1 Fabricante
Instruções de Utilização do
SURVEYOR® Scan KRAS Kit
Exon 2 CE IVD
para Sistemas de DHPLC
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Índice
1 Fabricante ....................................................................................................................................... 3
2 SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD ................................................................................ 3
2.1 Utilização Prevista ................................................................................................................................... 3
2.2 Indicações de Utilização .......................................................................................................................... 3
3 Princípios do Teste de Detecção de Mutações com o SURVEYOR Scan KRAS .................... 4
3.1 KRAS e NRAS ............................................................................................................................................ 4
3.2 Análise de amostras de pacientes utilizando os Kits SURVEYOR Scan .................................................... 4
3.3 SURVEYOR Nuclease ................................................................................................................................ 5
4 Rastreabilidade dos Controlos do Kit ......................................................................................... 6
5 Componentes ................................................................................................................................. 6
5.1 Número de Amostras que podem ser testadas com um Kit .................................................................... 7
5.2 Sequenciação de DNA ............................................................................................................................. 7
6 Reagentes e Equipamentos Adicionais Necessários ................................................................ 7
7 Preparação dos Reagentes........................................................................................................... 8
8 Armazenamento e Tempo de Permanência na Prateleira ......................................................... 8
9 Advertências e Precauções .......................................................................................................... 8
10 Recolha, Manuseamento e Armazenamento da Amostra Primária ........................................ 8
11 Procedimento de Teste ............................................................................................................... 9
11.1 Detecção de Mutações Somáticas com os Kits de Análise SURVEYOR Scan - Uma Visão Geral ........... 9
12 Instruções Passo-a-Passo ........................................................................................................ 10
12.1 Configuração/Calibração inicial do Sistema DHPLC ............................................................................. 10
12.2 Considerações antes da Análise de Amostras KRAS ............................................................................ 10
12.3 Considerações sobre o Modelo ........................................................................................................... 10
12.4 Considerações sobre o Fluxo de Trabalho ........................................................................................... 11
12.5 Protocolo de Amplificação .................................................................................................................. 13
12.7 Programa do Termociclador para Protocolo de Amplificação ............................................................ 15
12.8 Controlo de Qualidade dos Produtos de PCR ...................................................................................... 15
12.9 Digestão da SURVEYOR Nuclease ........................................................................................................ 16
13 Procedimentos de Controlo da Qualidade .............................................................................. 17
13.1 Controlo de Qualidade do SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD ................................................... 17
13.2 Utilizar ADNs Plasmídicos de Controlo ................................................................................................ 17
14 Interpretação dos Resultados .................................................................................................. 18
14.1 Análise do KRAS Exon 2 utilizando a SURVEYOR Nuclease .................................................................. 18
14.2 Revisão de dados dos resultados do SURVEYOR Scan ......................................................................... 18
14.3 Exemplos de Resultados ...................................................................................................................... 19
15 Características de Desempenho .............................................................................................. 20
15.1 Nível de Detecção de Mutações utilizando os Kits SURVEYOR Scan ................................................... 20
15.2 Confirmação de Sequências ................................................................................................................ 20
15.3 Limitações do Procedimento de Teste ................................................................................................ 20
Apêndice A ...................................................................................................................................... 22
A.1 Plano de disposição de poços para os Kits SURVEYOR Scan ................................................................. 22
A.2 Selos de ADN de controlo ..................................................................................................................... 22
A.3 Requisitos de desnaturação do sistema HPLC (DHPLC) ........................................................................ 22
A.4 Preparação do laboratório para testes PCR .......................................................................................... 23
A.5 Referências Bibliográficas ..................................................................................................................... 25
Apêndice B ...................................................................................................................................... 26
Guia de Resolução de Problemas ................................................................................................................ 26
Detalhes para Encomendas ........................................................................................................... 32
Detalhes de Contacto ..................................................................................................................... 32
Tradução Disclaimer ...................................................................................................................... 32
Licenças, Marcas Comerciais e Direitos de Autor ...................................................................... 33
1 Fabricante
1 Fabricante
Fabricante
M
Transgenomic, Inc.
12325 Emmet Street, Omaha, NE 68164, USA
Tel.: 1-402-452-5400
Representante
na Comunidade
Europeia
P
Transgenomic Limited
40 Watt Road, Hillington Park, Glasgow G52 4RY, UK
Tel.: +44-141-892-8800
2 SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD
2.1 Utilização Prevista
Apenas para uso profissional. O SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD da Transgenomic é
um teste de diagnóstico in vitro que detecta mutações somáticas no Exon 2 do gene KRAS. Estas
mutações são indicadas pelos picos de clivagem da SURVEYOR Nuclease e incluem as
mutações com potencial conhecido de significância clínica. Este kit foi concebido para utilização
num laboratório de diagnósticos clínicos por pessoal adequadamente treinado, que testa DNA
extraído a partir de tecidos embebidos em parafina e fixados com formalina.
Este kit, número de catálogo 710104, é fornecido numa caixa individual que contém os
componentes abaixo indicados. Estas Instruções de Utilização estão disponíveis para
transferência no endereço http://world.transgenomic.com/files/literature/482404-PT.pdf.
2.2 Indicações de Utilização
Os clínicos podem utilizar o SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD com Sistemas de
DHPLC para ajudar a decidir se os tumores de cancro colo-rectal dos pacientes podem não
responder a terapêuticas anti-EGFR (epidermal growth factor receptor - receptor do factor de
crescimento epidérmico), como por exemplo, panitumumab.
O SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD destina-se a ser utilizado em conjunto com os
SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 3 e 4 CE IVD e com os SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2,
3 e 4 CE IVD.
O SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD não deve ser utilizado no diagnóstico do cancro
colo-rectal ou de qualquer outro cancro.
O SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD é um teste que detecta a presença de potenciais
mutações somáticas no Exon 2 do gene KRAS, mas não confirma a identidade da sequência da
mutação. Para confirmar com precisão a mutação detectada, seriam necessárias análises
adicionais, tais como a sequenciação de DNA.
Embora os resultados das análises efectuadas com este kit indiquem o estado de mutação do
paciente, outros factores clínicos, incluindo mutações nos KRAS Exons 3 e 4 e NRAS Exons 2, 3
e 4, devem ser tidos em consideração. Os resultados obtidos utilizando o SURVEYOR Scan
KRAS Kit Exon 2 CE IVD não devem constituir o único método utilizado na tomada de
decisões relativamente ao tratamento de quaisquer pacientes com cancro colo-rectal.
É importante salientar que a utilização de DHPLC para identificar amostras com resultado positivo
relativamente a uma mutação do gene KRAS com este kit só deve ser usada como orientação e
que todas as mutações têm de ser confirmadas através de análises adicionais, tais como a
sequenciação de ADN.
Instruções de Utilização do SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD para Sistemas de DHPLC
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3 Princípios do Teste de Detecção de Mutações com o SURVEYOR Scan KRAS
3 Princípios do Teste de Detecção de Mutações com o
SURVEYOR Scan KRAS
3.1 KRAS e NRAS
Os agentes terapêuticos que têm como alvo o receptor do factor de crescimento epidérmico
(EGFR) têm-se mostrado eficazes no tratamento do cancro colo-rectal. A investigação realizada
até ao momento indica que aproximadamente 40% dos tumores colo-rectais transportam
mutações somáticas do gene KRAS e os estudos clínicos demonstraram que as mutações do
KRAS exon 2 (codões 12 e 13) prevêm uma ausência de resposta a terapêuticas anti-EGFR.
Estudos exploratórios recentes demonstraram que a população de pacientes pode ser redefinida
de forma mais precisa como pacientes cujos tumores mCRC com uma mutação adicional nos
KRAS exons 3 e 4 e nos NRAS exons 2, 3 e 4 também não apresentaram qualquer tendência de
1-7
resposta a terapêuticas anti-EGFR . Este kit foi concebido para utilização na análise de
diagnóstico de mutações somáticas do KRAS Exon 2.
O SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD é um teste para detectar todas as sequências e
pequenas alterações de inserção/eliminação no Exon 2 do gene KRAS. As mutações nos codões
12 e 13 do gene KRAS têm sido associadas à falta de eficácia de panitumumab. São fornecidos
Positive Controls neste kit para mutações nos codões 12 e 13.
Este kit usa a tecnologia SURVEYOR Nuclease da Transgenomic que, quando aliada a DHPLC,
permite uma detecção simples e sensível de potenciais mutações. É capaz de detectar uma
mistura de 2-5% de mutante num fundo de DNA não-mutante. Os estudos de validação
demonstraram uma concordância extremamente elevada com a sequenciação em amostras de
cancro colo-rectal bem caracterizadas. A utilização do SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE
IVD irá diminuir o peso do trabalho de sequenciação por parte do utilizador e ajudar na chamada
de sequências quando o software de sequenciação automática não consegue determinar a
presença de mutações de baixo nível.
Devido à elevada sensibilidade deste teste em relação à sequenciação de Sanger, recomenda-se
que a preparação do laboratório seja optimizada para evitar a contaminação cruzada de amostras
ou controlos. Para um exemplo de uma preparação ideal do laboratório, consulte Apêndice A.4
Preparação do laboratório para testes PCR.
3.2 Análise de amostras de pacientes utilizando os Kits SURVEYOR Scan
O SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD só deve ser utilizado no contexto de um dos fluxos
de trabalho indicados abaixo.
Fluxo de trabalho A
Fluxo de trabalho B
Amostra de
paciente
Amostra de
paciente
Testes KRAS Exons 2, 3 e 4
e NRAS Exons 2, 3 e 4
Teste KRAS Exon 2
Resultado
Mutação do Codão
KRAS 12 ou 13
Resultado Codão
KRAS 12 ou 13 de
tipo selvagem
Reportar relatório
Testes KRAS Exons 3 e 4
e NRAS Exons 2, 3 e 4
Reportar relatório
Reportar relatório
Figura 1 Fluxos de trabalho do Kit de detecção de mutações SURVEYOR Scan
para o rastreio de KRAS e NRAS
Instruções de Utilização do SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD para Sistemas de DHPLC
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3 Princípios do Teste de Detecção de Mutações com o SURVEYOR Scan KRAS
Para uma sugestão sobre como configurar 96 poços para análise de todos os KRAS e NRAS
Exons 2-4 consulte Apêndice A.1 Plano de disposição de poços para os Kits SURVEYOR
Scan.
For translator: Figure text: Fluxo de trabalho A; Amostra de paciente; Testes KRAS Exons 2, 3 e 4
e NRAS Exons 2, 3 e 4; Reportar resultado; Fluxo de trabalho B; Teste KRAS Exon 2; Resultado
da mutação do Codão KRAS 12 ou 13; Resultado do Codão KRAS 12 ou 13 de tipo selvagem
3.3 SURVEYOR Nuclease
A SURVEYOR Nuclease da Transgenomic é uma endonuclease específica para mismatch
(desigualdade) do ADN, que consegue procurar mutações conhecidas e desconhecidas e
8
polimorfismos em heterodúplices de ADN . A enzima cliva o ADN com elevada especificidade em
locais com desigualdade de bases-substituição e outras distorções. Esta endonuclease do ADN
corta ambas as cadeias de uma heterodúplice de ADN na extremidade 3’ do sítio de mismatch. As
desigualdades de inserção/deleção e todas as desigualdades de bases-substituição são
reconhecidas, mas a eficiência da clivagem varia em função da sequência da desigualdade.
Figura 2. Modo de acção da
SURVEYOR Nuclease. A
endonuclease reconhece uma
mismatch e cliva na extremidade 3’
de cada base na mismatch. Isto cliva
a cadeira dupla de ADN, deixando
saliente uma única base de 3’.
A SURVEYOR Nuclease tem sido utilizada em diversos contextos para detectar com precisão
uma vasta gama de mutações e polimorfismos nos genes. Em particular, a SURVEYOR Nuclease
tem sido utilizada para verificar a presença de mutações conhecidas numa série de genes
associados ao cancro renal, cancro dos pulmões, cancro da cabeça e do pescoço, leucemia, cancro
9,10,11
do endométrio e na previsão de resultados da radioterapia
.
O SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD foi concebido para a clivagem de mismatches no
KRAS Exon 2 para análise subsequente pelo DHPLC.
Nota: se uma amostra for 100% de ADN mutante, não podem ser formados quaisquer
heterodúplices e a amostra aparentará ser “Wild-Type”. No entanto, as amostras de biopsia
tumoral conterão células Wild-Type devido à heterogeneidade do tumor e/ou à
contaminação do tecido normal; note que entre 2 a 5% de amostras de Wild-Type podem
ser detectados por este kit com traços idênticos a 2-5% de ADN mutante.
Nota: apenas deve ser utilizada para este teste a DNA Polymerase fornecida com este kit.
Nota: Siga as instruções específicas no manual do sistema DHPLC.
Para utilizar este kit com êxito, recomendamos vivamente que leia este manual com
atenção e que siga cuidadosamente as instruções e orientações fornecidas. Os utilizadores
principiantes devem realizar as experiências de controlo descritas na secção Utilizar ADNs
Plasmídicos de Controlo.
Se tiver mais questões ou necessitar de assistência, contacte-nos através do número (888) 2339283 (apenas América do Norte), +1 (402) 452-5400 ou +44 (0) 141 892 8800 (Europa) e solicite
“Apoio sobre KRAS”. Em alternativa, pode enviar-nos um e-mail para o endereço:
[email protected]
Instruções de Utilização do SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD para Sistemas de DHPLC
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4 Rastreabilidade dos Controlos do Kit
4 Rastreabilidade dos Controlos do Kit
Os controlos fornecidos com este kit são clones plasmídicos das sequências do KRAS Exon 2.
Todos os clones foram sequenciados para verificar a fidelidade da sequência por comparação
com a NCBI Reference Sequence: NG_007524.1.
Os controlos têm um "selo" genético. Consulte Apêndice A.2 Selos de ADN de Controlo; estas
variações da sequência KRAS Wild-Type, numa região onde não se espera ocorrerem mutações,
podem ser utilizadas para resolver questões de contaminação de amostras através de Positive
Controls. Consulte o Apêndice B - Guia de Resolução de Problemas, Problema 8, para um
exemplo de um rastreio SURVEYOR Scan de tal contaminação.
O “KRAS Control Wild-Type” foi criado através da síntese e clonagem do KRAS Exon 2
utilizando a sequência de referência NCBI acima.
O “KRAS Positive Control Exon 2” foi criado através da síntese do KRAS Exon 2 utilizando a
sequência de referência acima mas contendo a mutação G12D. A sequenciação de ADN
confirmou que a única alteração da sequência se encontra no codão 12 com uma alteração
G12D, GGT>GAT. Este clone é em seguida misturado com ADN do KRAS Control Wild-Type
para criar uma mistura de heterozigotos.
5 Componentes
O SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD é composto por (1) uma Caixa de componentes
de digestão SURVEYOR com 10 tubos de reagente sem orifícios vazios e (2) um Suporte de
tubos de controlos e componentes PCR externo com 11 tubos de reagente e 9 orifícios vazios.
Número
de
catálogo
Componente
Cor da
tampa do
tubo
Volume fornecido
no Kit de
100 reacções
Roxo
Preto
Rosa
Castanho
Vermelho
Laranja
Laranja
2 x 105 µL
105 µL
105 µL
105 µL
250 µL
2 x 125 µL
2 x 125 µL
Vermelho
Transparente
Transparente
Azul
Azul
Amarelo
Verde
100 µL
1 mL
500 µL
3 x 90 µL
3 x 90 µL
120 µL
40 µL
Caixa de componentes de digestão SURVEYOR
710160
710161
708049
708027
708030
710153F
710153R
SURVEYOR Nuclease W
SURVEYOR Enhancer W2
SURVEYOR Enhancer Cofactor
0.15 M MgCl2 Solution
SURVEYOR Stop Solution
Universal Sequencing Primer 1 (10 µM)
Universal Sequencing Primer 2 (10 µM)
Caixa de controlos e componentes PCR
703310
703315
703065
710155F
710155R
710131
710135
482404
DNA Polymerase
DNA Polymerase 10X PCR Buffer
dNTPs (10 mM)
KRAS Primer Exon 2 Forward (10 µM)
KRAS Primer Exon 2 Reverse (10 µM)
KRAS Control Wild-Type
KRAS Positive Control Exon 2
Instruções de Utilização
Transferir a partir do site*
http://world.transgenomic.com/files/literature/482404-PT.pdf
Instruções de Utilização do SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD para Sistemas de DHPLC
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5 Componentes
5.1 Número de Amostras que podem ser testadas com um Kit
O SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD foi concebido para permitir testar 100 reacções. O
número total de amostras que podem ser testadas com o kit depende do tamanho médio do lote
de amostras testadas em cada momento, uma vez que em cada placa de reacção deve ser
incluído um conjunto de reacções de controlo (Controlo Wild-Type, Positive Control e Controlo
sem modelo). A tabela que se segue apresenta o número de amostras que podem ser analisadas
com o Kit KRAS em função do tamanho médio do lote de amostras. Isso tem em consideração (a)
os 3 controlos (Wild-Type, Positive Control, Controlo sem modelo) que são necessários para cada
execução de análise de amostras e (b) o limite de 100 reacções por kit.
Nota: Se forem processadas várias placas, deve ser processado em cada placa um conjunto dos
3 controlos listados acima. Por conseguinte, duas placas precisam de, no total, 6 reacções de
controlo, 3 placas precisam de 9 reacções de controlo, etc.
Quando se aumenta o tamanho do lote de amostras, aumenta o número de amostras que podem
ser testadas com um kit, reduzindo o custo médio de reagentes por amostra. A tabela abaixo
serve de orientação para determinar o número de amostras que podem ser testadas com um
único kit. Apresenta um valor estimado para prováveis perdas durante a pipetagem.
Tamanho do
lote de
amostras
N.º de reacções de
controlo + N.º de
amplificações de
amostras
N.º de reacções
por
processamento
N.º total de
processamentos
de lote de
amostras por kit
Total de
amostras
testadas
por kit
1
3+1
4
25
25
2
3+2
5
20
40
3
3+3
6
16
48
4
3+4
7
14
56
5
3+5
8
12
60
5.2 Sequenciação de DNA
São fornecidos Universal Sequencing Primers (PNs 710153F e 710153R) para utilização na
sequenciação de ADN de todas as amostras testadas. As amplificações obtidas por PCR, criadas
antes da digestão com a SURVEYOR Nuclease, devem ser utilizadas na sequenciação.
6 Reagentes e Equipamentos Adicionais Necessários
Os componentes e equipamentos adicionais necessários para utilizar o SURVEYOR Scan KRAS
Kit Exon 2 CE IVD para DHPLC incluem os seguintes:
Sistema DHPLC, coluna, tampões, ADN tamanho padrão
- consulte o Apêndice A.3.1 Especificações do Sistema DHPLC para aplicações
SURVEYOR Scan quanto às características de um sistema DHPLC adequado para
utilização com este kit
Água para biologia molecular
Tubos PCR de 0,2 mL, tiras ou placa de 96 poços
Micropipetas
Pontas de pipeta
Banho de gelo
Agitador de vórtice
Microcentrífuga
Termociclador
Géis de agarose e equipamento de electroforese em gel de agarose
Solução de lixívia a 10% ou agente de limpeza semelhante
Instruções de Utilização do SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD para Sistemas de DHPLC
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7 Preparação dos Reagentes
ponentes
7 Preparação dos Reagentes
Todos os reagentes fornecidos com este kit estão prontos a utilizar. Alguns componentes
precisam de ser descongelados, agitados ou centrifugados numa microcentrífuga antes da sua
utilização. Verifique os detalhes na secção Procedimento de teste abaixo apresentada. É
necessário combinar reagentes para produzir Misturas Principais e misturas de reacção. Os
detalhes completos são fornecidos na secção Procedimento de teste abaixo.
8 Armazenamento e Tempo de Permanência na Prateleira
O kit deve ser armazenado a uma temperatura entre -18 ºC e -25 °C num frigorífico de
temperatura constante até ser utilizado. Tenha em atenção o Prazo de Validade de cada kit
recebido. Não utilize um kit cujo prazo de validade já tenha expirado.
A mistura da SURVEYOR Nuclease preparada no Passo 7 com a Digestão de SURVEYOR
Nuclease deve ser imediatamente usada, uma vez que a SURVEYOR Nuclease W é
desactivada ao longo do tempo na presença de outros componentes da mistura de reacção da
SURVEYOR Nuclease.
9 Advertências e Precauções
Nenhum dos reagentes deste kit representa um perigo para a saúde nas quantidades fornecidas.
A Ficha de Dados de Segurança, documento n.º MSD-710104, da Transgenomic pode ser
transferida a partir de
http://world.transgenomic.com/files/literature/710104-PT.pdf
Este kit não contém substâncias de origem animal ou humana que representem um risco de
infecção.
Este kit deve ser utilizado apenas pelas pessoas que receberam formação sobre as técnicas
laboratoriais adequadas. Ao trabalhar com os componentes deste kit, use sempre uma bata de
laboratório adequada, luvas descartáveis e protecção ocular. Após a utilização, os componentes
do kit devem ser eliminados como resíduos clínicos e em conformidade com as normas e
regulamentos locais.
As alíquotas de reagentes pipetadas a partir dos tubos deste kit destinam-se a ser utilizadas
apenas uma vez. Os componentes deste kit demonstraram manter-se estáveis ao longo de 25
ciclos de congelamento/descongelamento. Não utilize este kit se este número de ciclos de
congelamento/descongelamento for excedido.
10 Recolha, Manuseamento e Armazenamento da
Amostra Primária
O SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD para o Sistema DHPLC foi validado para utilização
com ADN extraído a partir de amostras de tumores de cancro colo-rectal fixadas em formol e
embebidas em parafina (FFPE). Para uma extracção optimizada do DNA, os tecidos devem ser
fixados em formol durante 14–24 horas antes de serem embebidos em parafina.
As biópsias tumorais são uma mistura heterogénea de células tumorais e células não tumorais.
Para além disso, o próprio tumor é uma mistura heterogénea de células tumorais com mutações
e células tumorais sem mutações. Uma vez que estas mutações somáticas podem não estar
uniformemente distribuídas pelo tumor, as análises mutacionais de diferentes secções do mesmo
tumor podem ser diferentes. Para aumentar a probabilidade de detectar uma mutação, o ADN da
região tumoral do tecido deve ser isolado, raspando apenas a área do tumor da lâmina de vidro
utilizando um bisturi novo e esterilizado para cada nova lâmina.
Instruções de Utilização do SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD para Sistemas de DHPLC
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10 Recolha, Manuseamento e Armazenamento da Amostra Primária
Para a utilização bem-sucedida deste kit, o ADN extraído deve cumprir os critérios listados na
secção Considerações sobre o Modelo.
NOTA: As amostras de ADN extraído não destinadas a análise imediata com este kit devem ser
armazenadas congeladas a uma temperatura entre -20 ºC e -80 ºC.
11 Procedimento de Teste
11.1 Detecção de Mutações Somáticas com os Kits de Análise SURVEYOR
Scan - Uma Visão Geral
A detecção e confirmação de mutações com a SURVEYOR Nuclease envolve três passos:
Passo 1 - Preparar amplificações por PCR a partir de ADN mutante (teste) e normal
(referência), continuando a partir do ciclo final de amplificação por PCR para fundir todas
as cadeias duplas e depois arrefecer lentamente para uma formação óptima de hetero- e
homodúplices (os heterodúplices ocorrem quando uma cadeia de uma sequência WildType se hibrida com uma cadeia de uma sequência mutante).
Passo 2 - Tratar uma porção da mistura híbrida de heterodúplices/homodúplices com a
SURVEYOR Nuclease. A SURVEYOR Nuclease irá cortar ambas as cadeias de ADN
com heterodúplices, dando origem a fragmentos de ADN. O ADN Control Wild-Type,
tratado da mesma forma, serve de controlo de fundo.
Passo 3 - Analisar os fragmentos de ADN com o sistema DHPLC. A formação de novos
produtos de clivagem, devido à presença de uma ou mais desigualdades (mismatches), é
indicada pela presença de picos cromatográficos adicionais. Os tempos de migração dos
produtos de clivagem indicam o tamanho dos fragmentos e, por conseguinte, a
localização aproximada da desigualdade ou desigualdades.
Instruções de Utilização do SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD para Sistemas de DHPLC
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12 Instruções Passo-a-Passo
12 Instruções Passo-a-Passo
12.1 Configuração/Calibração inicial do Sistema DHPLC
Aquando da preparação da placa SURVEYOR Nuclease para análise com o sistema DHPLC,
consulte o Apêndice A.3 Requisitos de desnaturação do sistema HPLC (DHPLC).
12.2 Considerações antes da Análise de Amostras KRAS
Antes de processar amostras num sistema DHPLC, deve ser processado um ADN de tamanho
padrão apropriado para assegurar que o sistema está a funcionar correctamente. Através do
instrumento, o pessoal do laboratório deverá verificar a qualidade da resolução do ADN de
tamanho padrão antes de prosseguir com a análise.
12.3 Considerações sobre o Modelo
1. Para o DNA modelo isolado FFPE, use os procedimentos normais de laboratório para
avaliar a qualidade e quantidade do ADN extraído, de forma a assegurar que existe
quantidade suficiente de modelo para a PCR.
2. O rácio de absorção 260/280 deve ser superior a 1,80.
3. Para agilizar a preparação da PCR, ajuste a concentração do modelo de trabalho para
cerca de 12,5 ng/µL. Se necessário, dilua o ADN modelo em água para biologia
molecular.
Instruções de Utilização do SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD para Sistemas de DHPLC
Página 10
12 Instruções Passo-a-Passo
12.4 Considerações sobre o Fluxo de Trabalho
O kit foi concebido para permitir a análise de 100 reacções. Podem ser analisados lotes de
amostras mais pequenos, mas os controlos do kit e um “controlo sem modelo” têm de ser
incluídos em cada lote de amostras. O kit contém materiais de controlo suficientes para 100
reacções de todas as combinações de tamanhos de lotes de amostras a serem utilizados.
No geral, o processamento de amostras deve ser executado desde o início ao fim, conforme
descrito nestas Instruções de Utilização. Se o processamento de uma amostra tiver de ser
interrompido antes da conclusão de todos os passos, o ADN deve ser armazenado a uma
temperatura de -20 °C nos pontos indicados. Contudo, deve-se evitar a exposição de qualquer
amostra congelada a ciclos repetidos de congelamento/descongelamento e o armazenamento
congelado (-18 a -25 °C) de ADN amplificado por PCR ou de produtos de digestão da
SURVEYOR Nuclease por períodos alargados (>1 semana) deve ser evitado.
A análise de amostras deve seguir o fluxo de trabalho abaixo ilustrado:
Raspagem
de tecido
1
Isolamento
de ADN e
PCR
2
Electroforese em gel
3
Classificar PCR como Robusta/Fraca
4
5
Falha do
SURVEYOR
Scan
Análise de SURVEYOR
Nuclease e DHPLC
SURVEYOR Scan
Positivo
SURVEYOR Scan
Negativo
6
7
NVD
Confirmação
da sequência
8
Qualidade da
sequência
reprovada
Qualidade da
sequência aprovada
9
Mutações nos codões
G12 ou G13.
NVD
Figura 3 Fluxo de Trabalho da análise com o Kit SURVEYOR Scan KRAS
Instruções de Utilização do SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD para Sistemas de DHPLC
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12 Instruções Passo-a-Passo
Notas da Figura 3
1. Isole o DNA a partir de FFPE utilizando os procedimentos normais de laboratório.
2. Execute a PCR e verifique a qualidade do DNA através da electroforese em gel.
3. Registe se a banda de PCR é Robusta (≥20 ng/µL) ou Fraca (<20 ng/µL).
Se existirem múltiplas bandas de PCR, prepare ADN genómico fresco a partir de FFPE.
4. Com amostras que são classificadas como PCR Robusta ou PCR Fraca após a
amplificação por PCR, avance para o tratamento da SURVEYOR Nuclease e análise do
sistema DHPLC.
Note que com uma chamada de PCR Fraca, poderão não haver ADN suficiente para
a geração de resultados significativos no sistema DHPLC, mas poderá haver ADN
suficiente para a sequenciação.
5. Consulte o Apêndice B – Guia de Resolução de Problemas para exemplos de
resultados SURVEYOR Scan com falha. Todas as amostras com resultado falhado do
SURVEYOR Scan devem ser reprocessados de uma das seguintes formas:
a. repetindo a PCR se ainda restar ADN genómico suficiente
b. voltando a extrair ADN a partir de FFPE. Esta deverá ser a escolha secundária,
uma vez que normalmente não é desejável cortar outro bloco FFPE.
c.
se for utilizada outra secção ou bloco, o teste deve ser repetido na íntegra, uma
vez que as discrepâncias na digestão podem dever-se à heterogeneidade
tumoral.
6. Se não existirem picos de clivagem visíveis, registe um resultado negativo do
SURVEYOR Scan, ou seja, NVD = Nenhuma Variante Detectada.
7. Se uma amostra apresentar produtos de clivagem da SURVEYOR Nuclease (não
corresponder ao Wild-Type Control relevante), estes devem ser enviados para
confirmação da sequenciação.
8. Se a análise de confirmação de sequências for inaceitável, deve proceder de uma das
seguintes formas:
a. repetir a PCR se ainda restar ADN genómico suficiente
b. voltar a extrair ADN a partir de FFPE. Esta deverá ser a escolha secundária, uma
vez que normalmente não é desejável cortar outro bloco FFPE.
9. Se a análise de confirmação de sequências for aceitável, os resultados devem indicar:
a. Sequência Wild-Type, ou seja, Nenhuma Variante Detectada (NVD); ou
b. Variante Detectada. Se a confirmação de sequências indicar qualquer alteração
de base resultando numa alteração em aminoácido no:
i. codão 12; ou
ii. codão 13
classifique como uma mutação positiva do KRAS.
Nota: é possível ter uma chamada de SURVEYOR Scan Positivo que também resulta em
"Nenhuma Variante Detectada" a partir de um teste de confirmação de sequências. O nível de
detecção (LOD) da SURVEYOR Nuclease num sistema DHPLC é tão baixo como 2% de mutante
em 98% de ADN Wild-Type para algumas mutações, enquanto que o LOD de sequenciação é de
cerca de 10-25% de mutante em 90-75% de ADN Wild-Type.
Nota: se uma amostra for 100% de ADN mutante, não podem ser formados quaisquer
heterodúplices e a amostra aparentará ser “Wild-Type”. No entanto, as amostras de biopsia
tumoral conterão células Wild-Type devido à heterogeneidade do tumor e/ou à contaminação do
tecido normal; 5% de amostras de Wild-Type podem ser detectados por este kit com traços
idênticos a 5% de ADN mutante.
Instruções de Utilização do SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD para Sistemas de DHPLC
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12 Instruções Passo-a-Passo
Nota: os resultados positivos do SURVEYOR Scan podem ser devidos a alterações de bases que
não as que são activadoras do KRAS. Embora estas mutações sejam raras, a confirmação
através de outros métodos, tais como a sequenciação de ADN, será necessária para determinar
se um resultado positivo do SURVEYOR Scan é ou não uma mutação activadora do KRAS.
Nota: o processo de fixação em formol utilizado na preparação de amostras FFPE de biópsia
tumoral podem resultar na desaminação de citosinas. Esta desaminação converte a citosina em
uracilo. A polimerase irá “interpretar” este uracilo como uma timina e incorporar uma adenina nas
cadeias copiadas. Isto irá então parecer uma mutação onde o G normal é agora substituído por
um A gerando uma mutação de G/C para A/T que é uma mutação artificial resultante do processo
de fixação e não uma verdadeira mutação somática. Estes são acontecimentos raros, mas se
forem copiados no ciclo de PCR, estes irão “parecer” mutações. Estes não se repetem com a
reanálise.
Exemplos de potenciais mutações da desaminação da citosina que seriam consideradas para a
determinação do tratamento do paciente incluem:
-
Codão 12: AGT (G12S) e GAT (G12D)
-
Codão 13: AGC (G13S), GAC (G13D) e GGT (G13G, uma mutação silenciosa)
Por isso, é recomendado que qualquer mutação dessas seja confirmada por uma análise de
duplicados do mesmo ADN genómico ou que todas as amostras sejam sujeitas à análise de
duplicados desde o início da análise.
12.5 Protocolo de Amplificação
1. A solução pré-misturada dNTP da Transgenomic (PN 703065) é fornecida com uma
concentração de trabalho total de 10 mM de desoxinucleótidos (2,5 mM de cada um dos
quatro desoxinucleótidos).
2. Os primers de PCR KRAS Exon 2 Forward e Reverse (PNs 710155F/R) são fornecidos
na concentração de 10 µM.
3. Retire os primers de 10 µM, a solução de 10 mM dNTPs e o DNA Polymerase 10X PCR
Buffer (PN 703315) do frigorífico e descongele em gelo.
4. Uma vez descongelados, agite em vórtice todos os componentes do kit (~10 segundos)
para misturar bem, centrifugue brevemente (~10 segundos) para assegurar que não resta
nenhum líquido nas tampas dos tubos e coloque em gelo.
5. Prepare a Mistura Principal em gelo.
6. Use a tabela que se segue como um guia para preparar a Mistura Principal para as
reacções do KRAS Exon 2:
Número de Reacções:
Cálculo do Volume:
Volume de Água (µL)
DNA Polymerase 10X PCR Buffer (µL)
dNTPs (µL)
KRAS Primer Exon 2 Forward (µL)
KRAS Primer Exon 2 Reverse (µL)
DNA Polymerase (µL)
Volume Total da Mistura Principal
10
330**
50
40
25
25
10
48,0
**Nota: O utilizador deve ter como objectivo um mínimo de 25 ng de ADN por
reacção de 50 µL. Quando as concentrações de ADN extraído são inferiores a 12,5
ng/µL, aumente proporcionalmente o volume de ADN extraído para assegurar 25 ng por
reacção. Diminua também nessa mesma quantidade o volume de água na Mistura
Principal para resultar em 50 µL por reacção. Todas as amostras preparadas com esta
Mistura Principal irão necessitar de diluir o ADN extraído para aproximadamente o
mesmo nível de concentração mínimo. A utilização de concentrações de ADN extraído
inferiores a 5 ng/µL não é recomendada.
Instruções de Utilização do SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD para Sistemas de DHPLC
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12 Instruções Passo-a-Passo
7. Calcule os volumes necessários para qualquer Mistura Principal de acordo com o gráfico
acima; note que:
Para esta Mistura Principal, são necessárias três reacções adicionais para o
Controlo KRAS Wild-Type, KRAS Positive Control Exon 2 e para o Controlo sem
modelo KRAS Exon 2 (NTC1).
Nota: tenha em atenção que será necessário um volume de Mistura Principal
ligeiramente superior a este cálculo para compensar as perdas durante a pipetagem.
8. Rotule os tubos de PCR de 0,2 mL ou os poços de uma placa de 96 poços, com as
informações adequadas da amostra.
9. Rotule um tubo centrífugo de 2,0 mL para a preparação da Mistura Principal.
10. Adicione o volume necessário de água para biologia molecular aos tubos centrífugos de
2,0 mL rotulados “Mistura Principal”.
11. Adicione o volume necessário de DNA Polymerase 10X PCR Buffer ao tubo da Mistura
Principal.
12. Adicione o volume necessário de 10 mM dNTPs ao tubo da Mistura Principal.
13. Adicione o volume necessário de KRAS Forward Primer ao tubo da Mistura Principal.
14. Adicione o volume necessário de KRAS Reverse Primer ao tubo da Mistura Principal.
15. Retire a DNA Polymerase (PN 703310) do frigorífico.
16. Centrifugue a DNA Polymerase durante ~10 segundos.
17. Misture a DNA Polymerase durante ~10 segundos.
18. Adicione o volume necessário de DNA Polymerase ao tubo da Mistura Principal.
19. Coloque a tampa no tubo da Mistura Principal.
20. Antes de utilizar, agite em vórtice o tubo da Mistura Principal durante ~30 segundos e
depois centrifugue brevemente durante ~10 segundos.
21. Armazene em gelo até ser utilizado.
22. Pipete 48,0 µL (ver nota acima no passo 6) da Mistura Principal nos poços adequados,
mudando entretanto as pontas de pipeta se estiver a utilizar um pipetador de canal único.
Se estiver a utilizar um pipetador de repetição, assegure que não existem derrames ou
salpicos de poço para poço. Mantenha a placa em gelo.
23. Nos poços adequados, adicione 2,0 µL (ver nota acima no passo 6) de cada ADN modelo
de amostra ou de água (controlo sem modelo, NTC). Use pontas de pipeta separadas
para cada amostra e evite a contaminação cruzada entre amostras por salpicos. Coloque
a tampa nos poços que contêm as amostras de ADN e o NTC com as tiras de 8 tampas
(se estiver a utilizar uma placa de 96 poços) ou coloque a tampa nos tubos de PCR de
0,2 mL. Certifique-se de que as tampas estão bem seladas.
24. Só então deve abrir os tubos de ADN modelo de controlo do kit (PNs 710131, 710135) um
de cada vez. Pipete 2,0 µL de cada um dos modelos destes controlos em último lugar, de
forma a reduzir a probabilidade de contaminação de qualquer amostra de ADN. Mais uma
vez, coloque a tampa em cada poço com as tiras de 8 tampas (se estiver a utilizar uma
placa de 96 poços) ou coloque a tampa nos tubos de PCR de 0,2 mL. Certifique-se de
que as tampas estão bem seladas.
NOTA: A boa prática é colocar os controlos sem modelo (NTC) em poços não adjacentes
ao Positive Control ou amostras.
NOTA: Para uma sugestão sobre como configurar placas de 96 poços para análise de
todos os KRAS e NRAS exons 2-4 consulte o Apêndice A.1 Plano de disposição de
poços para os Kits SURVEYOR Scan.
25. Agite em vórtice (velocidade ~1/2) durante 10 segundos.
Instruções de Utilização do SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD para Sistemas de DHPLC
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12 Instruções Passo-a-Passo
26. Centrifugue durante 1-2 minutos para assegurar que todas as soluções são recolhidas no
fundo dos poços ou tubos. Verifique se as soluções estão no fundo de cada poço ou tubo.
Senão, repita a centrifugação.
12.7 Programa do Termociclador para Protocolo de Amplificação
1. Use o seguinte protocolo do termociclador para Amplificação por PCR e formação de
heterodúplices:
Desnaturação inicial
95 C
Amplificação de assentamento
15 ciclos
30 ciclos
1 ciclo
5 minutos
95 C
62 C, -0,5 ºC/ciclo
72 C
Amplificação
30 segundos
30 segundos
25 segundos
95 C
55 C
72 C
Extensão final
30 segundos
30 segundos
25 segundos
72 C
Formação de heterodúplices
95 ºC
2 minutos
≤12 C
2 minutos
Manter
12.8 Controlo de Qualidade dos Produtos de PCR
1. Recomenda-se que a qualidade e quantidade das amplificações seja verificada através
da electroforese em gel (ou meio equivalente) antes de avançar para a digestão com a
SURVEYOR Nuclease.
2. Analise uma alíquota do produto de PCR, juntamente com diferentes quantidades de um
ladder de massa ADN de 100-bp.
3. Use o ladder para estimar a concentração do ADN amplificado.
4. Apenas deve ser observada uma única banda superior a 20 ng/µL correspondente ao
produto de PCR principal.
5. Se estiverem presentes múltiplas bandas, certifique-se de que a qualidade do ADN
modelo de partida era suficiente (consulte o Apêndice B – Guia de Resolução de
Problemas).
6. Se não for observado nenhum produto, certifique-se de que a qualidade do ADN modelo
de partida era suficiente (consulte Apêndice B – Guia de Resolução de Problemas). Se
a qualidade satisfizer as especificações, aumente o volume de modelo para 4,0 µL por
reacção de 50 µL (reduza a água por reacção para 31,0 µL).
7. Não deve ser visível nenhum produto de PCR na amostra de controlo sem modelo. Se
estiverem visíveis produtos de ADN com este controlo, é provável a ocorrência de
contaminação; consulte o Apêndice B - Guia de Resolução de Problemas.
8. Classifique a PCR como PCR Robusta ou PCR Fraca.
a. A PCR Robusta deve ter uma única banda igual ou superior a 20 ng/µL.
b. A PCR Fraca deve ter uma única banda inferior a 20 ng/µL.
c.
Avance para a digestão com a SURVEYOR Nuclease com pontuações de PCR
Robusta e Fraca.
CONSELHO: nessa etapa, os produtos de PCR podem ser armazenados a uma
temperatura inferior ou igual a -20 ºC até uma semana.
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12 Instruções Passo-a-Passo
12.9 Digestão da SURVEYOR Nuclease
1. Depois de a PCR da amostra ser considerada suficiente em termos qualitativos e
quantitativos, execute a reacção de digestão com a SURVEYOR Nuclease, conforme
descrito de seguida.
2. Descongele os tubos que contêm a 0.15 M MgCl2 Solution e o SURVEYOR Enhancer
Cofactor em gelo.
3. Adicione 10,0 µL de cada amostra amplificada por PCR a partir de cima para um novo
tubo de PCR de 0,2 mL ou poço de uma placa de 96 poços.
4. Prepare uma mistura fresca com 0.15 M MgCl2 Solution, SURVEYOR Enhancer Cofactor,
SURVEYOR Enhancer W2 e SURVEYOR Nuclease W (mistura da SURVEYOR
Nuclease).
Use a tabela que se segue como um guia para preparar uma Mistura Principal Digerida pela
SURVEYOR Nuclease para a análise de múltiplas amostras. O exemplo abaixo contém os
volumes para uma Mistura Principal para 10 amostras.
Tenha em atenção que será necessário um volume de Mistura Principal ligeiramente superior a
este cálculo para compensar as perdas durante a pipetagem.
Número de Reacções de Digestão com SURVEYOR
Nuclease:
Cálculo do Volume:
0.15 M MgCl2 Solution (µL)
SURVEYOR Enhancer Cofactor (µL)
SURVEYOR Enhancer W2 (µL)
SURVEYOR Nuclease W (µL)
Volume Total da Mistura Principal:
10
10,0
10,0
10,0
20,0
50,0
Adicionar 5 µL de Mistura Principal da SURVEYOR
Nuclease a cada
amostra amplificada por PCR (µL)
Volume Total da Reacção de Digestão com
SURVEYOR Nuclease:
10,0
15,0
a. Centrifugue cada reagente antes de o utilizar.
b. Agite suavemente em vórtice cada reagente antes de pipetar; centrifugue brevemente
durante ~10 segundos após cada etapa de vórtice.
c.
Para cada digestão, adicione os seguintes componentes a um tubo microcentrífugo
de PCR de 0,2 mL (ou maior).
1,0 µL 0,15 M MgCl2 Solution (PN 708027)
1,0 µL SURVEYOR Enhancer Cofactor (PN 708049)
1,0 µL SURVEYOR Enhancer W2 (PN 710161)
2,0 µL SURVEYOR Nuclease W (PN 710160)
Ou adicione 5 µL de Mistura Principal, preparada de acordo com a tabela acima.
5. Agite lentamente em vórtice a Mistura Principal Digerida pela SURVEYOR Nuclease
durante 10 segundos numa velocidade reduzida.
6. Centrifugue a Mistura Principal Digerida pela SURVEYOR Nuclease durante 10 segundos
numa velocidade reduzida.
7. Coloque a Mistura Principal Digerida pela SURVEYOR Nuclease em gelo até ser
utilizada.
Nota: A Mistura Principal Digerida com SURVEYOR Nuclease preparada no Passo 7
deve ser imediatamente usada, uma vez que a SURVEYOR Nuclease W é desactivada
ao longo do tempo quando na presença de outros componentes da Mistura Principal
Digerida com SURVEYOR Nuclease.
Instruções de Utilização do SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD para Sistemas de DHPLC
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12 Instruções Passo-a-Passo
8. Pipete uma alíquota de 5,0 µL-da Mistura Principal Digerida com SURVEYOR Nuclease
em cada tubo ou poço com uma alíquota de 10,0 µL de produto amplificado por PCR (ver
o Passo 3 acima).
9. Quando a pipetagem estiver concluída, centrifugue os tubos de PCR de 0,2 mL ou placa
de 96 poços durante 10 segundos.
10. Agite lentamente em vórtice os tubos de PCR de 0,2 mL da amostra ou placa de 96
poços, durante 10 segundos.
11. Centrifugue durante 10 segundos a uma velocidade reduzida (este passo é
especialmente importante se a digestão for executada num instrumento sem uma tampa
aquecida).
12. Deixe incubar a uma temperatura de 42 °C durante 30 minutos.
13. Adicione 1,0 µL de SURVEYOR Stop Solution (PN 708030) a cada tubo ou poço e agite
lentamente em vórtice (o volume total da reacção de digestão com a SURVEYOR
Nuclease é de 16,0 µL).
CONSELHO: nessa etapa, os produtos de PCR podem ser armazenados a uma
temperatura inferior ou igual a -20 ºC até uma semana.
14. Carregue as amostras digeridas num sistema DHPLC.
Nota: Para definições de gradiente sugeridas do sistema DHPLC para a análise de digestões
da SURVEYOR Nuclease, consulte http://world.transgenomic.com/diagnostic-tools/geneticanalysis-kits/crc-rascan-kits-eu/dhplcsystemsettings.
13 Procedimentos de Controlo da Qualidade
13.1 Controlo de Qualidade do SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD
Os ADNs Plasmídicos de Controlo estão incluídos no kit para permitir a execução de verificações
de controlo da qualidade em passos específicos do procedimento de teste. Para o Protocolo de
Amplificação, estes controlos fornecem uma forma para assegurar que a Mistura Principal está
correctamente preparada e a amplificação está a funcionar adequadamente. Também são
necessários controlos sem modelo (nos quais é adicionada água em vez de ADN modelo) para
verificar a possível ocorrência de contaminação dos componentes do kit com algum modelo de
ADN externo.
Na fase de digestão com a SURVEYOR Nuclease, a amplificação do ADN plasmídico de controlo
fornece uma verificação eficaz de que as condições da reacção de clivagem (condições de
preparação e incubação da Mistura Principal Digerida com SURVEYOR Nuclease) foram
satisfatórias. Na fase de análise, os cromatogramas do sistema DHPLC das amplificações de
controlo digeridas com a SURVEYOR Nuclease fornecem orientações sobre onde os picos de
produtos de clivagem correspondentes às mutações do KRAS Exon 2, mesmo a baixos níveis,
irão eluir (ver Figura 4). Os picos de produtos de clivagem correspondentes a outras mutações no
KRAS Exon 2 podem eluir em posições ligeiramente diferentes.
Se as amplificações obtidas por PCR não coincidirem com os resultados descritos na secção
Controlo de Qualidade dos Produtos de PCR, consulte o Apêndice B - Guia de Resolução de
Problemas ou contacte o Apoio Técnico da Transgenomic antes de avançar para os passos
seguintes da análise de amostras.
13.2 Utilizar ADNs Plasmídicos de Controlo
O kit é fornecido com dois ADNs de controlo:
KRAS Control Wild-Type; PN 710131
KRAS Positive Control Exon 2; PN 710135
Estes ADNs de controlo são plasmídeos com inserções. Cada Positive Control contém dois
plasmídeos: uma mistura do KRAS Control Wild-Type e um clone de mutação que difere do WildType num único par de bases. Os controlos são fornecidos em frascos separados, cada um com
5
uma concentração de 10 cópias/µL.
Instruções de Utilização do SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD para Sistemas de DHPLC
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13 Procedimentos de Controlo da Qualidade
Os primers de PCR KRAS Exon 2 Forward e Reverse, necessários para a amplificação por PCR,
são fornecidos em separado no kit. Para a utilização destes controlos, siga as instruções contidas
na secção Protocolo de Amplificação, Digestão com a SURVEYOR Nuclease e Análise do
KRAS Exon 2 utilizando a SURVEYOR Nuclease.
RECOMENDAMOS VIVAMENTE QUE OS UTILIZADORES PRINCIPIANTES REALIZEM
EXPERIÊNCIAS APENAS COM OS CONTROLOS ANTES DE TESTAREM AMOSTRAS
GENÓMICAS.
14 Interpretação dos Resultados
14.1 Análise do KRAS Exon 2 utilizando a SURVEYOR Nuclease
Para fins de comparação e controlo, execute SEMPRE a digestão com SURVEYOR Nuclease em
cada um dos controlos (Wild-Type e Positive Controls), um controlo sem modelo, assim como
amostras de ADN, e execute a análise na mesma placa de amostras do sistema DHPLC.
Na fase de digestão com a SURVEYOR Nuclease, a amplificação destes ADNs plasmídicos de
controlo fornecem uma verificação eficaz de que as condições da reacção de clivagem (condições
de preparação e incubação da mistura SURVEYOR Nuclease) foram satisfatórias. Na fase de
análise, os rastreios do sistema DHPLC destas amplificações de controlo digeridas com a
SURVEYOR Nuclease fornecem orientações sobre onde irão eluir os fragmentos de ADN
resultantes da clivagem nos sítios de mismatch (desigualdade) de mutações específicas, mesmo
a baixos níveis (ver Figura 4).
Se as amplificações obtidas por PCR ou os fragmentos de clivagem da SURVEYOR Nuclease
derivados a partir dos ADNs de controlo não coincidirem com os resultados descritos, consulte o
Apêndice B -Guia de resolução de problemas ou contacte o Apoio Técnico da Transgenomic
antes de avançar para os passos seguintes da análise de amostras.
Os exemplos abaixo são apresentados apenas a título de exemplo e NÃO se destinam a ser
utilizados para determinar a identidade de qualquer mutação. É necessária a confirmação da
identidade de uma mutação de forma a determinar inequivocamente a presença de uma alteração
de bases específica no Exon 2 do gene KRAS.
A SURVEYOR Nuclease cliva todas as desigualdades (mismatches) resultantes da
formação de heterodúplices entre ADNs Wild-Type e mutantes, não apenas mutações no
Exon 2. A SURVEYOR Nuclease confirma que está presente uma desigualdade. A identidade da
alteração de bases específica da mutação é necessária para a determinação do estado de
activação de KRAS e deve ser confirmada por outros métodos, tais como a sequenciação.
14.2 Revisão de dados dos resultados do SURVEYOR Scan
Observe os cromatogramas e compare os cromatogramas de Wild-Type e Positive Controls com
os da amostra. Determine se o cromatograma da amostra é similar a ou diferente do padrão WildType. Se for diferente, a amostra deve ser considerada “SURVEYOR Scan Positivo” e enviada
para análise da sequência de ADN. Consulte a Figura 4 para exemplos e o Apêndice B –
Resolução de Problemas, Problemas 7 e 8 para exemplos de tais amostras.
Qualquer amostra com um padrão de SURVEYOR Nuclease diferente do Wild-Type deve ser
enviada para confirmação das sequências mesmo se não for idêntica ao Controlo. Consulte o
Apêndice B – Resolução de Problemas, Problema 7 para um exemplo de tal amostra.
Quando necessário, amplie a região de interesse e sobreponha o cromatograma da amostra com
o Controlo Wild-Type para essa amplificação.
Identifique quaisquer diferenças entre o controlo Wild-Type e a amostra analisada.
Importante! Após uma revisão minuciosa de cada amostra, o revisor de dados deve examinar se
as amostras adjacentes na placa de análises têm os mesmos resultados positivos do SURVEYOR
Scan. Se ocorrerem resultados positivos idênticos, estes podem resultar da contaminação
cruzada de amostras ou controlos e a análise tem de ser repetida.
Instruções de Utilização do SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD para Sistemas de DHPLC
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14 Interpretação dos Resultados
14.3 Exemplos de Resultados
Os exemplos de resultados obtidos utilizando o SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD com
®
o sistema DHPLC são apresentados na Figura 4 abaixo. Nestes exemplos, utilizando os WAVE
4500 Systems com detectores de UV e fluorescência, o processo descrito na secção Instruções
passo-a-passo foi seguido com precisão. Para uma orientação no que diz respeito às definições
de gradiente sugeridas do sistema DHPLC para a análise de digestões da SURVEYOR Nuclease,
consulte
http://world.transgenomic.com/diagnostic-tools/genetic-analysis-kits/crc-rascan-kitseu/dhplcsystemsettings.
Figura 4A
KRAS Control Wild-Type
KRAS Positive Control Exon 2
Amplificação
Amostra 1, KRAS Exon 2
não clivada
Amostra 2, KRAS Exon 2
200-bpAmostra 3, KRAS Exon 2
Tamanho de ADN padrão
Fluxo através
de DHPLC
G12D gera
fragmentos de
74 e 116-bp
Amplificação
não clivada
190-bp
Lavagem
do DHPLC
Figura 4B
G12D gera
fragmentos de
74 e 116-bp
KRAS Control Wild-Type
KRAS Positive Control Exon 2
Amplificação
Amostra 1, KRAS Exon 2
não clivada
Amostra 2, KRAS Exon 2
200-bpAmostra 3, KRAS Exon 2
Tamanho de ADN padrão
Amplificação
não clivada
190-bp
Figuras 4A e 4B: Análise WAVE DHPLC com detecção de UV (Figura 4A) e fluorescência
(Figura 4B) de digestões da SURVEYOR Nuclease do KRAS Positive Control Exon 2 e do
KRAS Control Wild-Type e ADN CRC isolado de secções FFPE. Ao rever visualmente os
cromatogramas, as amostras digeridas devem ser comparadas ao Wild-Type Control (linha
castanha). O KRAS Positive Control Exon 2 (linha azul) é uma mistura de Wild-Type e plasmídeos
mutantes G12D que resulta em picos de digestão de 74 e 116 bp; este controlo indica que o
passo de digestão da SURVEYOR Nuclease está a funcionar e mostra a região do cromatograma
que deve ser visualmente inspeccionada para determinar se uma amostra deve ser enviada para
análise de sequências de ADN. Ao comparar padrões de digestão para as amostras 1-3 com o
electroferograma de não digestão Wild-Type, é evidente que as Amostras 1 e 2 (linhas vermelha e
turqueza) apresentam possíveis mutações e devem ser alvo de sequenciação para confirmar a
presença ou ausência de uma mutação no codão relevante. A Amostra 3 (linha verde) possui
cromatogramas similares aos observados para o Wild-Type Control e não precisa de ser enviada
para análise de sequências de ADN. Tenha em atenção que o resultado da sequência é o
Instruções de Utilização do SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD para Sistemas de DHPLC
Página 19
14 Interpretação dos Resultados
resultado definitivo, uma vez que podem existir outras mutações não relevantes que podem
resultar em fragmentos do mesmo tamanho.
15 Características de Desempenho
15.1 Nível de Detecção de Mutações utilizando os Kits SURVEYOR Scan
A validação dos Kits SURVEYOR Scan para plataformas DHPLC utilizando clones plasmídicos de
todas as mutações indicadas tem mostrado que os picos da SURVEYOR Nuclease podem ser
detectados numa mistura de 2-5% de mutante num fundo Wild-Type.
A chamada de sequenciação automática das cadeias forward e reverse muitas vezes não
consegue detectar mutações a níveis abaixo de 10% em misturas com ADN Wild-Type.
Juntamente com os resultados da SURVEYOR Nuclease, é possível interpretar com maior
confiança os electroferogramas de sequenciação de 5-10% de mutante.
Se uma análise de amostras apresentar um resultado positivo do SURVEYOR Scan, mas
não existir nenhuma mutação do KRAS ou do NRAS detectável através da sequenciação de
ADN, recomendamos que seja registado um resultado de "Nenhuma Variante Detectada".
Para mais detalhes, consulte a secção Considerações sobre o Fluxo de Trabalho”.
15.2 Confirmação de Sequências
Avance para a confirmação de sequências de todos os resultados positivos do SURVEYOR Scan
para determinar a identidade da sequência das mutações do KRAS Exon 2.
Não avance para a confirmação de sequências se o SURVEYOR Scan apresentar um resultado
negativo. A amostra pode ser registada como Wild-Type ou nenhuma variante detectada.
Os Universal Sequencing Primers incluídos neste kit destinam-se a ser utilizados para a
confirmação de sequências. O primer forward é o PN 710153F (Universal Sequencing Primer 1) e
o primer reverse é o PN 710153R (Universal Sequencing Primer 2).
15.3 Limitações do Procedimento de Teste
As substâncias contaminadas, transferidas através da extracção de amostras fixadas em formol e
embebidas em parafina, podem interferir nos procedimentos de amplificação por PCR e de
digestão com a SURVEYOR Nuclease. Os procedimentos de controlo da qualidade descritos na
secção Controlo de Qualidade dos Produtos de PCR irão assegurar que o ADN extraído é
adequado para utilização neste kit.
Este kit foi validado para a análise de amostras de tumores de cancro colo-rectal fixadas em
formol e embebidas em parafina. Não foi validado para diagnóstico de outros outro tipo de
cancros ou para uso com amostras de biópsia frescas ou congeladas.
Para a resolução de problemas com resultados anormais ou para obter detalhes sobre factores
que podem afectar este teste, consulte o Apêndice B - Guia de Resolução de Problemas
abaixo.
Deve ter-se cuidado para evitar transferências ou contaminação cruzada com este kit. A extrema
sensibilidade do método de teste requer que sejam tomadas precauções nos seguintes pontos:

Certifique-se de que todas as amostras são manuseadas de forma a que não possa
ocorrer contaminação cruzada entre amostras.

Trabalhe numa estação de trabalho de PCR ou noutro espaço adequado onde a área de
trabalho possa estar exposta aos raios UV antes de preparar as reacções de amplificação
por PCR.

Use uma estação de trabalho ou sala de PCR separada para abrir as amostras após a
amplificação por PCR para o Controlo de Qualidade através da electroforese em gel.

A preparação da digestão com a SURVEYOR Nuclease deve ser feita numa sala
separada ou numa estação de trabalho de PCR diferente daquela onde a PCR inicial foi
preparada.
Instruções de Utilização do SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD para Sistemas de DHPLC
Página 20
15 Características de Desempenho


Assegure que os controlos plasmídicos do kit são manuseados em separado das
amostras de teste em todas as etapas do teste.
o
Certifique-se de que todas as soluções, o controlo sem modelo e poços de
amostras de ADN estão fechados com a respectiva tampa antes de abrir os tubos
que contêm o DNA Plasmídico de Controlo.
o
MANUSEIE OS CONTROLOS EM ÚLTIMO LUGAR. Adicione o DNA Plasmídico
de Controlo aos tubos adequados apenas DEPOIS DE TODOS os poços de
amostras e o controlo sem modelo estarem fechados com a respectiva tampa.
o
Depois de tapar os tubos de ADN de controlo com a respectiva tampa, limpe
TODOS os tubos e tampas com um agente de destruição de ADN (como por
exemplo, solução de lixívia a 10%) antes de os transferir para outra área.
Ao pipetar as amostras nas placas de 96 poços, certifique-se de que não permite a
contaminação das amostras de poços adjacentes devido a salpicos durante a mistura ou
por não ter mudado pontas de pipetas.
Instruções de Utilização do SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD para Sistemas de DHPLC
Página 21
Apêndice A
Apêndice A
A.1 Plano de disposição de poços para os Kits SURVEYOR Scan
O plano de disposição de poços sugerido abaixo destina-se a ser utilizado na execução da
análise SURVEYOR Scan simultânea dos sete KRAS e NRAS Exons em 10 amostras.
Chave: Ex = Exon; WT = Wild-Type; Mut = Mutação; NTC = Controlo sem modelo.
A.2 Selos de ADN de controlo
As sequências com um "Selo" são apresentadas abaixo.
Chave: As regiões de mutação mais comuns estão assinaladas a Roxo. As sequências
apresentadas em MAIÚSCULAS são bases codificadoras; as sequências apresentadas
em minúsculas são bases não codificadoras.
Os controlos possuem um "selo" genético realçado a Amarelo; esta variação da
sequência do KRAS Wild-Type, numa região onde não se espera ocorrerem mutações,
pode ser utilizada para solucionar problemas de contaminação de amostras por
Positive Controls. Consulte o Apêndice B - Guia de resolução de problemas,
Problema 8, para um exemplo de um rastreio do SURVEYOR Scan de tal
contaminação.
"Selo" do KRAS Exon 2
Tamanho da Amplificação: 190 bp. Para a criação do selo genético de plasmídeos de
controlo KRAS Exon 2, TAT é alterado para ATA. Os Codões 12 e 13 estão igualmente
realçados abaixo.
GCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAAATAGAT
A.3 Requisitos de desnaturação do sistema HPLC (DHPLC)
A.3.1 Especificações do sistema DHPLC para aplicações SURVEYOR Scan
As especificações que se seguem constituem os requisitos mínimos das especificações do
sistema DHPLC para a realização de testes com os Kits SURVEYOR Scan KRAS e NRAS.
Sistema de administração de solvente com gradiente de elevado desempenho
 Capacidade de gradiente binário; alta pressão ou baixa pressão
 Controlo da taxa de fluxo, intervalo mínimo: 0,7 – 1,6 mL/min
 Precisão da taxa de fluxo: ± 2% (H2O a 20 ºC)
 Solvente desgaseificador
Sistema de auto-amostragem
 Controlo de temperatura para placas frias, configurável: 4 a 14 ºC
 Volume de injecção: 5–50 µL
Cartucho de separação
Instruções de Utilização do SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD para Sistemas de DHPLC
Página 22
Apêndice A

Concebido para a separação de tamanhos de fragmentos dsADN, fragmentos de
tamanho entre 50 bp e 250 bp
Estufa de controlo de temperatura de alta precisão
 Intervalo de temperatura: 40 a 70 ºC
 Precisão de temperatura: ± 0,2 ºC
 Reprodutibilidade da temperatura: ± 0,2 ºC
 Linearidade sobre intervalo de temperatura completo: ± 2,0 ºC
Alternativa de detecção 1
 Detector UV/VIS
 Intervalo do comprimento de onda: 190 – 700 nm
 Fonte UV: Lâmpada de deutério
Alternativa de detecção 2
 Detector de fluorescência
 Intervalo do comprimento de onda: excitação: 200 – 850 nm; emissão: 250 – 900
nm
 Fonte de fluorescência: Lâmpada de Xénon de 150 W

Bomba de coloração de fluorescência
 Taxa de fluxo fixa a 0,1 mL/min – 20%/+50%
 Fluxo de baixa pulsação
A.3.2 Funcionamento do sistema
Para a instalação e utilização do sistema DHPLC, consulte e siga as recomendações do
fabricante quanto à análise de fragmentos de dsADN dentro do intervalo de dimensões de 50 bp a
250 bp, direccionada para uma discriminação de tamanho igual ou superior a 10 bp. Este é o
intervalo de dimensões para fragmentos no seguimento da digestão da SURVEYOR Nuclease
com este kit.
Para uma orientação no que diz respeito às definições de gradiente sugeridas do sistema DHPLC
para a análise de digestões da SURVEYOR Nuclease, consulte
http://world.transgenomic.com/diagnostic-tools/genetic-analysis-kits/crc-rascan-kitseu/dhplcsystemsettings.
A.3.3 Manutenção dos cartuchos do sistema DHPLC
Para a manutenção dos cartuchos do sistema DHPLC, siga as recomendações do fabricante.
Nota: a análise de reacções da SURVEYOR Nuclease irá requerer protocolos de limpeza mais
frequentes e rigorosos do que os utilizados na análise de amostras por PCR. Consulte as
directrizes do seu sistema DHPLC para obter mais informações.
A.4 Preparação do laboratório para testes PCR
Para produzir resultados de PCR fiáveis e sem contaminação, siga as boas práticas de laboratório
aquando da concepção da disposição do laboratório de PCR.
Aquando do planeamento da disposição do laboratório, tenha em consideração a necessidade de
separação espacial das actividades de preparação da amplificação por PCR e pós-amplificação.
É importante separar as actividades de (i) isolamento do ADN; (ii) amplificação por PCR; e (iii)
Pós-PCR como a abertura de tubos que contêm amostras amplificadas na preparação para a
execução de géis e configuração de outros testes, tais como a digestão com SURVEYOR
Nuclease e a sequenciação de ADN.
É igualmente importante ter materiais e equipamento de laboratório dedicados a cada área e para
utilização apenas nessa área. A limpeza das superfícies com uma solução de lixívia a 10% (v/v),
preparada semanalmente, auxiliará na eliminação de fragmentos de ADN ≤ 500 bp como modelos
para PCR. Além disso, poderá ser útil para tratar plásticos e soluções com uma exposição de 7–
10 minutos a luz UV de onda curta utilizando um crosslinker de UV.
Nota: as enzimas e ADN a amplificar não devem ser tratados com luz UV.
Instruções de Utilização do SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD para Sistemas de DHPLC
Página 23
Apêndice A
Usar vestuário de protecção adequado, mudar de luvas frequentemente e limpar as mãos com
luvas com uma solução de lixívia a 10% (v/v) antes de entrar numa estação de trabalho ajudará
em muito na redução da contaminação.
No mínimo, deverá existir uma configuração similar à disposição de duas salas apresentada no
diagrama abaixo especificamente concebida para PCR e análise utilizando a SURVEYOR
Nuclease.
Instruções de Utilização do SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD para Sistemas de DHPLC
Página 24
Apêndice A
A.5 Referências Bibliográficas
®
1. Amgen News Release (2013) New analyses identify predictive biomarkers for Vectibix
(panitumumab) in patients with metastatic colorectal cancer.
http://wwwext.amgen.com/media/media_pr_detail.jsp?-year=2013&releaseID=1820728
2. Peeters M et al (2013) Massively parallel tumor multigene sequencing to evaluate
response to panitumumab in a randomized phase III study of metastatic colorectal cancer.
Clin Cancer Res. 19 1902-12.
3. De Roock W et al (2010) Association of KRAS p.G13D mutation with outcome in patients
with chemotherapy-refractory metastatic colorectal cancer treated with cetuximab. JAMA
304 1812-20.
4. Peeters M et al (2013) Mutant KRAS codon 12 and 13 alleles in patients with metastatic
colorectal cancer: assessment as prognostic and predictive biomarkers of response to
panitumumab. J Clin Oncol. 31 759-65.
5. Andre T et al (2013) Panitumumab combined with irinotecan for patients with KRAS wildtype metastatic colorectal cancer refractory to standard chemotherapy: a GERCOR
efficacy, tolerance, and translational molecular study. Ann Oncol. 24 412-9.
6. Loupakis F et al (2009) KRAS codon 61, 146 and BRAF mutations predict resistance to
cetuximab plus irinotecan in KRAS codon 12 and 13 wild-type metastatic colorectal
cancer. Br J Cancer 101 715-21.
7. De Roock W et al (2010) Effects of KRAS, BRAF, NRAS, and PIK3CA mutations on the
efficacy of cetuximab plus chemotherapy in chemotherapy-refractory metastatic colorectal
cancer: a retrospective consortium analysis. Lancet Oncol. 11 753-62.
8. Qiu P et al (2004) Mutation detection using Surveyor™ nuclease. Biotechniques 36 702707
9. Kuang Y et al (2009) Noninvasive detection of EGFR T790M in gefitinib or erlotinib
resistant non-small cell lung cancer. Clin. Cancer Res. 15 2630-6
10. Mitani N et al (2007) Surveyor nuclease-based detection of p53 gene mutations in
haematological malignancy. Ann. Clin. Biochem. 44 557-9
11. Engelman JA et al (2006) Allelic dilution obscures detection of a biologically significant
resistance mutation in EGFR-amplified lung cancer. J. Clin. Invest. 116 2695-2706
Consulte também http://world.transgenomic.com/files/literature/482146.pdf para referências
acerca da SURVEYOR Nuclease e respectivas aplicações.
Instruções de Utilização do SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD para Sistemas de DHPLC
Página 25
Apêndice B
Apêndice B
Guia de Resolução de Problemas
A utilização eficaz dos Kits SURVEYOR Scan com o sistema DHPLC depende da conclusão bemsucedida de um conjunto de passos. Um dos mais críticos é a amplificação por PCR, que tem de
resultar na produção de ADNs específicos, uniformizados e em quantidade suficiente para serem
detectados após hibridação e clivagem. Isso por sua vez depende da qualidade da amostra inicial.
A realização do teste com DNA que não satisfaça os critérios de qualidade e quantidade não é
recomendada.
Nota: Se estiver a utilizar pela primeira vez a SURVEYOR Nuclease, realize as experiências
descritas na secção Utilizar ADNs Plasmídicos de Controlo depois de ler e compreender a
secção Instruções Passo-a-Passo. Por favor, tenha junto de si os resultados dos ADNs
Plasmídicos de Controlo antes de contactar o Apoio Técnico da Transgenomic.
Este Guia de resolução de problemas inclui uma lista dos problemas que pode encontrar ao
utilizar os Kits SURVEYOR Scan com o sistema DHPLC e sugestões sobre como resolvê-los.
Consulte o manual do sistema DHPLC para informações detalhadas acerca do funcionamento e
manutenção do instrumento. O manual inclui procedimentos específicos para verificar e manter o
desempenho da coluna e inclui detalhes de resolução de problemas.
Problema 1 – Baixo rendimento da PCR ou nenhum produto de PCR quando
analisado em gel de agarose
BAIXO
RENDIMENTO DA
PCR
Bom
rendim
ento
da
PCR
Baixo
rendim
ento
da
PCR
Banda
de
ARN
CAUSA POSSÍVEL
SOLUÇÃO
Fraca qualidade do
ADN modelo
Repita a purificação do ADN; reveja o método
de purificação utilizado. Se o ADN FFPE
extraído estiver demasiado fragmentado,
podem ser necessários blocos FFPE
alternativos.
Demasiado ARN na
amostra, o que levará
à sobrestimação da
concentração de ADN
Repita o tratamento com RNase da amostra
de ADN e re-purifique o ADN.
Termociclador não
calibrado.
Execute a calibração do termociclador.
Quantidade
insuficiente de modelo.
Aumente a quantidade de modelo.
Nota: Deve ser utilizado ADN de alta qualidade a partir de FFPE. O ADN deve ter uma
concentração de 25 ng/µL, tal como determinado pela absorção a 260 nm, deve ter um rácio de
absorção a 260/280 nm superior a 1,8 e ser superior a 90% de ADN (ou seja, livre da maior
parte da contaminação tARN e rARN, tal como julgado pelo aspecto num gel de agarose).
Armazene as amostras de ADN a uma temperatura entre -20 °C e -80 °C.
A análise de ADN modelo extraído a partir de tecidos embebidos em parafina requer que se tomem
diversas precauções. O ADN extraído pode ser tratado com uracil DNA glycosylase para prevenir
a amplificação de fragmentos de ADN que contenham determinados resíduos de C. Muitas vezes,
uma elevada percentagem de A260 que absorve material extraído a partir de tecidos embebidos
em parafina não é bem amplificada durante a PCR. A utilização de uma maior quantidade de ADN
de partida irá muitas vezes ajudar a produzir um produto de amplificação adequado. Outra
consideração seria escolher secções de tumor FFPE com uma elevada percentagem de células
tumorais. Poderá ser igualmente utilizada microdissecção, mas trata-se de uma opção que consome
muito tempo e não recomendada para testes laboratoriais no geral.
Instruções de Utilização do SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD para Sistemas de DHPLC
Página 26
Apêndice B
Problema 2 – Múltiplos produtos de PCR quando analisado em gel de
agarose
MÚLTIPLOS PRODUTOS DE
PCR
Bom
rendi- Múltiplas
mento bandas
da rendimento
PCR
CAUSA POSSÍVEL
SOLUÇÃO
Temperatura de hibridação
demasiado baixa.
Verifique a calibração do
termociclador.
Nota: A PCR deverá gerar um rendimento suficientemente elevado (superior a 20 ng/µL) de uma
ÚNICA espécie amplificada do tamanho correcto. A DNA Polymerase e o DNA Polymerase 10X
PCR Buffer fornecidos com este kit devem ser utilizados para a PCR. As amplificações dos
Controlos devem ser digeridas com a SURVEYOR Nuclease e analisadas em paralelo para
excluir ruído de fundo artificial através da comparação visual de perfis de electroferograma (ver
Exemplos de Resultados, Figura 4). Examine cada produto de ADN amplificado antes da
digestão através da electroforese em gel (ou através da Análise do DHPLC System) para se
certificar de que é uma única espécie do tamanho esperado.
Problema 3 – Nenhum produto de clivagem observado ao executar a análise
após o tratamento de heterodúplices com a SURVEYOR
Nuclease
NENHUM PRODUTO DE CLIVAGEM
Posição de
heterodúplices
em falta
CAUSA
POSSÍVEL
SOLUÇÃO
Proporção de
alvo de
mismatch
demasiado
baixa
Verifique o teste utilizando os
Controlos.
Formação
insuficiente
de heterodúplices
Siga o Procedimento correcto de
PCR e Hibridação. Use ADN
acabado de hibridizar nas
digestões da SURVEYOR
Nuclease.
Efectue uma nova amplificação
por PCR utilizando (1) a mesma
quantidade de ADN modelo; (2)
uma maior quantidade de ADN de
partida; ou (3) ADN isolado da
mesma ou de uma outra secção
FFPE.
Pico
não cortado
dos
homodúplice
s
SURVEYOR
Nuclease
Inactiva
Execute a reacção de Positive
Control para verificar o
desempenho da enzima. Use
apenas Misturas Principais da
SURVEYOR Nuclease que
tenham sido acabadas de
preparar.
Instruções de Utilização do SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD para Sistemas de DHPLC
Página 27
Apêndice B
Nota: A SURVEYOR Nuclease cliva sobretudo nas desigualdades em heterodúplices. A
proporção de heterodúplices face a homodúplices na amostra hibridizada irá determinar o
tamanho do sinal de digestão da SURVEYOR Nuclease. Se a mutação do KRAS estiver presente
com uma concentração muito baixa na amostra de ADN genómico, o sinal pode ser demasiado
baixo para gerar um resultado positivo.
É importante assegurar que o passo de hibridação está incluído no programa do termociclador
(ver Protocolo de Amplificação), de forma a maximizar a eficiência da formação de
heterodúplices. Os heterodúplices são formados de forma muito ineficiente durante as reacções
padrão de PCR.
Nota: o rácio de sinal/ruído é normalmente elevado o suficiente para detectar mutações presentes
a uma baixa percentagem do modelo de ADN total. É possível detectar um nível tão baixo como
2% de ADN mutante. A Figura 4 mostra os produtos de digestão gerados com ADNs KRAS
Positive Control de homodúplices e heterodúplices (incluídos neste kit) e amostras FFPE num
WAVE DHPLC 4500 System. Os produtos de clivagem são claramente visíveis como dois novos
picos que eluem com os tamanhos esperados que podem ser estimados em relação ao marcador
de tamanho de ADN.
Atenção: os tampões de PCR disponíveis no mercado variam muito em termos de conteúdo e
muitas vezes as formulações não são definidas pelos fornecedores. Há vários tampões que NÃO
são compatíveis com a SURVEYOR Nuclease devido ao pH ou à presença de aditivos, agentes
tensioactivos ou outros ingredientes patenteados. NÃO utilize qualquer polimerase ou tampões
de polimerase 10X que não os fornecidos no kit.
Problema 4 – Fundo elevado após o tratamento com a SURVEYOR Nuclease
FUNDO ELEVADO
Fluxo
através
do
DHPLC
Amostra
com
linha de
base
ruidosa
Lavagem
do
DHPLC
CAUSA POSSÍVEL
SOLUÇÃO
Passo de hibridação
subóptimo.
Faça o seguinte:
1. Certifique-se de que
a concentração de
ADN está no
intervalo >25 ng/µL.
2. Repita o passo de
formação de
heterodúplices, tendo
cuidado para seguir o
procedimento
recomendado; ver
12.7.1.
Quantidade de ADN
demasiado baixa
Verifique o rendimento e
qualidade do ADN
modelo
Produtos de PCR não
específicos
Verifique o rendimento e
qualidade do DNA
modelo.
O SURVEYOR
Enhancer W2 e/ou o
SURVEYOR Enhancer
Cofactor perderam
actividade
Verifique o Prazo de
Validade do kit.
Nota: A SURVEYOR Nuclease ocasionalmente corta ADN de cadeia dupla em sítios aleatórios
correspondidos. Isto produz um fundo após a digestão. Esta actividade é suprimida pelo
SURVEYOR Enhancer W2 e o seu Cofactor sem afectar negativamente a reacção de clivagem de
desigualdades. O SURVEYOR Enhancer W2 e o SURVEYOR Enhancer Cofactor estão incluídos
neste kit e devem sempre ser utilizados.
Instruções de Utilização do SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD para Sistemas de DHPLC
Página 28
Apêndice B
Quando este corte ainda ocorre, geram-se pequenos picos no sistema DHPLC. A comparação
das digestões dos controlos de homodúplices com as digestões da amostra permitirá que esses
picos sejam reconhecidos.
Problema 5 – Picos de digestão da SURVEYOR Nuclease em controlos
negativos
PICOS DE DIGESTÃO EM CONTROLOS
NEGATIVOS
Sinal fraco
Picos de digestão
no controlo WildType
Fluxo
através
do
DHPLC
Pico
não cortado dos
homodúplices
CAUSA POSSÍVEL
SOLUÇÃO
Contaminação dos
conteúdos do kit
com amplificações
do KRAS ou
controlos
plasmídicos.
Elimine todos os
componentes do
kit e utilize um kit
novo.
Contacte o Apoio
Técnico da
Transgenomic para
discutir potenciais
causas e fontes de
contaminação.
Lavagem
do
DHPLC
Problema 6 – Falha nos resultados da SURVEYOR Nuclease
A DIGESTÃO DA SURVEYOR NUCLEASE DE
CONTROLOS POSITIVOS FALHOU
Nenhum
pico de
digestão
nítido
Pico
não cortado dos
homodúplices
CAUSA
POSSÍVEL
SOLUÇÃO
A SURVEYOR
Nuclease não foi
adicionada
Efectue a digestão
de uma nova
amostra
A digestão da
SURVEYOR
Nuclease foi
realizada à
temperatura
errada
Efectue a digestão
de uma nova
amostra
Instruções de Utilização do SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD para Sistemas de DHPLC
Página 29
Apêndice B
Problema 7 – Picos inesperados no rastreio de digestão da SURVEYOR
Nuclease
A DIGESTÃO DA SURVEYOR NUCLEASE DE
CONTROLOS POSITIVOS FALHOU
CAUSA
POSSÍVEL
Pico
não cortado dos
homodúplices
Mutação
presente num
sítio pouco
frequente
SOLUÇÃO
Efectuar a
sequência da
amostra para
verificar a
mutação
Pico de
digestão
inesperado
Fluxo
através
do
DHPLC
Picos de
digestão
esperados
Lavagem
do
DHPLC
Instruções de Utilização do SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD para Sistemas de DHPLC
Página 30
Apêndice B
Problema 8 – Contaminação de amostras com Positive Controls
Padrões de digestão consistentes com a presença de
uma região com Positive Controls misturados e
heterodúplices Wild-Type
CAUSA
POSSÍVEL
Técnica de
pipetagem
de fraca
qualidade
Amostra 1
Amostra 2
Amostra 3
SOLUÇÃO
Deverá ter cuidado
ao pipetar amostras
para evitar a
contaminação
cruzada.
Verifique as regiões
de sequências de
selo de controlo para
contaminação de
Positive Control.
Região de Codões 12
e 13
Região do selo de
controlo
Amostra 1
NVD nos
Codões
12 e 13
Selo
detectado
Amostra 2
c.34G>T
p.G12C, 30%
Nenhum selo
detectado
Amostra 3
NVD nos
Codões
12 e 13
Nenhum selo
detectado
Instruções de Utilização do SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD para Sistemas de DHPLC
Página 31
Detalhes para Encomendas
Detalhes para Encomendas
Número
de
produto
Nome do Produto
Dimensão
710104
SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD
100 reacções
710106
SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 3 & 4 CE IVD
100 reacções
710400
SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 CE IVD
100 reacções
710077
CRC RAScan Combination Kit para KRAS e NRAS Exons 2, 3
& 4 CE IVD
230 reacções
Detalhes de Contacto
Sede da Empresa
Transgenomic, Inc.
12325 Emmet Street
Omaha
Nebraska 68164
United States of America
Europa
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Telefone: +44 141 892 8800
Fax:
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E-mail:
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*Apenas na América do Norte
www.Transgenomic.com
Tradução Disclaimer
Transgenomic, Inc. tem feito todos os esforços para garantir a precisão desta tradução. Se você tem dúvidas sobre
qualquer informação nesta versão traduzida do manual, consulte a versão em Inglês Instructions for Use for the
SURVEYOR® Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD for DHPLC Systems – 482404(EN)
http://world.Transgenomic.com/files/literature/482404-EN.pdf e / ou Transgenomic em contato
support @transgenomic.com.
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Licenças, Marcas Comerciais e Direitos de Autor
Licenças, Marcas Comerciais e Direitos de Autor
SURVEYOR Nuclease: Este produto é fabricado ao abrigo de uma licença exclusiva sob as Patentes US 6,699,980,
6,391,557, 5,869,245, as suas homólogas estrangeiras e outras patentes pendentes. A utilização do SURVEYOR
Nuclease requer uma licença da Transgenomic. As organizações académicas e organizações com e sem fins lucrativos
têm direitos limitados de utilização do SURVEYOR Nuclease para fins de investigação através da compra deste produto. A
revenda ou outras utilizações estão estritamente proibidas. Para mais informações, contacte a Transgenomic.
DNA Polymerase: A utilização deste produto está abrangida por uma ou mais das seguintes Patentes US e pelas
respectivas reivindicações de patentes fora dos EUA: 5,789,224, 5,618,711, 6,127,155 e reivindicações fora dos EUA
correspondentes à Patente US N.º 4,889,818. A aquisição deste produto inclui uma imunidade limitada e não transferível
face a processos judiciais ao abrigo das reivindicações de patentes acima referidas para utilizar apenas esta quantidade
de produto para a investigação interna do comprador. Não é expressamente transmitido, seja por implicação ou por
preclusão, nenhum direito ao abrigo de qualquer outra reivindicação de patentes (tais como as reivindicações do Processo
de Nuclease 5' patenteado nas Patentes US N.os 5,210,015 e 5,487,972), nenhum direito para executar qualquer método
patenteado e nenhum direito para prestar serviços comerciais de qualquer tipo, incluindo sem limitação a comunicação
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