UNIVERSIDADE TECNOLÓGICA FEDERAL DO PARANÁ
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA ELÉTRICA E
INFORMÁTICA INDUSTRIAL – CPGEI
LUCIANA MARTINS PEREIRA DE ARAÚJO
Análise de Detecção de Fluorescência para Aplicação em
Sistemas de Diagnóstico em Saúde
DISSERTAÇÃO
CURITIBA
2010
LUCIANA MARTINS PEREIRA DE ARAÚJO
Análise de Detecção de Fluorescência para Aplicação em
Sistemas de Diagnóstico em Saúde
.
Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação em Engenharia Elétrica e Informática
Industrial da Universidade Tecnológica Federal do
Paraná, como requisito parcial para a obtenção
do grau de Mestre em Ciências – Área de
Concentração: Engenharia Biomédica.
Orientador: Prof. Dr. Fábio Kurt Schneider
Coorientador: Prof. Dr. Gilberto Branco
CURITIBA
2010
Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca da UTFPR – Campus Curitiba
A663
Araújo, Luciana Martins Pereira de
Análise de detecção de fluorescência para aplicação em sistemas de
diagnóstico em saúde / Luciana Martins Pereira de Araújo. — 2010.
93 f. : il. ; 30 cm
Orientador: Fábio Kurt Schneider
Co-orientador: Gilberto Branco
Dissertação (Mestrado) – Universidade Tecnológica Federal do Paraná.
Programa de Pós-graduação em Engenharia Elétrica e Informática Industrial.
Área de concentração: Engenharia biomédica, Curitiba, 2010.
Bibliografia: f. 82-9
1. Espectroscopia fluorescente. 2. Európio. 3. Agentes luminescentes – Uso
em diagnóstico. 4. Corantes fluorescentes – Uso em diagnóstico. 5.
Engenharia elétrica – Dissertações. I. Schneider, Fábio Kurt, orient. II.
Branco, Gilberto, co-orient. III. Universidade Tecnológica Federal do Paraná.
Programa de Pósgraduação em Engenharia Elétrica e Informática Industrial.
III. Título.
CDD (22. ed.) 621.3
Dedico esta dissertação a Deus, pois sem Ele, nada seria
possível.
À minha família pelo incentivo e confiança.
Ao meu esposo e minha filha, pelo apoio incondicional,
compreensão e motivação.
Enfim, a todos que de alguma forma tornaram este caminho
mais fácil de ser percorrido.
AGRADECIMENTOS
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES,
pelo suporte e apoio financeiro a esse projeto.
Ao Professor Dr. Fábio Kurt Schneider, pela orientação e confiança.
Ao Professor Dr. Arandi Ginane Bezerra Junior e o Dr. Gilberto Branco, pela coorientação, apoio, dedicação e partilha.
Aos colegas do CPGEI pelo companheirismo, convívio, estímulo e partilha, em
especial, Claúdio Marquetto, Joyce Klock, Terezinha Strapasson, Leonardo
Zanin, Neusa Grando e Joaquim de Mira.
Aos alunos de Iniciação Científica, Vinícius Oliveira e Eduardo Almeida dos
Santos, pelo apoio e aprendizado partilhado.
Ao colega Wellington Celestino dos Santos, pelo apoio e pela partilha de
aprendizado.
Aos professores, pelo conhecimento compartilhado.
Ao meu esposo Walter Duarte e minha filha Lívia Helena que colaboraram em
todos os momentos, pela paciência, incentivo e amor.
Agradeço a Deus que me deu força e sempre esteve presente em minha vida.
Aos meus pais Evandro Reis Pereira (in memorian) e Maria da Piedade Martins
que sempre me deram força para continuar perseverando rumo ao objetivo a
ser alcançado.
RESUMO
ARAÚJO, Luciana M. P. Análise de detecção de Fluorescência para Aplicação
em Sistemas de Diagnóstico em Saúde 2010. Dissertação (Programa de PósGraduação em Engenharia Elétrica e Informática Industrial da Universidade
Tecnológica Federal do Paraná). Curitiba, 2010.
A técnica de espectroscopia de emissão de fluorescência tem sido
utilizada para caracterizar moléculas e compostos moleculares, pois propicia
que fluoróforos sejam usados como elementos de marcação de antígenos e/ou
anticorpos, que servirão para a identificação de doenças. Assim, o objetivo
desta dissertação é analisar a emissão de fluorescência a partir de um novo
composto molecular, desenvolvido pelo Laboratório de Polímeros Paulo Scarpa
(LaPPS/UFPR) em função do elemento químico európio, denominado
complexo LaPPS34M, por meio de um sistema de detecção em estado sólido
resolvido no tempo. As características ópticas como: o espectro de absorção, o
espectro de fluorescência, o deslocamento de Stokes e os tempos de vida de
luminescência resultaram nos parâmetros importantes do complexo para
potenciais aplicações em sistemas biomédicos através do projeto INDISAÚDE/PR.
Palavras-Chave: Fluorescência, Fluoróforo, Espectroscopia, Diagnóstico,
Saúde Pública.
ABSTRACT
ARAÚJO, Luciana M. P. Fluorescence detection analysis for Application in
Diagnostic Systems in Health. 2010. Graduate Program in Electrical
Engineering and Computer Science Industrial of the Federal Technological
University of Parana). Curitiba. 2010.
The technique of fluorescence emission spectroscopy has been used to
characterize molecules and molecular compounds. Fluorophores can be used
as markup elements of antigens and / or antibodies for identification of disease.
Thus, the objective of this dissertation is to analysis the fluorescence emission
from a new molecular compound, developed by the Laboratory of Polymers
Paulo Scarpa (Lapps / UFPR) according to the chemical element europium,
called complex LaPPS34M, through a solid state detection system resolved
in time. The optical characteristics as: absorption spectrum, fluorescence
spectrum, the Stokes shift and the lifetime of luminescence have resulted in
importants parameters of the complex for potential applications in biomedical
systems by designing INDI-SAÚDE/PR.
Keywords: Fluorescence, Fluorophore, Spectroscopy, Diagnosis, Public
Health.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Esquema representativo da marcação do complexo antígenoanticorpo por fluoróforo. ................................................................................... 25
Figura 2 - Apresentação do diagrama de Jablonski. ........................................ 26
Figura 3 - Ilustração do deslocamento de Stokes entre o pico de absorção
máxima e o pico de emissão máxima. ............................................................. 32
Figura 4 - Ilustração da estrutura molecular do fluoróforo comercial Cy3. O N+ é
o símbolo do íon nitrogênio e o I- é o símbolo do íon iodo. .............................. 38
Figura 5 - Estrutura molecular do complexo LaPPS34M, com os elementos N
(nitrogênio) e O ( oxigênio), as cadeias aromáticas (representada pelos
hexágonos)....................................................................................................... 39
Figura 6 - Dimensões, formas e tamanhos das nanopartículas metálicas. ...... 42
Figura 7 - Esquema do processo de FRET entre dois fluoróforos, a fluoresceína
doadora) e a rodamina (receptora), onde r é a distância de mínima de FRET. 44
Figura 8 - Descrição do processo de FRET pelo de diagrama de Jablonski. ... 45
Figura 9 - Desenho esquemático do espectrofotômetro de duplo feixe ........... 49
Figura 10 - Espectro de absorção do fluoroforo Cy3 obtido pelo
espectrofotômetro. ........................................................................................... 51
Figura 11 - Espectro de absorção do complexo LaPPS34M obtido pelo
espectrofotômetro ............................................................................................ 51
Figura 12 - Representação esquemática do sistema de detecção proposto .... 52
Figura 13 - Desenho esquemático do sistema experimental por válvula
fotomultiplicadora R928 (de alta sensibilidade) ................................................ 53
Figura 14 - Desenho esquemático do sistema com o uso da válvula
fotomultiplicadora miniatura (R5600U-01). ....................................................... 54
Figura 15 - Desenho esquemático do sistema experimental por fotodiodo ...... 55
Figura 16 - (a) Dispositivo OPT 301 apresenta um fotodiodo integrado com
amplificador conversor corrente-tensão, (b) resposta espectral do OPT 301, (i)
emissão de luminescência do indicador (LAPPS34M ~ 615 nm) (ii) excitação do
indicador (LAPPS34M ~ 350 nm). .................................................................... 56
Figura 17 – Espectro de emissão da lâmpada xenon ...................................... 58
Figura 18 - Espectro de emissão de led azul, com comprimento de onda do
pico é 440 nm. .................................................................................................. 59
Figura 19 - Espectro de emissão de led ultravioleta, com comprimento de onda
do pico é 400 nm. ............................................................................................. 59
Figura 20 - Espectro de transmitância do filtro de interferência na região do
vermelho........................................................................................................... 61
Figura 21 - Diagrama representativo da transmitância de luz pela amostra na
cubeta .............................................................................................................. 63
Figura 22 - llustração do espectro de transmitância da cubeta de quartzo ...... 63
Figura 23 - Representação do processo de geração e multiplicação de elétrons
em uma válvula fotomultiplicadora ................................................................... 64
Figura 24 - Circuito de Implementação do Amplificador de Transimpedância . 65
Figura 25 - Espectro de fluorescência do fluoróforo Cy3 obtido pela FASE I
(válvula fotomultiplicadora R928) ..................................................................... 68
Figura 26 - Espectro de absorção e emissão de fluoróforo Cy3 demonstrando o
deslocamento de Stokes obtido pela FASE I. .................................................. 68
Figura 27 - Espectro de fluorescência do complexo LaPPS34M obtido pela
FASE I. ............................................................................................................. 69
Figura 28 - Espectro de absorção e emissão de LaPPS34M demonstrando o
deslocamento de Stokes obtido pela FASE I ................................................... 70
Figura 29 - a)Espectro de Fluorescência do fluoróforo Cy3 e b) o espectro de
fluorescência do Fluoróforo Cy3 conjugado com Nanopartícula de Ouro obtido
pela FASE I. ..................................................................................................... 71
Figura 30 - Espectro de fluorescência (em preto) do complexo LaPPS34M e o
espectro de fluorescência do LaPPS34M ( em verde) conjugado com
nanopartículas de prata obtido pela FASE I. .................................................... 72
Figura 31 - Decaimento de Fluorescência do Complexo LaPPS34M com o uso
da válvula fotomultiplicadora R928 obtido pela FASE I .................................... 74
Figura 32 - Decaimento exponencial de emissão de luminescência do indicador
LaPPS34M pela válvula fotomultiplicadora miniatura R5600U-01 obtido pela
FASE II. ............................................................................................................ 75
Figura 33 - Sinal elétrico aplicado ao led para excitação do indicador (linha
contínua), sinal de saída do detector na ausência do fluoróforo (linha tracejada)
e sinal de luminescência na presença do fluoróforo (linha contínua) obtido pela
FASE III. ........................................................................................................... 76
Figura 34 - Exponencial de decaimento de emissão de luminescência do
indicador LaPPS34M pelo uso detectores de fotodiodo obtido pela FASE III .. 77
Figura 35 - A) Tamanho das nanopartículas de ouro por DLS, B) Espectro de
absorção das nanopartículas de ouro e C) Espectro de absorção linear para o
colóide de prata ................................................................................................ 95
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Características dos Fluoróforos Comerciais em relação aos
comprimentos de onda de absorção e de emissão de fluorescência ............... 31
Tabela 2 - Características ópticas relevantes para um fluoróforo da família Cycorante ............................................................................................................. 39
Tabela 3 - Relação entre as fases da pesquisa e os resultados do tempo de
vida de Luminescência ..................................................................................... 77
LISTA DE FOTOGRAFIAS
Fotografia 1 - Espectrofotômetro de Duplo Feixe UV-Vis. ................................ 50
Fotografia 2 - Montagem do uso das lentes convergentes no experimento de
fluorescência. ................................................................................................... 60
Fotografia 3 - Monocromador do tipo Czerny-Turner. ...................................... 62
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
INDI-SAÚDE
Instituto Nacional de Inovação em Saúde Pública
NAT
Teste de Ácido Nucléico
DNA
Ácido Desoxirribonucléico
HIV
Human Immunodeficiency Virus
Ē
Intensidade do Campo Elétrico [V/m]
H
Intensidade do Campo Magnético [A/m]
RNA
Ácido Ribonucléico
ELISA
Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay
Cy3
Fluoróforo Comercial Cianina (Cyanine)
Cy4
Fluoróforo Comercial Cianina (Cyanine)
Cy7
Fluoróforo Comercial Cianina (Cyanine)
LaPPS34M
Complexo de Európio/ Bipiridina/ Dibenzoílmetano
PH
Pontecial Hidrogeniônico
NADH
Quinona Oxidorredutase
FAD
Dinucleotídeo Flavina Adenina
NP
Nanopartículas
DLS
Espalhamento Dinâmico da Luz
FRET
Transferência
de
Energia
de
Ressonância
Fluorescência
Ln
Familia dos elementos quimicos dos Lantanídeos
Lu
Elemento Químico Lutécio
Y
Elemento Químico Ítrio
Sc
Elemento Químico Escândio
Na
Elemento Químico Sódio
K
Elemento Químico Potássio
Sb
Elemento Químico Antimônio
Cs
Elemento Químico Césio
de
Eu
Elemento Químico Európio
Eu3+
Representação do Elemento Európio
Tb3+
Representação do Elemento Térbio
C
Elemento Químico Carbono
H
Elemento Químico Hidrogênio
O
Elemento Químico Oxigênio
Au
Elemento Químico Ouro
Ag
Elemento Químico Prata
Ni
Elemento Químico Níquel
Cu
Elemento Químico Cobre
La
Família dos lantanídeos
N
Elemento Químico Nitrogênio
Z
Número Atômico dos Elementos Químicos
RMN
Ressonância Magnética Nuclear
led
Light Emitting Diode
π
Orbital pi Ligante e Antiligante
π*
Orbital pi Antiligante
λ
Comprimento de Onda
S
Estado Singleto
S
S
S
1
2
0
Primeiro Estado Singleto Excitado
Segundo Estado Singleto Excitado
Estado Singleto Fundamental
THF
Tetrahidrofurano
UV-Vis
Espectroscopia na Região do Ultravioleta-Visível
OEM
Onda Eletromagnética
PCR
Polimerase Chain Reaction
PMT
Photo Multiplier Tube
USB
Universal Serial Bus
Gap
Fosfeto de Gálio
DC-DC
Conversor de Corrente Contínua
UFPR
Universidade Federal do Paraná
PR
Estado do Paraná
CI
Conversões Internas
CSI
Cruzamento Interno
LASER
Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation
UTFPR
Universidade Tecnológica Federal do Paraná
DMSO
Dimetilsulfóxido
RMSE
Quadrado Médio do Erro
LaPPS
Laboratório de Polímeros Paulo Scarpa
DO
Densidade Óptica
FITC
Isotiocianato de Fluoresceína
RITC
Rodamina
AT
Amplificador de Transimpêdancia
a.u
Arbitraries Unites (Unidades Arbitrárias)
A
ZX
Representação do elemento químico (Z é o número
atômico e A o número de massa)
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ........................................................................................... 19
1.1. MOTIVAÇÃO ............................................................................................. 19
1.2. JUSTIFICATIVA ......................................................................................... 20
1.3. OBJETIVOS ............................................................................................... 21
1.3.1.
Objetivo Geral ...................................................................................... 21
1.3.2.
Objetivos Específicos .......................................................................... 21
1.4. ESTRUTURA DA DISSERTAÇÃO ............................................................ 23
2. FLUORESCÊNCIA E FLUORÓFORO ....................................................... 24
2.1. INTRODUÇÃO ........................................................................................... 24
2.2. COMPLEXO ANTÍGENO- ANTICORPO.................................................... 24
2.3. O FENÔMENO DE FLUORESCÊNCIA ..................................................... 25
2.4. FLUORÓFOROS ....................................................................................... 29
2.4.1.
Características Ópticas dos Fluoróforos .............................................. 29
2.4.2. Propriedades dos Fluoróforos Comerciais e dos Complexos
Biomarcadores ................................................................................................. 34
2.4.2.1. Fluoróforo Comercial Cy3 .................................................................... 37
2.4.2.2. Complexo LaPPS34M ......................................................................... 39
2.5. NANOPARTÍCULA .................................................................................... 41
2.5.1.
Fluoróforo na Presença de Nanopartículas ......................................... 43
2.6. RESUMO ................................................................................................... 46
3. SISTEMAS DE AQUISIÇÃO DE LUMINESCÊNCIA.................................. 47
3.1. INTRODUÇÃO ........................................................................................... 47
3.2. DETERMINAÇÃO DO ESPECTRO DE ABSORÇÃO DO CY3 E DO
COMPLEXO LaPPS34M .................................................................................. 47
3.2.1.
Espectrofotômetro de Duplo Feixe ...................................................... 48
3.2.1.1. Espectro de Absorção ......................................................................... 50
3.3. SISTEMA DE AQUISIÇÃO DE SINAL DE FLUORESCÊNCIA .................. 52
3.4. SISTEMA DE DETECÇÃO DE FLUORESCÊNCIA ................................... 57
3.4.1.
Fonte Óptica ........................................................................................ 57
3.4.2.
Lentes Convergentes e Filtros ............................................................. 59
3.4.3.
Monocromador .................................................................................... 61
3.4.4.
Cubeta ................................................................................................. 62
3.4.5.
Válvulas Fotomultiplicadoras ( PMTs) ................................................. 63
3.4.6.
Amplificador de Transimpedância........................................................ 65
3.4.7.
Aquisição do Processamento do Sinal ................................................ 66
3.5. RESUMO ................................................................................................... 66
4. RESULTADOS .......................................................................................... 67
4.1. INTRODUÇÃO ........................................................................................... 67
4.2. ESPECTROS DE FLUORESCÊNCIA........................................................ 67
4.3. ESPECTROS DE FLUORESCÊNCIA COM NANOPARTÍCULAS
METÁLICAS ..................................................................................................... 71
4.4. TEMPOS DE VIDA DE LUMINESCÊNCIA DO FLUORÓFORO E DO
COMPLEXO LaPPS34M .................................................................................. 73
5. DISCUSSÃO E CONCLUSÃO................................................................... 78
5.1. INTRODUÇÃO ........................................................................................... 78
5.2. CARACTERIZAÇÃO DE BIOMARCADORES ........................................... 78
5.3. SISTEMAS DE CUSTO REDUZIDO .......................................................... 80
5.4. LIMITAÇÕES DO ESTUDO ....................................................................... 81
5.5. TRABALHOS FUTUROS ........................................................................... 81
5.6. PUBLICAÇÕES ......................................................................................... 83
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................... 84
7. ANEXOS .................................................................................................... 92
19
1.
INTRODUÇÃO
1.1.
MOTIVAÇÃO
Muitas doenças infecciosas, comuns em diversas regioes de países em
desenvolvimento, são tratáveis por meio de medicações apropriadas. Isto tem
prevenido e diminuído, significativamente, a mortalidade e a morbidade das
populações infectadas residentes nestas áreas de risco (MABEY, 2004). Os
métodos de diagnósticos mais rápidos certamente auxiliarão para que as
doenças infecciosas, que apresenta significantes consequências para a saúde
pública, sejam eficientemente controladas se identificadas precocemente
(NICHOL, 2000).
As técnicas tradicionais de diagnóstico laboratorial incluem os métodos
diretos: como a identificação direta do microrganismo por meio da microscopia
óptica, e métodos indiretos: como a inoculação de amostras potencialmente
infectadas em animais e meios de cultura. Além destes, nos últimos vinte anos,
também houve o desenvolvimento de métodos rápidos de diagnóstico, que
proporcionaram um avanço importante, pois os resultados podem ser obtidos
em poucas horas ou até mesmo em minutos (PERUSK, 2003).
Atualmente, várias doenças infecciosas e parasitárias são pesquisadas
pelos métodos imunológicos. Graças à sua simplicidade, o método ELISA
(Enzyme LinkedImmuno Sorbent Assay) permite reconhecer e quantificar
antígenos através de uma reação enzimática (ENGVALL, 1971). Este método
é usado para analisar grande número de indivíduos com um volume pequeno
de amostra (PERUSK, 2003). Os testes moleculares como o PCR (Polimerase
Chain Reaction) em tempo real e os microarranjos líquidos possibilitaram a
marcação do complexo antígeno-anticorpo por sondas fluorescentes com
diferentes espectros de emissão (YANG, 2004).
Ao aplicar os fluoróforos nos estudos diagnósticos, recorre-se a uma
área que está em franca expansão. Novas tecnologias estão sendo
empregadas à procura de diagnósticos mais rápidos e precisos. Neste sentido,
a utilização conjunta da fluorescência através dos fluoróforos levou a criação
20
de outra área de pesquisa, chamada de imunofluorescência, que é a ligação do
antígeno e anticorpo através da marcação do anticorpo marcado com uma
molécula fluorescente (VALEUR, 2002),(LAKOWICZ,1999).
1.2. JUSTIFICATIVA
O esforço do sistema nacional de saúde em ampliar o setor de
diagnósticos e conjuntamente integrar a produção acadêmica com o setor
produtivo possibilitou a criação do Instituto Nacional de Inovação em Saúde
Pública (INDI-SAÚDE), que se situa no Instituto Carlos Chagas – Curitiba/PR
(2008). Assim sendo, o objetivo do INDI-SAÚDE, consiste na implantação de
novas tecnologias para a produção de sistemas de diagnóstico centrados em
doenças causadas por microrganismos importantes para a saúde pública no
Brasil. Uma das metas do Instituto é a nacionalização de insumos e sistemas
de diagnóstico relevantes para a saúde pública, envolvendo métodos rápidos
para utilização no local de tratamento (point of care) (INDI, 2008).
Adicionalmente, pretende-se obter procedimentos de multitestes para o
diagnóstico e controle do sangue, ou seja, aqueles capazes de detectar mais
de uma doença simultaneamente.
Os sistemas de diagnósticos desenvolvidos pela Instituto terão seu
alicerce no diagnóstico molecular, como os microarranjos líquidos, por ser o
método
moderno
para
detecção
e
quantificação
de
doenças
por
microrganismos, como por exemplo doença de chagas e dengue (INDI, 2008).
Um dos estudos do Instituto Nacional de Inovação em Saúde Pública é
a marcação do complexo antígeno-anticorpo através de fluoróforos para
detectar doenças por meio de fluorescência. Essa dissertação representa um
dos projetos a serem desenvolvidos pelo INDI-SAÚDE através do complexo
LaPPS34M, desenvolvido pelo laboratório de polímeros Paulo Scarpa da UFPR
será realizado um estudo de comparação com um fluoróforo comercial Cy3,
amplamente utilizado na tecnologia de microarranjos. Algumas características
ópticas tais como deslocamento de Stokes e o tempo de vida de luminescência
21
são avaliados para o estudo do potencial de aplicação do complexo LaPPS34M
como fluoróforo.
1.3. OBJETIVOS
1.3.1.
Objetivo Geral
O objetivo principal deste trabalho é analisar a detecção de
fluorescência para aplicação em sistemas de diagnósticos com ênfase em um
novo composto molecular - desenvolvido em função do elemento químico
európio (Eu - grupo dos lantanídeos) - denominado complexo LaPPS34M por
meio de um sistema de excitação e detecção em estado sólido resolvido no
tempo.
1.3.2.
Objetivos Específicos
Os objetivos específicos são:
1. Determinar os espectros de absorção do fluoróforo Cy3 e do complexo
LaPPS34M e a relação entre os picos máximos de absorção para as
amostras.
2. Determinar a relação entre os espectros de fluorescência do fluoróforo
Cy3 e do complexo LaPPS34M e os picos máximos de emissão das
amostras
3. Avaliar a relação entre a fluorescência de Cy3 e de LaPPS34M na
presença de nanopartículas e suas implicações na intensidade de
fluorescência.
4. Analisar a detecção de fluorescência com o uso de fotodetectores
(válvula fotomultiplicadora R928, válvula fotomultiplicadora miniatura
22
R5600U-01 e de detector optoeletrônico OPT301) e utilizando uma
instrumentação de baixo custo.
5. Determinar o tempo de vida de luminescência do complexo LaPPS34M.
23
1.4. ESTRUTURA DA DISSERTAÇÃO
O trabalho está dividido em 5 capítulos, onde neste capítulo 1 são
expressas as motivações, as justificativas e os objetivos gerais e específicos
desta dissertação. O capítulo 2, apresenta uma revisão sobre a luminescência,
com ênfase para a fluorescência e suas propriedades físicas. Descreve-se
ainda alguns fluoróforos e os fatores que afetam o desempenho dos
fluoróforos.
O capítulo 3 apresenta o uso do sistema para a identificação de
emissão fluorescente; com fonte óptica composta de diodos emissores de luz
violeta, chaveados (e controlados) para excitar substâncias fluorescentes em
solução aquosas; e detecção com sensor optoeletrônico.
O capítulo 4 apresenta os resultados usando a instrumentação
implementada quanto à detecção da fluorescência para atingir os objetivos
específicos previamente listados.
Finalmente, o capítulo 5 apresenta uma discussão e as principais
conclusões do trabalho.
24
2.
FLUORESCÊNCIA E FLUORÓFORO
2.1.
INTRODUÇÃO
O capítulo versará sobre a espectroscopia de fluorescência, os
fluoróforos e as propriedades ópticas dos fluoróforos comerciais e do complexo
LaPPS34M.
2.2. COMPLEXO ANTÍGENO- ANTICORPO
Na descricao de imunologia, a interação do antígeno com o anticorpo é
fundamental. Essa relação é denominada de complexo antígeno-anticorpo ou
complexo imune (ALBERTS et al ,1995). A maior parte dos métodos de
diagnósticos baseia-se na detecção do complexo antígeno-anticorpo, ou seja,
quando um antígeno, que é definido como uma substância estranha que induz
uma resposta imune, causa uma produção de anticorpos e/ou linfócitos
sensibilizados que reagem especificamente com a substância ingressa num
organismo (VOET, 1995).
O sistema imunológico do corpo inicia a produção de anticorpos, que
são proteínas que reconhecem um antígeno de forma específica e com alta
afinidade e são produzidos pelos linfócitos B, que se originam na medula óssea.
Os anticorpos são então distribuídos pelo organismo inteiro através do sistema
linfático para neutralizar a ação do antígeno (VOET, 1995). Para que haja
detecção do complexo antígeno-anticorpo é necessário que este esteja
conjugado com um indicador, conforme apresentado na Figura 1.
Os fluoróforos são compostos que emitem luz em certo comprimento
de onda quando excitados por uma radiação luminosa de outro comprimento
de onda, e podem atuar como biomarcadores, quando conjugados com o
complexo antígeno-anticorpo ou estruturas internas de células.
25
A marcação descrita na Figura 1 descreve a ligação entre um anticorpo
específico, geralmente de uma espécie diferente da célula, e outro anticorpo,
que seja “anti” o anticorpo utilizado anteriormente, sendo este novo anticorpo
de uma terceira espécie e tendo sido também previamente marcado por algum
fluoróforo, desta maneira, formam-se complexos antígeno-anticorpo marcados,
de forma que esta estrutura é bem mais eficiente na detecção de doenças por
fluorescência e seu uso em diagnósticos.
Figura 1 - Esquema representativo da marcação do complexo antígeno-anticorpo por
fluoróforo.
Fonte: Modificado de FERREIRA, 2001
2.3. O FENÔMENO DE FLUORESCÊNCIA
Quando os fótons são absorvidos por uma molécula, a mesma é levada
a um estado excitado. Após um determinado tempo, há o retorno da molécula
ao estado fundamental (ou estado não excitado) com a possível emissão de
parte da energia absorvida na forma de energia radiante (WILLARD, 1988).
Uma forma mais clara de visualização dos estados de excitação das
moléculas é apresentada pelo diagrama de Jablonski (Erro! Fonte de referência não
26
encontrada.), que relaciona as transições que ocorrem entre os níveis básicos de
energia e os níveis excitados, bem como as reemissões de energia radiante
(ATVARS, 2002).
Inicialmente, a partir da absorção de radiação, a molécula é promovida
para um estado excitado singleto Sn (Erro! Fonte de referência não encontrada.).
Posteriormente, a molécula se desativa por relaxamento, através dos níveis
vibracionais de estados eletrônicos, até atingir o primeiro nível vibracional do
estado excitado singleto de menor energia S1. Este processo de relaxamento
recebe o nome de conversão interna (EISBERG, 1988).
Figura 2 - Apresentação do diagrama de Jablonski.
Fonte: Própria
A partir do estado singleto S1, existem alguns caminhos possíveis para
a molécula retornar ao estado fundamental:
(a) se não há diferença de energia entre o estado excitado e estado
fundamental existi a possibilidade de sobreposição de níveis vibracionais, a
molécula pode ser levada ao mais baixo nível vibracional do estado excitado
por relaxamento vibracional sem emissão de radiação eletromagnética, ou seja,
ocorre um cruzamento interno.
(b) se, no entanto, a diferença energética entre o estado excitado e
estado fundamental for relativamente grande, a desativação para o estado
fundamental se dá com emissão de radiação na forma de fluorescência
27
(VALEUR, 2002). Isto quer dizer que o spin1 do estado excitado mantém sua
orientação original e há uma maior probabilidade de acontecer essa
configuração. Corresponde a um fenômeno rápido, na ordem de 10-9 a 10-7
segundos (EISBERG, 1988).
(c) se ocorrer um cruzamento entre sistemas, que é a transferência de
elétrons entre estados de diferentes multiplicidades de spins. Outro fenômeno
de desativação se faz presente é a fosforescência. Esta representa emissão de
fótons após as transições do estado singleto para o estado tripleto, isto é, neste
tipo de fenômeno o spin se mantém de forma contrária da sua posição inicial e
o tempo de duração é maior, na ordem de 10-3 s a 10 s (AMANDO,2004).
O uso da fluorescência é um dos métodos para aplicação em sistemas
de diagnósticos, utilizados pelo Instituto Nacional de Inovação para
Diagnósticos em Saúde Pública do Paraná (INDI-SAÚDE/PR), que busca
sondas fluorescentes de baixo custo que possam ser utilizadas em kits
diagnósticos para a detecção de doenças por microorganismos demandas do
sistema de saúde pública nacional.
O complexo LaPPS34M faz parte das sondas fluorescentes compostas
de Európio (Eu3 +) ou Térbio (Tb3 +) que estão sendo estudados para
aplicação em sistemas biomédicos (ALBANI, 2007). Os tempos de vida dos
fluoróforos destes elementos estão na escala de tempo de milisegundos e
surgem de transições entre os orbitais f dos átomos. Possuem características
ópticas relevantes na marcação de doenças, pois têm grande fotoestabilidade.
a) Fatores que afetam a fluorescência
Há uma grande variedade de fluoróforos e, consequentemente, uma
gama de espectros de absorção e emissão, além de uma diferenciação dos
1
O spin corresponde a um grau de liberdade interno do elétron,e, embora seja descrito como
de forma aproximada com o movimento do elétron em torno do seu próprio eixo, é uma
propriedade intrínseca da partícula (CARUSO, 2006).
28
tempos de vida de luminescência para cada biomarcador. A detecção de
fluorescência pode então sofrer modificações na sua intensidade com as
mudanças de temperatura, pH, a possibilidade de interação com solvente,
viscosidade, polarização, pressão e suas interações com os solutos
(VALEUR,2002),(LAKOWICZ,1999).
O aumento da temperatura tem como consequência um aumento na
eficiência dos processos de conversões internas (CI) na desativação do estado
excitado (Figura 02). No entanto, por ser um fenômeno de tempo de vida
relativamente curto, esse fator é menos crítico no caso da fluorescência, o que
permite fácil observação do fenômeno na temperatura ambiente (BASSI, 2001).
Para o caso do pH, a fluorescência de compostos aromáticos com
funcionalidades ácidas ou básicas apresentam forte dependência com o pH,
desta forma, é importante manter o pH das amostras sempre constante.
A presença de outros grupos químicos, como o oxigênio dissolvido,
pode levar a uma diminuição da fluorescência pelo aumento do cruzamento
inter sistemas (CSI), conforme Erro! Fonte de referência não encontrada..
O decréscimo na viscosidade da solução que possui o fluoróforo leva a
diminuição da taxa de colisões moleculares levando a uma diminuição da
difusão dos fótons de fluorescência
Os solventes contendo átomos pesados acarretam na diminuição da
energia relativa do estado excitado. Essa diminuição de energia pode levar a
um aumento da eficiência das conversões internas (CI) e em contrapartida a
diminuição da fluorescência (BASSI, 2001).
Todos os fatores acima mencionados contribuem para que a
fluorescência seja atenuada. Os testes foram realizados a temperatura
ambiente, com o pH 7 fixo, a viscosidade é mantida constante e a diluição foi
realizada para manter a razão entre solvente e soluto sempre a mesma. Nesta
dissertação as condições acima elencadas foram necessárias para manter o
sistema constante ao longo das experiências ora realizadas
29
2.4. FLUORÓFOROS
Os fluoróforos formam um grupo químico que fluoresce quando
exposto a luz de um determinado comprimento de onda. Cada fluoróforo tem
um espectro de emissão e de excitação característico.
Prasad (2003) classifica os fluoróforos em duas categorias, os
fluoróforos intrínsecos ou naturais, e os fluoróforos biomarcadores, não
naturais.
Os fluoróforos intrínsecos são aqueles que ocorrem naturalmente. As
proteínas como triptofano, tirosina e a fenilalamina, e algumas enzimas NADH,
FAD e Ribofavin encontrados dentro das células e dos tecidos são
caracterizados
como fluoróforos
intrínsecos,
alguns destes fluoróforos
encontram-se ilustrados no anexo A. Eles podem ser usados para estudar as
estruturas dinâmicas das células e das proteínas. Também servem como
parâmetros para os estudos de autofluorescência (LAKOWICZ,1999).
Os fluoróforos extrínsecos são aqueles que são adicionados a uma
amostra e chamados também de biomarcadores. Os fluoróforos comerciais
como a família das sondas cyanines são representativas desse grupo,
representados
no
anexo
B.
As
fluorescências
advindas
de
sondas
fluorescentes apresentam alta intensidade, são estáveis durante iluminação
contínua e não perturbam o processo ou a biomolécula onde está sendo
estudada (LAKOWICZ,1999).
O fluoróforo comercial Cy3 e o complexo LaPPS34M são sintetizados
em laboratórios e classificam-se como fluoróforos extrínsecos, sendo
caracterizados como biomarcadores.
2.4.1.
Características Ópticas dos Fluoróforos
Algumas propriedades, como os espectros de absorção e de emissão, o
deslocamento de Stokes e o tempo de vida de luminescência, fazem com que
os fluoróforos tenham grande aplicação na biologia molecular, medicina e
30
engenharia
biomédica
principalmente
relacionada
aos
diagnósticos
e
tratamentos de várias doenças, tais como doença de chagas, dengue e
hepatite (HAUGLAND,1996).
a) Absorção e Emissão
A intensidade do feixe luminoso diminui ao atravessar qualquer meio
absorvente, de acordo com a seguinte lei exponencial geral.
(Eq.1)
em que
e
são respectivamente as intensidades do feixe incidente e do
feixe transmitido,
é o coeficiente de absorção (cm-1), dependente do
comprimento de onda e é o comprimento do meio absorvente (cm).
Define-se a transmitância como:
(Eq. 2)
e absorbância (Abs) ou densidade óptica (DO) como:
(Eq. 3)
Quando o meio absorvente é uma solução com uma dada concentração c, é
comum relacionar
com a concentração, sendo:
(Eq. 4)
31
Onde
se designa por coeficiente de extinção molar ou absortividade molar
e c é a concentração da solução em estudo. Se a concentração for expressa
em M (mol-1),
será expresso em M-1 cm-1.
Usando as relações anteriores pode-se então escrever:
(Eq. 5)
Esta relação representa a forma usual da Lei de Beer, que prevê para soluções
diluídas em apenas uma espécie de absorvente, uma proporcionalidade direta
entre a concentração e a absorbância. A constante de proporcionalidade é o
coeficiente de extinção molar,
, que é a medida da intensidade da banda de
absorção, ou seja, a intensidade de energia da transição para cada
comprimento de onda.
Na Tabela 1 estão listados os comprimentos de onda de absorção e
emissão de fluorescência para alguns fluoróforos encontrados comercialmente.
Tabela 1 - Características dos Fluoróforos Comerciais em relação aos comprimentos de
onda de absorção e de emissão de fluorescência
Fluoróforos
Acridime Orange
502
526
Alexa Fluor 532
532
553
Cy3
548
562
Cy7
710
805
FITC
490
520
RITC
570
595
FDA
495
520
Fonte: Modificado de HAUGLAND, 1996
b) Deslocamento de Stokes
A natureza do solvente e o ambiente local produzem profundos efeitos
sobre o espectro eletrônico das moléculas. Esses efeitos são a origem do
32
deslocamento de Stokes (Δλ), que é a diferença do comprimento de onda entre
as posições do máximo dos espectros de excitação e emissão, da mesma
transição eletrônica. Esta foi uma das primeiras observações do fenômeno
conhecido como fluorescência, descrito pelo físico irlândes G. G. Stokes, em
1852 (LAKOWICZ, 1999), (ABBYAD et al, 2007). Uma causa comum para o
deslocamento de Stokes é a rápida relaxação da estrutura para níveis
vibracionais mais baixos a partir de S1 demonstrado na Figura 2.
A Figura 3 representa um desenho esquemático de um exemplo dos
espectros típicos de fluorescência para moléculas, onde podemos ver
representado o deslocamento de Stokes (Stokes Shift). Essa característica
óptica é importante para diferenciar os espectros de absorção e emissão para
cada molécula estudada. No caso específico desta dissertação o complexo
LaPPS34M
será
responsável
por
um
deslocamento
de
Stokes
de
aproximadamente 200 nm.
Figura 3 - Ilustração do deslocamento de Stokes entre o pico de absorção máxima e o
pico de emissão máxima.
Fonte: Modificado de MGUILBAULT, 1990
Para aplicações em sistemas biomédicos e biológicos é necessário que
os espectros de absorção e emissão sejam localizados em comprimentos de
onda distintos no espectro eletromagnético para que haja uma facilidade na
detecção de fluorescência por parte da instrumentação. No caso do complexo
33
LaPPS34M a absorção se dá na região do azul (350 nm) e a emissão se dá na
região do vermelho (615 nm).
A equação 6 descreve as transições possíveis para que ocorra o
deslocamento de Stokes. O comprimento de onda de absorção (ou o espectro
de absorção da molécula) descreve a variação de energia entre dois estados.
(Eq. 6)
Onde:
E1 corresponde ao nível de energia fundamental [J];
E2 é o nível de energia do estado excitado [J]
ħ a constante de Planck [6,62 x 10-34 J.s]
c a velocidade de propagação da luz [ km/s]
é o comprimento de onda de emissão [nm]
c) Tempos de Vida de Luminescência
A fluorescência tem sido usada para estudar vários sistemas químicos,
físicos e biológicos (LAKOWICZ,1991), (JAMESON,1991). Apesar da grande
quantidade de informações que se consegue com medidas estáticas, é
interessante examinar também a fluorescência resolvida no tempo, ou seja,
através da análise do tempo de vida é possível verificar se uma amostra
contém vários fluoróforos distintos, pois neste caso o que se espera é mais de
um tempo de vida. No caso de um único tipo de fluoróforo, os dados resolvidos
no tempo podem indicar a influência do meio em que se encontra o fluoróforo
uma vez que isto pode alterar o tempo de vida de luminescência.
Há duas técnicas para se obter dados de fluorescência resolvidos no
tempo. Na primeira, uma amostra é excitada com um pulso de luz e observa-se
a fluorescência em função do tempo. Na segunda técnica, a amostra é excitada
34
com luz modulada e a fluorescência em função do tempo é obtida da resposta
em frequência da emissão. Nos dois casos o objetivo é obter os parâmetros
que descrevem a fluorescência em função do tempo.
Os tempos de vida de luminescência dos fluoróforos podem variar de
10
-12
a centenas de 10-9 s. Este tempo corresponde ao intervalo temporal para
que haja um decaimento exponencial partindo do valor máximo até 36,8%.
(isto é, 1/e).
A equação a seguir relaciona os parâmetros para a obtenção dos
valores do tempo de vida de luminescência dos fluoróforos.
(Eq. 7)
Onde
é a intensidade de luminescência inicial no instante de t igual a 0, e
seguido de
variável
que é o tempo de vida de luminescência do fluoróforo. Esta
pode também ser descrita como
Γ + krn)–1.
(Eq. 8)
Onde Γ representa à taxa de emissão do fluoróforo e krn a taxa de decaimento
não radiativa do estado fundamental.
Geralmente, para os fluoróforos comerciais os tempos de vida estão
em torno de 10-9 s. O Cy3 tem o tempo de vida de luminescência em torno de
0,3 ns e é utilizado na marcação de complexos imunes, pois é invariável ao pH
(entre 3 a 7) e a temperatura, mantendo sua estabilidade perante outros
fluoróforos, tais como a fluoresceína (MUJUMDAR et al, 1996).
2.4.2.
Propriedades dos Fluoróforos Comerciais e dos Complexos
Biomarcadores
35
A seleção de um marcador ou de um complexo biomarcador, é
influenciada
por fatores
tais
como
as características
espectrais.
As
características do instrumento de detecção são fundamentais para que haja
precisão na coleta dos dados. Os parâmetros dos instrumentos a serem
considerados incluem o tipo de fonte de excitação, os filtros ópticos utilizados
para a discriminação do sinal e de sensibilidade, e os detectores, ou seja, a
forma como será adquirido os dados.
As características importantes dos marcadores na otimização são o
espectro de excitação, o deslocamento de Stokes, a emissão espectral e o
tempo de vida de luminescência. Outros fatores, incluindo o coeficiente de
extinção, o rendimento quântico de fluorescência, fotoestabilidade e a
sensibilidade ambiental, determinam a intensidade de luminescência de
biomoléculas marcadas. Além disso, os efeitos das características físicas do
marcador sobre a rotulagem influenciam na eficiência e estrutura biológica das
moléculas (HAUGLAND,1996).
Uma abordagem utilizada amplamente é determinar qual o marcador
ou quais os marcadores que são mais adequados para uma determinada
aplicação. O desempenho de um fluoróforo está diretamente relacionado com
as
propriedades
químicas
e
seus
conjugados
de
ácidos
nucléicos
(HAUGLAND,1996).
O rendimento quântico de fluorescência é uma medida da eficiência
com que a molécula excitada é capaz de converter a radiação luminosa
absorvida em emitida. É definida como a fração de fótons absorvidos que são
convertidos em emissão de fluorescência. O rendimento quântico é muito
sensível ao ambiente, ao pH, a temperatura e a estrutura do fluoróforo
(PRASAD, 2003).
Fotoestabilidade é a capacidade que tem um fluoróforo de sofrer
repetidos ciclos de excitação e de emissão sem ser destruído, enquanto no
estado excitado.
O ambiente tem um forte efeito em alguns fluoróforos e mínimos sobre
outros. Os mais fortes fatores ambientais que afetam o rendimento de
fluorescência são o pH e a escolha do solvente.
36
O coeficiente de extinção molar (ε) é a capacidade que um mol2 de uma
substância tem em absorver luz num dado comprimento de onda, ou o quão
fortemente uma substância absorve radiação a uma determinada frequência.
Esta capacidade é muito importante na determinação da quantidade de
radiação luminosa que pode gerar uma molécula através da emissão de
fluorescência (PRASAD, 2003).
A
maioria
dos
fluoróforos
de
uso
comercial
ou
complexos
biomarcadores têm coeficientes de extinção molar em seu comprimento de
onda de absorção máxima variando entre 5.000 e 200.000 L mol−1cm−1
(HAUGLAND, 1996). Em geral, marcadores, com grandes deslocamentos de
Stokes tendem a ter coeficientes de extinção relativamente pequenos,
enquanto que os marcadores com pequenas mudanças no deslocamento de
Stokes tendem a ter coeficientes de extinção relativamente grandes.
Algumas características dos fluoróforos para que se possa ter
biomarcadores de qualidade, são:
1) Os
marcadores
devem
produzir
sinais
luminosos,
que
são
espectralmente distinguíveis da excitação e da emissão;
2) Fluoróforos devem ser compatíveis com a instrumentação disponível;
3) Os marcadores e seus conjugados devem ser estáveis em relação ao
pH, temperatura e condições de iluminação necessária para a análise.
Além disso, alguns dos fatores que influenciam no desempenho dos
fluoróforos, são:
1) Os espectros de excitação e emissão de acordo com a fonte de
excitação e filtro de comprimentos de onda de emissão;
2) O rendimento quântico de fluorescência do marcador;
3) A fotoestabilidade do marcador;
4) O meio onde o marcador se encontra, e
2
O mol é definido como sendo a quantidade de matéria de um sistema que contém tantas
entidades elementares quantos são os átomos contidos em 0,012 kg de carbono 12
(SOLOMONS, 2009).
37
5) O coeficiente de extinção molar.
A banda espectral e a pureza do corante também são fatores
importantes que afetam a análise do fluoróforo. A importância da largura de
banda espectral, especialmente no espectro de emissão, concentra-se na
capacidade dos instrumentos em distinguir um marcador do outro (PRASAD,
2003).
O uso dos fluoróforos como biomarcadores abre a possibilidade de
pesquisas de como novos fluoróforos podem se enquadrar nas características
necessárias para aplicação em sistemas biomédicos. Nesta dissertação
analisa-se o complexo LaPPS34M em comparação com o fluoróforo Cy3 para
demonstrar as possíveis aplicações deste novo complexo em biomédica e
também nos projetos desenvolvidos pelo Instituto Nacional de Inovação em
Saúde Pública (INDI-SAÚDE).
2.4.2.1.
Fluoróforo Comercial Cy3
Há uma grande quantidade de marcadores ou fluoróforos. A família
Cyanine (Cy) são marcadores fluorescentes. Esta família de fluoróforos tem
grande intensidade de fluorescência em relação à emissão de cores, possuindo
faixas espectrais distintas e estão disponíveis em diferentes composições
químicas permitindo rotulagem via amina ou grupos tiol. O fluoróforo Cyanine
proporciona alta sensibilidade e é fotoestável (ERNST,1989).
O marcador Cy3 tem emissão na região do verde e pode ser
sintetizado com grupos reativos em cada um dos radicais [R] ou ambas as
cadeias laterais, de modo que o fluoróforo pode ser quimicamente ligado a
qualquer ácido nucléico ou moléculas de proteínas (ERNST,1989). Na Figura 4
apresenta-se a estrutura molecular do Cy3. Os Radicais [R] representam os
grupos aminas ou tiol aos quais a molécula pode se ligar. Os números 1, 2 e 3
representam as posições das ramificações que compõem a estrutura molecular
do fluoróforo.
38
+
Figura 4 - Ilustração da estrutura molecular do fluoróforo comercial Cy3. O N é o
-
símbolo do íon nitrogênio e o I é o símbolo do íon iodo.
Fonte: Modificado de LAUREN et al,1988
O Cy3 constitui uma família molecular com solubilidade em água, e
tolerância ao Dimetilsulfóxido (DMSO), com comprimento de onda de excitação
da ordem de 550 nm e de emissão da ordem de 570 nm (ambos na faixa de
emissão do verde). A marcação em sistemas médicos e biológicos é
direcionada para identificação e quantificação do complexo antígeno-anticorpo
ou de estruturas internas da célula. Os Cy3 são usados em uma ampla
variedade de aplicações. Para rotulagem de proteínas e ácidos núcleicos tal
como descrito pelos trabalhos de WILTSHIRE, 2000, e para localização de
DNA e RNA (XIAO, 2007).
Esta classe de marcadores é insensível ao pH na faixa entre 3-10 e é
fotoestável. A fluorescência advinda desse marcador permanece por mais
tempo, caracterizado pela fotoestabilidade. As características ópticas da família
de Cy’s, que refletem a qualidade de um fluoróforo, são apresentadas na
Tabela 2.
39
Tabela 2 - Características ópticas relevantes para um fluoróforo da família Cy-corante
Cy-
Peso
Molecular
[u]
λABS
[nm]
λEm
[nm]
Rendimento
Quântico
Coeficiente
de
extinção
molar
-1
-1
[M .cm ]
Tempo
de
vida
[ns]
Cy3
765,9
548
562
<0,3
0.04
0,30
Cy4
791,9
646
664
1.0
0.24
0,25
Cy5
792,1
649
670
0,28
0,15
1,0
corante
Fonte: adaptada de Mujumdar, R.B., et al,1993
2.4.2.2.
Complexo LaPPS34M
O
complexo
tem
a
estrutura
molecular
composta
por
európio/bipiridina/dibenzoílmetano na concentração de 1:1:3. A estrutura
molecular é demonstrada na Figura 5, e apresenta a faixa de comprimento de
onda de absorção na região do azul e emissão de fluorescência na região do
vermelho (AKCELRUD, 2010)..
Figura 5 - Estrutura molecular do complexo LaPPS34M, com os elementos N (nitrogênio)
e O ( oxigênio), as cadeias aromáticas (representada pelos hexágonos).
Fonte : Lapps/UFPR,(2010)
O elemento químico európio (63Eu152) pertence à família dos
lantanídeos que compreende os elementos do lantânio (57La138,9) ao lutécio
40
(71Lu), entre os quais se incluem o ítrio (39Y89) e o escândio (21Sc45),(LEE,
1999).
Esses elementos são aplicados na investigação das propriedades e
funções de sistemas biomédicos e na identificação de substâncias biológicas.
Eles são usados principalmente como sondas espectroscópicas no estudo de
biomoléculas e suas funções, por exemplo em marcadores biológicos para
acompanhar o caminho percorrido pelos medicamentos no homem e em
animais; também como marcadores em imunologia e, como agentes de
contraste em diagnóstico não invasivo de patologias em tecidos por imagem de
ressonância magnética nuclear (MARTINS, 2005).
A semelhança entre as características físicas e químicas dos
elementos lantanídeos (SÁ, 2000) faz com que eles sejam mais estáveis. LUI
(1997) descreve o estudo de fluorescência resolvida no tempo onde se
encontrou os tempos de vida de luminescência dos sistemas contendo európio
em torno de microsegundos. A presença do elemento európio em alguns
complexos ou polímeros faz com que a luminescência esteja presente (LIMA,
2005). Há uma transferência de energia intramolecular do íon metálico central e
esse efeito é chamado de efeito antena3 .
Dentre os lantanídeos, os íons Eu(III) e Tb(III), são os mais utilizados
como sondas espectroscópicas, nas quais os elementos considerados
quelatos
4
destes elementos são os mais convenientes como sondas
luminescentes para sistemas biológicos. Isto se deve ao fato de os mesmos
serem estáveis e a transferência de energia do quelato para o íon Ln poder
atingir eficiência de aproximadamente 100% (BÜNZLI, 1989), fazendo com que
a luminescência seja intensa, apresentando assim, alto rendimento quântico.
Os tempos de vida de luminescência destes complexos são longos (100 a
1000 µs); a diferença de energia entre a absorção do ligante e a emissão do
íon (deslocamento de Stokes) é muito grande, acima de 200 nm; possuem alta
3
O processo de conversão de luz, chamado de efeito antena, envolve a absorção de radiação
ultravioleta através dos ligantes, que atuam como antenas, a transferência de energia do
estado excitado do ligante para os níveis 4f do íon metálico e a emissão de radiação se dá no
visível, característica do íon metálico ( LIMA, 2005)
4
Quando, em uma molécula, o átomo de metal possui ligantes coordenados a ele,sendo que,
cada um desses ligantes efetua duas ligações ou mais com este metal, essa molécula é
considerada um quelato ( SALIBA,2009)
41
sensibilidade de detecção; têm facilidade de se ligarem ao reagente
bioanalítico para marcação de antígenos e/ou anticorpos (BÜNZLI, 1989).
O complexo LaPPS34M que é estudado em relação ao fluoróforo
comercial Cy3, apresenta maior tempo de luminescência, em torno de 110 μs a
114,5 μs, como está demonstrado nas figuras 30 e 32.
2.5. NANOPARTÍCULA
A nanotecnologia refere-se à técnica utilizada para manipular
estruturas na ordem de 10-9 m, tornando possível a criação de estruturas
funcionais em nano escala. Elas podem ser produzidas a partir de diferentes
materiais e formas (LIU, 2006).
As nanopartículas são utilizadas em uma grande variedade de áreas,
incluindo
materiais
biomedicina,
avançados,
fármacos
e
eletrônica,
cosméticos
(ZUO
magnetismo,
et
optoeletrônica,
al, 2007).
Há
várias
nanopartículas como as de materiais metálicos, por exemplo: ouro (Au), prata
(Ag), níquel (Ni), cobre (Cu), semicondutores e os polímeros.
A Figura 6 apresenta as nanopartículas metálicas em diferentes
dimensões, formas e composições e produzem materiais com distintas
propriedades de dispersão da luz. Outra característica visível na figura é a
variação na cor das nanopartículas metálicas (ROSI et al, 2005).
42
Figura 6 - Dimensões, formas e tamanhos das nanopartículas metálicas.
Fonte: Modificado de ROSI et al, (2005)
A
utilização
conjuntamente
com
de
nanopartículas
fluoróforos,
há
um
possibilita
aumento
que
da
ao
conjugá-las
intensidade
de
fluorescência (LAKOWICZ, 2001). A intensificação do sinal permite que a
detecção de fluorescência seja ampliada por causa da transferência de energia
de ressonância.
As
aplicações
dessa
tecnologia
são
a
caracterização
e
o
aprimoramento de novos biomarcadores, como por exemplo, para o
diagnóstico de câncer e a detecção de doenças infecciosas por microorganismos (SOKOLOV, 1998) e (SIWACH, 2009).
O aumento da intensidade de fluorescência do fluoróforo Cy3 e do
complexo LaPPS34M foi realizado com o uso de nanopartículas de ouro e
prata e servirão de parâmetros para a otimização do sistema de
instrumentação desenvolvido com a finalidade de obter as características
ópticas das amostras. As nanopartículas utilizadas foram produzidas pela
UFPR e sua produção e caracterização estão apresentadas no anexo C.
43
2.5.1.
Fluoróforo na Presença de Nanopartículas
A
transferência
de
energia
de
ressonância
de
fluorescência
(Fluorescence Resonance Energy Transfer - FRET) é uma técnica para a
caracterização de interações à distância. É uma das poucas ferramentas
disponíveis que é capaz de medir as interações intermoleculares e a distância
intramolecular tanto in vivo quanto in vitro (SELVIN, 2000). É um processo pelo
qual um doador não radiativo do estado excitado (e.g., um fluoróforo) transfere
energia para um estado receptor através de interações de longo alcance
dipolo-dipolo (LAKOWICZ, 1999).
A FRET envolve a excitação de um fluoróforo doador por incidência de
luz dentro do seu espectro de absorção. Essa absorção de radiação eleva o
fluoróforo a uma maior energia, estado excitado, que normalmente decai
(retorno ao estado fundamental) com um espectro de emissão característico.
Se, no entanto, outro fluoróforo ou nanopartículas (o receptor) existe nas
proximidades do doador há uma sobreposição do espectro de absorção do
receptor ao espectro de emissão do doador e, em seguida a possibilidade de
transferência de energia não-radiativa entre o doador e o receptor (PRASAD,
2003).
A Figura 7 mostra a sobreposição do espectro de absorção da proteína
fluorescente fluoresceína e do espectro de emissão da proteína fluorescente
rodamina possibilitando uma forte interação FRET.
44
Figura 7 - Esquema do processo de FRET entre dois fluoróforos, a fluoresceína doadora)
e a rodamina (receptora), onde r é a distância de mínima de FRET.
Fonte: Modificado de SAPSFORD et al, 2006.
Em geral, o doador e o receptor são diferentes. O FRET é detectado
pelo aparecimento de fluorescência do receptor ou por extinção de
fluorescência do doador.
Em uma molécula os elétrons migram do estado fundamental (So) para
um nível de vibração mais elevada, de forma rápida com tempos da ordem de
pico segundos. Estes elétrons decaem para o nível mais baixo de vibração (S1)
e, eventualmente, dentro de nanosegundos, voltam para o estado (So) e um
fóton de luz é emitido (LAKOWICZ et al, 2008).
Na transferência de energia de ressonância o fóton não é emitido, mas
a energia é transferida para a molécula receptora, cujos elétrons por sua vez,
tornam-se excitados. Isto está apresentado na Figura 6, por meio de um
diagrama de Jablonski para o processo de FRET.
45
Figura 8 - Descrição do processo de FRET pelo de diagrama de Jablonski.
Fonte: Própria
O FRET pode resultar em uma diminuição da fluorescência da
molécula doadora como em um aumento da fluorescência do receptor. O
método estabelece a medida da interação entre o fluoróforo e a superfície das
nanopartículas A taxa de transferência de energia é dependente de muitos
fatores, tais como o grau de sobreposição espectral entre o doador e o
receptor, a orientação relativa dos dipolos de transição, e mais importante, a
distância entre o doador e receptor nas moléculas. Geralmente o FRET ocorre
nos sistemas biomédicos em dimensões (r) em torno de 2 a 10 nm (CHEN,
2007).
Quando se conjuga as nanoparticulas com fluoróforos ou complexos
há um aumento da intensidade de fluorescência. A Figura 30 representa o
resultado do fenômeno de FRET para o caso de nanopartículas de prata
conjugadas com o bioindicador LaPPS34M.
46
2.6. RESUMO
Neste capítulo, apresentou-se que a medição de fluorescência apresenta
potencialidade
para
sistemas
de
diagnósticos
rápidos
utilizando
um
biomarcador fluorescente.
Para a caracterização óptica deste indicador fluorescente utilizou-se os
espectros de absorção e emissão da substância ou complexo, o deslocamento
de Stokes entre a absorção e emissão e o tempo de vida do emissão de
luminescência.
Normalmente, o Cy3 é o indicador mais utlizado para a marcação do
complexo antígeno-anticorpo, entretanto, este trabalho utililizará o novo
complexo LaPPS34M (Lapps/UFPR) para a emissão de fluorescência devido
ao maior tempo de emissão (na ordem de 100s) e deslocamento de Stokes
(em torno de 200 nm).
Adicionalmente, o uso de nanopartículas possibilitará a intensificação
do sinal de fluorescência quando houver a conjugação de fluoróforos com as
nanopartículas.
No capítulo a seguir, apresenta-se uma descrição dos elementos
utilizados na implementação de um sistema de aquisição de fluorescência.
47
3.
SISTEMAS DE AQUISIÇÃO DE LUMINESCÊNCIA
3.1.
INTRODUÇÃO
Neste capítulo é apresentado o sistema implementado para a detecção
da emissão de fluorescência dos fluoróforos Cy3 e LaPPS34M. Dentro deste
sistema,
utilizou-se
para
a
detecção
de
fluorescência,
a
válvula
fotomultiplicadora R928 e a válvula fotomultiplicadora miniatura R5600U-01 e,
posteriormente, por um componente optoeletrônico OPT 301.
3.2. DETERMINAÇÃO DO ESPECTRO DE ABSORÇÃO DO CY3 E DO
COMPLEXO LaPPS34M
A análise de elementos químicos, as estruturas internas dos compostos
e o levantamento de dados físico-químicos da absorção, emissão e dispersão
da interação da luz com as amostras são essenciais para descrever o
comportamento e natureza dos compostos orgânicos (LEE, 1999).
A absorção de radiação eletromagnética que acontece na região do
ultravioleta e também do visível, é estudada através da espectroscopia de
absorção. Se o objeto de interesse é a emissão, obtém-se tal espectro pela
espectroscopia de emissão. Há outros tipos de espectroscopia como de
infravermelho, de microondas, Raman, de fluorescência, de raios x, de plasma,
fotoacústica e de ressonância magnética (OKUNO, 1982).
Para que haja interação entre a luz incidente e a amostra deve haver
ressonância. A radiação eletromagnética e as partículas da amostra devem ter
a mesma frequência, e isto só é possível se a energia de excitação for maior
que a fundamental levando às transições eletrônicas entre os níveis de energia
(EISBERG, 1988).
A absorção molecular se dá através da soma das contribuições de
vários níveis de energia, a rotacional, vibracional e eletrônica. O movimento de
translação da molécula como um todo não modifica as posições relativas das
48
partículas que a constituem, entretanto as ligações intermoleculares e os
ângulos entre as ligações vibram, enquanto que a estrutura nuclear gira como
um todo. Podemos desprezar os movimentos de rotação e vibração das
moléculas, pois as velocidades eletrônicas são pelo menos mil vezes maiores
que as nucleares (BASSI, 2001).
3.2.1.
Espectrofotômetro de Duplo Feixe
Para a determinação o espectro de absorção e emissao dos fluoróforos
Cy3 e LaPPS34M, utilizou-se um espectrofotômetro para as regiões do
ultravioleta, do visível e do infravermelho.
O espectrofotômetro apresenta uma fonte de radiação eletromagnética
de espectro contínuo, um porta amostra, um monocromador e um detector
(Figura 9). Nos espectrofotômetros de feixe simples a radiação só atravessa a
amostra e nos espectrofotômetros de feixe duplo mede-se simultaneamente a
intensidade transmitida pela amostra e a transmitida por um padrão de
referência, a diferença das duas intensidades é aquela absorvida pela amostra.
49
Figura 9 - Desenho esquemático do espectrofotômetro de duplo feixe
Fonte: Própria
O equipamento disponível no laboratório de óptica da UTFPR consiste
em um espectrofotômetro de duplo feixe UV-VIS, modelo DB – 1880S,
composto de duas fontes óticas, uma lâmpada de tungstênio – halogênio ( para
a região do visível) e outra de deutério (para a região do ultravioleta). Tem-se
internamente dois monocromadores que permitem a passagem de uma faixa
estreita do espectro da energia incidente com um comprimento de onda
específico, que varia de 190 nm a 1100 nm. A cubeta onde se coloca a amostra
é de quartzo com volume de 3,5 ml e o comprimento do caminho óptico, pelo
qual se dará a interação da radiação e a substância da amostra, é definido pelo
diâmetro interno da cubeta na ordem de 10 mm. A fotografia 1 representa o
equipamento disponível no laboratório de óptica da UTFPR.
50
Fotografia 1 - Espectrofotômetro de Duplo Feixe UV-Vis.
Fonte: Própria
O sistema descrito foi utilizado para se obter os espectros de absorção
do fluoróforo comercial Cy3, o espectro de absorção do complexo LaPPS34M,
e a resposta espectral dos filtros utilizados no experimento.
3.2.1.1.
Espectro de Absorção
Os espectros de absorção do fluoróforo comercial Cy3 e o do complexo
LaPPS34M foram obtidos pelo espectrofotômetro descrito no item 3.2.1. O
fluoróforo Cy3 foi diluído em uma solução tampão na proporção 1:1, isto é, 1 ml
de soluto em 1 ml de solvente e colocado na cubeta de quartzo e transportada
ao espectrofotômetro. Observa-se que a absorção do fluoróforo Cy3 acontece
na região compreendida entre 530nm e 560nm, com um pico máximo em
550 nm, conforme vizualiza-se na Figura 6. O espectro de absorção do
complexo LaPPS34M foi obtido diluindo a amostra em solução de
tetrahidrofurano (THF), seguindo o mesmo procedimento no qual foi obtido o
espectro de absorção do fluoróforo Cy3. A Figura 6 representa o gráfico do
complexo LaPPS34M com um pico máximo (principal) em 400nm e outro
secundário em 300nm.
51
Figura 10 - Espectro de absorção do fluoroforo Cy3 obtido pelo espectrofotômetro.
Fonte: Própria
Figura 11 - Espectro de absorção do complexo LaPPS34M obtido pelo espectrofotômetro
Fonte: Própria
Os resultados indicam que no caso do fluoróforo Cy3, os dados
coletados no laboratório da UTFPR correspondem ao disponível na literatura,
pois o pico máximo de absorção se encontra em 550 nm, conforme
apresentado na Erro! Fonte de referência não encontrada.. Para o estudo do
complexo LaPPS34M percebe-se a presença de dois picos, sendo que a maior
52
absorbância se encontra em 400 nm, como demonstrado na Erro! Fonte de
referência não encontrada..
3.3. SISTEMA DE AQUISIÇÃO DE SINAL DE FLUORESCÊNCIA
Para a detecção da luminescência, foi implementado um sistema de
detecção de acordo com a Figura 12. O sistema é composto por (a) uma fonte
óptica acoplada a um gerador de sinais utilizado para a excitação do fluoróforo,
(b) um fluoróforo em uma cubeta posicionada de forma que o caminho óptico
de excitação e de detecção formem um ângulo de 90 graus para minimizar a
energia de excitação que incide no sensor de luminescência, (c) lente
convergente para orientar o feixe incidente d) Monocromador ou filtro óptico
para emissão, (e) um fotodetector de estado sólido, (f) um amplificador de
transimpedância,
(g)
e
(h)
representam
o
sistema
de
aquisição
e
processamento de sinais através do osciloscópio e computador padrão.
Figura 12 - Representação esquemática do sistema de detecção proposto
Fonte: Própria
O método proposto será dividido em três fases devido a utilização de
três
distintos
optodetectores
(válvula
fotomultiplicadora
R928,
válvula
fotomultiplicadora miniatura R5600U-01 e detector optoletrônico OPT301):
53
A fase I é constituída da coleta de dados a partir da instrumentação
com o uso da válvula fotomultiplicadora R928, conforme pode ser visto na
Figura 13
Figura 13 - Desenho esquemático do sistema experimental por válvula fotomultiplicadora
R928 (de alta sensibilidade)
Fonte: Própria
A instrumentação descrita na Figura 13 possibilita a obtenção do
espectro de fluorescência e o tempo de vida de luminescência da amostra
LaPPS34M na fase 1, bem como o espectro de fluorescência do fluoróforo
comercial Cy3, cujo sistema de detecção baseia-se na utilização da válvula
fotomultiplicadora grande. O sistema é composto por (a) uma fonte óptica
acoplada a um gerador de sinais utilizado, neste caso led´s ultravioleta e azul
(b) uma cubeta de quartzo contendo a amostra, (c) uma lente convergente d)
um monocromador para selecionar o comprimento de onda de emissão modelo
SpectraPro 275 (Acton Research Co., U.S.A) com distância focal de 275 mm,
sistema óptico do tipo Czerny-Turner, (d) uma válvula fotomultiplicadora grande
tipo janela lateral R928 (Hamamatsu Co.,U.S.A), (e) um amplificador de
transimpedância, (f) e (g) um sistema de aquisição e processamento de sinais.
A fase II é constituída de (a) uma fonte óptica composta de um diodo
emissor de luz ultravioleta,(b) uma câmara de amostra que contém saída que
direcionam o feixe de luz do diodo emissor de luz para o filtro, (c) um filtro que
54
serve para selecionar o comprimento de onda de emissão de fluorescência, (d)
uma válvula fotomultiplicadora miniatura em modelo R5600U-01 ultra compacto
com 10 mm de comprimento, 15 mm de diâmetro e janela óptica (fotocatodo)
de 8 mm de diâmetro. São ainda componentes da fase II, (e) um amplificador
de transimpedância usado para converte o sinal luminoso em tensão elétrica (f)
um osciloscópio que permite a captação dos sinais e (g) um computador
padrão para realizar o tratamento dos dados.
O tamanho reduzido da válvula e do filtro de interferência permitiu a
acomodação deste conjunto em uma das saídas da câmara de amostras,
configurando um sistema compacto conforme o esquema apresentado na
Figura 14.
Figura 14 - Desenho esquemático do sistema com o uso da válvula fotomultiplicadora
miniatura (R5600U-01).
Fonte: Própria
No caso específico do sistema com o uso da válvula fotomultiplicadora
miniatura (R5600U-01), a câmara de amostra é adaptada para que a amostra
seja utilizada em um tubo de ensaio, tamanho de 2 cm de diâmetro e 10 cm de
altura. O complexo LaPPS34M foi diluído em tetrahidrofurano (THF) colocado
no tubo de ensaio e posteriormente na câmara de amostra. Através da
configuração descrita na Figura 14, permite-se obter o tempo de vida de
luminescência.
55
A fase III corresponderá pelo uso da mesma instrumentação com
detector optoleletrônico, a ilustração do desenho esquemático do sistema é
apresentada na Erro! Fonte de referência não encontrada..
Figura 15 - Desenho esquemático do sistema experimental por fotodiodo
Fonte: Própria
A instrumentação descrita na Erro! Fonte de referência não encontrada.
possibilita a obtenção do tempo de vida de luminescência da amostra
LaPPS34M na fase 3, cujo sistema de detecção baseia-se na utilização do
fotodiodo OPT301. O sistema é composto por (a) uma fonte óptica acoplada a
um gerador de sinais utilizado para a excitação do indicador, (b) um indicador
em uma cubeta posicionada de forma que o caminho óptico de excitação e de
detecção formam um ângulo de 90 graus, (c) filtro óptico para permitir a
emissão, (d) um fotodetector de estado sólido,
(e) amplificador de
transimpedância é utilizado para converter o sinal luminoso em sinal elétrico (f)
um sistema de aquisição e processamento de sinais.
A fonte óptica corresponde ao diodo emissor de luz na faixa do violeta
com comprimento de onda para o pico de emissão em 400 nm. Aplica-se um
sinal com frequência de 100Hz (periodo de 10 ms) e duty cicle de
aproximadamente 15%, isto é, pulso de 1.5 ms. Esse sinal foi aplicado
utilizando-se o gerador de sinais AFG3000 da Tektronix.
A amostra LaPPS34M. foi diluída em uma solução de tetrahidrofurano
(THF) na proporção 1:1, isto é, 10 ml de soluto em 10 ml de solvente e
colocada num tubo de ensaio de 2 mm de diâmetro.
56
No caminho óptico da emissão foi acrescido um filtro de interferência
com o espectro de transmitância apresentado na Figura 20. Observa-se que a
resposta desse filtro apresenta elevada transmitância na região de emissão do
complexo LAPPS34M. O filtro foi adicionado ao sistema com a intenção de
minimizar qualquer interferência da energia de excitação no fotodetector
permitindo a passagem da energia emitida pelo indicador.
A detecção do sinal de fluorescência foi obtida por um fotodiodo
OPT301, com janela fotosensível de 2,29 mm x 2,29 mm (OPT301, 1994). O
fotodetector tem um amplificador conversor corrente-tensão integrado no
mesmo encapsulamento. A Erro! Fonte de referência não encontrada.a
apresenta o circuito interno do OPT301 e a Erro! Fonte de referência não
encontrada.b
é a resposta espectral do sensor.
(i)
(ii)
Figura 16 - (a) Dispositivo OPT 301 apresenta um fotodiodo integrado com amplificador
conversor corrente-tensão, (b) resposta espectral do OPT 301, (i) emissão de
luminescência do indicador (LAPPS34M ~ 615 nm) (ii) excitação do indicador (LAPPS34M
~ 350 nm).
Fonte: Burr-Brown Corporation, 1994
Da figura 16(b), a resposta espectral do detector optoreletrônico
apresenta: (a) uma boa resposta para a emissão de luminescência do indicador
(LAPPS34M ~ 615 nm) e (b) uma resposta inferior para a excitação do
indicador (LAPPS34M ~ 350 nm).
Os sinais foram adquiridos com um osciloscópio digital modelo
TDS2002B (Tektronix, Beaverton, OR, U.S.A.). Os sinais são digitalizados e
57
armazenados em um dispositivo via interface serial USB. Após transferidos
para um computador os dados são processados utilizando uma função
Dynamic Fit Wizard do programa Sigmaplot 11.0 para determinação dos
parâmetros de uma ou mais exponenciais. O parâmetro de tempo de
decaimento da exponencial corresponde ao tempo de vida de luminescência do
indicador LaPPS34M.
Na fase I, II e III com a utilização dos sistemas descritos nas figuras 13,
14 e 15 foram coletadas as características ópticas necessárias para
caracterizar o fluoróforo estudado, ou seja, o complexo LaPPS34M.
O levantamento dos espectros de absorção, de emissão de
fluorescência e os tempos de vida de luminescência são os parâmetros
relevantes para a consolidação das características ópticas de um fluoróforo. A
descrição do uso de nanopartículas de ouro e prata servirão para demonstrar a
possibilidade de intensificar o sinal de intensidade de fluorescência nos
sistemas utilizados.
3.4.
SISTEMA DE DETECÇÃO DE FLUORESCÊNCIA
Em um sistema de detecção de luminescência típico, um feixe de luz
de alta intensidade passa através de lentes convergentes para orientar o feixe
a passar pela cubeta. O feixe de luz de excitação passa através de uma cubeta
contendo a amostra (Figura 12). Para evitar a detecção do feixe incidente,
pode-se fazer a observação da fluorescência em ângulo reto com o feixe
incidente, pois a amostra irá emitir em todas as direções. A luz emitida
(luminescência) passa através de um monocromador para a análise do
comprimento de onda e depois vai para um detector fotossensível (válvula
fotomultiplicadora). Os comprimentos de onda são detectados e apresentam a
intensidade de emissão como uma função do comprimento de onda da luz
emitida (WILLARD, 1988).
3.4.1.
Fonte Óptica
58
A fonte óptica deve ceder energia radiante para a faixa de comprimento
de onda de absorção do estudo. Há vários tipos de fontes ópticas que podem
ser utilizadas para obter a fluorescência como: diodos emissores de luz LightEmitting Diodes (led) e os dispositivos de Light Amplification by Stimulated
Emission of Radiation (LASER).
A excitação advinda dos marcadores fluorescentes gera pulsos na faixa
de nano segundos. A fonte óptica deve ser capaz de fornecer um espectro de
energia abrangente. Os diodos representam a fonte óptica escolhida por
apresentarem um baixo custo e grande diversidade de comprimentos de onda.
Para a obtenção do tempo de vida de luminescência da molécula
LaPPS34M utilizou-se uma lâmpada xênon de arco curto (1,5 mm) para
excitação pulsada tipo FX-249 (EG&G ELETRO-OPTICS, U.S.A). A Figura 17
representa o espectro de emissão. Esta lâmpada possibilita excitações na faixa
de 7J e potência média de 20 W e trabalha com tensões de até 1500 V com
taxas de repetições de até 500 Hz. A faixa espectral está entre 310 a 1100 nm.
100
90
Emissão Relativa [a.u]
80
70
60
50
40
30
20
10
0
300
400
500
600
700
800
Comprimento de Onda [nm]
Figura 17 – Espectro de emissão da lâmpada xenon
Fonte: Própria
Utilizou-se conjuntamente uma fonte de disparo da lâmpada tipo PS302 (EG&G ELETRO-OPTICS, U.S.A), a tensão de saída pode ser regulada
entre 400 e 1500 V, com pulsos com tensão de 3V com duração de 1 a 100 μs.
59
As figuras 18 e 19 representam os espectros de emissão dos dois leds
utilizados no experimento, os espectros de emissão do led azul e do ultravioleta
foram obtidos utilizando o sistema descrito pela Figura 12.
Figura 18 - Espectro de emissão de led azul, com comprimento de onda do pico é 440 nm.
Fonte: Própria
Figura 19 - Espectro de emissão de led ultravioleta, com comprimento de onda do pico
é 400 nm.
Fonte: Própria
3.4.2.
Lentes Convergentes e Filtros
60
A lente convergente utilizada no experimento de fluorescência serviu
para redirecionar a luz que vem da fonte óptica, neste caso do diodo emissor
de luz (led) para o foco. A amostra era colocada na posição focal em relação à
lente. Foram utilizadas duas lentes convergentes de 15 cm e 5 cm de distância
focal respectivamente, como mostra o esquema de montagem do sistema de
detecção representado na Fotografia 2.
Fotografia 2 - Montagem do uso das lentes convergentes no experimento de
fluorescência.
Fonte: Própria
Os filtros em geral selecionam os comprimentos de onda que são
transmitidos através de absorção, pela interação da energia radiante incidente
com o material do filtro. Eles possibilitam a passagem de comprimentos de
onda acima ou abaixo de um valor específico; caracterizam-se por não serem
sensíveis ao ângulo de incidência da radiação e são muito utilizados em
sistemas óticos para selecionar as faixas de frequência desejáveis.
No experimento de fluorescência, para a obtenção do tempo de vida do
complexo LaPPS34M foram utilizado filtros de 614 nm e 640 nm. A Figura 20
61
representa o espectro de transmissão de um filtro de interferência na região do
vermelho.
1,0
Transmitância [%]
0,9
0,8
0,7
0,6
600
700
800
900
1000
1100
Comprimento de Onda [nm]
Figura 20 - Espectro de transmitância do filtro de interferência na região do vermelho
Fonte: Própria
3.4.3.
Monocromador
A função de um monocromador é permitir a passagem de uma faixa
estreita do espectro da energia radiante centrada em um comprimento de onda
específico. O monocromador utilizado no experimento de detecção de
fluorescência foi o SpectraPro 275 (Acton Research Co., U.S.A) com distância
focal de 275 mm, sistema óptico do tipo Czerny-Turner, conforme mostra a
Fotografia 3. O equipamento permite o controle local ou remoto da velocidade
de varredura, comprimentos de onda inicial e final, avanço passo a passo, para
uma das duas grades possíveis de serem acopladas.
A 1ª Grade possui 1200 ranhuras/mm, comprimento de onda de
transmissão de 300nm, e a 2ª Grade possui 1200 ranhuras/mm, comprimento
de onda de 500 nm (Acton Research Co., 1992). As fendas foram fixadas em
3,0 mm, tanto na entrada com na saída, possibilitando um controle da faixa de
passagem do comprimento de onda e da resolução. A resolução máxima está
em torno de 0,1 nm medido para um comprimento de onda a 435,8 nm com
uma grade difratora de 1200 ranhuras/mm.
62
Para o experimento foi escolhida a grade 1 por estar de acordo com a
região do espectro do de fluorescência
desejado com a largura da fenda
mantida constante em 3 mm.
Fotografia 3 - Monocromador do tipo Czerny-Turner.
Fonte: Própria
3.4.4. Cubeta
A cubeta do tipo 111–OS (Hellmasulamericana Ltda) para os estudos
de fluorescência possui todas as laterais polidas de quartzo, possibilitando que
a transmitância seja alta para a faixa de comprimento de onda de excitação e
emissão, permitindo que a luz de excitação entre em uma direção e possa ser
detectada em outra direção, perpendicular a da excitação, diminuindo assim a
incidência de radiação de excitação no detector. A câmara de amostra utilizada
possui um caminho óptico de 10 mm, conforme ilustrado na Figura 21.
Na Figura 22 é representado o espectro de transmitância da cubeta de
quartzo. Na faixa correspondente a absorção da amostra LaPPS34M, a cubeta
de quartzo é apropriada, pois tem pouca absorção no ultravioleta.
63
Figura 21 - Diagrama representativo da transmitância de luz pela amostra na cubeta
Fonte: Modificado de BRANCO, 1997
Figura 22 - llustração do espectro de transmitância da cubeta de quartzo
Fonte: BRANCO, 1997
3.4.5.
Válvulas Fotomultiplicadoras ( PMTs)
64
A detecção é realizada através da transformação dos sinais ópticos em
sinais elétricos com o uso de sensores opto-eletrônicos. Um dos sensores
utilizados foi uma válvula fotomultiplicadora tipo janela lateral R928
(Hamamatsu Co.,U.S.A) com sensibilidade do catodo de 352 μA/lúmen, com
corrente de anodo na ausência de energia radiante incidente de 4,5 nA. O
tempo de subida do sinal é de 2,2 ns e a resposta espectral óptica varia de 190
a 900 nm. Utilizou-se uma fonte de alta tensão para a polarização da válvula,
conversor DC-DC tipo C1309-04 ( Hamamatsu Co., U.S.A) com tensão de
entrada de 13 a 24 V e corrente de 160 mA. A tensão de saída regulada foi de
190 a 1100 V.
As válvulas fotomultiplicadoras (PMT - photo multiplier tube) combinam
uma camada fotosensível de metais alcalinos (multialkali: Na-K-Sb-Cs)
denominada de fotocatodo, e um multiplicador de elétrons que consiste em
uma série de dinodos cobertos com um material de alta emissão secundária
(metal channel dynode). O fotocatodo converte fótons incidentes em
fotoelétrons e estes são multiplicados de dinodo para dinodo atingir o anodo,
conforme a Figura 23.
Figura 23 - Representação do processo de geração e multiplicação de elétrons em uma
válvula fotomultiplicadora
Fonte: BRANCO,1997
Um conjunto de resistores divide a tensão de polarização para os
diversos dinodos. O ganho total (G) da válvula corresponde ao número de
estágios n multiplicado pelo fator de emissão secundária por estágio f , sendo
dado por:
65
G fn
(Eq.12)
Os valores assumidos por f apresentam-se na faixa de 3 a 10, sendo
que para dinodos recobertos com GaP (Fosfeto de Gálio), o fator de emissão
secundária pode alcançar 50. Esta larga capacidade de amplificação interna,
permite a utilização das PMTs na medição de sinais luminosos com baixos
níveis de intensidade, na faixa de 10-14 a 10-4 lúmens, sendo que 1 lúmen
corresponde a 1,47 mW (BRANCO, 1997).
3.4.6.
Amplificador de Transimpedância
Para converter a corrente do sensor optoeletrônico em um nível de
tensão, utiliza-se um amplificador de transimpedância.
O circuito apresentado na Figura 24 foi montado em circuito impresso e
introduzido numa caixa metálica. O circuito possui capacitores para estabilizar
a tensão de alimentação, diodos (1N4148) de proteção na entrada e diodo para
alimentação da tensão de saída. O amplificador operacional foi o OP 627 com
baixa corrente de fuga e offset e alta impedância de entrada com baixo valor
capacitivo, alto ganho de malha aberta, ampla largura de banda de 16 MHz
assim como variação da tensão de saída.
Figura 24 - Circuito de Implementação do Amplificador de Transimpedância
Fonte: SCHNEIDER, 1995
66
3.4.7.
Aquisição do Processamento do Sinal
Os sinais foram adquiridos com um osciloscópio digital modelo
TDS2002B (Tektronix, Beaverton, OR, U.S.A.). Os sinais são digitalizados e
armazenados em um dispositivo via interface serial USB. Depois de
transferidos para um computador os dados são processados. Utilizou-se uma
função Dynamic Fit Wizard do programa Sigmaplot 11.0 para determinação dos
parâmetros de uma exponencial
3.5.
RESUMO
Implementou-se um sistema de detecção de fluorescência com 3
distintos detectores ópticos, denominados de fases I (válvula fotomultiplicadora
R928), II (válvula fotomultiplicadora miniatura R5600U-01) e III (detector
optoeletrônico OPT301). De acordo com os detectores e as suas medidas dos
tempo de emissão de fluorescência, estes servirão de referência para a
construção de equipamentos de baixo custo e maior resistência mecânica.
O capítulo 4 a seguir apresenta os ensaios realizados para a
determinação dos tempos de vida da fluorescência com a instrumentação
implementada e o marcador LaPPS34M.
67
4.
RESULTADOS
4.1.
INTRODUÇÃO
No sistema desenvolvido, a
detecção de fluorescência foi feita por
meio de (a) válvulas fotomultiplicadoras e (b) um detector optoeletrônico. Os
resultados deste trabalho são apresentados neste capítulo na seguinte
sequência:
a) Os espectros de emissão de Fluorescência do Cy3 e do complexo
LaPPS34M;
b) Os espectros de emissão de fluorescência conjugados com
nanopartículas do Cy3 e do complexo LaPPS34M;
c) O tempos de vida de luminescência do complexo LaPPS34M.
4.2.
ESPECTROS DE FLUORESCÊNCIA
a) Fluoróforo Cy3
Os espectros de fluorescência de Cy3 foram obtidos através da fase I
descrita no item 3.3. A amostra de fluoróforo comercial Cy3 foi diluída em
solução tampão na proporção de 1:1 e colocada na cubeta de quartzo. A Figura
25 representa o gráfico da região do espectro de emissão.
O fluoróforo Cy3 apresenta excitação na região do azul e região
espectral de emissão variando de 530 nm a 580 nm, com um pico máximo em
564 nm. Os dados experimentais foram obtidos com pulsos de 75 μs com
frequência de 147,3 Hz. A válvula fotomultiplicadora R928 foi mantida a 800 V
e as fendas do monocromador mantidas com abertura de 3 mm.
O deslocamento de Stokes do fluoróforo Cy3 é pequeno entre a
excitação e a emissão, em torno de aproximadamente 15 nm, indicando a
aproximação entre os picos do espectro de excitação e emissão concentrando-
68
se na região do verde, com a excitação na região do azul, isto dificultaria, no
filtro óptico, separar emissão de recepção.
Emissão de Fluorescência [a.u]
1,0
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
520
540
560
580
600
620
Comprimento de Onda [nm]
Figura 25 - Espectro de fluorescência do fluoróforo Cy3 obtido pela FASE I (válvula
fotomultiplicadora R928)
Fonte: Própria
A Figura 26 representa o deslocamento de Stokes do fluoróforo Cy3
demonstrando a variação para o complexo em torno de 20 a 50 nm.
Figura 26 - Espectro de absorção e emissão de fluoróforo Cy3 demonstrando o
deslocamento de Stokes obtido pela FASE I.
Fonte: Própria
69
b) Complexo LaPPS34M
Na Fase I descrita no item 3.3 o complexo LaPPS34M foi diluído em
solução de tetrahidrofurano (THF) cuja a fórmula molecular é representada por
C4 H8 O, na proporção de 1:1. Pulsos ópticos de 3 ms com frequência de
114 Hz foram obtidos de forma experimental. A válvula fotomultiplicadora R928
foi mantida em 700 V e a abertura das fendas do monocromador em 3 mm. A
região espectral de emissão acontece entre 600 nm e 630 nm, com um pico
máximo em 615 nm conforme a Figura 27. Essa caracterização óptica indica
que a molécula tem um grande O deslocamento de Stokes entre os picos do
espectro de excitação e emissão, e esta variação ocorre entre a região do azul
(excitação) e a região do vermelho (emissão).
1,0
Emissão de Fluorescência [a.u]
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
580
590
600
610
620
630
640
Comprimento de onda [nm]
Figura 27 - Espectro de fluorescência do complexo LaPPS34M obtido pela FASE I.
Fonte: Própria
A Figura 28 representa o deslocamento de Stokes do complexo
LaPPS34M demonstrando a variação para o complexo em torno de 200 a 250
nm.
70
Figura 28 - Espectro de absorção e emissão de LaPPS34M demonstrando o
deslocamento de Stokes obtido pela FASE I
Fonte: Própria
71
4.3. ESPECTROS
DE
FLUORESCÊNCIA
COM
NANOPARTÍCULAS
METÁLICAS
a) Fluoróforo Cy3
O fluoróforo Cy3 foi conjugado com nanopartículas de ouro e a Figura
29 representa os espectros de fluorescência. No anexo C segue a descrição da
formação e caracterização das nanopartículas. Segundo a teoria de FRET
descrita na seção 2.7.1 quando um fluoróforo se encontra na presença de
nanopartículas pode haver um aumento da intensidade de fluorescência e um
decréscimo do tempo de vida.
O gráfico da Figura 29 demonstra que o fluoróforo comercial Cy3 na
presença de nanopartículas de ouro apresenta um deslocamento espectral, no
sentido
de
menores comprimentos de
onda,
com
um aumento
de
aproximadamente 170% no valor da intensidade de fluorescência, demonstrada
pelo aumento da intensidade de sinal do sistema, confirmando a teoria de que
a presença de nanopartículas modifica a fluorescência.
26
100
90
Intensidade de Fluorescência [a.u]
Emissão de Fluorescência [a.u]
24
22
20
18
16
14
80
70
60
50
40
30
20
10
12
520
540
560
580
Comprimento de Onda [nm]
600
620
0
500
520
540
560
580
600
Comprimento de Onda [nm]
Figura 29 - a)Espectro de Fluorescência do fluoróforo Cy3 e b) o espectro de fluorescência do
Fluoróforo Cy3 conjugado com Nanopartícula de Ouro obtido pela FASE I.
Fonte: Própria
72
b) Complexo LaPPS34M
No estudo do complexo LaPPS34M, a escolha das nanopartículas de
prata se deu em virtude de que o espectro de absorção destas nanopartículas
ocorre na região do espectro de absorção do complexo, o que segundo a teoria
de FRET (seção 2.5.1) ocasiona uma intensificação da fluorescência. Neste
caso, a absorção das nanopartículas de prata acontece em 400 nm e a
absorção do complexo está na faixa de 350 nm a 400 nm.
A Erro! Fonte de referência não encontrada. representa o gráfico do espectro
de fluorescência do complexo LaPPS34M, demonstrando que há uma
modificação do sistema com a introdução das nanopartículas de prata. A
amostra foi diluída em etanol na proporção de 1:1, isto é, 10 ml de soluto em 10
ml de solvente. E posteriormente a colocação de nanopartículas de prata na
proporção de 1 ml para 2 ml da solução de LaPPS+Etanol numa cubeta de
quartzo de 3.5 ml.
O
sistema
foi
iluminado
com
diodo
ultravioleta
usando
a
instrumentação descrita na seção 3.4.1. Observa-se um aumento da
intensidade de fluorescência com a conjugação do LaPPS34M com
nanopartículas de prata, em torno de 15% do valor inicial. Esta constatação
condiz perfeitamente com o esperado pela teoria descrita por LAKOWICZ,
1999.
1,2
Intensidade de Fluorescência [a.u]
LaPPS34M
1,0
LaPPS34M com Ag
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
740
760
780
800
820
840
860
880
900
Comprimento de Onda [nm]
Figura 30 - Espectro de fluorescência (em preto) do complexo LaPPS34M e o espectro
de fluorescência do LaPPS34M ( em verde) conjugado com nanopartículas de prata
obtido pela FASE I.
73
Fonte: Própria
4.4. TEMPOS DE VIDA DE LUMINESCÊNCIA DO FLUORÓFORO E DO
COMPLEXO LaPPS34M
a) Fluoróforo Cy3
Geralmente para os fluoróforos comerciais os tempos de vida estão em
torno de 10-9 s. O Cy3 tem o tempo de vida de 0.3 ns (HAHN, 2000). A medida
do tempo de vida do fluoróforo comercial Cy3 não foi possível de ser realizada
pela instrumentação construída para a detecção de fluorescência, uma vez que
o sistema de detecção não é capaz de observar eventos tão rápidos em função
da resposta em frequência do circuito optoeletrônico.
b) O complexo LaPPS34M
O complexo LaPPS34M utilizado para estudar a fluorescência permite
uma estabilidade maior e também, como visto anteriormente, possui o tempo
de vida de luminescência em torno de 100 a 1000 µs (BÜNZLI, 1989). A
instrumentação descrita na fase I (seção 3.2) desta dissertação possibilitou a
medida do tempo de vida do complexo e confirmou o dado que consta na
literatura. Na Figura 31 está apresentado o gráfico de decaimento de
fluorescência do complexo LaPPS34M observado com o sistema de aquisição
com a válvula fotomultiplicadora R928 descrita na Figura 13. O tempo de vida
de luminescência obtido é de 110 μs.
74
1,0
Intensidade de Sinal [a.u.]
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
0,0000
0,0002
0,0004
0,0006
0,0008
0,0010
Tempo [s]
Figura 31 - Decaimento de Fluorescência do Complexo LaPPS34M com o uso da válvula
fotomultiplicadora R928 obtido pela FASE I
Fonte: Própria
Para o caso da fase II com o uso de uma válvula fotomultiplicadora
miniatura, conforme descrita na figura 15, o valor do tempo de vida de
luminescência é dado por 109,5 μs, confirmando os dados relatados nas fases I
anterioremente mencionada e também descrito por BÜNZLI, 1989, que o tempo
de vida de luminescência é longo para composto na presença de európio em
sua estrutura molecular. A Figura 32 ilustra o decaimento exponencial de
emissão
de
luminescência
do
indicador
LaPPS34M
pela
válvula
fotomultiplicadora miniatura R5600U-01. O valor do tempo de vida foi obtido
através da composição duas funções exponenciais (tempo de vida de
fluorescência e resposta temporal da Val/vula fotomultiplicadora miniatura).
75
Intensidade Relativa de Sinal [a.u]
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
0,0002
0,0004
0,0006
0,0008
0,0010
Tempo [s]
Figura 32 - Decaimento exponencial de emissão de luminescência do indicador LaPPS34M
pela válvula fotomultiplicadora miniatura R5600U-01 obtido pela FASE II.
Fonte: Própria
A partir da fase III a Erro! Fonte de referência não encontrada. apresenta o
sinal elétrico aplicado ao diodo emissor de luz (led) para excitação do indicador
(linha contínua), o sinal de saída do detector na ausência do fluoróforo (linha
tracejada) e o sinal de luminescência na presença do fluoróforo (linha
contínua). Todos os sinais foram normalizados para apresentarem valor igual a
1 antes do início do decaimento.
76
Figura 33 - Sinal elétrico aplicado ao led para excitação do indicador (linha contínua),
sinal de saída do detector na ausência do fluoróforo (linha tracejada) e sinal de
luminescência na presença do fluoróforo (linha contínua) obtido pela FASE III.
Fonte: Própria
Na Erro! Fonte de referência não encontrada. é possível observar que a
resposta do circuito detector não é tão rápida quanto a que seria observada
utilizando detectores de maior velocidade (e.g., válvula fotomultiplicadora). É
possível observar a resposta temporal referente à luminescência do complexo
LaPPS34M destacada da resposta do sistema sensor na ausência do
complexo. Sabe-se, portanto, que a luminescência desse complexo pode ser
observada por detectores de estado sólido de baixo custo que tenham
sensibilidade aproximada a do fotodetector utilizado (i.e., 0.47A/W para
comprimento de onda de 650nm) mas que tenham uma resposta temporal mais
rápida que a do OPT301 (i.e., típico “rise time” de 90 μs, tempo para transição
de 10% a 90% do sinal).
Após o tratamento dos dados obteve-se o tempo de vida de
fluorescência do complexo LaPPS34M, correspondendo ao valor de 114,5 μs.
A Erro! Fonte de referência não encontrada. apresenta os detalhes dos pontos
amostrados para o decaimento de luminescência e a curva exponencial
ajustada (linha contínua). O valor do tempo de vida foi obtido através da
77
composição duas funções exponenciais (tempo de vida de fluorescência e
resposta temporal do fotodiodo).
Figura 34 - Exponencial de decaimento de emissão de luminescência do indicador
LaPPS34M pelo uso detectores de fotodiodo obtido pela FASE III
Fonte: Própria
Por fim é possível estabelecer que há uma correlação entre os tempos
de vida de luminescência para as três fases estudadas ao longo dessa
dissertação. A Tabela 3 representa os resultados encontrados.
Tabela 3 - Relação entre as fases da pesquisa e os resultados do tempo de vida de
Luminescência
Método de Medição
Tempo de Vida de Luminescência [μs]
FASE I (válvula fotomultiplicadora R928)
110,0
FASE II (válvula fotomultiplicadora R5600U-01)
109,5
FASE III (detector optoeletrônico OPT301)
114,5
Fonte : Própria
78
5.
DISCUSSÃO E CONCLUSÃO
5.1.
INTRODUÇÃO
A detecção usando válvula fotomultiplicadora e fotodiodo possibilitou a
medição de parâmetros para avaliar a utilização de novas moléculas e/ou
complexo em sistemas biológicos ou médicos. A obtenção dos espectros de
absorção, de emissão de fluorescências, de emissão de fluorescências na
presença de nanopartículas e os tempos de vida de luminescência demonstram
que o complexo LaPPS34M assim como o fluoróforo comercial Cy3 possuem
características ópticas necessárias para serem biomarcadores.
5.2. CARACTERIZAÇÃO DE BIOMARCADORES
a) Fluoróforo Cy3
A fase I possibilitou fazer a caracterização de possíveis fluoróforos para
aplicação em sistemas biomédicos e de diagnósticos em saúde. O estudo do
fluoróforo Cy3 e também do complexo LaPPS34M demonstra a necessidade de
obter as características ópticas que são importantes para a utilização de
biomarcadores.
Os espectros de absorção e de emissão do fluoróforo comercial Cy3
demonstram que há um deslocamento de Stokes pequeno, correspondente a
um deslocamento de 20 a 50 nm. Essa variação é muito pequena e dificulta a
detecção quando a instrumentação é de baixa resolução. Adicionalmente, a
proximidade dos espectros de absorção e de emissão dificulta até mesmo
diferenciar o espectro de emissão do diodo utilizado, escolhido para emitir na
região de absorção do marcador, do espectro de fluorescência do fluoróforo
Cy3.
79
Os
espectros
de
fluorescência
do
marcador
conjugado
com
nanopartículas metálicas, sejam elas de prata ou de ouro, sinalizou uma
variável para caracterizar os candidatos a novos fluoróforos. A utilização de
nanopartículas, que pode resultar no aumento de intensidade de fluorescência,
possibilita que o sistema de detecção de fluorescência possa ser mais simples
permitindo que um fotosensor com uma menor sensibilidade seja utilizado.
Pode-se observar que o fluoróforo comercial Cy3 conjugado com nanopartícula
de
ouro
propicia
um
aumento
da
intensidade
de
fluorescência
de
aproximadamente 170% em relação ao espectro de fluorescência na ausência
de nanopartícula.
b) Complexo LaPPS34M
O grande deslocamento de Stokes do complexo LaPPS34M garante
que a absorção e a emissão se darão em regiões distantes do espectro. Essa
variação espectral permite uma precisão do sinal de fluorescência que é
fundamental para sistemas de detecção que utilizam detectores por válvulas
fotomultiplicadoras, válvulas fotomultiplicadoras miniaturas ou fotodiodos. Um
dos erros associados à detecção de fluorescência é o mascaramento do sinal
de
fluorescência
pelo
sinal
advindo
dos
diodos,
impossibilitando
a
confiabilidade na instrumentação desenvolvida.
Outro aspecto verificado no caso do complexo LaPPS34M é o
deslocamento do comprimento de onda de 615 nm para 820 nm na presença
de diferentes solventes conforme observa-se nas figuras 27 (espectro de
fluorescência em tetrahidrofurano) e a figura 30 (espectro na presença de
etanol). Alguns fatores devem ter contribuído para tal mudança, como: a
diluição do complexo em diferentes solventes e a presença de nanopartículas
de prata.
O tempo de vida de luminescência fornece informações que
possibilitam identificar e quantificar o tempo médio que a molécula passa no
estado excitado antes de retornar ao estado fundamental. No caso do
80
fluoróforo comercial Cy3, o tempo de vida de luminescência se encontra em
torno de 0,3 ns, o que representa um tempo de luminescência curto.
No caso do complexo LaPPS34M verificou-se através do gráfico do
tempo de vida de luminescência, demonstrado na figura 31, 32 e 34, que o
tempo de decaimento da amostra varia entre 110 μs ( com o uso de válvula
fotomultiplicadora R928), 109,5 μs ( com o uso da válvula fotomultiplicadora
miniatura R5600U-01) e 114,5 μs (com uso do detector optoeletrônico OPT301)
Esse tempo elevado de luminescência é adequado para aplicações
biomédicas, onde é interessante o uso de moléculas com tempos de vida de
luminescência maiores, caracterizando uma nova classe interessante de
fluoróforos.
5.3. SISTEMAS DE CUSTO REDUZIDO
As fases I, II e III evidenciam a busca por um sistema de detecção de
fluorescência que reduza os custos de aquisição e processamento de dados.
Na fase I o uso da válvula fotomultiplicadora R928 encarece o sistema
proposto, tendo em vista a necessidade futura de se projetar equipamentos de
detecção de fluorescência que sejam compactos e tenha um custo reduzido.
Na fase II com o uso da válvula fotomultiplicadora miniatura R5600U-01 que é
mais barata que a anteriormente mencionada, é possível obter dados
confiáveis com uma redução de custo em torno de 30%. A fase III demonstra a
possibilidade de redução ainda maior dos custos utilizando detectores
optoeletrônicos. Nos três casos o estudo da fluorescência resolvida no tempo,
garante a escolha de um sistema eficiente pra a detecção de fluorescência.
Concluiu-se que a identificação de fluorescência por meio do uso do
complexo LaPPS34M possibilita a indicação da amostra estudada para
aplicações em sistemas biomédicos que necessitem de biomarcadores, pois as
características ópticas relevantes como espectro de absorção e emissão, o
deslocamento de Stokes e o tempo de vida de luminescência apresentam
superioridade nas características ópticas em relação aos fluoróforos comerciais
81
já em uso, como o Cy3. O complexo apresenta características ópticas
importantes para estudos de identificação e quantificação de microorganismos.
Assim, desta maneira, sinalizamos o uso do complexo de európio – LaPPS34M
para utilização nos projetos do Instituto Nacional de Inovação em Saúde
Pública (INDI-Saúde), que se situa no Instituto Carlos Chagas – Curitiba/PR.
5.4. LIMITAÇÕES DO ESTUDO
Um dos fatores limitantes observado neste estudo foi à necessidade de
contornar obstáculos referentes à detecção do sinal de fluorescência utilizando
um equipamento de baixo custo. O sistema utilizado, baseado na válvula
fotomultiplicadora encarece o processo e inviabiliza equipamentos de leitura do
tipo point-of-care.
A necessidade de se testar a emissão de fluorescência para outros
detectores, como fotodiodos, se tornam fundamentais quando estamos
interessados em sistemas de leituras ópticas de baixo custo, e que possam ser
colocados em equipamentos que façam interpretações de diagnósticos nos
locais de atendimento do paciente.
Outra limitação é que os fluoróforos utilizados devem apresentar
grandes deslocamentos de Stokes para que os sistemas de detecção de
fluorescência dos equipamentos possam com precisão distinguir os espectros
de absorção e emissão sem a necessidade de uso de componentes especiais
e de custo elevado.
5.5. TRABALHOS FUTUROS
Os resultados deste estudo sugerem novos trabalhos que incorporem a
necessidade de testar novos complexos, aproveitando que o laboratório de
Polímeros Paulo Scarpa – LaPPS, da Universidade Federal do Paraná, possui
um acervo de complexos e polímeros que podem desempenhar o papel de
82
possíveis biomarcadores, tanto nos processos industriais como em processos
biológicos e médicos. Essa interação entre as instituições faz com que novos
estudos possam ser direcionados na busca de efetivar a participação desses
novos complexos em estudos que priorizem o diagnóstico e tratamento de
doenças.
Salienta-se também que a inserção dessa dissertação nos estudos do
Instituto Nacional de Inovação em Saúde Pública (INDI-Saúde), possibilita
contribuir com novos trabalhos relacionados ao tema e também servir de
alicerce
para
o
desenvolvimento
de
equipamentos
de
detecção
de
fluorescência de baixo custo, condição primordial para o avanço tecnológico do
país visando a independência externa relacionada aos sistemas de
identificação e tratamento de doenças.
83
5.6. PUBLICAÇÕES
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P.M; Turchett D.A.; Akcelrud, L.C. Optical Characterization of the Molecule
Lapps34m for use as a New Fluorophore. Latin America Optics and
Photonics Conference (LAOP), September 27-30, 2010, Recife, Brasil.
2- Oliveira, V. S. ; Araújo, L.M.P; Schneider, F.K.; Bezerra-Jr, A.G. Sistema
para Estudo da Fluorescência de Marcadores para Diagnósticos em
Saúde Pública. I CICPG - I Congresso de Iniciação Científica e PósGraduação, 13 a 16 de setembro de 2010, Florianópolis, Santa Catarina, Brasil.
3- Araújo, L.M.P.; dos Santos, E. A. ; Schneider, F.K.; Branco,G.; Turchett D.A.;
Akcelrud, L.C.; Bezerra-Jr, A.G. Sistema de Detecção de Fluorescência para
Aplicação em Sistemas de Diagnóstico em Saúde. XXII Congresso
Brasileiro de Engenharia Biomédica, 21 a 25 de novembro de 2010, Tiradentes,
MG.
4- Dos Santos, E. A.; Schneider, F.K.; Araújo, L.M.P.; Branco,G.; Simas, A. G.;
Branco,G.; Sistema de Detecção de Fluorescência para Análise de
Complexo Antígeno-Anticorpo com Indicadores Fluorescentes. Seminário
de Iniciação Científica e Tecnológica (SICITE 2010), realizado de 06 a 08 de
Outubro, no Campus de Cornélio Procópio/ UTFPR, Paraná, 2010.
84
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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20194. , December 18, 2007.
ALCANTARA, P.Jr. Espectroscopia Molecular. Departamento de Física,
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Zamora, 1995
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Latin America Optics and Photonics Conference (LAOP), September 27 -30,
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BASSI, A.B.M.S. Conceitos Fundamentais em Espectroscopia .Chemkeys,
2001.
BRANCO, G. Novo Instrumento para Monitorização de O2 Gasoso através
de Fosforescência Resolvida no Tempo. Curitiba, 1997. Dissertação
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Tecnológica do Paraná.
BRASIL. Ação Civil Pública n.º 200500761820, de outubro de 2005, o Juízo
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GO, 10 Julho de 2006.
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92
7. ANEXOS
ANEXO A FLUORÓFOROS INTRÍNSECOS
93
ANEXO B FLUORÓFOROS EXTRÍNSECOS OU
BIOMARCADORES
FLUORESCEÍNA
Rodamina B
94
ANEXO C PRODUÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DAS
NANOPARTÍCULAS
A produção e caracterização das nanoparticulas (NP) se deram por
ablação a laser em meio líquido utilizando alvos metálicos (ULLMANN, 2002).
Os alvos utilizados foram de Au, e Ag. A ablação foi realizada usando a
linha de emissão 1064 nm de um laser Nd:YAG Quantronix Model 117
operando em modo Q-switched, com duração de pulso de 150 ns e taxa de
repetição de 300 Hz. O feixe laser foi guiado para a amostra através de dois
espelhos e focalizado por uma lente de 50 mm de distância focal formando um
spot de 40 µm. Para todos os alvos foi utilizada água bidestilada como meio
liquido. A coluna de água formada sobre a superfície dos alvos era de 2 mm,
exceto para o alvo de ouro onde a coluna era de 3 mm.
A caracterização das partículas foi realizada utilizando as técnicas de
espalhamento dinâmico de luz (DLS) para obtenção da distribuição de tamanho
das partículas, e por absorção linear de luz (UV-VIS) para estudo das
atividades ópticas. O DLS foi realizado com o equipamento BI-200SM ver. 2.0
da Brookhaven utilizando como fonte de luz a emissão de 632.8 nm de um
laser de HeNe com potência de 75 mW máxima. em modo continuo (CW). A
obtenção da distribuição de tamanho foi através do modelo NNLS5.
Os gráficos abaixo representam os resultados dos espectros de
absorção das nanopartículas de ouro e prata, e também a caracterização por
DLS do tamanho das nanopartículas de ouro, que fazendo aproximação para
as nanopartículas de prata o tamanho se mantém constante.
5
O modelo NNLS (Non-Negative Least-Squares) constitui em uma distribuição não negativa
dos mínimos quadrados para mostrar a distribuição do tamanho das nanopartículas, função do
MATLAB, construído por CL Lawson, RJ Hanson, 1974. (LAWSON, 1974)
95
(A)
(B)
(C)
Figura 35 - A) Tamanho das nanopartículas de ouro por DLS, B) Espectro de absorção
das nanopartículas de ouro e C) Espectro de absorção linear para o colóide de prata
Fonte: (SANTOS, 2010)