapas subsequentes à digestão (Sastre et al., 2002).
Um procedimento de digestão pode consumir até 61% do tempo total gasto no
processamento analítico, podendo ser responsável por até 30% do erro total da análise
(Oliveira, 2003). Outro fator que se deve levar em consideração é que os sistemas abertos não
fornecem interação entre a temperatura e pressão, sendo inferior o poder de digestão para
amostras com alto teor de matéria orgânica (Hurt & Gibbins, 1995).
2.5 Aspectos gerais dos métodos de análises químicas de nutrientes em tecido vegetal
De acordo com Kingston & Jassie (1988) e Krug et al. (2000), os ácidos mais
comumente empregados, na digestão de tecido foliar, são:
a) Nítrico (HNO3), ponto de ebulição, 86°C, agente oxidante mais utilizado na digestão de
amostras orgânicas, libera os elementos na forma de nitratos solúveis e é normalmente
comercializado em forma bastante pura, a 65 – 69% (> 69 %, HNO3 “fumegante”);
b) Clorídrico (HCl), ponto de ebulição, 110 ºC, comercializado com alto grau de pureza a 36 –
38% (11,6 a 12,4 mol l-1). Apesar de ser um ácido forte, não possui propriedades oxidantes e
reage com a maioria dos cátions metálicos de transição, formando complexos bastante fortes
com Au, Tl e Hg e mais fracos com Fe, Ga, In e Sn;
c) Sulfúrico (H2SO4), ponto de ebulição 338 ºC, comercializado como 98% de pureza,
apresenta o ponto de ebulição mais alto entre os ácidos minerais concentrados mais comuns;
d) Perclórico (HClO4), ponto de ebulição 203 ºC, comercializado a 60 - 72% de pureza (nuca
se deve utilizar em concentrações superiores) – a altas temperaturas, é um forte agente
oxidante para matéria orgânica, apresenta baixo poder complexante;
e) Fluorídrico – HF, ponto de ebulição 112 °C, ácido fraco, não oxidante, comercializado
entre 38 – 48% de pureza, é empregado para a dissolução de silicatos, pois o HF é um
poderoso ânion complexante, reage com os elementos que forma óxidos refratários difíceis de
serem dissolvidos;
As seguintes observações devem ser lembradas para a decomposição de materiais
orgânicos e biológicos, quanto à escolha do ácido ou mistura ácida (Krug, 1999):
a) É muito difícil oxidar amostras completamente utilizando somente HNO3 (este ácido tem o
menor ponto de ebulição, sendo o mais moderado dos três ácidos oxidantes). Se por um lado o
baixo ponto de ebulição do azeótropo (86 ºC) facilita a remoção do ácido nítrico após a
oxidação, por outro a baixa temperatura limita a sua eficiência oxidativa. Altas temperaturas
10
são necessárias para possibilitar maior eficiência nas quebras das ligações carbono-carbono
das moléculas orgânicas;
b) HClO4 apresenta alto poder de oxidação, mas quando utilizado isoladamente, torna-se
muito perigoso devido ao risco iminente de explosão, pela formação de percloratos instáveis.
Na prática, recomenda-se usar sempre o ácido perclórico em combinação com outro ácido
(em geral utiliza-se após a adição de ácido nítrico);
c) H2SO4 seria o mais útil dos três ácidos para ser usado sozinho, face ao seu elevado ponto de
ebulição, mas o processo de oxidação é bastante lento. Na maioria dos casos H2SO4 é
utilizado em combinação com HNO3, HClO4 ou H2O2. As misturas ácidas mais usadas em
digestão por via úmida são: nítrico-perclórica, nítrico-sulfúrica, nítrico-peróxida, nítricoclorídrica, nítrico-perclórica-peróxido (Knapp, 1998).
Na prática, a maioria dos métodos de dissolução de amostras inorgânicas é realizada
com o emprego de dois ou três ácidos, pois diferentes propriedades úteis podem ser
combinadas: um ácido oxidante e um ácido complexante; ácidos podem reagir, formando
produtos com maior reatividade do que qualquer um deles separadamente; uma propriedade
indesejável de um determinado ácido pode ser moderada pela presença de outro ácido e a
amostra pode ser dissolvida com um ácido que a seguir pode ser separado da mistura por
outro ácido (Kingston & Jassie, 1988; Krug et al., 2000).
2.5.1 Método de extração via solubilização com adição de HCl
O uso da extração via solubilização de elementos químicos, aparece como uma
promissora alternativa para análises químicas, sendo metodologia que apresenta pequeno risco
operacional e produz resíduos de fácil neutralização, minimizando impactos ao meio
ambiente. No entanto, há necessidade de se comparar os resultados obtidos, com aqueles
oriundos da análise, com outras metodologias correntes na área da nutrição mineral de plantas
(Carneiro et al.,2006).
E ainda, (Carneiro et al, 2006) afirmaram que a extração com HCl, na concentração
de 1 mol/L, e mesmo diluído (0,33 mol/L), proporcionou excelentes valores de solubilização,
sempre acima de 80% ou próximo da máxima solubilidade alcançada e os resultados obtidos
com esta metodologia, além disso, mostraram estreita correlação com as outras técnicas
comparadas – digestão via úmida nitro-perclórica, via seca em cadinhos de porcelana e via
seca em cadinhos de platina, (exceção feita aos valores de Ca) e apresentaram baixos
coeficientes de variação.
11
Estes aspectos todos, associados ao fato de ser metodologia de simples execução
rotineira, e de baixo risco operacional e ambiental, conferem a esta metodologia um potencial
de utilização na rotina analítica para caracterizar K, Mg e Al em folhas de erva-mate
(Carneiro et al., 2006).
2.5.2 Método de extração via seca (incineração) em forno tipo mufla e dissolução
posterior do resíduo (cinzas) com adição de HCl 1 mol/L
Na decomposição por via seca a queima da amostra normalmente é realizada em
forno mufla, no entanto, esta queima é inadequada quando o analito é um elemento volátil,
que pode ser perdido total ou parcialmente devido ás altas temperaturas envolvidas. Essas
temperaturas podem variar de 450- 550 °C. Para evitar estas perdas, podem-se utilizar
temperaturas menores, mas, em contrapartida, corre-se o risco da amostra não ser decomposta
e dar origem a resultados inexatos (Ferrarini, 2006).
As recomendações da concentração de ácidos para a solubilização das cinzas variam.
É sugerido que a concentração final da solução atinja até 1 mol/L no caso da água régia ou
uma dissolução das cinzas em solução ácida contendo 3% de HCl e 1% de HNO3 v/v (Jones &
Case, 1990).
Nesse tipo de decomposição a fração orgânica da amostra é queimada a elevadas
temperaturas pelo oxigênio do ar (que atua como agente oxidante), obtendo-se um resíduo
inorgânico na forma de cinza solúvel em ácido diluído. É comum também a utilização de
reagentes auxiliares de queima antes da decomposição da amostra. Estes reagentes podem
acelerar a oxidação, prevenir a volatilização de certos componentes das cinzas e evitar reações
entre os componentes da cinza e o material do cadinho (Krug, 2006).
2.5.3 Digestão via úmida em sistema aberto e a mistura de HNO3 + H2O2 para digerir a
matéria seca
A mistura HNO3 + H2O2 é adequada a amostras que contenham alto teor de carbono,
tais como, sementes de mamona, gergelim e outros, (Silva, 2009).
A utilização individual do ácido ou da mistura depende da natureza da amostra e do
elemento a ser determinado. Esse método é recomendado para determinação dentre outros,
dos elementos K, Ca, Mg, Cu, Fe, Mn, Zn, Al, Na, Cr, Ni, V, Pb, Cd, Co, Mo. Pode também
ser usado para a determinação de P e S, entre os não metais. Alguns elementos podem ser
12
perdidos completa ou parcialmente por volatilização, aqui podendo ser incluídos os
halogênios, além de Sb, As, B, Hg e Se, se for empregado sistemas abertos de decomposição
(bloco digestor, sistema por micro-ondas focalizadas), sendo nesses casos recomendado o uso
de fornos com micro-ondas fechado (Nogueira, 2003).
2.5.4 Digestão via úmida em sistema aberto e a mistura de H2SO4 + H2O2 para digerir a
matéria seca
Existem muitas variações deste método de extração incluindo o uso de misturas digestoras
com ácido sulfúrico concentrado com adição de sais para aumentar a temperatura de ebulição
do ácido, catalisadores e agentes oxidantes, outros que não o permanganato de potássio que
foi sugerido originalmente por Kjeldahl. Para amostras em que o N está na forma oxidada,
como os nitratos e nitritos, é necessário efetuar um pré-tratamento antes da digestão da
amostra. Os nitratos são reduzidos à amônia; a adição de ferro reduzido em meio ácido libera
H+ e reduz o NO3- à amônia; os nitritos são primeiramente oxidados com permanganato a
nitrato e este é posteriormente reduzido à amônia com adição do ferro reduzido em meio
ácido. O sulfato de potássio é adicionado ao ácido sulfúrico para elevar a temperatura de
digestão. Os catalisadores usados são selênio, óxido de mercúrio (II) e sulfato de cobre para
promover a oxidação da matéria orgânica. Vários agentes oxidantes são usados, um deles já
referido é o permanganato de potássio. O agente oxidante mais usado é o peróxido de
hidrogênio (H2O2) e tem mostrado ser melhor nas digestões que não requerem pré-tratamento
da amostra (Trivelin, 1973).
A mistura H2SO4 + H2O2 é utilizada na digestão do tecido vegetal para a
determinação de N total ou proteína total e P total. O nitrato encontrado na planta não é
determinado nesse extrato digerido. Nesse extrato digerido também se pode determinar os
metais Al, Cr, Fe, Ni e Pb. Entretanto, frequentemente a contaminação dos reagentes por esses
metais dificulta suas determinações (Silva, 2009).
O ácido sulfúrico diluído não tem praticamente poder oxidante, a não ser o
proveniente dos íons hidrogênio, que podem ser reduzidos a hidrogênio gasoso pela ação dos
metais em solução. O ácido concentrado, por outro lado, quando aquecido, oxida muitos
elementos, sendo ele próprio reduzido a SO3, enxofre elementar ou H2S. Quase todos os
compostos orgânicos são parcialmente oxidados ou completamente destruídos pelo ácido
concentrado a quente (Bock, 1979).
13
2.5.5 Digestão via úmida em sistema fechado usando forno micro-ondas como fonte de
calor e o HNO3 para digerir a matéria seca
Um recente desenvolvimento em termos de digestão por via úmida a elevadas
pressões (e consequentemente a elevadas temperaturas) se baseia na decomposição de
amostras por micro-ondas, utilizando ácido nítrico e outros ácidos minerais em recipientes de
Teflon selados. O equipamento utilizado é um forno de micro-ondas, especialmente projetado
para uso em laboratório, com paredes revestidas de material anticorrosivo, sensores de
temperatura e pressão nos recipientes. A eficiência da decomposição é citada na literatura
como sendo dramaticamente maior com o uso deste tipo de equipamento em relação aos
métodos tradicionais de abertura de amostras. Por exemplo, aberturas que levam várias horas
em condições atmosféricas são completadas em poucos minutos pela técnica de micro-ondas.
Outra vantagem é que a quantidade de reagente necessária para a digestão é muito menor,
diminuindo os níveis do branco significativamente (Kingston & Jassie, 1986).
A abertura de amostras em forno micro-ondas vem sendo cada vez mais utilizada
devido às vantagens frente aos métodos de digestão tradicionais, pois não há perda do analito
por volatilização, permitindo menor consumo de reagente e menor tempo de digestão, com
mínima contaminação externa e sem desprendimento de gases e vapores tóxicos. O uso de
micro-ondas nos processos de digestão de amostras, inclusive para a decomposição de
silicatos, tem despertado grande interesse (Boaventura, 1996).
Em geral, os procedimentos realizados em frascos fechados são mais rápidos e
eficientes, enquanto que a utilização de sistemas abertos implica em etapas trabalhosas e
tediosas, possibilitando, ainda, perdas de analitos por volatilização e/ou contaminação das
amostras (Oliveira, 2003; Luque-Garcia & Castro, 2003; Capelo et al., 2005).
A digestão ácida empregando aquecimento induzido por energia de micro-ondas é
uma metodologia atualmente bem estabelecida para o tratamento de amostras visando à
determinação de metais (Bernmejo-Barreira et al., 2001).
Esta técnica de digestão, assim como os procedimentos convencionais, requer, na
grande maioria dos casos, o uso de ácidos concentrados. Embora a introdução dos fornos de
micro-ondas tenha permitido abreviar os tempos de digestão, a principal limitação desta
técnica está relacionada ao alto custo dos instrumentos empregados. Outras dificuldades
associadas ao pré-tratamento de amostras usando radiação na faixa de micro-ondas são: (1) os
altos tempos de resfriamento requeridos até a abertura dos frascos de alta pressão, embora esta
limitação possa ser contornada pelo uso de fornos de micro-ondas com radiação focalizada,
14
que trabalham sob pressão atmosférica e (2) a geração de vapores nocivos, muitas vezes
cancerígenos, como consequência da destruição da matriz da amostra (Soriano, 2006).
2.5.6 Digestão via úmida em sistema aberto e a mistura de HNO3 + HClO4 (3:1) para
digerir a matéria seca
O método da decomposição por via úmida com a mistura ácida nítro-perclórica é o
mais utilizado na dissolução de tecidos vegetais por solubilizar quase totalmente a amostra.
No entanto ele apresenta algumas limitações, como a emissão de vapores tóxicos, a
necessidade de utilização de equipamentos especiais (capelas de gases e blocos digestores) e
de reagentes de difícil aquisição (controlados pelo Ministério do Exército, pela Polícia Civil e
Polícia Federal), além do perigo de explosão pelo emprego do ácido perclórico na forma
oxidada e a quente (Miyazawa et. al., 1984).
Os métodos que utilizam HClO4, por sua vez, são criticados (apesar de serem
considerados eficientes) por consumirem horas, às vezes dias, de tratamento, por envolver a
adição repetitiva de ácidos fortes nos frascos de reação. Além disso, pela natureza explosiva
do HClO4 anidro, é necessário o uso de capelas especiais e manuseio muito cuidadoso
(Krishnamurti, 1994).
A mistura HNO3 + HClO4 (3:1) é a mais utilizada para a digestão do tecido vegetal,
sendo aplicável a quase todos os tipos de amostras: folhas, sementes, raízes, caules, cascas e
outros. Nesse material digerido, é possível determinar Al, B, Ca, Cd, Cl, Cr, Co, Cu, Fe, K,
Mg, Mn, Mo, Na, P, Pb, S, Se, Si e Zn. Para sementes com alto teor de óleo (mamona,
gergelim, amendoim e outros) recomenda-se efetuar a pré-digestão com HNO3 + H2O2, para
prevenir a possível explosão do ClO4- na presença de carbono. O método é rápido (o tempo da
digestão é de 1 a 2 horas) e permite análise em série. Entretanto, a grande inconveniência do
método é o desprendimento de gases e vapores tóxicos de NO, NO2, HNO3, HClO4 durante a
digestão. Esses vapores são também altamente corrosivos, atacando principalmente o bloco
digestor e a capela, o que cria a possibilidade de explosão pelo acúmulo dos vapores de
HClO4 na capela (Silva, 2009).
15
3. MATERIAL E MÉTODOS
De modo geral, as ações descritas a seguir tiveram como pressupostos resultados de
investigações científicas, onde para a realização da pesquisa foram avaliados seis métodos de
análise química de tecido vegetal, utilizando amostras de tecido vegetal fornecidas pelo
Programa Interlaboratorial de Análise de Tecido Vegetal (PIATV), coordenado pela
ESALQ/USP. O Programa baseia-se no envio de 16 amostras prontas (amostras padrão) de
tecido vegetal, identificadas apenas por uma numeração. Essas amostras, a cada ano, são
analisadas por laboratórios em todo mundo e a avaliação dos resultados é realizada através de
um procedimento estatístico elaborado especialmente para o programa.
Das 16 amostras recebidas, referentes aos anos 2011 e 2012, com os resultados
previamente conhecidos, foram selecionadas 10 amostras para serem utilizadas na pesquisa. A
seleção seguiu o critério de diversidade em relação aos teores de nutrientes encontrados, cujos
resultados (valores máximos, mínimos e a média) são apresentados no quadro 1.
A pesquisa foi realisada no Laboratório de Fertilidade do Solo e Nutrição de Plantas
da Universidade Federal Rural do Semi-Árido (UFERSA), onde foram utilizadas duas etapas
na obtenção dos teores de nutrientes no tecido vegetal.
1a etapa – Mineralização ou digestão das amostras
Cada uma das dez amostras padrão foi analisada em quintuplicata pelos seis métodos
analíticos de digestão ou extração dos nutrientes da matéria seca de tecido vegetal: 1)
Extração dos nutrientes da matéria seca com o uso de HCl 1 molL; 2) Digestão via seca
(incineração) em forno mufla e dissolução posterior do resíduo inorgânico (cinzas) com HCl 1
mol/L; 3) Digestão via úmida em sistema aberto usando bloco digestor como fonte de calor e
a mistura de HNO3+ H2O2 para digerir a matéria seca; 4) Digestão via úmida em sistema
aberto usando bloco digestor como fonte de calor e a mistura de H2SO4 + H2O2 para digerir a
matéria seca; 5) Digestão via úmida em sistema fechado usando forno micro-ondas como
fonte de calor e o HNO3 para digerir a matéria seca; 6) Digestão via úmida em sistema aberto
usando bloco digestor como fonte de calor e a mistura de HNO3 + HClO4 (3:1) para digerir a
matéria seca.
Em cada método foi obtido um extrato, o qual recebeu uma nomenclatura de extrato
1. Esses extratos foram armazenados em coletores para serem utilizados na etapa 2.
16
2a etapa – Dosagem
Na etapa de dosagem dos elementos químicos nos extratos obtidos, foram utilizados
os mesmos métodos de dosagem desses elementos químicos. Os nutrientes analisados foram:
Nitrogênio, fósforo, potássio, cálcio, magnésio, enxofre, ferro, cobre, manganês, zinco e boro.
Os procedimentos analíticos adotados em cada um dos seis métodos analíticos
avaliados, bem como os procedimentos de dosagem são descritos a seguir.
17
Quadro 1 – Resultados das análises químicas das amostras-padrão fornecidos pelo Programa Interlaboratorial de Análise de Tecido Vegetal
Amostra
padrão
Medida
estatística
N
P
K
Ca
Resultados das análises(1)
Mg
S
B
-1
------------------------------------------ g kg ------------------------------------------
1
3
6
7
8
Cu
Fe
Mn
Zn
-1
--------------------------------- mg kg ---------------------------------
Média
19,11
1,92
16,91
35,91
3,00
2,15
89,89
6,73
278,26
24,81
16,05
Mínimo
16,67
1,58
13,83
27,41
2,43
1,54
61,96
4,61
200,55
16,15
10,26
Máximo
21,55
2,25
20,00
44,41
3,57
2,77
117,83
8,84
355,98
33,47
21,85
Média
16,99
0,93
6,49
7,23
2,16
0,83
28,49
7,64
211,62
222,44
16,63
Mínimo
14,45
0,69
4,81
5,22
1,71
0,54
20,82
5,28
153,71
179,74
11,3
Máximo
19,53
1,16
8,17
9,24
2,61
1,11
36,16
10,01
269,53
265,14
21,96
Média
32,07
3,38
24,75
16,88
3,47
2,08
82,32
12,36
759,22
78,29
63,16
Mínimo
28,00
2,75
19,73
13,11
2,72
1,55
58,18
9,23
509,16
62,06
50,18
Máximo
36,15
4,00
29,78
20,65
4,23
2,61
106,46
15,49
1009,28
94,52
76,13
Média
5,90
1,09
2,94
1,24
0,74
0,57
6,58
5,09
72,94
215,47
19,63
Mínimo
4,27
0,69
1,76
0,60
0,52
0,35
3,12
3,42
43,87
166,89
14,04
Máximo
7,54
1,48
4,11
1,87
0,95
0,79
10,03
6,75
102,01
264,06
25,23
Média
14,70
2,40
3,15
0,34
0,81
0,82
4,85
2,81
20,90
4,89
18,58
Mínimo
12,58
1,74
2,16
0,13
0,57
0,53
2,45
1,54
9,81
2,96
12,77
Máximo
16,81
3,07
4,13
0,55
1,05
1,12
7,25
4,09
31,99
6,81
24,39
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Continuação...
18
Amostra
padrão
Medida
estatística
N
P
K
Ca
Resultados das análises(1)
Mg
S
B
-1
------------------------------------------ g kg -------------------------------------------
9
10
13
14
16
Cu
Fe
Mn
Zn
-1
--------------------------------- mg kg ---------------------------------
Média
25,16
1,73
25,81
7,48
3,53
1,80
24,60
7,49
275,57
377,33
17,02
Mínimo
22,67
1,39
19,95
5,86
2,83
1,15
17,52
5,40
222,03
305,34
11,71
Máximo
27,65
2,07
31,67
9,10
4,23
2,44
31,68
9,57
329,12
449,32
22,34
Média
31,26
3,03
51,14
9,50
2,70
2,36
27,98
8,88
477,78
59,42
46,13
Mínimo
26,90
2,33
33,79
7,57
1,98
1,57
19,43
6,03
371,68
43,19
36,08
Máximo
35,61
3,74
68,49
11,42
3,41
3,16
36,53
11,73
583,87
75,65
56,18
Média
16,90
3,34
33,53
5,39
2,27
1,75
18,03
9,61
149,13
40,76
85,37
Mínimo
13,98
2,68
25,16
4,17
1,88
1,29
12,04
7,50
103,05
30,87
64,80
Máximo
19,83
4,00
41,90
6,60
2,66
2,21
24,02
11,71
195,20
50,65
105,94
Média
15,37
1,33
8,99
6,02
1,32
1,53
12,84
5,32
256,97
94,31
15,81
Mínimo
13,82
1,07
6,93
4,88
1,10
1,17
8,39
3,36
186,29
74,99
11,65
Máximo
16,92
1,59
11,05
7,16
1,55
1,89
17,29
7,28
327,66
113,63
19,97
Média
28,99
2,07
13,25
12,22
3,58
1,97
42,97
10,40
345,64
72,52
21,51
Mínimo
25,68
1,69
10,34
9,82
2,91
1,37
27,83
7,24
269,97
58,18
16,52
Máximo
32,29
2,46
16,15
14,61
4,24
2,57
58,11
13,57
421,31
86,86
26,51
(1)
Resultados obtidos a partir da terceira rodada de cálculos realizados com os dados fornecidos por 110 laboratórios de análises de tecido vegetal do Brasil. O valor mínimo é
igual à média menos duas vezes o desvio padrão e o valor máximo é igual à média mais duas vezes o desvio padrão.
19
3.1. Descrição dos métodos de digestão da matéria seca e de extração dos nutrientes do
tecido vegetal
Todos esses procedimentos de digestão ou extração foram adaptados do manual de
análises de solo, plantas e fertilizantes da Embrapa, (Silva, 2009).
3.1.1 Extração dos nutrientes da matéria seca com o uso de HCl 1 mol/L
Transferiu-se 0,5 g de matéria seca para frasco de vidro comum de 50 mL ou
erlenmeyer de 125 mL, adicionou-se 25 mL de HCl 1 mol/L, tampou-se os frascos e anotouse o peso total (frasco + matéria seca + solução de HCl).
Após a pesagem, aqueceu-se por 15 minutos em banho-maria a 800C, agitou-se por
15 minutos no agitador horizontal a 250 rpm. Após o resfriamento foi verificado se ocorreu
alguma evaporação, no caso não ocorreu, pois os frascos estavam tampados. Caso tivesse
ocorrido, seria necessário repor a água evaporada até o peso inicial com água destilada e
depois filtrar com papel de filtro.
Para cada bateria de amostras, a serem analisadas, foi realizado uma prova em branco
adotando os mesmos procedimentos das demais amostras, excluindo-se apenas a colocação da
matéria seca para extração.
3.1.2 Digestão via seca (incineração) em forno tipo mufla e dissolução posterior do
resíduo (cinzas) com HCl 1 mol/L
Esse método de digestão compreendeu duas etapas: a de incineração da matéria seca
e a de dissolução das cinzas em meio ácido.
Adicionou-se 0,5 g de matéria seca em cadinho de porcelana e levou-os à mufla
elétrica. Aumentou-se a temperatura gradativamente até atingir 500 ºC, permaneceu nessa
temperatura durante 3 horas e em seguida desligou-se a mufla e deixou ocorrer o
resfriamento.
O resíduo da matéria seca de tecido vegetal (cinzas) que permaneceu em cada
cadinho foi dissolvido adicionando-se 25 mL de HCl 1 mol/L, para obtenção do Extrato1, a
partir do qual foram dosados os teores dos nutrientes.
Para cada bateria de amostras, a serem analisadas, foi realizado uma prova em branco
adotando os mesmos procedimentos das demais amostras, excluindo-se apenas a colocação da
matéria seca para incineração.
20
3.1.3 Digestão via úmida em sistema aberto usando bloco digestor como fonte de calor e
a mistura de HNO3 + H2O2 para digerir a matéria seca
Transferiu-se 0,3 g de matéria seca para tubo digestor de 80 mL. Levou-os para o
bloco digestor que se encontrava na capela de exaustão de gases e, em cada tubo digestor,
adicionou-se 6 mL de HNO3 65% p.a. O bloco digestor foi ligado e aquecido até alcançar a
temperatura de 80 ºC, e permaneceu nesta temperatura por 1 hora.
Em seguida, acrescentou-se 3 mL de H2O2 30 % p.a e aumentou-se gradativamente a
temperatura para 160 0C, a qual foi alcançada em aproximadamente 1 hora, permaneceu nesta
temperatura por mais uma hora e meia. Em seguida desligou o bloco digestor, deixou ocorrer
o resfriamento e depois se adicionou água destilada até completar o volume para 50 mL. Este
foi o extrato 1.
Para cada bateria de amostras, a serem analisadas, foi realizado uma prova em branco
adotando os mesmos procedimentos das demais amostras, excluindo-se apenas a colocação da
matéria seca para digestão.
3.1.4 Digestão via úmida em sistema aberto usando bloco digestor como fonte de calor e
a mistura de H2SO4 + H2O2 para digerir a matéria seca
Nesse método de digestão, utilizou-se uma “mistura digestora” de três reagentes
puros para análise, preparada da seguinte maneira. Pesou-se 100 g de Na2SO4, 10 g de
CuSO4.5H2O e 1 g de Se, separadamente. Moeu cada reagente em almofariz, um por vez, até
obtenção de um pó fino. Misturaram-se bem os três reagentes e moeu novamente no
almofariz.
Na preparação da “mistura digestora”, o Na2SO4 pode ser substituído por K2SO4,
mas com essa substituição o potássio não poderá ser analisado nesse extrato devido à alta
concentração desse elemento com a adição de K2SO4 na mistura digestora. Geralmente, o Se
já é adquirido em pó.
Transferiu-se 0,4 g de matéria seca para tubo digestor de 100 mL e adicionou 2
mL de H2O2 30% p.a. Na capela, foi adicionado vagarosamente 4 mL de H2SO4 98% p.a e
depois adicionou-se 0,7 g da “mistura digestora”. Ao adicionar o H2SO4 no tubo digestor, é
necessário cuidado, pois a reação é rápida.
Colocaram-se os tubos no bloco digestor e aqueceu por 30 minutos a 250 0C e
aumentou-se a temperatura á 350 0C, até obtenção de um líquido viscoso esverdeado, o que
durou em média 3 horas. O bloco digestor foi desligado e deixou ocorrer o resfriamento, mas
21
mantendo a capela ligada para liberação dos vapores tóxicos. Em seguida, adicionou-se água
destilada até completar o volume de 50 mL, o que se constituiu no extrato 1.
Para cada bateria de amostras, a serem analisadas, foi realizado uma prova em branco
adotando os mesmos procedimentos das demais amostras, excluindo-se apenas a colocação da
matéria seca para digestão.
3.1.5 Digestão via úmida em sistema fechado usando forno micro-ondas como fonte de
calor e o HNO3 concentrado para digerir a matéria seca
Para aplicação dessa técnica de digestão com aquecimento por micro-ondas em tubos
de teflon pressurizados, utilizou-se o Digestor MARS™ fabricado pela CEM Corporation.
Transferiu-se 0,5 g de matéria seca para tubo de teflon de 100 mL, adicionou-se 5
mL de HNO3 65% p.a. Colocou os tubos no cilindro de aço de segurança do equipamento.
Introduziu-se o tubo no Digestor MARS™ e submeteu-o à temperatura de 170 a 180 0C, pressão de
20 a 25 bar e potência de 600 a 1000 W por 20 minutos, manteve-se nesta temperatura por
mais 15 minutos. Após desligar o Digestor MARS™ e esfriar os extratos, adicionou-se água
destilada até completar o volume de 25 mL (extrato 1).
Para cada bateria de amostras, a serem analisadas, foi realizado uma prova em branco
adotando os mesmos procedimentos das demais amostras, excluindo-se apenas a colocação da
matéria seca para digestão.
3.1.6 Digestão via úmida em sistema aberto usando bloco digestor como fonte de calor e
a mistura de HNO3 + HClO4 (3:1) para digerir a matéria seca
Na preparação da solução digestora ácida, misturaram-se três partes (em volume) de
ácido nítrico concentrado (HNO3 65% p.a) mais uma parte (em volume) de ácido perclórico
concentrado (HClO4 72% p.a).
Transferiu-se 0,5 g de matéria seca para tubo digestor de 80 mL, adicionou-se 8 mL
da solução digestora ácida e levou-os para o bloco digestor desligado, mantendo esse material
em pré-digestão à temperatura ambiente pelo período de 4 horas. Após esse período, ligou-se
o bloco digestor e aqueceu-o lentamente até atingir a temperatura de 120 ºC e permaneceu
com o material nessa temperatura até cessar o desprendimento do vapor castanho de NO2.
Em seguida, aumentou-se a temperatura para 200 ºC e manteve-se até cessar o
desprendimento do vapor branco de HClO4, o que durou, em média, de 3 a 4 horas. Desligou
22
o bloco digestor e deixou esfriar o material e depois complete o volume até 25 mL com água
destilada, para obtenção do extrato 1.
Para cada bateria de amostras, a serem analisadas, foi realizado uma prova em branco
adotando os mesmos procedimentos das demais amostras, excluindo-se apenas a colocação da
matéria seca para digestão.
3.2 Métodos de dosagem dos nutrientes nos extratos provenientes da digestão ou da
extração
O B e o P foram determinados por espectrometria de absorção molecular, sendo o
primeiro com a utilização de azometina-H (460 nm) e o segundo pelo método do azul de
molibdênio (660 nm). O S foi dosado pelo método da turbidimetria do sulfato de bário, lendose as amostras no espectrofotômetro a 420 nm. Os elementos Ca, Mg, Fe, Cu, Mn e Zn foram
determinados por espectrometria de absorção atômica e o K por fotometria de chama. Todos
esses procedimentos de dosagem foram realizados de acordo com Embrapa (2009).
A concentração de N total nos extratos foi medida pelo método kjeldahl, destilandose todo o amônio do extrato em meio fortemente alcalino e retendo a amônia em uma solução
de ácido bórico, que depois foi titulada com ácido sulfúrico (Tedesco et al., 1995; Silva,
2009).
3.3 Índices de exatidão e de precisão dos métodos analíticos comparados para avaliar os
teores de nutrientes em tecido vegetal.
A eficiência de cada método analítico comparado foi com base em critérios de
exatidão e de precisão. A exatidão de cada método foi avaliada a partir dos resultados das
concentrações dos nutrientes obtidos em cada método, observando se os valores situavam-se
dentro do intervalo de confiança dos valores reais das concentrações de nutrientes das
amostras padrão.
A estimativa da exatidão de cada método foi calculada utilizando-se a seguinte
expressão:
IE = Índice de exatidão do método analítico para determinado nutriente (%);
Nº de acertos = número de amostras cujos resultados observados ficaram dentro do intervalo
de confiança para os valores reais das concentrações de nutrientes nas amostras padrão;
23
Os seis métodos analíticos, a partir dos resultados das concentrações de cada
nutriente, foi classificado, em relação à exatidão, de acordo com o quadro abaixo:
Quadro 2 – Classificação da exatidão de métodos analíticos utilizados para a análise química
de tecido vegetal
Índice de exatidão
Exatidão
90% ≤ IE ≤ 100%
Excelente
70% ≤ IE < 90%
Boa
60% ≤ IE < 70%
Regular
IE ˂ 60%
Ruim
A precisão, como está relacionada com a repetibilidade ou variabilidade do método
analítico, foi estimada por meio do coeficiente de variação, determinado a partir dos
resultados obtidos para as cinco repetições. Dessa forma, calculou-se um coeficiente de
variação para cada método, dentro de cada nutriente.
Os seis métodos analíticos, a partir dos resultados das concentrações de cada
nutriente, foi classificado, em relação à precisão, de acordo com o quadro abaixo:
Quadro 3 – Classificação do coeficiente de variação dos métodos analíticos utilizados para a
análise química de tecido vegetal
Índice de precisão
Precisão
CV ≤ 10%
Excelente
10% < CV ≤ 30%
Boa
30% < CV ≤ 40%
Regular
CV ˃ 40%
Ruim
24
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Extração dos nutrientes da matéria seca com o uso de HCl 1 mol/L
A utilização do método de extração de nutrientes com HCl 1 mol/L resultou em
concentrações baixas de nitrogênio (Figura 1a), fósforo (Figura 1b), cálcio (Figura 1d) e
enxofre (Figura 1f), ao contrário do observado para as concentrações de potássio (Figura 1c) e
magnésio (Figura 1e) que se mantiveram dentro do intervalo de confiança. Resultados
semelhantes para o cálcio também foram encontrados por Vila Nova et al. (2012), ao
avaliarem a eficiência da extração de nutrientes da matéria seca de tomate utilizando a
solução de HCl 1mol/L. Esses autores também verificaram que a solução de HCl 1 mol/L só
extraiu parte do Ca total presente na matéria seca vegetal.
Comparando cinco métodos de análise química foliar e suas relações para análise de
K, Ca, Mg e Al, Carneiro et al. (2006) verificaram que a extração com ácido clorídrico
resultou em maiores valores de K e Mg, tendo ainda os resultados mostrado estreita
correlação com as outras técnicas de extração comparadas (exceção feita aos valores de Ca).
Infere-se que, apesar desse método mostrar ser um dos mais promissores, pela
rapidez e simplicidade, aliado ao baixo nível de risco no manuseio e contaminação ambiental,
ser de simples execução rotineira e, apresentar potencial de utilização na rotina analítica para
caracterizar alguns nutrientes, como o K e o Mg (Carneiro et al., 2006), apresenta uma
exatidão ruim, para a maioria dos macronutrientes, com exceção de K e Mg, com 100% e
90% respectivamente (Quadro 4).
Para o nitrogênio (Figura 1a), verifica-se que o método foi totalmente ineficiente, com 0% de
exatidão (Quadro 4), visto que, praticamente não houve extração de nitrogênio, pois todas as
concentrações de N foram iguais ou bem próximos à zero. Provavelmente isso ocorreu devido
à função estrutural que o nitrogênio ocupa na planta, assim um método sem digerir totalmente
a matéria seca não seria capaz de extrair tal nutriente.
25
------- Mínimo
(A)
(B)
(C)
(D)
(E)
(F)
 Máximo
 Observado
------- Mínimo
 Máximo
 Observado
Figura 1 – Teores mínimos e máximos esperados de nitrogênio (A), fósforo (B), potássio (C),
cálcio (D), magnésio (E) e enxofre (F) nas amostras-padrão, e valores observados
para os teores desses nutrientes nessas mesmas amostras pelo método da extração
dos nutrientes da matéria seca com o uso de HCl 1 mol /L.
26
Quadro 4 – Índice de exatidão dos métodos analíticos comparados para avaliar os teores de
nutrientes em amostras padrão de tecido vegetal
Nutrientes
Método
N
P
K
Ca
Mg
S
Fe
Cu
Mn
Zn
B
----------------------------------------------- % ----------------------------------------------Extração com HCl
0
0
100
0
100
0
20
90
90
20
0
Extração via seca
0
90
60
50
100
40
10
40
30
50
100
Digestão nítrica com
peróxido
-
40
100
60
30
40
90
70
100
80
0
100
80
100
100
90
-
70
-
70
60
0
-
80
100
100
90
70
90
80
90
90
10
-
100
100
100
100
70
90
100
100
90
0
Digestão sulfúrica
Digestão nítrica
(micro-ondas)
Digestão nitroperclórica
Para os micronutrientes, verificou-se que a utilização desse método, na extração dos
nutrientes, resultou em concentrações inferiores para o ferro (Figura 2a) e superiores para o
Zinco (Figura 2d) e o Boro (Figura 2e), em relação às concentrações desses nutrientes nas
amostras padrão (Quadro 1). No caso dos micronutrientes cobre e manganês, os valores
observados estão dentro do intervalo de confiança para as concentrações esperadas desses
nutrientes nas amostras padrão (Figuras 2b e 2c).
Os resultados para os micronutrientes Fe, Cu, Mn e Zn (Figura 2), no presente
trabalho, divergem daqueles observados no trabalho de Vila Nova et al. (2012), onde
verificaram menores valores para os elementos Cu, Mn e Zn. Além disso, esses autores
verificaram que, para o ferro, o método de extração com HCl se equivaleu ao método da
digestão nitroperclórica.
O coeficiente de variação para os micronutrientes analisados apresentou níveis baixos,
de bom a excelentes, para a maioria desses nutrientes (Quadro 5) com exceção do boro (CV =
49,3%). Estes valores adequados de CV vêm a demonstrar a precisão das análises realizadas,
nesse método, mesmo esse apresentando elevado índice de exatidão apenas para Cu e Mn
(Quadro 4).
27
(A)
(B)
(C)
(D)
(E)
------- Mínimo
 Máximo
 Observado
Figura 2 – Teores mínimos e máximos esperados de ferro (A), cobre (B), manganês (C), zinco
(D) e boro (E) nas amostras padrão, e valores observados para os teores desses
nutrientes nessas mesmas amostras pelo método da extração dos nutrientes da
matéria seca com o uso de HCl 1 mol/L.
28
Quadro 5 – Coeficientes de variação dos métodos analíticos comparados para avaliar os teores
de nutrientes em amostras padrão de tecido vegetal
Nutrientes
Método
N
P
K
Ca
Mg
S
Fe
Cu
Mn
Zn
B
----------------------------------------------- % ----------------------------------------------Extração com HCl
-
9,6
2,6
16,8
6,9
9,0
6,9
5,2
7,8
7,6
49,3
Extração via seca
12,5
6,2
3,7
10,8
6,7
3,3
10,8
12,3
7,9
7,1
23,5
-
11,1
2,0
7,4
5,5
3,5
6,4
13,8
3,5
5,5
12,5
1,7
3,1
4,3
5,6
5,6
-
9,9
-
5,9
5,5
27,0
-
4,5
3,4
4,2
3,2
4,7
5,0
4,5
2,0
3,2
49,5
-
5,2
5,5
4,8
5,2
5,2
7,1
2,9
4,8
5,6
107,6
Digestão nítrica com
peróxido
Digestão sulfúrica
Digestão nítrica
(micro-ondas)
Digestão
nitroperclórica
A solução de HCl 1 mol/L extraiu poucos nutrientes da matéria seca vegetal (Figuras
1 e 2) provavelmente por causa da baixa concentração de ácido dessa solução e da ausência de
substâncias oxidantes que poderiam contribuir para a oxidação total da matéria seca vegetal.
Por este motivo, esse método não deve ser usado para avaliação do estado nutricional das
plantas, até mesmo porque os níveis críticos dos nutrientes nas folhas das plantas foram
definidos (Malavolta et al., 1997) com base em métodos que digerem totalmente a matéria
seca vegetal.
Para melhorar a eficiência do método de extração com HCl, sugere-se o aumento da
concentração de HCl e, ou, o tempo de agitação, combinado ou não com uma pré-digestão da
amostra com a solução extratora durante um pernoite.
29
4.2 Digestão via seca (incineração) em forno tipo mufla e dissolução posterior do resíduo
(cinzas) com HCl 1 mol/L
De modo geral, diante dos resultados obtidos, infere-se que esse método mostra-se
mais eficiente na extração do fósforo e magnésio, com 90% e 100% de exatidão,
respectivamente (Quadro 4), classificada como exatidão excelente (Quadro 2). E tem uma
excelente precisão para a maioria dos macronutrientes, com exceção do nitrogênio (CV =
12,5%) e o cálcio (CV = 10,8%). Para esses apresenta uma boa precisão.
Para o nutriente Mg (Figura 3e) as concentrações em todas as amostras analisadas,
mantiveram-se dentro do intervalo de confiança estabelecido, e ainda um coeficiente de
variação considerado excelente com 6,7% (Quadro 5). Para as concentrações de P (Figura 3b),
constatou-se que 90% das amostras analisadas mantiveram-se dentro do intervalo de
confiança estabelecido, apresentando um CV de 6,2% (Quadro 5), classificado como
excelente (Quadro 2). Por outro lado, para as concentrações de K (Figura 3c), a exatidão foi
de apenas 60%, no entanto o CV foi igual a 3,7% (Quadro 5), classificado como excelente.
Resultados equivalentes, para a extração do potássio, foram encontrados em Carneiro
et al. (2006), que comparando cinco métodos de extração de nutrientes, verificaram que a
digestão via seca com ácido clorídrico foi aquela que se mostrou menos eficiente na extração
de K, e o método foi cerca de 20% inferior àquele mais elevado.
Embora as concentrações das amostras 3, 1, 6 e 10 na análise de potássio, ficarem
um pouco acima do limite superior do intervalo de confiança, esses valores não foram
discrepantes ao ponto de se descartar a possibilidade de utilização desse método de extração
de nutrientes para a quantificação dos teores de K em tecido vegetal, considerando que é
possível extrair quantidades substanciais de K, apenas com água quente (Heinrichs &
Malavolta, 2001; Reissmann et al., 1994).
O referido método proporcionou valores de Ca abaixo do intervalo de confiança para
50% das amostras analisadas (Figura 3d), provavelmente isso ocorreu devido o cálcio ser um
elemento estrutural, e ácidos com concentrações diluídas não são capazes de romper as
ligações estruturais que integram as paredes celulares do tecido vegetal, e portanto, extrair tal
nutriente. Para as concentrações de enxofre (S) essa proporção foi de 60% (Figura 3f).
Carneiro et al. (2006) constataram que a extração de Ca por via seca com adição de HCl
resultaram em solubilizações baixas, em relação ao máximo obtido na digestão nitroperclórica
e na extração via solubilização com adição HCl 1 mol/L.
30
------- Mínimo
(A)
(B)
(C)
(D)
(E)
(F)
 Máximo
 Observado
------- Mínimo
 Máximo
 Observado
Figura 3 – Teores mínimos e máximos esperados de nitrogênio (A), fósforo (B), potássio (C),
cálcio (D), magnésio (E) e enxofre (F) nas amostras padrão, e valores observados
para os teores desses nutrientes nessas mesmas amostras pelo método da extração
via seca (incineração) com adição de HCl 1 mol/L.
31
Para a extração dos micronutrientes, ferro (Fe), cobre (Cu), manganês (Mn) e zinco
(Zn), o método mostrou-se ineficiente em relação às análises das amostras padrão, constatouse que, em maior proporção, os resultados ficaram abaixo dos intervalos de confiança
indicados (Figura 4), no entanto, os coeficientes de variação para esses micronutrientes
analisados foram classificados de bom a excelente (Quadro 5).
De acordo com a Figura 4b, verifica-se que 60% das amostras padrão analisadas
apresentaram concentrações de cobre abaixo do intervalo de confiança indicado pelo PIATV,
sendo as amostras 14 e 7 àquelas que mais se distanciaram do intervalo de confiança.
Para as concentrações de ferro (Figura 4a), os resultados foram mais discrepantes,
90% das amostras analisadas manteve-se fora do intervalo de confiança, tendo, ainda, 70%
das amostras distando com maiores magnitudes dos valores mínimos indicados, apresentando
apenas 10% de exatidão (Quadro 4).
Com relação ao manganês, apesar de apresentar apenas 30% de exatidão (Quadro 4),
as amostras analisadas que ficaram abaixo do intervalo de confiança, não se distanciaram de
forma acentuada dos valores mínimos indicados (Quadro 1). Para o Zn (Figura 4d), foi
verificado uma exatidão de 50% (Quadro 4).
Esses dados corroboram com Souza et al. (2012), os quais observaram inferioridade
significativa da recuperação dos elementos Fe, Zn e Mn em relação à outro método (via
úmida), onde esse efeito foi mais intenso para o Fe, cuja estimativa correspondeu a 27% do
valor médio determinado, comparada com as estimativas para o Zn e Mn, que estiveram entre
8 e 10% dos respectivos valores médios.
Em contrapartida, as concentrações de boro (B), em todas as amostras analisadas,
mantiveram-se dentro do intervalo de confiança estabelecido para as amostras padrão (Figura
4e), isto significa que, este método é eficiente na extração desse micronutriente, com 100%
das amostras analisadas dentro do intervalo de confiança indicado pelo PIATV (Quadro 1), e
ainda, constatou-se um CV igual a 23,5% (Quadro 5), classificado como bom. Portanto o
método mostra-se tanto exato como preciso na extração desse nutriente.
32
(A)
(B)
(C)
(D)
(E)
------- Mínimo
 Máximo
 Observado
Figura 4 - Teores mínimos e máximos esperados de ferro (A), cobre (B), manganês (C), zinco
(D) e boro (E) nas amostras padrão, e valores observados para os teores desses
nutrientes nessas mesmas amostras pelo método da extração via seca (incineração)
com adição de HCl 1 mol/L.
33
A extração por via seca, com uso da mufla e temperatura de 500 ºC, proporcionou
níveis de concentrações baixas para vários nutrientes (Figuras 3 e 4), provavelmente, devido a
altas temperaturas a qual a amostra foi submetida na mufla, ocasionando talvez possíveis
perdas por volatilização, e ainda, pode ter ocorrido contaminação por meio de reações entre os
analitos e o material do cadinho, formando resíduos de difícil combustão e pouco solúveis.
Para melhorar a eficiência do referido método de extração sugere-se a diminuição da
temperatura na digestão, combinado ou não, com o aumento da concentração da solução
extratora de HCl.
34
4.3 Digestão via úmida em sistema aberto usando bloco digestor como fonte de calor e a
mistura de HNO3 + H2O2 para digerir a matéria seca
Verificou-se, com a utilização desse método, que a maioria das amostras, nas
análises dos macronutrientes, apresentou exatidão classificada como ruim (Quadro 2), com
40% na análise de fósforo, 30% na análise de magnésio e 40% na análise de enxofre (Quadro
4).
Com relação ao cálcio, observa-se que 60% das amostras analisadas mantiveram-se
dentro do intervalo de confiança, mesmo com a exatidão de 60%, constatou-se um coeficiente
de variação classificado como excelente (CV = 7,4%).
Para a extração de potássio (K), o método foi tanto exato, quanto preciso, com 100%
das amostras analisadas dentro do intervalo de confiança, e ainda, um coeficiente de variação
igual a 2,0%, classificado como excelente (Quadro 3).
Observou-se no método, coeficientes de variação no intervalo de bom a excelente
(Quadro 3), na análise de todos os macronutrientes (Quadro 5). Estes valores adequados de
CV vêm a demonstrar a precisão das análises realizadas nesse método, mesmo esse não sendo
exato para os nutrientes P, Ca, Mg e S (Quadro 4).
35
(A)
(B)
(C)
(D)
(E)
------- Mínimo
 Máximo
 Observado
Figura 5 – Teores mínimos e máximos esperados de fósforo (A), potássio (B), cálcio (C),
magnésio (D) e enxofre (E) nas amostras padrão, e valores observados para os
teores desses nutrientes nessas mesmas amostras pelo método da extração via
úmida em sistema aberto com a mistura de HNO3 + H2O2 para digerir a matéria
seca.
36
Ainda na análise do método de digestão via úmida em sistema aberto usando bloco
digestor como fonte de calor e a mistura de HNO3 + H2O2 para digerir a matéria seca, em
relação aos micronutrientes, observou-se que esse apresenta um índice de exatidão variando
de bom a excelente (Quadro 4), com exceção do boro, e coeficientes de variação classificado
também de bom a excelente (Quadro 5) para esses nutrientes, inclusive o boro.
Observou-se no método, 70% de exatidão nas análises das amostras padrão, na
extração de ferro, 90% na extração de cobre, 100% na extração de manganês e 80% na
extração de zinco.
Resultados equivalentes para o cobre e ferro também foram encontrados em
Morgano et al. (2002), na determinação de minerais em café cru, onde o referido método de
digestão por via úmida apresentou melhor recuperação apenas na determinação desses
elementos comparado com outra técnica de extração.
Em contrapartida, as concentrações de boro (B), em todas as amostras, mantiveramse fora do intervalo de confiança estabelecido para as amostras padrão (Figura 6e), e com
valores discrepantes comparados aos resultados do intervalo de confiança indicado pelo
PIATV (Quadro 1). Constatou-se 0% de exatidão no método nas análises das amostras padrão
na extração de boro (Quadro 4). Os resultados elevados (Figura 6e) talvez sejam devido à
contaminação do extrato com boro proveniente da vidraria utilizada, a qual é constituída de
borossilicato.
Este método proporcionou baixa extração para alguns nutrientes analisados (Figuras
5 e 6), provavelmente, devido esses elementos apresentarem função estrutural na planta, e as
baixas temperaturas utilizadas não serem suficientes para oxidar a matéria orgânica,
ocasionando a incompleta digestão do tecido, e, portanto, os elementos não ficam solúveis e
disponíveis no extrato.
Para melhorar a eficiência do referido método de digestão, sugere-se o aumento da
temperatura do bloco, bem como um maior tempo de digestão, combinado ou não com uma
pré-digestão da amostra com a solução extratora durante um pernoite.
37
(A)
(B)
(C)
(D)
(E)
------- Mínimo
 Máximo
 Observado
Figura 6 – Teores mínimos e máximos esperados de ferro (A), cobre (B), manganês (C), zinco
(D) e boro (E) nas amostras-padrão, e valores observados para os teores desses
nutrientes nessas mesmas amostras pelo método da extração via úmida em sistema
aberto com a mistura de HNO3 + H2O2 para digerir a matéria seca.
38
4.4 Digestão via úmida em sistema aberto usando bloco digestor como fonte de calor e a
mistura de H2SO4 + H2O2 para digerir a matéria seca
Na análise do método, foi verificado com a análise das amostras padrão, que se
mantiveram dentro do intervalo de confiança para a extração de N, K e Ca com 100% das
amostras analisadas (Figura 7), refletindo uma exatidão excelente (Quadro 4). Os resultados
para a análise das amostras padrão na extração de Mg, mantiveram-se dentro do intervalo de
confiança em 90% das amostras (Figura 7e) e na análise de P, 80% (Figura 7b).
Conforme os resultados encontrados para a digestão sulfúrica com adição de H2O2,
verificou-se valores baixos de coeficientes de variação (Quadro 5) para todos os
macronutrientes analisados no método, refletindo uma precisão excelente (Quadro 3). Isso
implica, segundo Tedesco et al. (1995), que a referida metodologia permite a determinação de
até 5 macro-elementos em uma única digestão.
É relevante destacar a análise de nitrogênio (N) com esse método, onde foi verificado
uma exatidão de 100% (Quadro 4) e um CV de 1,7% (Quadro 5),o menor observado em todas
as análises realizadas.
A digestão sulfúrica foi um método aplicado com sucesso, mostrando-se eficiente e
satisfatório na determinação de N, P, K, Ca e Mg, sendo exato e preciso.
39
(A)
(B)
(C)
(D)
(E)
------- Mínimo
 Máximo
 Observado
Figura 7 – Teores mínimos e máximos esperados de nitrogênio (A), fósforo (B), potássio (C),
cálcio (D) e magnésio (E) nas amostras-padrão, e valores observados para os teores
desses nutrientes nessas mesmas amostras pelo método da digestão via úmida em
sistema aberto com a mistura de H2SO4 + H2O2 para digerir a matéria seca.
40
De acordo com a Figura 8, verifica-se que 70% das amostras padrão na análise de
ferro, 70% das amostras na análise de manganês e 60% das amostras na análise de zinco,
apresentaram concentrações dentro do intervalo de confiança indicado pelo PIATV, e os
coeficientes de variação, para esses micronutrientes analisados, demonstraram níveis
adequados, sendo classificados como excelentes (Quadro 5), evidenciando a precisão das
análises realizadas nesse método.
Por outro lado, para as concentrações de boro (Figura 8d), os resultados observados
foram discrepantes, com 100% das amostras analisadas fora do intervalo de confiança, isso
implica que o método de digestão sulfúrica não é indicado para analisar esse micronutriente,
no entanto foi verificado um coeficiente de variação igual a 27%, classificado como bom
(Quadro 3). Esses resultados elevados na extração do boro, talvez sejam devido à
contaminação do extrato com boro proveniente da vidraria, a qual é constituída de
borossilicato.
O método proporcionou resultados significativos, nas análises das amostras padrão,
nas extrações dos nutrientes N, P, K, Ca, Mg, Fe e Mn (Figuras 7 e 8), principalmente para o
nitrogênio (Figura 7a), em comparação aos métodos citados anteriormente.
Os resultados significativos, provavelmente são devidos o uso do ácido sulfúrico
concentrado e do peróxido de hidrogênio como agente oxidante, essa mistura combinada com
o calor e com catalisadores que aceleram o processo de digestão, provocam a destruição da
matéria orgânica deixando os elementos disponíveis em solução. Quase todos os compostos
orgânicos são parcialmente oxidados ou completamente destruídos pelo ácido concentrado a
quente (Bock, 1979).
Para melhorar a eficiência do método de digestão sulfúrica, sugere-se a busca de catalisadores
que promovam menos contaminação no analito combinado ou não com uma pré-digestão da
amostra com a solução extratora durante um pernoite.
41
------- Mínimo
(A)
(B)
(C)
(D)
 Máximo
 Observado
------- Mínimo
 Máximo
 Observado
Figura 8 – Teores mínimos e máximos esperados de ferro (A), manganês (B), zinco (C) e boro
(D) nas amostras-padrão, e valores observados para os teores desses nutrientes
nessas mesmas amostras pelo método da digestão via úmida em sistema aberto
com a mistura de H2SO4 + H2O2 para digerir a matéria seca.
42
4.5 Digestão via úmida em sistema fechado usando forno micro-ondas como fonte de
calor e o HNO3 para digerir a matéria seca
Comparando os resultados das concentrações dos nutrientes das amostras padrão,
obtidas pela extração com o método digestão via úmida em sistema fechado usando forno
micro-ondas como fonte de calor e o HNO3 para digerir a matéria seca, com os intervalos de
confiança estabelecidos para essas amostras, verifica-se que para as extrações dos nutrientes
K (Figura 9b) e Ca (Figura 9c) em todas as amostras analisadas, as concentrações
mantiveram-se dentro do intervalo de confiança estabelecido pelo PIATV, com 100% de
exatidão. Para os nutrientes S (Figura 9e), P (Figura 9a) e Mg (Figura 9d), constatou-se a
exatidão de 70, 80 e 90%, respectivamente.
De acordo com os resultados obtidos para as amostras padrão em relação aos
intervalos de confiança estabelecidos pelo PIATV e, em detrimento dos coeficientes de
variação encontrados para as amostras analisadas 4,5% para o P, 3,4% para o K, 4,2% para o
Ca, 3,2% para o Mg e 4,7% para o S (Quadro 5), pode-se inferir que esse método de digestão
é altamente preciso na extração desses macronutrientes, visto que para todos os nutrientes os
CVs foram inferiores a 10%, classificados como excelentes (Quadro 3).
A eficiência deste método de extração de nutrientes em relação a outros mais
convencionais, como o método calcinação, o método de digestão sulfúrica e o nitroperclórico,
foi, também, evidenciada por Silva et al. (2008), com os resultados analíticos da determinação
de macro e micronutrientes em folhas de tecido vegetal, a partir dos métodos de extração de
nutrientes, digestão seca, digestão úmida em sistema aberto e digestão úmida em sistema
fechado em forno de micro-ondas, concluíram que os extratos provenientes da digestão úmida
em sistema fechado em forno de micro-ondas foram aqueles que apresentaram maior
eficiência de extração e menor variação em relação aos demais métodos avaliados.
43
(A)
(B)
(C)
(D)
(E)
------- Mínimo
 Máximo
 Observado
Figura 9 – Teores mínimos e máximos esperados de fósforo (A), potássio (B), cálcio (C),
magnésio (D) e boro (E) nas amostras-padrão, e valores observados para os teores
desses nutrientes nessas mesmas amostras pelo método da digestão via úmida em
sistema fechado usando forno micro-ondas como fonte de calor e o HNO3 para
digerir a matéria seca.
44
Com relação aos teores de micronutrientes (Figura 10), verificou-se que o método
testado foi altamente preciso, tendo obtido coeficiente de variação abaixo de 10% (Quadro 5)
para todos os micronutrientes analisados, exceção feita ao boro que apresentou um CV de
49,5%, classificado como ruim (Quadro 3).
Infere-se desta forma que o método testado não é preciso e nem exato na
determinação do nutriente boro, visto ter apresentado 90% das amostras padrão fora do
intervalo de confiança indicados pelo PIATV (Figura 10e).
Em contrapartida, verificou-se no referido método, que os CVs foram classificados
como excelentes na extração de Fe, Cu, Mn e Zn (Quadro 5), além de preciso foi também
exato para 80% dos micronutrientes analisados, tendo constado uma exatidão de 80% para o
nutriente Cu (Figura 10b) e de 90% para os nutrientes Fe (Figura 10c), Mn (figura 10d) e Zn
(Figura 10e).
Silva et al. (2008) verificaram que os extratos provenientes da digestão úmida em
sistema fechado em forno de micro-ondas foram aqueles que apresentaram maior eficiência
de extração e menor variação em relação aos demais métodos avaliados para os
micronutrientes.
A digestão via úmida em sistema fechado usando forno micro-ondas como fonte de
calor e o HNO3 para digerir a matéria seca, proporcionaram resultados significativos na
extração de praticamente todos os nutrientes analisados (Figura 9 e 10), com exceção do boro
(Figura 10e). Esses valores significativos, provavelmente são devidos o uso do ácido nítrico
concentrado, combinado com o sistema fechado e pressões maiores e constantes, que reduz o
tempo de digestão, implicando na ausência de possíveis perdas de analitos por volatilização.
Para melhorar a eficiência do referido método de digestão sugere-se a adição de um agente
oxidante combinado ou não com uma pré-digestão da amostra com a solução extratora
durante um pernoite.
45
(A)
(B)
(C)
(D)
(E)
------- Mínimo
 Máximo
 Observado
Figura 10 – Teores mínimos e máximos esperados de ferro (A), cobre (B), manganês (C),
zinco (D) e boro (E) nas amostras-padrão, e valores observados para os teores
desses nutrientes nessas mesmas amostras pelo método da digestão via úmida
em sistema fechado usando forno micro-ondas como fonte de calor e o HNO3
para digerir a matéria seca.
46
4.6 Digestão via úmida em sistema aberto usando bloco digestor como fonte de calor e a
mistura de HNO3 + HClO4 (3:1) para digerir a matéria seca
Este método de digestão proporcionou excelentes resultados para todos os
macronutrientes analisados (Figura 11), onde foi observado que 100% das amostras padrão na
análise de P, K, Ca e Mg ficaram dentro do intervalo de confiança indicados pelo PIATV e
para S, 70% das amostras analisadas apresentaram concentrações dentro do intervalo de
confiança, caracterizando a exatidão do método na análise desses nutrientes. E ainda os
coeficientes de variação demonstraram níveis excelentes, com todos os valores abaixo de 10%
(Quadro 5), evidenciando também a precisão das análises realizadas com esse método.
Esses dados corroboram com Vaccaro et al (2004), quando comparando três métodos
de análise química de tecido vegetal, observaram que a extração de Ca e Mg, com o uso da
digestão nitroperclórica, foi muito superior à outras técnicas estudadas.
Vila Nova et al. (2012), empregando o método de digestão via úmida nitroperclórica,
digestão por via seca em cadinho de porcelana e digestão por via úmida em HCl 1mol/ para
determinação de vários nutrientes em amostras secas de tomates orgânicos, observaram que
para o elemento Ca e Mg, os maiores valores foram obtidos após digestão nitroperclórica.
47
(A)
(B)
(C)
(D)
(E)
------- Mínimo
 Máximo
 Observado
Figura 11 - Teores mínimos e máximos esperados de fósforo (A), potássio (B), cálcio (C),
magnésio (D) e enxofre (E) nas amostras-padrão, e valores observados para os
teores desses nutrientes nessas mesmas amostras pelo método da digestão via
úmida em sistema aberto com a mistura de HNO3 + HClO4 (3:1) para digerir a
matéria seca.
48
No resultado das análises dos micronutrientes (Figura 12) foi observado que 90% das
amostras padrão na análise de Fe e Zn, 100% das amostras na análise de Cu e Mn,
apresentaram concentrações dentro do intervalo de confiança indicado pelo PIATV,
comprovando a exatidão do método na análise desses nutrientes, e os coeficientes de variação
(Quadro 5) demonstraram níveis excelentes, evidenciando também a precisão das análises
realizadas com esse método.
Resultados semelhantes foram encontrados por Souza et al (2012), observaram a
superioridade significativa da recuperação na digestão por via úmida com a mistura de ácido
nítrico e perclórico, para os elementos Fe, Zn e Mn.
Para as concentrações de boro (Figura 12e), os resultados foram contrários aos
observados nas análises de Fe, Cu, Mn e Zn (Figura 12), pelo fato de 100% das amostras
analisadas terem ficado fora do intervalo de confiança, apresentando ainda um coeficiente de
variância bastante alto (107,6%), o maior entre os métodos testados. Assim o método de
digestão nitroperclórica não é indicado para a análise desse micronutriente, apresentando 0%
de exatidão, e precisão classificada como ruim (Quadro 3). Isso talvez seja devido à
contaminação do extrato com boro proveniente da vidraria utilizada, a qual é constituída de
borossilicato.
Este método de digestão resultou em valores ótimos para praticamente todos os
nutrientes avaliados (Figura 11 e 12), exceção do boro (Figura 12e). Esses resultados
significativos ocorreram provavelmente devido à combinação de dois ácidos concentrados
com alto poder de destruição da matéria orgânica, oxidando vários elementos e deixando-os
disponíveis em solução.
Constatou-se, a partir dos índices de exatidão (Quadro 4), e através dos coeficientes
de variação (Quadro 5), a eficiência da oxidação nitroperclórica em digestões, no entanto, sua
utilização, de acordo com Jones et al. (1990), só não é maior devido às restrições na
manipulação dos ácidos, principalmente do ácido perclórico, pois o mesmo possui elevado
poder oxidante quando empregado na forma concentrada e a quente, podendo ocorrer
explosões.
49
(A)
(B)
(C)
(D)
(E)
------- Mínimo
 Máximo
 Observado
Figura 12 - Teores mínimos e máximos esperados de ferro (A), cobre (B), manganês (C),
zinco (D) e boro (E) nas amostras-padrão, e valores observados para os teores
desses nutrientes nessas mesmas amostras pelo método da digestão via úmida em
sistema aberto com a mistura de HNO3 + HClO4 (3:1) para digerir a matéria seca.
50
5. CONCLUSÕES
5.1. De modo geral, todos os métodos apresentaram precisão boa a excelente, porém, nem
todos apresentaram uma exatidão aceitável para a determinação dos nutrientes nas amostras
padrão de tecido vegetal fornecida pelo PIATV;
5.2. Para a extração de potássio, nas amostras padrão de tecido vegetal fornecida pelo PIATV,
todos os métodos avaliados apresentaram excelente exatidão;
5.3. A calcinação, método de digestão via seca com o uso do HCl na concentração de 1 mol/L
para a solubilização da matéria seca, foi o método exato, dentre os testados, para a extração de
boro;
5.4. A digestão sulfúrica, método de digestão via úmida com uso do H2SO4 + H2O2, foi o
método exato, dentre os testados, para a extração de nitrogênio total;
5.5. Para a extração de enxofre, os métodos que apresentaram maior exatidão foram a digestão
em sistema fechado usando o micro-ondas como fonte de calor e o uso ácido nítrico para
digerir a matéria seca e o método de digestão nitroperclórica;
5.6. À exceção dos nutrientes nitrogênio e boro, o método mais exato para extração dos macro
e micronutrientes avaliados foi o nitroperclórico, seguido, pelo método de digestão usando o
forno micro-ondas e HNO3 e pelo método de digestão sulfúrica usando H2SO4 e H2O2;
5.7. Para a extração de N, P, K, Ca e Mg, pode ser utilizado o método da digestão sulfúrica;
5.8. Para a extração de Fe, Cu, Mn e Zn, pode ser utilizado o método da digestão úmida em
forno micro-ondas com o uso do ácido nítrico;
51
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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56
APÊNDICE
57
1. Métodos de dosagem aplicados na obtenção dos macro e micronutrientes do tecido vegetal
1.1. Determinação de B (boro)
A determinação de boro será realizada por espectrofotometria com azometina – H,
princípio do método – o boro reage com azometina-H e forma um complexo amarelo que
absorve a luz na região de 460nm (EMBRAPA, 2009).
MATERIAL
Espectrofotômetro UV-VIS
REAGENTES
Solução tampão de acetato – dissolver 250g de NH4OAc e 15g de Na2EDTA em 400 mL de
H2O, adicionar 125 mL de HOAc glacial e completar o volume até 1000 mL com H2O.
Solução de azometina-H - Dissolver 1 g de ácido ascórbico em 80 mL de água, adicionar 0,45
g de azometina-H e completar o volume até 100 mL com água.
Solução de B 1000 mg L -1 – Dissolver 5,7178 g de H3BO3 em 1000 mL de água destilada.
Solução padrão de B – A partir da solução de 1000 mg L -1, preparar soluções de : 0 ; 1,0 mg
L-1; 2,0 mg L -1; 4,0 mg L -1; 6,0 mg L -1 e 8,0 mg L -1 de B. Essas soluções serão
utilizadas para realizar a curva de calibração e o intercepto da curva.
PROCEDIMENTO
Pipetar 1mL da solução do extrato 1, de qualquer método de extração, em tubo de 30 mL,
adicionar 2,0 mL da solução tampão e 2,0 mL da solução de azometina-H e homogeneizar.
Após 30 minutos, efetuar a leitura no espectrofotômetro a 460nm, a leitura é feita em
absorbância;
Pipetar 1 mL do branco, para realizar uma prova em branco, e seguir o mesmo procedimento
que é realizado com a amostra;
58
NOTA:
Sempre que for realizado um procedimento de diluição na amostra (extrato1), é necessário
realizar o mesmo procedimento, e na mesma proporção, com a prova em branco;
Se o valor da prova em branco, em absorbância, for inferior a zero, deve ser considerado o
valor nulo;
Seguir o mesmo raciocínio na preparação da curva analítica com os padrões preparados a
partir da solução de boro 1000 mg L -1, anotar os valores, em absorbância, obtidos no
espectrofotômetro e estimar a concentração de B, a partir do intercepto da curva;
O equipamento, espectrofotômetro, deve ser zerado com o primeiro ponto da curva, 1 mL de
água destilada com a adição de 2 mL da solução tampão e 2 mL de azometina-H. Assim
depois da leitura dos pontos da curva, faz-se a leitura da prova em branco e anota-se seu valor
em absorbância;
A solução de azometina-H deve ser preparada no dia em que será feita a análise, assim a
curva não apresentará variações;
CÁLCULO
Para os métodos de extração:
- Via seca (incineração) em forno tipo mufla e dissolução posterior do resíduo (cinzas) com
adição de HCl 1 mol/L; Via úmida em sistema fechado usando forno micro-ondas como fonte
de calor e o HNO3 para digerir a matéria seca; Via úmida em sistema aberto e a mistura de
HNO3 + HClO4 (3:1) para digerir a matéria seca e via solubilização com adição de HCl,
utilizar a equação:
B (boro em mg/Kg) = ((L – B) × b) + a ) × f × (5/1000) × (25/1) ×(1000/0,5)
L = leitura da amostra;
B = leitura do branco;
b = coeficiente linear (declividade) da equação ajustada para a curva padrão;
a = intercepto da equação ajustada para a curva padrão;
f = fator de diluição da amostra;
59
- Via úmida em sistema aberto e a mistura de H2SO4 + H2O2 para digerir a matéria seca,
utilizar a equação:
B (boro em mg/Kg) = ((L – B) × b) + a ) × f × (5/1000) ×(50/1) × (1000/0,4)
L = leitura da amostra;
B = leitura do branco;
b = coeficiente linear (declividade) da equação ajustada para a curva padrão;
a = intercepto da equação ajustada para a curva padrão;
f = fator de diluição da amostra;
- Via úmida em sistema aberto e a mistura de HNO3 + H2O2 para digerir a matéria seca,
utilizar a equação:
B (boro em mg/Kg) = ((L – B) × b) + a ) × f × (5/1000) ×(50/1) × (1000/0,3)
L = leitura da amostra;
B = leitura do branco;
b = coeficiente linear (declividade) da equação ajustada para a curva padrão;
a = intercepto da equação ajustada para a curva padrão;
f = fator de diluição da amostra;
1.2. Determinação de Ca e Mg por espectrofotometria de absorção atômica (EAA)
A espectrofotometria de absorção atômica é uma das técnicas com menor
interferência na análise (STANDARD, 1982). No entanto, no caso de Ca e Mg, as presenças
de fosfatos, Fe e Al interferem, sendo mascarados por La ou Sr(EMBRAPA, 2009), Portanto
é necessário adicionar uma das soluções de La ou Se nos extratos antes da leitura.
MATERIAL
Espectrofotômetro de absorção atômica com chama de ar-acetileno.
Lâmpada de cátodo oco de Ca e Mg.
60
REAGENTES
Solução padrão de Ca e Mg – A partir da solução padrão de Ca e Mg de 1000 mg L-1,
preparar soluções padrões para curva analítica: Ca ( 0; 1,0 mg L-1; 2,0 mg L -1; 4,0 mg L -1)
Mg (0; 0,2 mg L -1; 0,4 mg L -1; 0,8 mg L -1).
Solução de La 0,1 %- Transferir 1,14 g de La2O3 para frasco de 1000 mL, adicionar solução
de HNO3 10% até dissolução total do óxido e completar o volume com água destilada.
PROCEDIMENTO
Pipetar 1mL do extrato 1 da digestão seca (ou HNO3 + HClO4; micro-ondas; extração com
solução ácida diluída; HNO3 + HClO4) para um tubo e adicionar 19 mL de água destilada
(extrato 2).
Pipetar 1mL do extrato 2 em um tubo, adicionar 4 mL da solução de La 0,1% e determinar Ca
e Mg por EAA.
NOTA:
As soluções padrões que serão utilizadas para estimar a curva padrão podem ser preparadas
com a mistura de Ca e Mg;
Sempre que for realizado um procedimento de diluição na amostra (extrato 1), é necessário
realizar o mesmo procedimento, e na mesma proporção, com a prova em branco;
Se o valor da prova em branco, for inferior a zero, deve ser considerado o valor nulo;
CÁLCULO
Para os métodos de extração:
- Via seca (incineração) em forno tipo mufla e dissolução posterior do resíduo (cinzas) com
adição de HCl 1 mol/L, utilizar a equação:
Ca (cálcio em g/Kg) = (L – B) × f ×(5/1000)×(2/1)×(25/1)×(1000/0,5)×(1/1000)
Mg (magnésio em g/Kg)=(L- B)× f × (5/1000)×(20/1)×(25/1)×(1000/0,5)×(1/1000)
61
L = leitura da amostra;
B = leitura do branco;
f = fator de diluição da amostra;
- Via úmida em sistema aberto e a mistura de H2SO4 + H2O2 para digerir a matéria seca,
utilizar a equação abaixo para o cálculo de cálcio e magnésio, em g/Kg:
(L – B) × f × (5/1000) × (20/1) × (50/1) × (1000/0,4) × (1/1000)
L = leitura da amostra;
B = leitura do branco;
f = fator de diluição da amostra;
- Via úmida em sistema fechado usando forno micro-ondas como fonte de calor e o HNO3
para digerir a matéria seca; Via úmida em sistema aberto e a mistura de HNO3 + HClO4 (3:1)
para digerir a matéria seca e via solubilização com adição de HCl 1 molar, utilizar a equação
abaixo para o cálculo de cálcio e magnésio, em g/Kg:
(L – B) × f × (5/1000) × (20/1) × (25/1) × (1000/0,5) × (1/1000)
L = leitura da amostra;
B = leitura do branco;
f = fator de diluição da amostra;
- Via úmida em sistema aberto e a mistura de HNO3 + H2O2 para digerir a matéria seca,
utilizar a equação abaixo para o cálculo de cálcio e magnésio, em g/Kg:
(L – B) × f × (5/1000) × (20/1) × (50/1) × (1000/0,3) × (1/1000)
L = leitura da amostra;
B = leitura do branco;
f = fator de diluição da amostra;
62
1.3. Determinação de Cu, Fe, Zn e Mn por espectrofotometria de absorção atômica.
MATERIAL
Espectrofotômetro de absorção atômica com chama de ar-acetileno.
Lâmpada de cátodo oco de Cu, Fe, Zn e Mn .
REAGENTES
Solução padrão de Cu – A partir da solução padrão de 1000 mg L-1 de Cu, preparar soluções
de: 0; 0,2 mg L -1; 0,6 mg L -1; 1,0 mg L -1.
Solução padrão de Fe – A partir da solução padrão de 1000 mg L-1 de Fe, preparar soluções
de: 0; 2 mg L -1; 6 mg L -1; 10 mg L -1.
Solução padrão de Zn – A partir da solução padrão de 1000 mg L-1 de Zn, preparar soluções
de: (0; 0,5 mg L -1; 1,5 mg L -1; 2,0 mg L -1.
Solução padrão de Mn – A partir da solução padrão de 1000 mg L-1 de Mn, preparar soluções
de: 0; 1,0 mg L -1; 3,0 mg L -1; 5,0 mg L -1.
PROCEDIMENTO
Após o ajuste do EAA conforme manual do equipamento, efetuar a leitura das soluções
padrão, que estimam a curva analítica e logo em seguida, da solução da digestão seca ou
HNO3 + HClO4; micro-ondas; extração com solução ácida diluída; HNO3 + H2O2, todas a
partir do extrato 1.
NOTA:
Se for necessário fazer diluição para efetuar a leitura no EAA pode-se, para uma primeira
diluição, retirar 1mL do extrato 1 e acrescentar 9 mL de água destilada, formando o extrato 2;
Sempre que for realizado um procedimento de diluição na amostra (extrato 1), é necessário
realizar o mesmo procedimento, e na mesma proporção, com a prova em branco;
Se o valor da prova em branco, for inferior a zero, deve ser considerado o valor nulo;
As soluções padrão, que serão utilizadas para estimar a curva analítica, podem ser preparadas
com a mistura de Cu, Fe, Zn e Mn;
63
CÁLCULO:
Para os métodos de extração:
- Via seca (incineração) em forno tipo mufla e dissolução posterior do resíduo (cinzas) com
adição de HCl 1 mol/L; Via úmida em sistema fechado usando forno micro-ondas como fonte
de calor e o HNO3 para digerir a matéria seca; Via úmida em sistema aberto e a mistura de
HNO3 + HClO4 (3:1) para digerir a matéria seca e via solubilização com adição de HCl
mol/L, utilizar a equação:
abaixo para o cálculo de Fe, Cu, Mn e Zn, em mg/Kg:
(L–B) × f × (25/1000) × (1000/0,5)
L = leitura da amostra;
B = leitura do branco;
f = fator de diluição da amostra;
- Via úmida em sistema aberto e a mistura de H2SO4 + H2O2 para digerir a matéria seca,
utilizar a equação abaixo para o cálculo de Fe, Cu, Mn e Zn, mg/Kg:
(L – B) × f × (50/1000) × (1000/0,4)
L = leitura da amostra;
B = leitura do branco;
f = fator de diluição da amostra;
- Via úmida em sistema aberto e a mistura de HNO3 + H2O2 para digerir a matéria seca,
utilizar a equação abaixo para o cálculo de Fe, Cu, Mn e Zn, mg/Kg:
(L–B) × f × (50/1000) × (1000/0,3)
L = leitura da amostra;
B = leitura do branco;
f = fator de diluição da amostra;
64
1.4. Determinação de fósforo (Método da espectrofotometria com azul-de-molibdênio)
O íon H2PO4- em meio fortemente ácido reage com molibdato (MoO4-), formando
um complexo de coloração azul, e a intensidade da coloração é proporcional á concentração
de P (EMBRAPA, 2009).
MATERIAL
Espectrofotômetro UV-VIS.
REAGENTES
Solução de molibdato de amônio 2% - Dissolver 20 g (NH4+)6. Mo7O24p.a. em 200 mL de
água. Em outro frasco com 500 mL de H2O, dissolver 2g de subcarbonato de bismuto e
adicionar 150 mL de H2SO4 98% p.a. Esfriar, misturar as duas soluções e completar o volume
até 1000 mL com H2O (solução 1 ).
Solução diluída de molibdato – Transferir 300 mL da solução 1 para frasco de 1000 mL e
completar o volume com H2O (solução 2).
Solução padrão de 1000 ppm de P – Transferir 4,3928 g de KH2PO4p.a. em frasco de 1000
mL, adicionar 3 mL de H2SO4 98% e completar volume com H2O.
Soluções padrão de P – A partir da solução de 1000 ppm de P, preparar soluções de 0; 0,5
ppm; 1,0 ppm; 2,0 ppm; 3,0 ppm e 4,0 ppm de P.
Àcido ascórbico p.a., cristal.
PROCEDIMENTO
Pipetar 5mL da solução digerida de H2SO4 em tubo de 30 mL, em copos descartáveis de 40
mL, adicionar 10 mL da solução 2, uma pitada de ácido ascórbico e agitar;
Preparar uma prova em branco seguindo o mesmo procedimento da preparação da amostra
para leitura: 5mL do branco, 10 mL da solução 2 e uma pitada de ácido ascórbico e agitar;
Após 30 minutos, efetuar a leitura no espectrofotômetro a 660nm;
65
NOTAS:
Essas soluções padrão de P, serão utilizadas para estimar a curva analítica;
É necessário realizar a curva analítica que será preparada, separadamente, com cada uma das
soluções padrão de P: 0; 0,5 ppm; 1,0 ppm; 2,0 ppm; 3,0 ppm e 4,0 ppm com adição de 10
mL da solução 2 e uma pitada de ácido ascórbico. Anotar os valores, em absorbância, obtidos
no espectrofotômetro e estimar a concentração de P, a partir do intercepto da curva;
O equipamento deve ser zerado com o primeiro ponto da curva, que será preparado com 5mL
de água destilada, 10mL de solução de molibdato diluído e uma pitada de ácido ascórbico. È
necessário fazer a leitura da prova em branco;
Se a cor azul desenvolvida estiver superior à tonalidade do último ponto da curva é necessário
realizar uma diluição. Essa diluição pode ser efetuada retirando-se 1mL do extrato 1 e
acrescentando 9 mL de água destilada, formando um extrato 2. Então se retira 5mL do extrato
2, 10 mL de solução de molibdato diluído e uma pitada de ácido ascórbico, e após 30 minutos
efetua-se a leitura no espectrofotômetro a 660nm, ou seja segue-se o mesmo raciocínio da
amostra sem a diluição. Assim a amostra será diluída 10 vezes. Não é necessário fazer o
mesmo procedimento com a curva, essa terá os mesmos valores antes da diluição;
Sempre que for realizado um procedimento de diluição na amostra (extrato 1), é necessário
realizar o mesmo procedimento, e na mesma proporção, com a prova em branco;
Se o valor da prova em branco, em absorbância, for inferior a zero, deve ser considerado o
valor nulo;
CÁLCULO
Para os métodos de extração:
- Via seca (incineração) em forno tipo mufla e dissolução posterior do resíduo (cinzas) com
adição de HCl 1 mol/L; Via úmida em sistema fechado usando forno micro-ondas como fonte
de calor e o HNO3 para digerir a matéria seca; Via úmida em sistema aberto e a mistura de
HNO3 + HClO4 (3:1) para digerir a matéria seca e via solubilização com adição de HCl
mol/L, utilizar a equação:
66
P (fósforo,em mg/Kg) = ((L - B) × b) + a) × f × (15/1000) × (10/5) × (25/1) × (1000/0,5) ×
(1/1000)
L = leitura da amostra;
B = leitura do branco;
b = coeficiente linear (declividade) da equação ajustada para a curva padrão;
a = intercepto da equação ajustada para a curva padrão;
f = fator de diluição da amostra;
- Via úmida em sistema aberto e a mistura de H2SO4 + H2O2 para digerir a matéria seca,
utilizar a equação:
P(fósforo, em mg/Kg) = ((L - B) × b) + a) × f × (15/1000) × (10/5) × (50/1) × (1000/0,4) ×
(1/1000)
L = leitura da amostra;
B = leitura do branco;
b = coeficiente linear (declividade) da equação ajustada para a curva padrão;
a = intercepto da equação ajustada para a curva padrão;
f = fator de diluição da amostra;
- Via úmida em sistema aberto e a mistura de HNO3 + H2O2 para digerir a matéria seca,
utilizar a equação:
P(fósforo,em mg/Kg) = ((L - B) × b) + a) × f × (15/1000) × (10/5) × (50/1) × (1000/0,3) ×
(1/1000)
L = leitura da amostra;
B = leitura do branco;
b = coeficiente linear (declividade) da equação ajustada para a curva padrão;
a = intercepto da equação ajustada para a curva padrão;
f = fator de diluição da amostra
67
1.5. Determinação de enxofre
Princípio do método – O S orgânico do tecido vegetal é transformado em SO42- na
digestão úmida ou na seca. O SO42- forma precipitado branco com Ba2+, sendo determinado
por turbidimetria ou por espectrofotometria (EMBRAPA, 2009).
MATERIAL
Espectrofotômetro UV-VIS.
Agitador de tubo de ensaio.
Cronômetro.
REAGENTES
Cristal de BaCl2 p.a.
Solução de S-SO42- 1000 ppm – Dissolver 5,434 g de K2SO4 p.a. em 500 mL de água e
completar o volume até 1000 mL com água destilada.
Solução padrão de S – Preparar soluções de 0; 10,0; 15,0; 20,0; 25,0; 30,0; 40,0 e 50,0 ppm
de S- SO42- a partir da solução de 1000 ppm.
Solução de HCl 6 N - balão com capacidade 1000 mL, contendo aproximadamente 200 mL de
água destilada, deve-se adicionar 500 mL de HCl 36 % e 20 mL de S- SO42- de 1000 ppm e
completar o volume com água destilada.
PROCEDIMENTO
Pipetar 2 mL do extrato 1 da digestão seca (ou HNO3 + HClO4; micro-ondas; extração com
solução ácida diluída; HNO3 + H2O2) e acrescentar 18 mL de água destilada (extrato 2).
Pipetar 10 mL do extrato 2 e transferir para tubo de ensaio com capacidade de 20 mL, ou
copos descartáveis, com capacidade de 40 mL, adicionar 1 mL da solução de HCl 6 N e 0,5 g
de cristal de BaCl2. Agitar vigorosamente, com agitador de tubo de ensaio ou manualmente,
durante 30 segundos e após 5 minutos exatos (cronometrados) efetuar a leitura no
espectrofotômetro a 420 nm.
Seguir o mesmo procedimento com a prova em branco;
68
Realizar a leitura da curva analítica com 10 mL de cada solução padrão, 1 mL da solução de
HCl 6 N e 0,5 g de cristal de BaCl2. Agitar vigorosamente, com agitador de tubo de ensaio ou
manualmente, durante 30 segundos e após 5 minutos exatos (cronometrados) efetuar a leitura
no espectrofotômetro a 420 nm. .
NOTAS:
As soluções padrão de S estimam a curva analítica;
Anotar os valores, em absorbância, obtidos no espectrofotômetro e estimar a concentração de
S, a partir do intercepto da curva;
E necessário cronometrar a leitura devido à formação do precipitado BASO4 que decanta
rapidamente;
O equipamento deve ser zerado com o primeiro ponto da curva, que será preparado com 10
mL de água destilada, 1 mL da solução de HCl 6 N e 0,5 g de cristal de BaCl 2. Agitar
vigorosamente, durante 30 segundos e após 5 minutos exatos (cronometrados) efetuar a leitura
zerando o espectrofotômetro. Após, quando completar o tempo, será realizado a leitura dos
outros pontos da curva, da prova em branco e das amostras, respectivamente;
Os cristais de BaCl2 p.a. deve ser passados em uma peneira de 20 mesh e ficar retidos em uma
peneira de 60 mesh, esses que ficarão retidos são os que serão usados;
Sempre que for realizado um procedimento de diluição na amostra (extrato 1), é necessário
realizar o mesmo procedimento, e na mesma proporção, com a prova em branco;
Se o valor da prova em branco, em absorbância, for inferior a zero, deve ser considerado o
valor nulo;
CÁLCULO
Para os métodos de extração:
- Via seca (incineração) em forno tipo mufla e dissolução posterior do resíduo (cinzas) com
adição de HCl 1 mol/L e via úmida em sistema fechado usando forno micro-ondas como fonte
de calor e o HNO3 para digerir a matéria seca, utilizar a equação:
69
S(enxofre em g/Kg) = ((L - B) × b) + a) × f × (11/1000) × (10/20) × (25/2) × (1000/0,5) ×
(1/1000)
L = leitura da amostra;
B = leitura do branco;
b = coeficiente linear (declividade) da equação ajustada para a curva padrão;
a = intercepto da equação ajustada para a curva padrão;
f = fator de diluição da amostra;
- Via úmida em sistema aberto e a mistura de HNO3 + H2O2 para digerir a matéria seca,
utilizar a equação:
S(enxofre em g/Kg) = ((L - B) × b) + a) × f × (11/1000) × (50/10) × (1000/0,3) × (1/1000)
L = leitura da amostra;
B = leitura do branco;
b = coeficiente linear (declividade) da equação ajustada para a curva padrão;
a = intercepto da equação ajustada para a curva padrão;
f = fator de diluição da amostra;
- Via úmida em sistema aberto e a mistura de HNO3 + HClO4 (3:1) para digerir a matéria seca
e via solubilização com adição de HCl mol/L, utilizar a equação:
S(enxofre em g/Kg) = ((L-B) × b) + a) × f × (6/1000) × (25/1) × (1000/0,5) × (1/1000)
L = leitura da amostra;
B = leitura do branco;
b = coeficiente linear (declividade) da equação ajustada para a curva padrão;
a = intercepto da equação ajustada para a curva padrão;
f = fator de diluição da amostra
70
1.6. Determinação de potássio por fotometria de chama
Princípio do método – O K da solução aquosa é aspirado na chama ar – GLP, e as
energias emitidas por esse elemento são proporcional ás concentrações de K (EMBRAPA,
2009).
MATERIAL
Fotômetro de chama
REAGENTES
Solução de K 1000 ppm – Pesar 0,19067 g de KCl , transferir para balão volumétrico de 100
mL, adicionar 20 mL de ácido nítrico p.a. Completar o volume com água deionizada.
(Realizar esse procedimento em capela de exaustão).
Solução padrão de K: A partir da solução de K 1000 ppm, preparar soluções de: 0; 5,0; 10,0;
20,0 e 40,0 ppm de K.
PROCEDIMENTO
Pipetar 2 mL do extrato 1( da digestão seca ou HNO3 + HClO4; micro-ondas; extração com
solução ácida diluída; HNO3 + H2O2) em copo descartável e acrescentar 18 mL de água
destilada (extrato 2).
Ajustar o fotômetro de chama com a solução padrão de K 40 ppm e efetuar a leitura das
soluções que estimaram a curva.
Efetuar a leitura do extrato 2.
Realizar a leitura da prova em branco seguindo o mesmo procedimento da preparação da
amostra para leitura.
NOTAS:
O ácido utilizado no padrão de 1000 ppm de K dependerá da solução extratora.
As soluções padrão de K servirão para estimar a curva analítica;
A concentração de K deve ser estimada a partir do intercepto da curva;
Se a leitura do extrato 2 for superior ao último ponto da curva (40ppm), é necessário realizar
uma nova diluição. Essa diluição pode ser efetuada retirando-se 10 mL do extrato 2 e
acrescentando 10 mL de água destilada (extrato 3).
71
Sempre que a amostra for diluída é necessário realizar o mesmo procedimento com a prova
em branco;
Se o valor da prova em branco, em ppm, for inferior a zero, deve ser considerado o valor nulo;
CÁLCULO
Para os métodos de extração:
- Via seca (incineração) em forno tipo mufla e dissolução posterior do resíduo (cinzas) com
adição de HCl 1 mol/L; Via úmida em sistema fechado usando forno micro-ondas como fonte
de calor e o HNO3 para digerir a matéria seca; Via úmida em sistema aberto e a mistura de
HNO3 + HClO4 (3:1) para digerir a matéria seca e via solubilização com adição de HCl
mol/L, utilizar a equação:
K (potássio em g/Kg) = ((L - B) × b) + a) × f × (25/1000) × (1000/0,5) × (1/1000)
L = leitura da amostra;
B = leitura do branco;
b = coeficiente linear (declividade) da equação ajustada para a curva padrão;
a = intercepto da equação ajustada para a curva padrão;
f = fator de diluição da amostra;
- Via úmida em sistema aberto e a mistura de H2SO4 + H2O2 para digerir a matéria seca,
utilizar a equação:
K (potássio em g/Kg) = ((L - B) × b) + a) × f × (50/1000) × (1000/0,4) × (1/1000)
L = leitura da amostra;
B = leitura do branco;
b = coeficiente linear (declividade) da equação ajustada para a curva padrão;
a = intercepto da equação ajustada para a curva padrão;
f = fator de diluição da amostra;
- Via úmida em sistema aberto e a mistura de HNO3 + H2O2 para digerir a matéria seca,
utilizar a equação:
K (potássio em g/Kg) = ((L - B) × b) + a) × f × (50/1000) × (1000/0,3) × (1/1000)
72
L = leitura da amostra;
B = leitura do branco;
b = coeficiente linear (declividade) da equação ajustada para a curva padrão;
a = intercepto da equação ajustada para a curva padrão;
f = fator de diluição da amostra
1.7. Determinação de nitrogênio total (método kjeldahl)
Princípio do método – O NH4+ produzido na digestão com H2SO4 é destilado em
meio fortemente alcalino. O N condensado é coletado na solução de H3BO3 e titulado com a
solução de H2SO4 .
A metodologia é citada por Tedesco et al, com algumas adaptações da Embrapa
2009.
MATERIAL
Conjunto de destilador semimicro Kjeldahl de 100 mL.
Bureta de 10 mL
REAGENTES
Solução de verde de bromocresol e vermelho de metila – Dissolver 0,660 g de verde de
bromocresol e 0,330 g de vermelho de metila em 1000 mL de álcool etílico 95 % (solução 1).
Estocar em frasco de vidro.
Solução de NAOH 0,05 M – Pesar 2 g de NaOH p.a. e transferir para um balão volumétrico
de 1 L com auxílio de água destilada. Agitar e completar o volume do balão.
Indicador ácido bórico – Dissolver 40 g de ácido bórico em aproximadamente 1400 mL de
água destilada em um balão volumétrico de 2 L. Após solubilizar, acrescentar 400 mL de
álcool etílico 95 % e 40 mL da uma solução 1. Completar o volume a 2 L com água destilada
e misturar. O pH da solução deve ficar entre 5,0 e 5,1. Caso esteja mais baixo adicionar
cuidadosamente NaOH 0,05 M, até atingir o pH desejado. Estocar em frasco de vidro.
73
Solução de Hidróxido de sódio 10 M – Pesar 400 g de NaOH p.a. .Transferir para um balão
volumétrico contendo cerca de 500 mL água destilada com auxílio de um funil lavando o
bécker até que todo o NaOH seja completamente transferido para o balão. Cuidado a reação
do NaOH com a água gera calor, o balão fica muito quente. Se necessário utilize gelo para
resfriá-lo. Depois de frio, complete o volume para 1 L. Estocar em recipiente de plástico. Não
utilize vidro, pois o NaOH pode corroer.
Solução de ácido sulfúrico 0,025 M – Adicionar 1,4 mL de ácido sulfúrico p.a em
aproximadamente 800 mL de água destilada em um balão volumétrico com capacidade para 1
L. Completar o volume com água destilada e agitar. Estocar em frasco de vidro. Esse
procedimento deve ser realizado em capela devido à volatilização do ácido.
PROCEDIMENTO
Preparar erlenmeyer de 125 mL com 5 mL do indicador ácido bórico referente ao número de
amostras a serem determinadas.
Pipetar 10 mL do extrato 1 da digestão H2SO4 + H2O2 para um tubo de destilação;
Fixar o tubo no destilador de nitrogênio;
Adicionar 5 mL de hidróxido de sódio 10 M;
Destilar até coletar 35-40 mL;
Titular com ácido sulfúrico 0,025 M. Utilizar a bureta de 10 mL;
Realizar o mesmo procedimento com a prova em branco;
NOTAS:
O ponto final da titulação é a coloração rosa.
Iniciar a destilação com a prova em branco e observar se o valor obtido é aceitável (entre 0 e
0,5 ).
CÁLCULO
Para os métodos de extração:
- Via seca (incineração) em forno tipo mufla e dissolução posterior do resíduo (cinzas) com
adição de HCl 1 mol/L e via solubilização com adição de HCl mol/L, utilizar a equação:
74
N (nitrogênio em g/Kg) = ((L – B) × 700 × 5 × 5 ) / 10000) × 10 ) / 2,5
L = leitura da amostra;
B = leitura do branco;
- Via úmida em sistema aberto e a mistura de H2SO4 + H2O2 para digerir a matéria seca,
utilizar a equação:
N (nitrogênio em g/Kg) = ((L – B) × 700 × 5 × 5 ) / 10000) × 10 ) / 2,0
L = leitura da amostra;
B = leitura do branco;
75