INCT: Informação
Genético-Sanitária da
Pecuária Brasileira
SÉRIE TÉCNICA:
DOENÇAS
Disponível em www.animal.unb.br em 14/03/2011
Larvae Exsheathment Inhibition
Assay
Edgard Franco Gomes1,2, Helder Louvandini2, Cristiano Barros de
Melo2, Hervé Hoste3, Concepta McManus4
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2
Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, Universidade de Brasília, Brasília, DF,
70910-900
CENA, Universiade de São Paulo, Av. Centenário, 303 CEP: 13400-970, Piracicaba, São
Paulo - Brasil
3
INRA/ENVT, Unite Mixte de Interactions, 23 Chemin de Capelles, 31076, Toulouse, Cedex,
France
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Departmento de Zootecnia, Av. Bento Gonçalves, 7712 - Caixa Postal 15100 - CEP 91540000
O teste LEIA (“Larvae Exsheathment Inhibition Assay”)
(1)
visa testar
a eficácia de diferentes moléculas (compostos purificados) ou Extratos de
Plantas (EP) quanto a sua eficácia em impedir o desembainhamento de
larvas infectantes (L3). Para tal, são utilizadas larvas L3 de Haemonchus
contortus ou de Trichostrongylus colubriformis.
Para a realização do teste, são necessárias larvas L3 (obtidas através
de coprocultura), tubos de ensaio de 15 mL, microtubos de polietileno de 2
mL, solução tampão fosfato-salino (PBS), lâminas de vidro, lamínulas,
metanol e solução de hipoclorito de sódio a 2%. Utilizam-se compostos ou
EP em que se suspeita de sua ação anti-helmíntica.
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O teste consiste no preparo de quatro repetições com diferentes
concentrações dos compostos ou dos EP. No caso dos compostos, as
concentrações são: 0,001 M, 0,0005 M, 0,00025 M e 0,000125 M. No caso
de EP, são feitas as seguintes concentrações: 1200 µg/mL, 600 µg/mL, 300
µg/mL e 150 µg/mL. Além destes, é necessário um controle negativo
contendo apenas solução de PBS para verificar se as larvas estão
desembainhando normalmente. Deve-se conhecer a Massa Molar de cada
composto para o preparo de Solução Estoque (SE). A SE tem concentração
igual ao dobro da maior concentração desejada, ou seja, 0,002 M (no caso
dos compostos) e 2400 µg/mL (no caso de EP). São necessários 2 mL de SE
para que o teste seja rodado. Assim, através de diluições posteriores,
podem-se obter todas as concentrações desejadas. Em cada repetição e
também no controle, a proporção solução testada:solução de larvas foi de
1:1.
Os cálculos para o preparo da SE devem seguir os seguintes passos:
•
calcular a massa de molar composto necessária para o preparo de
solução com concentração 0,002 M, ou a massa de EP necessária
para concentração de 2400 µg/mL, utilizando uma balança de
precisão;
•
calcular o volume de PBS que se deve adicionar à quantidade de
massa do passo anterior;
•
calcular o valor de metanol que será utilizado, sendo que este será de
2% do volume de PBS calculado anteriormente, ou 200 µL de
metanol para cada 10 mL de PBS;
•
calcular o novo valor de volume de PBS a ser adicionado, diminuindo
do valor previamente obtido o valor calculado para o metanol.
O Exemplo 1 mostra o cálculo para o composto Quercetagetin.
Exemplo 1. Cálculos para o preparo de 2 mL de Solução Estoque a 0,002 M
do composto Quercetagetin.
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Massa Molar: 318,24 g/mol
318,24 g ------- 1 M
X ----------- 0,002 M
X = 0,63648 g (para 1 L de solução); para 1 mL...
0,62648 g ------- 1000 mL
X ------------ 1 mL
X = 0,00062648 g ou 0,62648 mg;
Para 2 mL de solução...
0,62648 mg x 2 = 1,27 mg deve-se adicionar 2 mL de PBS para essa
quantidade de composto.
Entretanto, mesmo se utilizando balança de precisão, é difícil mensurar
exatamente o referido valor. Iremos supor que o valor mensurado foi 1,5
mg de Quercetagetin.
Deve-se, portanto, corrigir o valor de PBS que irá se utilizar, visando
manter a concentração de 0,002 M.
1,27 mg ------- 2 mL de PBS
1,5 mg ---------
X
X = 2,36 mL de PBS;
Deve-se agora calcular o volume de Metanol que será adicionado...
200 µL de Metanol ------- 10 mL de PBS
X --------------------- 2,36 mL de PBS
X = 47,2 µL de Metanol;
Deve-se nesse momento calcular o Novo Volume de PBS (NVPBS) que
deverá ser adicionado, visando manter a solução com concentração igual a
0,002 M.
NVPBS = Volume0 PBS – Volume de Metanol
NVPBSQuercetagetin = 2,36 mLPBS – 0,0472 mLMetanol = 2,3128 mL;
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Para o preparo da SE a 0,002 M ou 2400 µg/mL, deve-se adicionar ao
tubo de ensaio o composto a ser analisado, pesado previamente em balança
de precisão. Em seguida, adicionar o metanol na proporção de 2 µL de
metanol para cada 100 µL de PBS, fazendo as devidas correções
matemáticas com relação à massa do composto, visando manter a
concentração final da solução em 0,002 M ou 2400 µg/mL. Agitar o tubo,
visando diluir o composto no metanol. Em seguida, adicionar o volume de
PBS calculado previamente.
De posse da SE pronta, deve-se separar cinco tubos de ensaio de 15
mL e devidamente identificado-los (Figura 1). Nos tubos destinados às
concentrações de 0,001 M ou 1200 µg/mL e 0,0005 M ou 600 µg/mL devese adicionar 1 mL de SE (Figura 2 - B). O tubo de maior concentração deve
ser reservado por um tempo. Ao tubo de concentração de 0,0005 M ou 600
µg/mL deve-se adicionar 1 mL de PBS e agitar o conteúdo (Figura 2 - C).
Um mililitro dessa nova solução deve ser adicionado ao tubo destinado à
concentração de 0,00025 M ou 300 µg/mL (Figura 2 - D). Nesse tubo,
adicionar 1 mL de PBS e agitar o conteúdo (Figura 2 - E). Realizar o mesmo
procedimento, retirando 1 mL da nova solução e o adicionar ao tubo
destinado à 0,000125 M ou 150 µg/mL (Figura 2 - F). Adicionar 1 mL de
PBS ao tubo destinado a concentração de 0,000125 M ou 150µg/mL (Figura
2 - G). Desse último tubo, após agitação, retirar 1 mL de solução e
descartar (Figura 2 - H). Ao tubo controle, adicionar apenas 1 mL de PBS
(Figura 2 - I).
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Figura 1 - Tubos de ensaio com diferentes concentrações e grupo controle.
Fonte: Arquivo Pessoal.
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Figura 2 – Desenho esquemático para obtenção das diluições. (A) Cinco
tubos vazios. (B) Adição de 1 mL de Solução Estoque aos dois primeiros
tubos. (C) Adição de 1 mL de PBS ao segundo tubo. (D) Passagem de 1 mL
de solução do segundo tubo para o terceiro tubo. (E) Adição de 1 mL de
PBS ao terceiro tubo. (F) Passagem de 1 mL de solução do terceiro para o
quarto tubo. (G) Adição de 1 mL de PBS ao quarto tubo. (H) Descarte de 1
mL de solução do quarto tubo. (I) Adição de 1 mL de PBS ao quinto tubo.
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(J) Adição de 1 mL de Solução de Larvas à todos os tubos. Fonte: Arquivo
Pessoal.
A cada tubo deve ser adicionado 1 mL de solução de L3 com
concentração de 1000 larvas/mL (Figura 2 - J). Assim, por conta da adição
de 1 mL de solução de larvas, todos os tubos atingem a concentração
desejada (0,001 M, 0,0005 M, 0,00025 M e 0,000125 M). Assim, cada tubo
de ensaio contém 2 mL de solução. Os tubos devem seguir para estufa a
23oC por três horas. A cada hora passada, os tubos devem ser agitados.
Após três horas passadas, os tubos devem ser submetidos à
centrifugação e lavagem. Cada centrifugação é feita a 1000 RPM e 20 oC,
com duração de três minutos cada. Nas lavagens, retirar 1 mL do
sobrenadante de cada tubo e repor com 1 mL de PBS. Fazer uma
centrifugação intercalada por uma lavagem, três vezes. Depois, centrifugar
uma quarta e apenas retirar 1 mL do sobrenadante de cada tubo de ensaio,
sem adicionar PBS. Assim, cada tubo contém 1 mL de Solução Final (SF).
Separar quatro microtubos de polietileno para cada concentração a
ser analisada. Em cada um deles, foi adicionar 200 µL de SF de sua
respectiva concentração e foram devidamente identificados (Figura 3).
Figura 3 – Microtubos de polietileno separados para cada concentração de
Solução Final. Fonte: Arquivo Pessoal.
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Após isso, preparar a Solução de Desembainhamento (SD). Esta
consiste na adição de 40 µL de hipoclorito de sódio à 2% em 5,96 mL de
PBS (1:149). A função da SD é propulsionar o desembainhamento artificial
das L3.
Para cada repetição de cada concentração realizar quatro leituras ao
microscópio
óptico,
com
intervalos
de
20
minutos
marcados
por
cronômetro, totalizando assim uma hora de duração do teste. Para se fazer
a leitura, as lâminas de vidro devem ser organizadas e devidamente
identificadas (Figura 4); para a primeira leitura, colocar 50 µL de SF em
lâmina de vidro, colocar a lamínula e, por cerca de dois segundos, submeter
a lamina a estresse térmico, com auxílio de palito de fósforo, na parte
inferior da mesma. Esse procedimento visa que as larvas fiquem imóveis
(Figura 4).
Figura 4 – Lâminas de vidro preparadas para leitura no microscópio óptico.
As lâminas de cor preta passaram por estresse térmico. Fonte: Arquivo
Pessoal.
Logo após ter retirar a primeira amostra, adicionar 150 µL de SD a
cada microtubo, visando assim iniciar o desembainhamento artificial. As
três leituras seguintes seguem de modo igual à primeira: colocar 50 µL da
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nova solução (SF com 150 µL de SD) nas lâminas de vidro, em seguida as
lamínulas e o estresse térmico.
As leituras são realizadas em microscópio óptico à magnitude 10x. A
cada leitura e com auxílio do contador, identificar e diferenciar as larvas L3
(Figura 5) das larvas L4 (Figura 6). Os valores para cada categoria devem
ser anotados em tabelas para posterior tabulação e análise.
Figura 5 – Larva L3 de Haemonchus contortus, com a respectiva bainha
revestindo-a. Microscópio óptico à magnitude 10x. Fonte: Arquivo Pessoal.
Figura 6 – Larva L4 de Haemonchus contortus, se desembainhando, com a
bainha na parte direita da figura. Microscópio óptico à magnitude 10x.
Fonte: Arquivo Pessoal.
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Bibliografia:
JACKSON, F. and HOSTE, H. In Vitro Methods for the Primary Screening of
Plant
Products
for
Direct
Activity
Against
Ruminant
Gastrointestinal
Nematodes. P. E. VERCOE, et al. in vitro screening of plant resources for
extra-nutritional attributes in ruminants. s.l. : Springer, 2010, 3, pp. 25-45.
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