UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE TECNOLOGIA
DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA QUÍMICA
TESE DE DOUTORADO
MICROPARTÍCULAS DE QUITOSANA
ESTRUTURADAS COM AEROSIL®:
ESTABILIDADE, ADSORÇÃO, ENCAPSULAÇÃO E
LIBERAÇÃO DE SUBSTÂNCIAS ATIVAS
Bento Pereira da Costa Neto
Orientadora: Profª Drª Ana Lúcia de M L da Mata – PPGEQ/UFRN
Coorientadora: Drª Maria Inês Ré – IPT/SP/ École des Mines d'Albi-Carmaux
(EMAC- França)
Natal/RN
Maio/2014
BENTO PEREIRA DA COSTA NETO
MICROPARTÍCULAS DE QUITOSANA
ESTRUTURADAS COM AEROSIL®:
ESTABILIDADE, ADSORÇÃO, ENCAPSULAÇÃO E
LIBERAÇÃO DE SUBSTANCIAS ATIVAS
Tese de doutorado apresentada ao
Programa
de
Pós-graduação
em
Engenharia Química – PPGEQ, da
Universidade Federal do Rio Grande de
Norte – UFRN, como parte dos
requisitos necessários à obtenção do
título de Doutor em Engenharia
Química, sob a orientação da Profa. Dra.
Ana Lúcia de Medeiros Lula da Mata e
coorientação da Dra. Maria Inês Ré.
Natal/RN
Maio/2014
Catalogação da Publicação na Fonte.
UFRN / CT / DEQ
Biblioteca Setorial “Professor Horácio Nícolás Sólimo”.
Costa Neto, Bento Pereira da.
Micropartículas de quitosana estruturadas com aerosil®: estabilidade, adsorção,
encapsulação e liberação de substâncias ativas / Bento Pereira da Costa Neto. Natal, 2014.
164 f.: il.
Orientador: Ana Lúcia de Medeiros Lula da Mata.
Coorientador: Maria Inês Ré.
Tese (Doutorado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de
Tecnologia. Departamento de Engenharia Química. Programa de Pós-graduação em
Engenharia Química.
1. Quitosana - Tese. 2. Polissacarídeos - Tese. 3. Nanocompósitos - Tese. 4.
Sílica - Tese. I. Mata, Ana Lúcia de Medeiros Lula da. II. Ré, Maria Inês. III.
Universidade Federal do Rio Grande do Norte. IV. Título.
RN/UF
CDU 547.995(043.2)
COSTA NETO, Bento Pereira da - Micropartículas de quitosana estruturadas com
aerosil®: estabilidade, adsorção, encapsulação e liberação de substancias ativas. Tese de
Doutorado, UFRN, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química. Área de
Concentração: Engenharia Química. Subárea de concentração: Secagem. Natal/RN,
Brasil.
Orientadora: Profª Drª Ana Lúcia de Medeiros Lula da Mata – PPGEQ/UFRN.
Coorientadora: Drª Maria Inês Ré – IPT/SP/ École des Mines d'Albi-Carmaux.
Resumo: Micropartículas biodegradáveis são utilizadas como sistemas de liberação
controlada de fármacos e estão em constante desenvolvimento e aperfeiçoamento.
Quitosana representa uma alternativa interessante de biomaterial devido às suas
características físico-químicas e biológicas. Micropartículas de quitosana apresentam-se
como sistemas promissores para carreamento e liberação controlada de fármacos e
vacinas principalmente por vias não invasivas de administração como as vias de
mucosa. O controle da velocidade e da capacidade de intumescimento destes sistemas
em meio ácido são os principais fatores limitantes que precisam ser superados para que
micropartículas de quitosana possam ter todo o seu potencial de aplicação explorado no
campo farmacêutico. Existem muitos estudos referentes a modificações da estrutura de
micropartículas de quitosana através de técnicas diversas (reticulação química, blendas
com outros polímeros, síntese de novos materiais híbridos orgânico-inorgânico) com a
finalidade de modificar estas propriedades que comprometem o uso da quitosana no
desenvolvimento de sistemas de liberação controlada. A proposta deste trabalho foi de
conceber e desenvolver um novo tipo de veículo para liberação controlada à base de
quitosana. Nanopartículas de sílica (Aerosil) foram incorporadas à uma solução de
quitosana para gerar micropartículas de quitosana nanoestruturadas com sílica à partir
da evaporação do solvente (água) através de um processo de secagem por spray drying.
As micropartículas obtidas foram caracterizadas através de espetroscopia infravermelho,
difração de raios X, calorimetria diferencial de varredura, análise termogravimétrica,
microscopia eletrônica de varredura e microscopia eletrônica de transmissão foram
utilizadas para caracterizar as micropartículas. Também foram avaliadas a estabilidade
ácida, capacidade de sorção de umidade, propriedades de liberação e ensaios biológicos.
As micropartículas nanoestruturadas com sílica hidrofóbica (Aerosil® R972)
apresentaram maior degradação térmica, menor afinidade de água, melhor estabilidade
ácida e capacidade de retardar liberação da rifampicina e cloridrato de propranolol
(modelos
de
drogas)
em
condições
fisiológicas
simuladas.
Estudos
de
biocompatibilidade in vitro indicaram baixa citotoxicidade e baixa capacidade de ativar
a produção de óxido nítrico das células, sendo compatível com uma baixa ação próinflamatória. Os resultados obtidos encorajaram estudos complementares sobre a
utilização das micropartículas de quitosana nanoestruturadas com Aerosil® como
sistemas carreadores de fármacos por via oral ou nasal.
Palavras-chave: Quitosana, spray drying, nanocompósitos, liberação controlada.
ABSTRACT
Biodegradable microspheres used as controlled release systems are important in
pharmaceutics. Chitosan biopolymer represents an attractive biomaterial alternative
because of its physicochemical and biological characteristics. Chitosan microspheres are
expected to become promising carrier systems for drug and vaccine delivery, especially
for non-invasive ways oral, mucosal and transdermal routes. Controlling the swelling
rate and swelling capacity of the hydrogel and improving the fragile nature of
microspheres under acidic conditions are the key challenges that need to be overcomed
in order to enable the exploration of the full pharmaceutical potential use of these
microparticles. Many studies have focused on the modification of chitosan microsphere
structures with cross-linkers, various polymers blends and new organic-inorganic hybrid
systems in order to obtain improved properties. In this work, microspheres made of
chitosan and nanosized hydrophobic silica (Aerosil R972) were produced by a method
consisting of two steps. First, a preparation of a macroscopically homogeneous
chitosan-hydrophobic silica dispersion was prepared followed by spray drying. FTIR
spectroscopy, X-ray powder diffraction, differential scanning calorimetry, thermal
gravimetric analysis, scanning electron microscopy (SEM) and high-resolution
transmission electron microscopy (TEM) were used to characterize the microspheres.
Also, the were conducted acid stability, moisture sorption capacity, release properties
and biological assays.
The chitosan-hydrophobic silica composite microspheres showed improved thermal
degradation, lower water affinity, better acid stability and ability to retard rifampicin
and propranolol hydrochloride (drug models) release under simulated physiological
conditions.
In vitro biocompatibility studies indicated low cytotoxicity and low
capacity to activate cell production of the pro-inflammatory mediator nitric oxide. The
results show here encourage further studies on the use of the new chitosan-hydrophobic
silica composite microspheres as drug carrier systems via oral or nasal routes.
Key-words: Chitosan, spray drying, nanocomposite, drug delivery
AGRADECIMENTOS
A minha Coorientadora, Maria Inês Ré, pela paciência, apoio, oportunidade e
suporte para meu crescimento científico, permanente dedicação e disponibilidade para
me orientar neste trabalho.
A minha orientadora, Dra. Ana Lúcia, pela oportunidade oferecida, por suas
orientações acadêmicas e pelos valorosos ensinamentos.
A minha esposa, Gidyonne, pelo companheirismo, paciência, orações, pelas
muitas madrugadas mal dormidas sempre ao meu lado, estendendo a mão.
A Professora Dra. Bartira Rossi Bergmann (UFRJ) pela realização dos ensaios
biológicos.
Aos amigos do Instituto de Pesquisas Tecnológicas do Estado de São Paulo,
Adriano Marim, Kleber Lanigra e David Freitas pelas contribuições neste trabalho.
Ao IPT pela oportunidade de realizar os ensaios experimentais no Laboratório
de Processos Químicos e Tecnologia de Partículas.
Ao Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química pela oportunidade de
melhorar minha qualificação profissional.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq, pelo
apoio financeiro concedido para a realização deste trabalho.
A todos que de alguma forma contribuíram para o desenvolvimento deste
trabalho, expresso minha sincera gratidão.
Sumário
Capitulo 1. Introdução..................................................................................................01
Capitulo 2. Revisão bibliográfica.................................................................................05
2.1. Microestruturas de encapsulação de princípios ativos.........................................06
2.2. Quitosana.............................................................................................................07
2.2.1. Características.....................................................................................07
2.2.2. Micropartículas de quitosana..............................................................09
2.3. Preparação de micropartículas de quitosana .......................................................10
2.4. Alteração das propriedades da quitosana.............................................................14
2.4.1. Reticulação da quitosana.....................................................................15
2.4.1.1.
Reticulação química.........................................................15
2.4.1.2.
Reticulação física.............................................................16
2.5. Considerações gerais sobre a sílica......................................................................21
2.6. Propriedades de encapsulação, de proteção, de adsorção e de liberação de
substâncias ativas .................................................................................................24
2.6.1. Encapsulação e liberação de princípios ativos....................................25
2.6.2. Dissolução ou liberação do fármaco de formas farmacêuticas
sólidas..................................................................................................29
2.6.3. Modelos matemáticos no estudo do perfil de dissolução....................32
2.6.4. Princípios
ativos
utilizados
-
cloridrato
de
propranolol
e
rifampicina..........................................................................................33
2.6.5. Estudo de estabilidade de princípios ativos.........................................35
2.6.5.1.
Manitol.............................................................................37
2.7. Propriedades adsorventes.....................................................................................39
2.7.1. Adsorção de proteína...........................................................................41
2.8. Ensaios biológicos...............................................................................................44
Capitulo 3. Preparação e caracterização de micropartículas de quitosana
nanoestruturadas com sílica.........................................................................................45
3.1.Metodologia experimental.........................................................................................46
3.1.1.Dispersão das sílicas Aerosil R972 e Aerosil 200 na solução de
quitosana.......................................................................................................47
3.1.2. Determinação do ângulo de contato entre Aerosil R972 e mistura água-etanol
(gota séssil)...................................................................................................47
3.1.3. Medida da viscosidade das suspensões de quitosana e sílica.........................48
3.1.4. Secagem das dispersões de quitosana e sílica por spray drying.....................48
3.1.4.1. Ensaios preliminares..........................................................................48
3.1.4.2. Produção de micropartículas de quitosana-sílica...............................49
3.1.5. Caracterização das micropartículas................................................................50
3.1.5.1. Granulometria....................................................................................51
3.1.5.2. Densidade aparente............................................................................51
3.1.5.3. Diâmetro aerodinâmico......................................................................51
3.1.5.4. Área especifica...................................................................................52
3.1.5.5. Microscopia eletrônica de varredura e de transmissão......................52
3.1.5.6. Carga superficial-potencial zeta.........................................................52
3.1.5.7. Teor de umidade.................................................................................52
3.1.5.8. Análise termogravimétrica.................................................................52
3.1.5.9. Calorimetria diferencial de varredura................................................53
3.1.5.10. Difratometria de raios X..................................................................53
3.1.5.11. Sorção dinâmica de vapor................................................................53
3.1.5.12. Caracterização biológica..................................................................54
3.1.5.12.1. Produção de óxido nítrico por macrófagos..........................54
3.1.5.12.2. Citotoxicidade......................................................................55
3.2. Resultados e discussão..............................................................................................56
3.2.1. Dispersão das sílicas na solução de quitosana.............................................56
3.2.1.1. Definição do procedimento de dispersão da sílica Aerosil 200.........56
3.2.1.2. Determinação do ângulo de contato entre Aerosil R972 e uma mistura
água-etanol (gota séssil)......................................................................58
3.2.1.3. Definição do tempo de homogeneização em HAP...........................59
3.2.2. Efeito da sílica na viscosidade das suspensões de quitosana.......................59
3.2.3. Secagem das suspensões de quitosana nanoestruturadas com sílica por spray
drying: definição das condições de processo.............................................60
3.2.4. Micropartículas de quitosana nanoestruturadas com sílica Aerosil 200:
produção e caracterização físico-química..............................................................62
3.2.4.1.Caracterização física....................................................................62
3.2.4.2.Propriedades térmicas..................................................................65
3.2.4.3. Caracterização estrutural micropartículas...................................70
3.2.4.3.1. Difração de Raios-X.....................................................70
3.2.4.3.2. Espectroscopia no infravermelho por transformada de
Fourier..........................................................................................72
3.2.4.4. Estudo de sorção dinâmica de vapor...........................................75
3.2.4.5. Ensaios biológicos preliminares com micropartículas
nanoestruturadas com Aerosil 200 e Aerosil R972..................................76
3.3. Conclusões parciais..................................................................................................78
Capitulo 4. Estudos de estabilidade de micropartículas nanoestruturadas
temperatura....................................................................................................................79
4.1. Metodologia Experimental.......................................................................................80
4.1.1. Estudo de estabilidade física das micropartículas nanoestruturadas com
sílica em meio ácido............................................................................................80
4.1.2. Estudo da estabilidade de manitol encapsulado nas micropartículas
nanoestruturadas com sílica quando exposto a condições de estresse de umidade
e temperatura ......................................................................................................81
4.1.2.1. Produção de
micropartículas de
quitosana, manitol
e
sílicas........................................................................................................81
4.1.2.3. Estocagem em condições controladas de temperatura e
umidade....................................................................................................83
4.1.2.4. Análise de DRX..........................................................................83
4.1.2.5. Teste de contato das micropartículas de quitosana e de
micropartículas nanoestruturadas com Aerosil® R972 com atmosfera
úmida
(vapor
d’agua)
em
microscópio
eletrônico
de
varredura..................................................................................................83
4.2. Resultados e discussão..............................................................................................85
4.2.1.Estudo de estabilidade física das micropartículas nanoestruturadas com
sílica em meio ácido........................................................................................................85
4.2.1.1. Micropartículas nanoestruturadas com Aerosil®........................85
4.2.2. Estudo da estabilidade de manitol encapsulado nas micropartículas
nanoestruturadas com sílica quando exposto a condições de estresse de umidade
e temperatura ......................................................................................................87
4.2.2.1. Efeito da secagem na estrutura cristalina do manitol..................87
4.2.2.2. Efeito da exposição das micropartículas a condições de estresse
de umidade e temperatura........................................................................88
4.2.2.2.1.Manitol..........................................................................88
4.2.2.2.2.Micropartículas
de
quitosana,
quitosana
nanoestruturadas com sílica, Aerosil® 200, Aerosil® R972 (sem
manitol)........................................................................................88
4.2.2.2.3.Micropartículas
nanoestruturadas
de
com
quitosana,
quitosana
Aerosil®,
(com
manitol)........................................................................................90
4.2.2.2.4. Teste de contato das micropartículas de quitosana e de
micropartículas nanoestruturadas com Aerosil® R972 com
atmosfera úmida (vapor d’agua) em microscópio eletrônico de
varredura ambiental......................................................................90
4.3. Conclusões parciais..................................................................................................92
Capitulo 5. Micropartículas de quitosana nanoestruturadas com sílica Aerosil 200
e sílica Aerosil R972 como matrizes de encapsulação e liberação de princípios
ativos de interesse farmacêutico...................................................................................93
5.1. Metodologia experimental........................................................................................94
5.1.1 Produção de micropartículas de quitosana nanoestruturadas com sílica
como matrizes de encapsulação...........................................................................94
5.1.1.1. Encapsulação de cloridrato de propranolol.................................94
5.1.1.2 Encapsulação de rifampicina.......................................................95
5.1.2.Caracterização das micropartículas contendo ativos..................................96
5.1.2.1.Granulometria..............................................................................96
5.1.2.2.Morfologia....................................................................................96
5.1.2.3.Análise do estado sólido por difração de raios-x e calorimetria
diferencial de varredura............................................................................96
5.1.2.4. Eficiência de encapsulação.........................................................97
5.1.2.5. Avaliação do perfil de liberação in vitro.....................................97
5.1.2.5.1. Cloridrato de propranolol.............................................97
5.1.2.5.2. Rifampicina..................................................................98
5.1.2.5.3. Modelo cinético............................................................98
5.2. Resultados e discussão..............................................................................................99
5.2.1. Características das micropartículas............................................................99
5.2.1.1. Granulometria, morfologia e eficiência de encapsulação...........99
5.2.1.2. Análise do estado sólido por difratometria de raios-x e
calorimetria exploratória diferencial..................................................................102
5.2.1.2.1.Difração de raios –X...................................................102
5.2.1.2.2.Calorimetria exploratória diferencial..........................104
5.2.1.3. Avaliação do perfil de liberação dos ativos in vitro..................106
5.2.1.4. Modelos matemáticos...............................................................107
5.3. Conclusões parciais................................................................................................109
Capitulo 6. Capacidade de adsorção e dessorção de uma proteína (albumina de
soro bovina) pelas
micropartículas de
quitosana nanoestruturadas com
sílica...............................................................................................................................110
6.1. Metodologia experimental......................................................................................111
6.1.1 Capacidade de adsorção de BSA em função do pH da solução tampão...111
6.1.2.Capacidade de adsorção em função da concentração de BSA..................111
6.1.3. Estudo cinético da adsorção da BSA.......................................................112
6.1.4. Medida do potencial zeta em função da quantidade de proteína BSA
adsorvida............................................................................................................112
6.1.5. Estudo da dessorção da BSA...................................................................113
6.1.6.Caracterização das micropartículas contendo BSA..................................113
6.1.6.1. Análise granulométrica............................................................113
6.1.6.2.Espectrofotometria no infravermelho por transformada de
fourier.....................................................................................................114
6.2. Resultados e discussão............................................................................................115
6.2.1.Capacidade
de
adsorção
de
BSA
em
função
do
pH.......................................................................................................................115
6.2.2. Capacidade de adsorção em função da concentração de BSA.................116
6.2.3.Velocidade de adsorção das proteínas......................................................118
6.2.4. Relação entre quantidade de BSA adsorvida e potencial zeta das
micropartículas...................................................................................................119
6.2.5. Estudo de dessorção da BSA...................................................................121
6.2.6. Análise granulométrica............................................................................124
6.2.7. Espectrofotometria no infravermelho por transformada de Fourier........124
6.3. Conclusões parciais................................................................................................126
Capitulo 7. Conclusão geral e perspectivas...............................................................127
Referências...................................................................................................................131
Anexo............................................................................................................................161
Publicações...................................................................................................................164
Lista de Figuras
Figura 2.1. Representação de cápsulas e esferas: a) fármaco dissolvido no núcleo
oleoso; b) fármaco adsorvido à parede polimérica; c) fármaco retido na matriz
polimérica; d) fármaco adsorvido ou disperso molecularmente na matriz polimérica
(Schaffazick et al., 2003).................................................................................................06
Figura 2.2. Estrutura química da quitosana.....................................................................08
Figura 2.3. Representação esquemática do funcionamento do equipamento “spray
dryer” (Ré, 2006).............................................................................................................11
Figura 2.4. Representação esquemática do número de Peclet.........................................12
Figura 2.5. Reação de formação da sílica pelo processo sol-gel.....................................21
Figura 2.6. Reação de formação da sílica pelo processo em fase de vapor.....................22
Figura 2.7. Diagrama apresentando possíveis arranjos de grupos silanóis e siloxanos na
superfície da sílica fumegada (Zuravlev, 2000)..............................................................23
Figura 2.8. Tratamento de sílica fumegada hidrofóbica (adaptado de Jonat,
2005)................................................................................................................................24
Figura 2.9. Processos de encapsulação do ibuprofeno e recobrimento da sílica
mesoporosa por quitosana (adaptado de Chen & Zhu, 2012)..........................................27
Figura 2.10. Processos de liberação do ibuprofeno nos diferentes pHs (adaptado de
Chen & Zhu, 2012)..........................................................................................................27
Figura 2.11. Fórmula molecular do cloridrato de propranolol........................................33
Figura 2.12. Estrutura molecular da rifampicina.............................................................34
Figura 2.13. Estrutura química do manitol......................................................................37
Figura 2.14. Difratogramas do α Manitol, β Manitol e δ Manitol...................................38
Figura 3.1. Fluxograma de obtenção das micropartículas de quitosana-sílica................46
Figura 3.2. Representação esquemática da medida do ângulo de contato líquido-sólido
em função da concentração do etanol na solução água/etanol em uma pastilha de Aerosil
R972.................................................................................................................................48
Figura 3.3. Secador tipo Spray Dryer Büchi B 190. Fonte: arquivo pessoal, 2013.........49
Figura 3.4. Esquema de um sistema de sorção dinâmica de vapor (Goalard, 2005).......54
Figura 3.5. Diâmetro das partículas de sílica Aerosil 200 em função do tempo de
dispersão em HAP...........................................................................................................57
Figura 3.6. Microfotografias (MEV) de partículas de quitosana nanoestruturadas com
sílica: a) sílica Aerosil 200 introduzida na solução de quitosana sem dispersão; b) sílica
Aerosil 200 dispersa na solução de quitosana em homogeneizador de alta pressão
(HAP)...............................................................................................................................57
Figura 3.7. Variação do ângulo de contato entre sílica Aerosil R972 e solução
água/etanol em função da concentração do etanol..........................................................58
Figura 3.8. Diâmetro das partículas de sílica Aerosil R972 em função do tempo de
dispersão em HAP (homogeneização a 800 bar).............................................................59
Figura 3.9. Influência da concentração de sílica sobre a viscosidade da solução aquosa
de quitosana.....................................................................................................................60
Figura 3.10. Micrografias (microscopia eletrônica de varredura) dos produtos secos
gerados por spray drying. A e B: F1; C e D: Fi4; E e F: Fo4..........................................64
Figura 3.11. Micrografias (microscopia eletrônica de transmissão) do produto seco
gerado por spray drying: Fi4:A e B; Fo4:C e D.............................................................65
Figura 3.12. Potencial zeta das micropartículas de quitosana, micropartículas
compósitas de quitosana e Aerosil R972 e Aerosil 200 em função do pH......................66
Figura 3.13. Potencial zeta das micropartículas de quitosana, micropartículas
compósitas de quitosana e Aerosil R972 e Aerosil R972 em função do pH...................66
Figura 3.14. Termogramas de TG das micropartículas com diferentes concentrações de
Aerosil 200: (a) F1, (b) Fi2 (16,5%), (c) Fi3 (31,7%), (d) Fi4 (46%), (e) Aerosil
200...................................................................................................................................67
Figura 3.15. Termogramas de TG das micropartículas com diferentes concentrações de
Aerosil R972: (a) F1, (b) Fo2 (21.5%), (c) Fo3 (39.9%), (d) Fo4 (58.1%), (e) Aerosil
R972.................................................................................................................................68
Figura 3.16. Termogramas de DSC das micropartículas com diferentes concentrações de
Aerosil 200: (a) F1, (b) Fi2, (c) Fi3, (d) Fi4, (e) Aerosil 200..........................................69
Figura 3.17. Termogramas de DSC das micropartículas com diferentes concentrações de
Aerosil R972: (a) F1, (b) Fo2 (21.5%), (c) Fo3 (39.9%), (d) Fo4 (58.1%), (e) Aerosil
R972.................................................................................................................................70
Figura 3.18. Difratogramas de raios X das micropartículas com diferentes concentrações
de Aerosil 200: (a) F1, (b) Fi2, (c) Fi3, (d) Fi4, (e) Aerosil 200.....................................71
Figura 3.19. Difratogramas das micropartículas com diferentes concentrações de Aerosil
R972: (a) F1, (b) Fo2 (21.5%), (c) Fo3 (39.9%), (d) Fo4 (58.1%), (e) Aerosil
R972.................................................................................................................................72
Figura 3.20. Espectro FTIR das micropartículas com diferentes concentrações de
Aerosil 200: (a) F1, (b) Fi2, (c) Fi3, (d) Fi4, (e) Aerosil 200..........................................73
Figura 3.21. Espectro FTIR das micropartículas com diferentes concentrações de
Aerosil R972: (a) F1, (b) Fo2 (21.5%), (c) Fo3 (39.9%), (d) Fo4 (58.1%), (e) Aerosil
R972.................................................................................................................................74
Figura 3.22. Isotermas de sorção de umidade das micropartículas com diferentes
concentrações de Aerosil R972.......................................................................................75
Figura 3.23. Isotermas de sorção de umidade das micropartículas com uma
concentração de Aerosil 200 de 58% (em massa) nas micropartículas quitosanasílica.................................................................................................................................76
Figura 3.24. Falta de estimulação da produção de óxido nítrico por macrófagos...........77
Figura 3.25 A citotoxicidade de macrófagos...................................................................77
Figura 4.1. Esquema do protocolo experimental para medida da estabilidade das
micropartículas nanoestruturadas em meio ácido............................................................81
Figura 4.2. Efeito do teor de sílica na estabilidade em meio ácido das micropartículas de
quitosana nanoestruturadas..............................................................................................86
Figura 4.3. Difratograma do manitol: (a) Manitol; (b) Manitol obtido via spray
drying...............................................................................................................................87
Figura 4.4. Difratograma do manitol no início do estudo (T0) e após os 180 dias de
exposição (T180).............................................................................................................88
Figura 4.5. Difratogramas das formulações no início do estudo de estabilidade acelerada
indicado pelo número 1 e no final dos 180 dias indicado pelo número 2. (a)
Micropartículas de quitosana; (b)Aerosil® R972; (c)Aerosil® 200...............................89
Figura 4.6. Difratogramas das formulações no início do estudo de estabilidade acelerada
indicado pelo número 1 e no final dos 180 dias indicado pelo número 2. (a)
Micropartícula nanoestruturada com Aerosil® R972; (b) micropartícula nanoestruturada
com Aerosil® 200............................................................................................................89
Figura 4.7. Difratogramas das formulações no início do estudo de estabilidade acelerada
indicado pelo número 1 e no final dos 180 dias indicado pelo número 2. (a) Formulação
Fm3; (b) Formulação Fm2; (c) Formulação Fm1............................................................90
Figura 4.8. Microscopias das micropartículas de quitosana e de micropartículas
nanoestruturadas com Aerosil® R972 em atmosfera úmida...........................................91
Figura 5.1. Imagens MEV de micropartículas de quitosana e sílica contendo cloridrato
de propranolol................................................................................................................101
Figura 5.2. Imagens MEV de micropartículas de quitosana e sílica contendo
rifampicina.....................................................................................................................102
Figura 5.3. Difratogramas das micropartículas de quitosana e sílica contendo cloridrato
de propranolol...............................................................................................................103
Figura 5.4. Difratogramas das micropartículas de quitosana e sílica contendo
rifampicina.....................................................................................................................103
Figura 5.5. DSC comparativo do cloridrato de propranolol incorporado às
micropartículas nanoestruturadas com Aerosil® e Livre(Referência) : 5°C/min, 25200°C, N2 - primeiro ciclo de aquecimento................................................................ 104
Figura 5.6. DSC comparativo do cloridrato de propranolol incorporado às
micropartículas nanoestruturadas com Aerosil®200 e Livre(Referência)_ 5°C/min_25200°C : 5°C/min, 25-200°C, N2 - segundo ciclo de aquecimento..............................105
Figura 5.7. DSC das micropartículas nanoestruturadas com Aerosil® e rifampicina de
referência. Ciclo de aquecimento 25-110-25-300°C; N2; 5°C/min..............................106
Figura 5.8. Representação gráfica dos perfis de liberação do cloridrato de propranolol
em tampão fosfato pH 6, 37°C......................................................................................106
Figura 5.9. Representação gráfica dos perfis de liberação da rifampicina em HCl 0,1M,
37°C...............................................................................................................................107
Figura 6.1. Capacidade de adsorção (mg.g-1) da BSA nas micropartículas
nanoestruturadas com Aerosil® em função do pH (25°C)............................................116
Figura 6.2. Capacidade de adsorção da BSA (mg.g-1) em função da concentração inicial
de BSA no meio de adsorção(mg.ml-1) (pH 6, 25°C)...................................................117
Figura 6.3. Isotermas de Langmuir referentes às adsorções da BSA nas micropartículas
nanoestruturadas com Aerosil®....................................................................................118
Figura 6.4. Capacidade de adsorção (mg.g-1) da BSA em função do pH nas
micropartículas de quitosana.........................................................................................119
Figura 6.5. Potencial Zeta em função adsorção da BSA em pH 6................................120
Figura 6.6. Potencial Zeta em função adsorção da BSA em pH 6, temperatura 25°C,
concentração de 5mg.ml-1, tempo de adsorção de 2h...................................................121
Figura 6.7. Potencial Zeta em função adsorção da BSA em pH 6, temperatura 25°C,
concentração de 5mg.ml-1, tempo de adsorção de 2h...................................................121
Figura 6.8. Perfil de liberação da BSA em diferentes pHs............................................122
Figura 6.9 Espectros infravermelos (a) Micropartícula nanoestruturada com Aerosil®
R972; (b) Quitosana; (c) Aerosil® R972; (d) BSA; (e) Micropartícula com BSA
adsorvida na superfície..................................................................................................125
Figura 6.10. Espectros infravermelos (a) Micropartícula nanoestruturada com Aerosil®
200; (b) Quitosana; (c) Aerosil® 200; (d) BSA; (e) Micropartícula com BSA adsorvida
na superfície...................................................................................................................125
Lista de Tabelas
Tabela 2.1. Exemplos de diferentes categorias de fármacos em partículas de quitosana e
suas vias de administração...............................................................................................10
Tabela 2.2. Exemplos de microesferas de quitosana preparadas pela técnica de spray
drying...............................................................................................................................14
Tabela 2.3. Poliânions que formam complexos de polieletrólitos com quitosana e
exemplos de aplicações...................................................................................................17
Tabela 2.4. Principais características da reticulação química e física de hidrogéis de
quitosana..........................................................................................................................18
Tabela 2.5. pH em algumas regiões e fluidos corporais.................................................31
Tabela 2.6. Relação de alguns tampões em função do pH..............................................31
Tabela 2.7. Ordem/modelos de cinética de dissolução avaliados....................................33
Tabela 2.8. Picos característicos em DRX para os polimorfos do manitol (Hulse et al
2009)................................................................................................................................38
Tabela 3.1. Condições operacionais usadas nos experimentos de spray drying..............50
Tabela 3.2. Efeito do modo e do tempo de dispersão na granulometria da sílica
hidrofílica (Aerosil® 200) dispersa na solução aquosa de quitosana..............................56
Tabela 3.3. Influência da concentração de sílica sobre a viscosidade da solução aquosa
de quitosana.....................................................................................................................60
Tabela 3.4. Condições operacionais e dados dos ensaios preliminares..........................61
Tabela 3.5. Características físicas das micropartículas (quitosana/Aerosil 200)............63
Tabela 3.6. Características físicas das micropartículas (quitosana/Aerosil R972)..........64
Tabela 3.7. Parâmetros térmicos, obtidos a partir de análise termogravimétrica............68
Tabela 4.1. Formulações das micropartículas de quitosana, manitol e sílicas para estudo
de estocagem sob condições controladas de temperatura (40°C) e umidade (75%).......82
Tabela 4.2. Estabilidade em meio ácido (HCL 0,1N) das micropartículas
nanoestruturadas com Aerosil®......................................................................................84
Tabela 5.1. Formulações de micropartículas de quitosana nanoestruturadas com sílica
contendo cloridrato de propranolol..................................................................................94
Tabela 5.2. Formulações de micropartículas de quitosana nanoestruturadas com sílica
contendo rifampicina.......................................................................................................95
Tabela 5.3. Modelos cinéticos usados na avaliação dos perfis de liberação de
micropartículas de quitosana nanoestruturadas com sílica..............................................99
Tabela 5.4. Granulometria e eficiência de encapsulação das micropartículas de
quitosana nanoestruturadas com sílica contendo cloridrato de propranolol e
rifampicina.....................................................................................................................100
Tabela 5.5. Coeficiente de correlação linear (R2) obtido através de linearização do perfil
de liberação do cloridrato de propranolol......................................................................108
Tabela 5.6 - Constante de liberação (k) segundo a equação da reta ajustada pelo modelo
de primeira ordem; Porcentagem de cloridrato de propranolol e rifampicina liberada no
tempo.............................................................................................................................108
Tabela 6.1. Quantidade de BSA adsorvida sobre as micropartículas de
quitosana.......................................................................................................................115
Tabela 6.2. Quantidade de BSA adsorvida em função da concentração inicial de BSA no
meio de adsorção (tampão fosfato, pH 6, 25°C)............................................................116
Tabela 6.3. Parâmetros das isotermas de Langmuir referentes às adsorções sobre
Qt...................................................................................................................................118
Tabela 6.4. Quantidade de BSA adsorvida nas micropartículas de quitosana em função
do tempo........................................................................................................................119
Tabela 6.5.Valores do Potencial Zeta em função adsorção da BSA em pH
6.....................................................................................................................................120
Tabela 6.6. Valores do perfil de liberação da BSA em diferentes
pHs.................................................................................................................................123
Tabela 6.7. Coeficiente de correlação linear (R2) obtido através de linearização do perfil
de dessorção da BSA.....................................................................................................123
Tabela 6.8- Parâmetros cinéticos do modelo de Higuchi..............................................123
Tabela 6.9. Análise granulométrica das micropartículas antes e após adsorção da
BSA...............................................................................................................................124
Lista de Abreviaturas e Siglas
BET: Braunauer, Emmet e Teller;
BSA: Albumina do soro Bovino;
DSC: Análise de Calorimetria Diferencial de Varredura;
DTA: Análise térmica diferencial;
DP: Desvio padrão.
DRX: Difração de raios-X;
DVS: Sorção dinâmica de vapor;
MEV: Microscopia Eletrônica de Varredura;
MET: Microscopia Eletrônica de Transmissão;
pI: Ponto isoelétrico;
TG: Análise Termogravimétrica;
μg/mƖ: Microgramas por mililitro;
mg/mƖ: Miligramas por mililitro;
μm: Micrômetro(s)
nm: Nanômetro(s)
µƖ: Microlitro(s)
mƖ: Mililitro(s)
min.: Minuto(s)
h: Hora(s)
λ: Comprimento de onda
CAPÍTULO 1
Introdução
Capítulo1. Introdução
Tese de doutorado
Introdução
O termo quitosana, mais que um biopolímero, pode ser usado para representar
uma família de polímeros de diferentes massas molares e graus de desacetilação, com
diferentes porcentagens de grupos amina primários na cadeia polimérica. Esta família de
polímeros é derivada da quitina, um polissacarídeo geralmente obtido de carapaças de
crustáceos marinhos como caranguejos e camarões.
A quitosana reúne uma série de características físico-químicas (grupos amina e
grupos hidroxila, carga positiva em condições acidas, capacidade de formação de filme),
além de características biológicas (biocompatibilidade, biodegradabilidade, atoxicidade,
efeito antimicrobiano, características bioadesivas) muito interessantes, que a tornam um
material atrativo para campos de aplicação tão distintos como tratamento de agua, uso
na agricultura ou aplicações biomédicas. A quitosana também exibe, a capacidade de se
ligar a substancias como proteínas, íons metálicos e mesmo células tumorais, podendo
ser incorporada em hidrogéis e sistemas de liberação controlada de fármacos, de
interesse para administração de medicamentos pelas vias oral, nasal ou transdérmica.
A quitosana oferece vantagens para o desenvolvimento de sistemas nano ou
microparticulados de liberação controlada de substancias ativas. Uma destas vantagens
reside no uso de processos que não envolvem o uso de solventes orgânicos como os
clorados, ainda muito utilizados para geração de micro/nanopartículas poliméricas, já
que a quitosana se dissolve em meios aquosos sob condições acidas. No entanto, a
estabilidade de micropartículas de quitosana nas diferentes condições fisiológicas de pH
ácido ou alcalino) é também uma das condições para o desenvolvimento de formulações
robustas cujo conteúdo substancia encapsulada possa ser liberado de forma controlada.
Por exemplo, micropartículas de quitosana para uma aplicação nasal devem ser
otimizadas em termos de tamanho e cargas superficiais para garantir uma boa
mucoadesividade. Micropartículas de quitosana tem demostrado boas propriedades de
mucoadesividade devido à interação entre suas cargas positivas e as cargas negativas da
mucosa nasal. Por outro lado, micropartículas de quitosana absorvem agua, e perdem a
rigidez e a forma física após intumescimento, o que pode resultar em uma sensação de
desconforto no caso da administração nasal (sensação de entupimento da cavidade
nasal), além da liberação não controlada do fármaco. Um outro exemplo é a
considerável limitação do uso de micropartículas de quitosana para a liberação
Bento Pereira da Costa Neto
2
Capítulo1. Introdução
Tese de doutorado
controlada de fármacos por via oral. Elas rapidamente absorvem agua e dissolvem no
meio gástrico, levando a liberação imediata do fármaco encapsulado.
Para superar estas limitações das micropartículas de quitosana é possível
modificar a estrutura da quitosana através de reticulações químicas, compondo misturas
de quitosana e polímeros sintéticos como álcool polivinílico ou desenvolvendo
membranas hibridas de material orgânico e inorgânico. Reticulações químicas
representam uma alternativa bastante explorada para melhorar as propriedades de
liberação controlada e propriedades mecânicas da quitosana. Os grupos amina da
quitosana são capazes de estabelecer ligações químicas com o agente reticulante como
aldeídos (glutaraldeído, formaldeído, gliceraldeído), enquanto seus grupos hidroxilas
são capazes de estabelecer ligações com a epiclorohidrina.
A reticulação química da quitosana, apesar de eficaz no controle de propriedades
como capacidade de absorção de água ou estabilidade física em meio ácido, apresenta
controvérsias devido ao caráter toxico dos reticulantes mais eficazes (glutaraldeído, por
exemplo).
Uma outra maneira de alterar a capacidade de intumescimento e a estabilidade
da quitosana em meio ácido é a formação de nanocompósitos de quitosana e argilas
como materiais de revestimento. Argilas são constituídas de camadas de silicato, que
hidratadas, se separam e formam estruturas tridimensionais com cargas negativas
capazes de interagir com as cargas positivas da quitosana. Vários trabalhos relatam a
formação de nanocompósitos de quitosana e argilas diversas como montimorilonitica ou
rectorita para recobrimento de comprimidos e formação de um filme nanocompósito
capaz de controlar o intumescimento e a estabilidade gástrica de comprimidos
revestidos além de permitir uma liberação do fármaco controlada no tempo. Além das
argilas, a quitosana também pode ser combinada com sílica para a síntese de materiais
híbridos de quitosana-sílica por processo de sol-gel sob condições acidas e para
formação de diferentes estruturas tais como materiais porosos e membranas compósitas.
Desta forma, o objetivo deste trabalho é o desenvolvimento de uma forma
alternativa de controlar as propriedades de micropartículas de quitosana (capacidade de
sorção de umidade, estabilidade em meio ácido, estabilidade em condições de estresse
de temperatura e umidade, carga superficial e liberação de princípios ativos) através da
combinação, por processo físico, de quitosana com sílica fumegada nanométrica. Para
isso, dois diferentes tipos de sílica foram testados, uma sílica de caráter hidrofílico
(Aerosil® 200) e outra de caráter mais hidrofóbico (Aerosil® R972). A incorporação
Bento Pereira da Costa Neto
3
Capítulo1. Introdução
Tese de doutorado
das nanopartículas de sílica (Aerosil) nas micropartículas de quitosana foi realizada
através de um processo de secagem por spray drying.
O trabalho realizado é apresentado em sete capítulos. O Capítulo 2 resume a
revisão sobre os sistemas de liberação controlada desenvolvidos à base de quitosana. O
enfoque deste trabalho são aplicações farmacêuticas e a revisão concentra-se
particularmente neste campo de aplicação. O Capítulo 3 descreve as diferentes etapas
de desenvolvimento de micropartículas de quitosana nanoestruturadas com sílica e as
técnicas utilizadas para a caracterização destes sistemas. Os Capítulos 4, 5 e 6
apresentam respectivamente as propriedades destas microesferas referentes à capacidade
de encapsular, reter, proteger diferentes substâncias ativas. Finalmente, o Capítulo 7
apresenta as principais conclusões oriundas deste trabalho bem como as perspectivas
para a continuidade desta linha de pesquisa.
Bento Pereira da Costa Neto
4
CAPÍTULO 2
Revisão bibliográfica
Capítulo 2. Revisão bibliográfica
2.1.
Tese de doutorado
Microestruturas de encapsulação de princípios ativos
Define-se microencapsulação como uma tecnologia de empacotamento de
sólidos, gotículas de líquido ou materiais gasosos em finas camadas poliméricas que
podem liberar seu conteúdo a taxas controladas e condições específicas (Sparks, 1981).
O material encapsulado é conhecido como ativo e o material de revestimento é
denominado de membrana ou parede (Gibbs et al., 1999).
Dentre as principais estruturas utilizadas para encapsulação de princípios ativos
estão as partículas poliméricas, as partículas lipídicas, os lipossomas e as ciclodextrinas.
As vantagens desses sistemas são a melhoria da estabilidade química e física dos
princípios ativos, melhoria da biodisponibilidade, manutenção do ativo no tecido alvo,
muitas vezes, possibilitando a penetração deste em zonas corpóreas de difícil acesso,
solubilização de ativos hidrofóbicos, redução de efeitos colaterais e da toxicidade, assim
como do número de doses e frequência de administração, proporcionando maior
conforto ao paciente e, consequentemente, a maior adesão ao tratamento (Lasic, 1993;
Szejtli, 1988).
As micropartículas são divididas em duas classes: microcápsulas e microesferas.
A microcápsula consiste, em geral, de uma camada de polímero que atua como filme
protetor, isolando a substância ativa e evitando os efeitos de sua exposição inadequada.
Essa membrana desfaz-se através de estímulos específicos, liberando a substância em
locais específicos ou na taxa mais adequada ao tratamento. Nas microesferas, o material
ativo encontra-se disperso em uma matriz sólida de polímero (Ré, 2000). A Figura 2.1
representa essa diferença entre cápsulas e esferas.
Cápsulas
Esferas
Parede polimérica
Matriz
polimérica
Núcleo
Fármaco
a)
b)
c)
d)
Figura 2.1- Representação de cápsulas e esferas: a) fármaco dissolvido no núcleo oleoso; b) fármaco
adsorvido à parede polimérica; c) fármaco retido na matriz polimérica; d) fármaco adsorvido ou
disperso molecularmente na matriz polimérica (Schaffazick et al., 2003).
Bento Pereira da Costa Neto
6
Capítulo 2. Revisão bibliográfica
Tese de doutorado
O processo de encapsulação polimérica pode ser aplicado às formulações de
produtos farmacêuticos e agrícolas, na indústria de cosméticos e em revestimentos Além
do controle da velocidade de liberação do material encapsulado, a encapsulação pode
ser realizada com a finalidade de mascarar gosto e odor, ou para facilitar a estocagem e
o transporte do produto encapsulado (Janssen, 1995).
Há um grande número de polímeros biodegradáveis, podendo ser naturais ou
sintéticos, embora poucos deles sejam biocompatíveis. Entre os polímeros sintéticos
frequentemente empregados no desenvolvimento de sistemas de liberação de princípios
ativos os polímeros e co-polímeros dos ácidos lático e glicólico são os mais utilizados
devido a sua segurança e uso autorizado para aplicações em humanos (Amass et al.,
1998).
Já entre os polímeros naturais utilizados na produção de micropartículas
podemos citar a albumina (Sitta et al., 2013), gelatina (Bueno, 2008), colágeno
(Montanha, 2013), quitosana (Mantripragada & Jayasuriya, 2014.), entre outros. No
entanto, a quitosana é um polímero natural abundante, tendo uma produção de baixo
custo e ecologicamente interessante (Dias et al., 2013). Quitosana é o material de
interesse deste trabalho e a revisão bibliográfica se concentrará a seguir na apresentação
e uso deste polímero para o desenvolvimento de sistemas particulados
2.2.
Quitosana
2.2.1 Características
A quitina é um polissacarídeo encontrado com facilidade na natureza. Sua
constituição química é formada apenas pela estrutura 2-acetamida 2-desoxi-b-Dglicose
(N-acetil-D-glicosamina), diferenciando-se da celulose pelo grupo N-acetil. A quitina é
encontrada nas formas onde sua estrutura é formada por cadeias paralelas e
antiparalelas, ß por cadeias paralelas e γ com sua estrutura não totalmente definida,
todas encontradas na natureza (Ravi Kumar, 2000).
A quitina, matéria-prima da quitosana, atualmente é obtida principalmente do
exoesqueleto de crustáceos, como o caranguejo e o camarão, que até há pouco tempo
era um resíduo descartável da indústria pesqueira. No exoesqueleto de crustáceos, além
da quitina existem quantidades de carbonato de cálcio, carbonato de magnésio,
pigmentos e proteínas (Torres, 2006).
Bento Pereira da Costa Neto
7
Capítulo 2. Revisão bibliográfica
Tese de doutorado
Devido à sua origem natural, a quitosana (Figura 2.2) não pode ser definida
como uma estrutura química única, mas, como uma família de polímeros de diferentes
pesos moleculares e graus de desacetilação, definida em termos da porcentagem de
grupos amino primários na cadeia principal do polímero (Sonia & Sharma, 2011).
OH
OH
-
O H
H
H
O H
H
H
H
HO
OH
H
H
OH
NH 2
H
H
H
O
O
OH
NH 2
-
O
H
OH
OH
NH 2
Figura 2.2. Estrutura química da quitosana.
A quitosana tem propriedades físico-químicas (grupos hidroxilo e amino
reativos, alta carga positiva em condições ácidas, boa formação de filmes) e biológicas
(biocompatibilidade, biodegradável, ausência de toxicidade, efeitos antimicrobianos e
características mucoadesivas), que a tornam um material atraente para o uso como
material funcional de elevado potencial de aplicação em áreas tão diferentes como
biomédica (Berger et al., 2004; Dasha et al., 2011; Alvesa & Manoa, 2008), alimentos
(Duttaa et al.,2009; Devlieghere et al.,2004; Shahidi et al.,1999; Onsoyen & Skaugrud,
1990), tratamento da água (Alvesa & Manoa, 2008; Zenga et al., 2008; Divakaran &
Pillai, 2001; Peter, 1995), agrícola (Onsoyen & Skaugrud, 1990; Peter, 1995; Zhang et
al., 2003), entre outros.
A quitosana na forma de solução ou gel possui arranjo conformacional variado,
na forma esférica, fibrilar e espiralada. O arranjo estrutural é influenciado pela
temperatura, pH, distribuição média das massas moleculares, e grau de desacetilação. A
distribuição dos grupos acetilados e desacetilados, ou seja, dos grupos N-acetil e amino
presentes na cadeia polimérica ocorre de forma randômica (Torres, 2006).
As soluções de quitosana, obtidas de procedimentos de solubilização,
normalmente, possuem características hidrofílicas (grupos amino). A partir das
alterações de sua estrutura elas podem intensificar a sua natureza hidrofílica ou
apresentar características hidrofóbicas (grupos imino). Essas interações hidrofóbicas
diferem de outros tipos de interações como as eletrostáticas, pontes de hidrogênio e de
van der Waals por não serem resultados de interações coesivas entre as moléculas, mas
sim, pela estabilização dos resíduos laterais presentes na cadeia polimérica que devem
Bento Pereira da Costa Neto
8
Capítulo 2. Revisão bibliográfica
Tese de doutorado
ser resguardados do contato com moléculas de água (Torres, 2006). Desbrières et al
(1996) pesquisaram as interações hidrofóbicas na estabilização das estruturas
reticuladas. Essas interações foram influenciadas pelo grau de desacetilação da
quitosana, através da distribuição dos grupos N-acetil e amino ou imino, ampliação da
concentração do reticulado, acréscimo da temperatura da amostra, pH do meio, com a
ionização do grupo amino quando em solução ácida, grau de reticulação, com a reação
do grupo amino de características hidrofílicas com o grupo aldeído formando base de
Schiff com características hidrofóbicas, entre outros fatores.
A quitosana tem a capacidade de se ligar a certos materiais, incluindo as
proteínas, os íons metálicos e até mesmo células tumorais. Além disso, a quitosana pode
ser incorporada em hidrogéis e micropartículas que demonstram grande potencial em
sistemas de liberação de princípios ativos via oral, nasal ou transdérmica [Lee et al.,
2009; Agnihotri et al., 2004; Gordon et al.,2010; Bansal et al., 2011; Gavini et al.,
2008).
2.2.2. Micropartículas de quitosana
A obtenção de micropartículas de quitosana tem sido estudada desde a década de
80. Dentre inúmeras possíveis técnicas de obtenção, somente quatro técnicas principais
têm sido investigadas: (a) secagem por atomização (spray drying); (b) coacervação
simples ou complexa (Braga, 2013); (c) gelificação ionotrópica (Kiill, 2012); e (d)
emulsificação com evaporação de solvente, (Rutz, 2013).
Micropartículas de quitosana têm sido usadas como potencial carreador para
liberação prolongada de fármacos e macromoléculas, vetorização, aumento de
biodisponibilidade de substâncias degradáveis e aumento da absorção de substâncias
hidrofílicas através de camadas epiteliais (Oliveira, 2005).
A Tabela 2.1 apresenta as principais classes de fármacos que vem sendo
investigadas com partículas de quitosana, com diferentes vias de administração testadas.
Bento Pereira da Costa Neto
9
Capítulo 2. Revisão bibliográfica
Tese de doutorado
Tabela 2.1. Exemplos de diferentes categorias de fármacos em partículas de quitosana e suas vias
de administração
Classe do Fármaco
Fármaco
Via de administração
Referência
Bacteriostática
Dapsona
Pulmonar
Oliveira,2010
Oral
Raffin et al., 2003
Anti-inflamatórios Indometacina
Agentes Cardíacos
Propranolol
Oral / Nasal
Dandagi et al., 2007
Antibiótico
Tetraciclina
Oral
Denobile & Nascimento, 2004
Esteroides
Progesterona
Intramuscular
Pimentel ,2010
Terapia gênica
DNA
Intramuscular
Aral et al., 2000
2.3.
Preparação de micropartículas de quitosana
Na gelificação ionotropica, uma solução de quitosana é preparada e extrudada
através de uma agulha em uma solução aquosa de tripolifosfato ou outro ânion sob
agitação. As esferas são removidas da solução iônica por filtração, lavadas com água
destilada, secas em temperatura ambiente.
Uma das vantagens apresentadas por este método é a não utilização de agentes
de reticulação que podem induzir efeitos tóxicos e outros efeitos indesejáveis (Dumitriu
& Chornet, 1998). Na coacervação simples, o polímero é solubilizado e então é
adicionado um soluto, o qual forma um derivado do polímero insolúvel com a
consequente precipitação. O processo de coacervação usa o fenômeno de desolvatação
parcial dos polímeros e sua agregação em resposta a trocas químicas ou físicas no meio
(Porte & Couarraze, 1994).
Micropartículas de quitosana também podem ser preparadas pela coacervação
complexa. Estas micropartículas são formadas pela interação interiônica entre polímeros
de cargas opostas. Bartkowiak (2001) revisou a influência dos parâmetros mais
pronunciados que podem ser usados para modular as propriedades de micropartículas
binárias. Estes parâmetros foram divididos em duas categorias; a primeira inclui a
massa molar do poliânion, pH, força iônica e concentração de ambos polieletrólitos, que
podem ser manipuladas simultaneamente para controlar as propriedades mecânicas e
estruturais. O segundo grupo, a massa molar do poliânion e o tempo de reação,
influenciam somente a resistência mecânica (Oliveira, 2005).
A emulsificação com evaporação de solvente é o método é o mais usado para a
microencapsulação, por ser considerado o método mais simples. Este método envolve a
Bento Pereira da Costa Neto
10
Capítulo 2. Revisão bibliográfica
Tese de doutorado
formação de uma emulsão entre a solução polimérica e uma fase contínua imiscível,
sendo aquosa formará uma emulsão O/A e se oleosa formará uma emulsão A/O. A
emulsão formada é submetida à agitação até a maior parte do solvente orgânico
evaporar, levando a solidificação das microesferas. As microesferas podem então ser
lavadas, centrifugadas e liofilizadas para obter microesferas secas (Oliveira, 2005).
A técnica de spray drying é uma tecnologia empregada em vários segmentos
industriais (farmacêuticos, materiais cerâmicos, plásticos, resinas, etc). Os benefícios da
técnica de spray drying é a obtenção reprodutível de partículas, aplicabilidade da técnica
tanto com materiais sensíveis quanto resistentes à temperatura, capacidade de processar
diversas matérias-primas e a flexibilidade na formulação. Os fatores de formulação e os
parâmetros de processo determinam as propriedades das partículas produzidas
(Wendel&Çelik, 1997).
O procedimento envolve quatro estágios sequenciais: (a) Atomização dos
materiais de alimentação através de um bico atomizador; (b) Contato das gotículas
produzidas com o ar; (c) Secagem (d) Coleta do produto sólido (micropartículas) obtido
(Broadhead et al., 1992, Ré 2006) (Figura 2.3).
Figura 2.3. Representação esquemática do funcionamento do equipamento “spray dryer” (Ré,
2006).
Bento Pereira da Costa Neto
11
Capítulo 2. Revisão bibliográfica
Tese de doutorado
Em comparação com as diferentes técnicas de microencapsulação utilizadas, a
secagem por spray drying apresenta a vantagem de ser um processo de etapa única.
Além disso, apresenta rapidez, pequena dependência sobre as características de
solubilidade do fármaco e do polímero e facilidade de escalonamento. Essas
características demonstram sua adequação como método de encapsulação de fármacos
(Ré, 1998; Ré, 2002; He et al., 1999; Huang et al., 2003).
A utilização da técnica de secagem por atomização na obtenção de
micropartículas consiste basicamente em dispersar o adjuvante e o fármaco em um
solvente ou sistema adequado, e atomizar via aspersor para originar microgotas. Estas,
ao entrarem em contato com o ar em temperatura próxima ou superior ao ponto de
ebulição do solvente, proporcionam a evaporação do mesmo de forma rápida e
dinâmica, formando assim as micropartículas (Masters, 1985; Fu, et al., 2002).
Micropartículas contendo um agente ativo podem ser preparadas por spray
drying a partir de sistemas homogêneos (soluções) ou heterogêneos (dispersões). No
caso de soluções, o ativo e o polímero estão co-dissolvidos em um mesmo solvente. No
caso de dispersões, partículas finamente divididas do ativo são incorporadas a uma
solução polimérica. A solução ou suspensão é atomizada e seca em secadores spray
drying. Com a evaporação do solvente, o polímero precipita e aprisiona o sólido
disperso (suspensão-mãe) ou os cristais precipitados (solução-mãe). A microestrutura
gerada é mais usualmente conhecida como microesfera em aplicações médicas e
farmacêuticas (Ré, 2006).
O número de Peclet, Pe (Figura 2.4), é um número adimensional relevante no
estudo de fenômenos de transporte em fluxos fluidos, e pode ser usado para representar
o efeito esperado nas variáveis estudadas em secagens por spray dryer: temperatura de
secagem e diâmetro do bico nebulizador.
Dsol
R(t)
Vf
Figura 2.4. Representação esquemática do número de Peclet
Bento Pereira da Costa Neto
12
Capítulo 2. Revisão bibliográfica
Tese de doutorado
O número de Peclet estabelece um balanço entre efeitos convectivos e difusivos em uma
gota submetida à evaporação para a qual a energia é fornecida pelo ar de secagem:
Pe = Vf.R/Dsol
(Equação 2.1)
onde :
Vf = velocidade de secagem (avanço do fronte de secagem);
R = Raio da gota,
Dsol = coeficiente de difusão dos constituintes da formulação liquida (sílica e quitosana).
As variações de Vf, Dsol e R alteram características físicas das partículas
formadas como tamanho, velocidade de secagem (aumento da capacidade de
evaporação do processo e da difusão interna dos constituintes da formulação liquida
com o aumento da temperatura do ar de secagem).
Quando Pe < 1, a velocidade de evaporação é lenta comparada à difusão dos
componentes no interior da gota e seu tamanho e densidade variam gradualmente. Os
constituintes da formulação (no caso as moléculas da quitosana em solução e as
partículas de sílica) tem tempo suficiente para difundir através da gota. Nestas
circunstâncias, a partícula formada terá uma estrutura densa com uma densidade
próxima à dos materiais que a constituem.
Quando Pe > 1, a velocidade de evaporação é muito rápida comparada aos
efeitos internos difusivos e a superfície da gota atinge rapidamente a supersaturação
crítica que leva à formação de uma crosta sólida. A partir dessa etapa, a difusão interna
passa a ser controlada pela barreira física que a crosta representa e que reduz a
velocidade de evaporação do solvente. Esta condição leva à formação de partículas
maiores e de menor densidade.
He et al. (1999) analisaram a influência dos parâmetros de processo de spray
drying (vazão de alimentação, fluxo de ar, tamanho do bico e temperatura de entrada)
sobre o tamanho de microesferas de quitosana e seu potencial zeta. O diâmetro das
microesferas obtidas utilizando o bico padrão (0,5 mm) foi 3,63 μm, e 4,83 μm quando
um bico de 1,0 mm foi usado. Com a ampliação da vazão de alimentação (15 mƖ/min),
as microesferas aumentaram de diâmetro. Quando o fluxo de ar foi reduzido de 10 para
6 l/min ocorreu um pequeno aumento aparente no tamanho das partículas de 3,32 a 3,81
μm. Microesferas com um pequeno tamanho de partícula foram produzidas usando altas
vazões de ar, e a temperatura de entrada teve pequena influência sobre o tamanho das
partículas. Os parâmetros de processo (tamanho do bico, vazão de alimentação e fluxo
Bento Pereira da Costa Neto
13
Capítulo 2. Revisão bibliográfica
Tese de doutorado
de ar) afetaram o tamanho das microesferas resultantes, porém mantiveram a sua
densidade de cargas na superfície devido ao mesmo nível de reticulação.
Micropartículas de quitosana têm sido obtidas para diferentes propostas de
aplicação/interesses por meio do uso da técnica de spray drying, bem como com
diferentes fármacos. A tabela 2.2 apresenta alguns exemplos da literatura.
Tabela2.2. Exemplos de microesferas de quitosana preparadas pela técnica de spray drying
2.4.
Fármaco
Aplicação/Interesse
Referência
Betametasona
Liberação pulmonar
Huang et al., 2003
Diclofenaco
Liberação gástrica
Beck et al., 2004
Cetoprofeno
Liberação controlada
Braga, 2005
Cloridrato de tacrina
Liberação nasal
Saladini et al., 2013
Metformina
Liberação mucosa bucal
Sander et al., 2013
Alteração das propriedades da quitosana
A quitosana possui uma série de vantagens, particularmente para o
desenvolvimento de nano/microesferas como sistema carreador de princípios ativos.
Algumas de suas vantagens incluem a sua capacidade de controlar a liberação desses
princípios ativos e evitar o uso de solventes orgânicos durante a produção de sistemas
particulados, uma vez que é solúvel em solução aquosa ácida. No entanto, a estabilidade
das microesferas de quitosana sob diferentes condições fisiológicas é um pré-requisito
para uma aplicação bem sucedida. Por exemplo, micropartículas destinadas a
administração nasal devem ser otimizadas em termos de tamanho de partícula e
mucoadesividade. A quitosana apresenta propriedades mucoadesivas, devido à interação
eletrostática entre as cargas positivas e as superfícies mucosas carregadas
negativamente. No entanto, micropartículas de quitosana absorvem água, intumescem e
tornam-se frágeis, perdendo rigidez e forma, podendo obstruir as narinas e dificultar a
administração intranasal. No caso do uso de micropartículas de quitosana como
sistemas carreadores de liberação sustentada para uma administração oral, outro
problema de estabilidade pode ser observado: rápida solubilização em condições
gástricas levando à rápida liberação de substâncias encapsuladas nas micropartículas
(Alpar et al., 1996; Salcedo et al., 2012).
Bento Pereira da Costa Neto
14
Capítulo 2. Revisão bibliográfica
Tese de doutorado
A fim de superar estes problemas que limitam o uso de micropartículas de quitosana
como veículos de administração de substancias ativas por vias oral ou nasal, é possível
modificar a estrutura da quitosana através da introdução de ligações cruzadas
(reticulações) pela combinação da quitosana com polímeros sintéticos, tal como
poliacetato de vinila (PVA) (Parida et al., 2011) ou ainda através do desenvolvimento
de membranas híbridas com estruturas orgânicas-inorgânicas (Wang et al., 2007).
2.4.1. Reticulação da quitosana
A reticulação interliga as cadeias poliméricas por agentes de reticulação para a
formação de uma estrutura tridimensional. As propriedades dos matériais reticulados
dependem principalmente da sua densidade de reticulação, ou seja, a razão molar de
agente reticulante por unidade monomérica do polímero (Peppas, 1986).
A reticulação pode ocorrer simultaneamente ao processo de obtenção das
micropartículas em diferentes técnicas de preparação, ou com micropartículas préformadas por diferentes técnicas. As micropartículas de quitosana também podem ser
classificadas como hidrogéis, os quais são definidos como redes macromoleculares
intumescidas em água ou fluidos biológicos (Peppas, 1986, Langer & Peppas, 2003). A
reticulação de hidrogéis de quitosana pode ser dividida em duas classes: do tipo química
ou física e serão descutidas a seguir.
2.4.1.1.
Reticulação química
Nessa reticulação os agentes são moléculas de massa molar menor que a massa
molar das cadeias entre duas reticulações consecutivas (Peppas, 1986). Berger et al.
(2004) revisaram a reticulação de hidrogéis de quitosana, dividindo os hidrogéis
covalentemente reticulados em três tipos com relação a sua estrutura: quitosana
reticulada consigo mesma, rede polimérica híbrida e rede polimérica semi ou
completamente interpenetrada.
Nos três tipos de estruturas de reticulação química, as ligações covalentes são as
principais interações que formam a rede, mas outras interações não podem ser excluídas
(Wang et al., 2001).
A ligação cruzada é uma forma comum de melhorar as propriedades de liberação
controlada e a resistência mecânica através da introdução de uma estrutura de rede
tridimensional (Chen et al., 2013). Por conseguinte, o movimento de solutos através das
membranas de polímero reticulado pode ser controlado com precisão pelo controle desta
Bento Pereira da Costa Neto
15
Capítulo 2. Revisão bibliográfica
Tese de doutorado
estrutura de rede. Os grupos amina e hidroxila disponíveis na quitosana são sítios ativos
capazes de formar uma série de ligações. Atualmente, os agentes de ligação cruzada
mais utilizados envolvendo ligações com grupos amina da quitosana são aldeídos, tais
como o glutaraldeído (Gupta & Jabrail, 2007; Ramachandran et al., 2011; Mirzaei et al.,
2013), de formaldeído (Du et al., 2009; Singh et al., 2006) ou glioxal (Yang et al., 2005;
Moniera et al., 2010). Epicloridrina, uma molécula bifuncional que contem dois grupos
funcionais, é outro reagente de reticulação altamente reativo com o grupo hidroxila da
quitosana (Coelho et al., 2007; Sahin et al., 2011).
Redes de quitosana reticulada são úteis no campo farmacêutico para a
formulação de sistemas de carreamento de novos fármacos, como microesferas,
nanoesferas e filmes/membranas. Contudo, a aceitação de tais produtos com ligações
cruzadas depende da quantidade de agente de reticulação presentes nos produtos finais.
Nesse sentido, a toxicidade dos aldeídos é limitada na reticulação das micropartículas de
quitosana quando se refere ao campo farmacêutico (Harris et al., 2010; Mi et al., 2000).
Para superar a toxicidade dos agentes reticulante, Oliveira et al. (2005) estudaram o uso
potencial de D- gliceraldeído e L-gliceraldeído como agente de ligação cruzada
biocompatível, uma vez que está presente no organismo humano como produto
metabólico da frutose. Foi estudada a morfologia, tamanho de partícula, carga de
superfície e propriedades de capacidade de absorção de água das microesferas de
quitosana reticuladas [Oliveira et al.,2005; Oliveira et al.,2006).
2.4.1.2.
Reticulação física
A reticulação física pode ser feita através de diferentes tipos de reticulação, entre
elas a reticulação iônica, complexos de polieletrólitos, complexação da quitosana/PVA e
quitosana enxertada. A reticulação iônica ocorre por interação de íons com os grupos
amino da quitosana positivamente carregados. A natureza destas interações é a mesma
daquela que aconteceu com complexos de polieletrólitos. A diferença reside no fato que
à massa molar dos agentes de reticulação iônica são menores que os da reticulação com
complexos de polieletrólitos. Berger et al. (2004) classificam como reticulação iônica,
as entidades que são moléculas iônicas ou íons com massa molar bem definido. Em
contra partida, com complexos de polieletrólitos, os agentes reticulantes são polímeros
com uma distribuição grande de massa molar.
Outra forma de reticulação física são os nanocompósitos de argila/quitosana,
sintetizados como materiais de revestimento para retardar o intumescimento provocado
Bento Pereira da Costa Neto
16
Capítulo 2. Revisão bibliográfica
Tese de doutorado
por soluções aquosas ácidas e melhorar estabilidade do compósito no fluido gástrico.
Argilas são compostas de camadas de silicato, as quais podem ser separadas e formarem
estruturas tridimensionais quando são hidratadas em água. Eles têm carga negativa e
pode interagir com a quitosana. Verificou-se que a quitosana reage com vários tipos de
argilas, tais como montmorillonita (Hua et al., 2010; Wang et al., 2005; Salcedo et al.,
2012; Na & Dulz, 2007), magadiíta (Liu et al., 2007), rectorite (Wang et al., 2007) ou
de silicato de alumínio e magnésio (Khunawattanakul et al., 2011) para os comprimidos
de libertação modificada. Nanocompósitos de quitosana/montmorillonita têm sido
propostos como uma nova rota de liberação de princípios ativos para administração oral,
combinando as propriedades mucoadesivas com baixa solubilidade em meio ácido
(Salcedo et al., 2012).
Os poliânions comumente utilizados na preparação de complexo de
polieletrólitos com quitosana e exemplos de aplicações como sistemas de liberação
controlada estão apresentados no Tabela 2.3.
Tabela 2.3. Poliânions que formam complexos de polieletrólitos com quitosana e exemplos de
aplicações.
Classe química
Polieletrólito
Ácido
hialurônico
Polissacarídeos
Grupo ácido
-COO-
Alginato
-COO-
Dextrana
-OSO3-
Aplicação
Liberação controlada
gentamicina
-COO-
Takka &
nicardipina
Acartürk, 1999
Liberação controlada
Sakiyama et al.,
por via oral
2001
liberação controlada
no cólon
Proteína
Colágeno
Ácido
Polímeros
sintéticos
polifosfórico
Polifosfato
Bento Pereira da Costa Neto
-COO-OPO3-OPO3-
Lim et al., 2000
Liberação controlada
Vetorização e
Pectina
Referência
Munjeri et al.,
1997
Liberação controlada
Zhang et al.,
propranolol
1997
Liberação sustentada
da 6-mercaptopurina
Liberação controlada
da 6-mercaptopurina
Mi et al., 1999a
Mi et al., 1999b
17
Capítulo 2. Revisão bibliográfica
Tese de doutorado
A escolha entre a utilização da reticulação física ou química da quitosana será
baseada principalmente na necessidade de cada aplicação, levando-se em conta as
propriedades geradas por cada tipo de reticulação. A Tabela 2.4 apresenta um resumo
das características revisadas e discutidas por Berger et al. (2004 a,b) que são geradas
pela reticulação química e física de hidrogéis de quitosana.
Tabela 2.4. Principais características da reticulação química e física de hidrogéis de quitosana
Reticulação química
Preparação
Simples
Reticulação física
Simples e condições
brandas
pH dependente em meio
pH dependente em meio
ácido
ácido e básico
Tipo de reticulação
Irreversível
Reversível
Toxicidade
Questionável
Boa
Propriedades mecânicas
Alta
Baixa
Dissolução
Baixa
Alta
Escalonamento
Simples
Complicado
Intumescimento/liberação
Recentes estudos sobre a obtenção de materiais constituídos de quitosana com
sílica têm sido realizados. Como se sabe, ossos, dentes, carapaças de animais e conchas
são constituídos de materiais organo-inorgânicos, nos quais proteínas e lipídios formam
uma matriz estrutural para a deposição de compostos inorgânicos como cristais de
hidroxiapatita, carbonato de cálcio, fosfato de cálcio e sílica (Reis, 2007). A produção
de materiais híbridos à base de quitosana e sílica tem sido realizada de forma a
aproveitar as características estruturais da quitosana, que possui uma estrutura de cadeia
regular e pode formar soluções verdadeiras em meios ácidos, o que facilita o seu uso no
processo sol-gel. Os derivados da quitosana e a própria quitosana podem apresentar
interações específicas com a superfície de gel de sílica, como ligações químicas ou
adsorção específica (Muzzarelli & Muzzarelli, 2002).
Rashidova et al., (2004) realizaram um estudo com o objetivo de produzir um
material híbrido na forma de pó através da inclusão da quitosana na cadeia de
polisiloxana durante a formação da sílica-gel na policondensação hidrolítica do
tetraetilortossilicato, através do processo sol-gel. O FTIR revelou bandas de absorção a
Bento Pereira da Costa Neto
18
Capítulo 2. Revisão bibliográfica
Tese de doutorado
1090, 1020 e 3400 cm-1, relacionadas à presença de ligações químicas do tipo Si-O-Si,
Si-O-C e NH2 livres e grupos OH, respectivamente. Não foram observadas bandas de
absorção dos grupos amidas da quitosana, no campo de 1650 cm -1, nem de grupos
silanol no campo de 960 cm-1. Este resultado foi considerado um forte indício da
formação das seguintes interações: a) ligações de hidrogênio entre os grupos silanol da
sílica e grupos amidos e hidroxilas da quitosana; b) ligações iônicas entre os grupos
silanol da sílica e os grupos aminos da quitosana.
Em outro estudo (Yang, Wang & Tan, 2004), géis porosos de quitosana e sílica
foram preparados através da mistura do tetrametilortossilicato, precursor da sílica, com
a quitosana em solução aquosa de ácido acético a 1% utilizando-se o processo sol-gel. A
proposta do estudo foi avaliar a capacidade do gel formado em servir como material
carreador para enzimas, no caso a glicose-oxidase.
A quitosana pode formar hidrogéis resistentes com agentes de ligações cruzadas,
como o glutaraldeído. Entretanto, todo o esforço para realizar a secagem do hidrogel
para a obtenção do aerogel não tem trazido bons resultados, devido à alta deformação e
contração do gel de quitosana (Reis, 2007). Esse comportamento é esperado já que a
quitosana possui caráter altamente polar com afinidade para formar ligações de
hidrogênio com cadeias adjacentes. Portanto, a adição de um material inorgânico como
a sílica poderia tornar o gel mais resistente a deformações.
Em um estudo, hidrogéis contendo uma fase sólida de quitosana e sílica foram
sintetizados através do uso de uma solução aquosa de quitosana em ácido acético a 1 %
para catalisar a hidrólise e a condensação do tetraetilortossilicato, alcóxido precursor da
sílica. As amostras variaram na proporção quitosana/sílica de 0,1 a 1,1 e o tempo de
geleificação variou de 1 a 4 horas para as várias amostras sintetizadas. As propriedades
físicas dos materiais mostraram uma forte dependência da proporção quitosana/sílica.
Quando a quantidade de quitosana aumentou, a contração do material diminuiu
significantemente. Isto mostrou que a quitosana inibiu a contração de geleificação a
despeito do fato de que a quitosana possui alto caráter polar e capacidade de formar
ligações de hidrogênio entre as partículas de sílica adjacentes. Estas ligações poderiam
explicar tal comportamento, já que elas podem reduzir as reações de condensação dos
grupos hidroxilas superficiais com as partículas de sílica vizinhas, desta forma, inibindo
a contração do gel. Portanto, amostras com alto conteúdo de quitosana podem reduzir o
empacotamento da estrutura do gel, trazendo como consequência maior capacidade de
absorver água quando em contato com soluções-tampão. A quantidade de quitosana
Bento Pereira da Costa Neto
19
Capítulo 2. Revisão bibliográfica
Tese de doutorado
presente também afetou a área superficial dos aerogéis secos, que diminuiu com o
aumento da quantidade de quitosana. Isto poderia ser explicado pela presença de
impurezas na quitosana ou pequenas porções do polímero que não se dissolveram
completamente no processo sol-gel (Ayers & Hunt, 2001).
Sílica tem sido utilizada na geração de micropartículas por spray drying. Beck et
al. (2004) produziram micropartículas revestidas com nanopartículas produzidas por
spray-drying, utilizando o diclofenaco como fármaco modelo. Trabalhos anteriores
apresentaram o processo para secar nanopartículas poliméricas carregadas de drogas
utilizando dióxido de silício como adjuvante. O fármaco foi associado ao dióxido de
silício e nanopartículas de Eudragit foram utilizadas como revestimento orgânico. O
Eudragit foi selecionado devido à resistência gástrica. O potencial de aplicação das
micropartículas foi avaliado em termos de rendimento de processo, eficiência de
encapsulação, análises morfológicas e perfis de liberação in vitro em meios de buffers
(pH 1.2, 5,0 e 7,4). Os resultados mostraram a viabilidade das micropartículas
inorgânicas revestidas com nanopartículas para a liberação gástrica do diclofenaco.
Yun et al. (2008) desenvolveram uma nova estratégia para obtenção de argila
dispersa em uma matriz polimérica pelo método de spray drying. As medidas feitas em
microscopia eletrônica e em microscopia eletrônica de transmissão mostraram que o
processo de secagem pelo método de spray drying produz microesferas de
argila/polímero no qual a argila é presa e dispersa dentro da matriz polimérica. A
argila/poli (metil metacrilato) foi adicionada à microesfera com sucesso. Os
nanocompósitos aumentaram as estruturas sem qualquer perturbação da nanoestrutura
da argila dispersa na microesfera original. A microscopia eletrônica de transmissão e
análise de raio-X de pequeno-ângulo mostram que as partículas de argila possuem um
grau excelente de dispersão. Os resultados mostram também que as microesferas obtidas
pelo método de spray drying constituem um excelente precursor para processos como
extrusão ou mistura de fundição com outros polímeros para obtenção de
nanocompósitos.
Quando a quitosana está presente na solução, ela pode interagir com as
partículas de sílica através de uma variedade de interações, incluindo as ligações Si-O-C
e ligações de hidrogênio, que, por sua vez, mantém as partículas de sílica relativamente
próximas umas das outras, facilitando a formação dos aglomerados. Desta forma, as
partículas de quitosana serviriam como conexão entre as partículas de sílica (unidade
primária) e os aglomerados de partículas (unidade secundária) (Hu et al., 2001).
Bento Pereira da Costa Neto
20
Capítulo 2. Revisão bibliográfica
2.5.
Tese de doutorado
Considerações gerais sobre a sílica
O termo sílica refere-se aos compostos de dióxido de silício, SiO2, nas suas
várias formas incluindo sílicas cristalinas e amorfas. A sílica amorfa se divide em dois
grupos: naturais e sintéticas. As sílicas sintéticas ocorrem em diversas formas e são
classificadas em sílica coloidal, sílica gel, sílicas fumegadas e precipitada (Prado, 2005;
Sales, 2003).
Na obtenção da sílica amorfa, existem parâmetros específicos que são
controlados independentemente como: área superficial, volume do poro, tamanho do
poro e diâmetro das partículas. Estes parâmetros governam o comportamento físicoquímico da sílica. Portanto, qualquer alteração nos métodos de obtenção de sílica
amorfa afetará o comportamento físico-químico deste material (Vansant, 1995).
As sílicas sintéticas amorfas são obtidas por dois tipos diferentes de processo: o
processo de fase líquida (LPP) e o processo em fase de vapor (VPP). Um dos processos
LPP de destaque é o processo sol-gel. O processo sol-gel envolve reações de hidrólise e
condensação do alcóxidos metálicos que resultam na formação de uma rede de óxido,
como mostrado na Figura 2.5, onde R= CH3, C2H5 ou C3H7 (Pagliaro, 2009):
Si(OR)4 + R'(Si(OR)3 + 7H2O↔ Si(OH)4 + R'(SiOH)3 + 7ROH (Hidrólise)
Si(OH)4 + R'(SiOH)3↔ (OH)3Si-O-SiR'(SiOH)3 + H2O (Condensação)
Figura 2.5. Reação de formação da sílica pelo processo sol-gel.
Hidrólise e condensação ocorrem simultaneamente em solução aquosa. Na
condensação, partículas estáveis de tamanho coloidal são formadas. Em seguida, o sol
se condensa na forma de hidrogel. A terminologia ‘sol’ refere-se a uma dispersão
estável de partículas sólidas coloidais em um líquido, enquanto que a terminologia ‘gel’
é atribuída para sistemas constituídos por um esqueleto sólido contínuo de partículas
coloidais ou polímeros encerrando uma fase contínua líquida. O processo sol-gel de
obtenção de sílica é muito utilizado devido à sua capacidade de formar produtos puros e
homogêneos em temperaturas brandas.
A sílica também pode ser obtida por processo que envolve alta temperatura, designado
de processo em fase de vapor, VPP. A sílica obtida por este processo é conhecida como
sílica fumegada. Ela é obtida pela hidrólise a alta temperatura (> 1000°C) do
tetracloreto de silício (SiCl4) na presença de hidrogênio e oxigênio, conforme Figura
2.6.
Bento Pereira da Costa Neto
21
Capítulo 2. Revisão bibliográfica
Tese de doutorado
2 H2 + O2 → 2 H2O
SiCl4 + 2 H2O → SiO2 + 4 HCl
Figura 2.6 Reação de formação da sílica pelo processo em fase de vapor.
A sílica é formada quando o tetracloreto de silício reage com o hidrogênio para
formar gotículas de dióxido de silício, construindo partículas primárias que estão
ligadas entre si em cadeias lineares. As características da sílica produzida podem ser
controladas por uma variação da concentração dos reagentes, da temperatura da chama e
do tempo de presença na câmara de combustão. Esse processo resulta na obtenção de
sílica pura com baixa quantidade de grupos silanóis, baixo teor de água com partículas
de tamanho menor (Hewitt, 2007). Em solução aquosa ou sob condições hidrotérmicas,
as sílicas fumegadas formam as chamadas sílicas coloidais ou sílicas mesoporosas
(Brinker & Scherer, 1990; Iler, 1979).
A sílica fumegada é utilizada como agente reforçante de compostos de silicone e
polímeros orgânicos. Polímeros sem aditivos possuem baixa resistência mecânica.
Adicionando se sílica fumegada à borracha, por exemplo, sua resistência mecânica no
alongamento e ruptura aumenta, permitindo que este composto possa ser alongado e
deformado sem quebrar.
As sílicas fumegadas são inodoras, insípidas e quimicamente inertes, o que
favorece sua utilização em aplicações de interesse de indústrias farmacêuticas,
cosméticas, alimentícias, de plásticos, adesivos, compósitos e, especificamente, em
tintas e vernizes. Estudos comprovam que nos seres humanos, a sílica fumegada amorfa
é atóxica, por via oral, pele ou olhos, e por inalação (Stein, 2001). Quando inalado o pó
se dissolve no fluido do pulmão e é rapidamente eliminado. Em caso de ingestão, a
sílica é excretada nas fezes e há pouca acumulação no organismo. Após a absorção
através do intestino a sílica é eliminada através da urina sem modificação em animais e
seres humanos (Jacc, 2006).
A sílica apresenta-se em unidades tetraédricas SiO4 distribuídas aleatoriamente,
possuindo grupos siloxanos (Si-O-Si) em seu interior e uma vasta população de grupos
silanóis (Si-OH) na sua superfície, como mostrado na Figura 2.7. Os grupos silanóis
presentes na superfície da sílica se distribuem aleatoriamente e, dependendo da maneira
como se encontram dispostos, podem ser denominados: - isolados ou livres, onde existe
apenas um grupo OH ligado a um átomo de silício; - vicinais ou em ponte, que
caracterizam os dois grupos silanóis ligados a dois diferentes átomos de silício da rede
Bento Pereira da Costa Neto
22
Capítulo 2. Revisão bibliográfica
Tese de doutorado
inorgânica; geminais, que consistem em dois grupos de hidroxilas ligados a um mesmo
átomo de silício (Zuravlev, 2000).
H
H
H Silanóis Geminais
Silanóis Isolados
O
O
O
SiH3
O
SiH2
SiH3
-
H3Si
H
O
-
-
O
+
H
SiH3
H
O
+
H3Si
O
+
H
Silanóis Vicinais
SiH3
H
Silanóis Vicinais
SiH2
SiH2
SiH2
SiH2
-
O
O
O
Siloxanos de Superfície
Figura 2.7. Diagrama apresentando possíveis arranjos de grupos silanóis e siloxanos na superfície
da sílica fumegada (Zuravlev, 2000).
Estes três tipos de grupos silanóis não são equivalentes quanto ao
comportamento de adsorção ou de reatividade química. As hidroxilas vicinais interagem
fortemente com as moléculas de água e são as responsáveis pelas excelentes
propriedades de adsorção de água da sílica, que são exploradas, por exemplo, nas
operações de secagem a gás industrial (Napierska et al, 2010).
As sílicas fumegadas são hidrofílicas, no entanto podem ser tratadas tornando-se
hidrofóbicas. Dessa forma, uma sílica de caráter hidrofílico devido à presença dos
grupos silanóis na superfície, poderá adquirir um caráter hidrofóbico, justamente pela
predominância dos grupos siloxanos na superfície (Lind et al., 2003).
Os compostos mais comuns utilizados nos tratamentos de superfície (físico ou
químico) da sílica amorfa hidrofílica para a produção de sílica hidrofóbica são:
dimetildiclorossilano, hexametildissilazano e polidimetilsiloxanos.
•
Dimetildiclorossilano → ≡Si–O–[Si(CH3)2–O–]x = 1 – 3
•
Hexametildissilazano → ≡Si–O–Si(CH3)3
•
Polidimetilsiloxanos → ≡Si–O–[Si(CH3)2–O–]x = 3 - 6(10)
Bento Pereira da Costa Neto
23
Capítulo 2. Revisão bibliográfica
Tese de doutorado
O tratamento de superfície não altera as propriedades do sólido, por exemplo,
diâmetro de partícula, cinética de dissolução do dióxido de silício de polímero
inorgânico (sílica, SiO2). Entretanto, ele altera as propriedades físico-químicas como
redução da absorção de umidade (Jacc, 2006).
A reação da sílica ativa com material de natureza orgânica permite converter a
sílica hidrofílica em material hidrofóbico. Quando a superfície dos grupos silanol reage
com compostos como organosilicones (grupo alquilo), estes são ligados à superfície,
tornando-os hidrofóbicos. O prefixo R (Repelente) caracteriza estes produtos. Através
do tratamento hidrofóbico, a densidade dos grupos silanol por nm2 diminui
aproximadamente de 2 para tipos hidrofílicos e 0,75 para os tipos hidrofóbicos. Os
grupos silanol hidrofílicos são convertidos com dimetildiclorossilano para formar
grupos dimetilsililos ligados quimicamente na superfície da sílica, tal como mostra a
Figura 2.8 (Jonat, 2005).
Figura 2.8. Tratamento de sílica fumegada hidrofóbica (adaptado de Jonat, 2005).
2.6.
Propriedades de encapsulação, de proteção, de adsorção e de
liberação de substâncias ativas
Sistemas particulados para encapsulação são desenvolvidos com diferentes
finalidades:
 Imobilizar;
 Proteger;
 Estruturar;
 Assegurar a liberação sob estímulos e condições especificas (local, temperatura e
pH por exemplo).
Micropartículas de quitosana modificadas pela presença de sílica fumegada
podem ter uma ou várias destas finalidades. Em particular, o interesse do trabalho é
avaliar a potencialidade de uso destas micropartículas nanoestruturadas com sílica para
Bento Pereira da Costa Neto
24
Capítulo 2. Revisão bibliográfica
Tese de doutorado
proteger contra fatores externos (umidade, por exemplo), encapsular e liberar fármacos
sob condições especificas e adsorver proteínas.
2.6.1. Encapsulação e liberação de princípios ativos
Por definição, o termo “sistema de liberação de fármacos” refere-se à tecnologia
utilizada para aperfeiçoar a liberação de um fármaco, onde o princípio ativo deve ser
liberado, de maneira apropriada, melhorando a resposta terapêutica. Os sistemas de
liberação oferecem vantagens quando comparados a outros de dosagem convencionais
(Duran, Marcato, Teixeira, 2007), tais como:
•Maior eficácia terapêutica, com liberação progressiva e controlada do ativo;
•Diminuição significativa da toxicidade e maior tempo de permanência na circulação;
•Natureza e composição dos veículos, além de proteção contra mecanismos de
instabilidade e decomposição da substância ativa (inativação prematura);
•Administração segura, sem reações inflamatórias locais;
•Diminuição do número de doses devido à liberação progressiva;
•Possibilidade de direcionamento a alvos específicos.
Existem três mecanismos gerais pelos quais os fármacos são liberados a partir de
sistemas poliméricos: (1) difusão do fármaco a partir do sistema de liberação; (2) reação
química ou enzimática que será a degradação do sistema, ou clivagem do fármaco a
partir do sistema; e (3) ativação do sistema de liberação através de osmose ou
intumescimento. Uma combinação destes mecanismos também é possível (Langer,
1998). Nestes tipos de sistema de liberação, o ativo irá difundir do interior da partícula e
as características físico-químicas do ativo e do polímero irão governar o perfil de
liberação controlada. O controle difusivo pode ser otimizado com a utilização de
materiais estímulos-resposta, que por meio de estímulos de temperatura, pH, força
iônica, força elétrica, compostos químicos, enzimas e ultrassom aumentam ou
diminuem a difusão do ativo pela matriz polimérica (Benita, 1996). De qualquer modo,
a liberação do fármaco para o meio fisiológico é estendida há um tempo maior quando
comparado ao fármaco na sua forma livre, sendo estas características um dos principais
fatores para a pesquisa e desenvolvimento de sistemas microparticulados (Filho &
Oliveira, 1999).
As recentes tecnologias requerem materiais com combinação de propriedades
que não são encontradas nos materiais convencionais. Materiais híbridos orgânicoinorgânicos são obtidos pela combinação de componentes orgânicos e inorgânicos e
Bento Pereira da Costa Neto
25
Capítulo 2. Revisão bibliográfica
Tese de doutorado
constituem alternativa para a produção de novos materiais multifuncionais, com larga
faixa de aplicações. Normalmente as características desejadas não são encontradas em
um único constituinte e a combinação adequada dos componentes tem levado à
formação de materiais que apresentam propriedades complementares (Nadia & Prado,
2005). Híbridos orgânico-inorgânicos são materiais de grande interesse em aplicações
comerciais devido às suas propriedades mecânicas, ópticas e térmicas, que combinam a
estabilidade térmica e química dos materiais cerâmicos, com a processabilidade e a
flexibilidade dos compostos e polímeros orgânicos (Hiratsuka, Santilli, Pulcinelli,
2005).
A quitosana é um biopolímero importante para a síntese de híbridos
bioinorgânicos à base de sílica devido a propriedades como alta resistência mecânica,
alta hidrofilicidade, boa capacidade de formação de filmes e partículas (Chernev et al.,
2008). Sílica-quitosana tem-se destacado como um material híbrido de promissora
aplicação, apresentando excelentes propriedades térmicas, mecânicas óticas e de
adsorção. A afinidade entre a sílica e a quitosana reside nas hidroxilas e os grupos
amina presentes na estrutura da quitosana com facilidade na formação de ligações ponte
de hidrogênio com os grupos silanóis da sílica (Silva et al., 2011; Muslim, 2010).
Um exemplo da utilização da sílica em um material hibrido como carreador de
princípios ativos foi o estudo realizado por Chen e Zhu (2012). Eles produziram
nanopartículas de sílica mesoporosa recobertas com quitosana para nano-carreamento e
liberação do Ibuprofeno em uma estreita faixa de pH (6,8 e 7,4). No processo de
produção, o ibuprofeno foi incorporado aos poros da nanopartículas de sílica
mesoporosa, em seguida a sílica foi recoberta com quitosana através de ligações de
hidrogênio (Figura 2.9).
Bento Pereira da Costa Neto
26
Capítulo 2. Revisão bibliográfica
Tese de doutorado
Figura 2.9. Processos de encapsulação do ibuprofeno e recobrimento da sílica mesoporosa por
quitosana (adaptado de Chen & Zhu, 2012).
Na liberação realizada em pH 7,4 as moléculas de quitosana se encontravam em
estado agregado e ordenado, impedindo eficazmente a liberação do princípio ativo. No
entanto, na liberação realizada em pH 6,8 as cadeias de quitosana foram protonadas
fazendo com que se espaçassem, o que facilitou a liberação do ibuprofeno (Figura 2.10).
Figura 2.10. Processos de liberação do ibuprofeno nos diferentes pHs (adaptado de Chen & Zhu,
2012).
Nos estudos com lipossomas, Mohanraj et al. (2010) desenvolveram um sistema
híbrido de sílica e lipossoma contendo insulina encapsulada. Eles avaliaram a proteção
que as nanopartículas de sílica produziam nos lipossomas e as propriedades de liberação
Bento Pereira da Costa Neto
27
Capítulo 2. Revisão bibliográfica
Tese de doutorado
controlada da insulina. Foi observado que o revestimento das nanopartículas de sílica na
superfície dos lipossomas as protegeram contra a degradação das enzimas digestivas. O
estudo de liberação de insulina comprovou que a taxa de liberação do princípio ativo a
partir dos lipossomas revestidos com sílica foi reduzida em comparação com os
lipossomas sem revestimento. Nesse estudo foi confirmado que a cinética de liberação
dos lipossomas e a estabilidade no meio podem ser controladas através da inclusão de
uma camada de nanopartículas de sílica na superfície dos lipossomas.
Liu et al. (2004) produziram membranas de quitosana pura e híbridas de
quitosana com sílica, utilizando-se o GPTMS (γ-glycidoxypropyltrimethoxysilane)
como precursor alcóxido da fase inorgânica. As membranas foram analisaram por FTIR
e comparadas em relação à capacidade de inchamento e propriedades mecânicas. A
sílica foi incorporada à quitosana em diversas proporções mássicas (5, 10, 20, 30, 40 e
50%) com o intuito de melhorar as suas propriedades mecânicas e biológicas. A reação
da quitosana com a sílica foi evidenciada pela diminuição de intensidade da banda 1550
cm-1 referente ao dobramento do grupo NH e pelo aparecimento da banda a 920 cm-1
referente à ligação Si-OH estiramento. A banda de absorção a 1000-1100 cm-1,
referente ao grupo Si-O-C, mostrou intensidade aumentada. O grau de inchamento da
quitosana em água foi diminuído significativamente com a incorporação de sílica. Os
testes mecânicos mostraram que a quitosana híbrida mostrou-se mais frágil e com
menor resistência à tração e percentual de alongamento quando comparada à membrana
de quitosana pura.
Estudos
realizados
bionanocompósitos
por
dispersando
Chrissafis
et
nanopartículas
al.
(2008)
sílica
produziram
(SiO2)
em
vários
polímeros
biocompatíveis como poli (vinil pirrolidona) (PVP), quitosana e poli (álcool vinílico)
(PVA). Para a obtenção dos bionanocompósitos foi utilizado o método de evaporação
do solvente. Por microscopia eletrônica de varredura (MEV) verificou-se a dispersão de
nanopartículas de sílica em todas as matrizes poliméricas dos compósitos com baixo
teor de sílica. Interações entre os grupos funcionais dos polímeros e do grupo hidroxila
da SiO2 foram reveladas por FTIR. Propriedades mecânicas como resistência à tração
melhoraram substancialmente com o aumento do teor de sílica nos bionanocompósitos.
A análise termogravimétrica (TGA) mostrou que as matrizes poliméricas foram
estabilizadas contra decomposição térmica pela adição de sílica devido a um efeito
barreira.
Bento Pereira da Costa Neto
28
Capítulo 2. Revisão bibliográfica
Tese de doutorado
Sun et al. (2012) desenvolveram uma nova matriz de nanopartículas de sílica
juntamente com quitosana de modo a investigar a viabilidade de utilização de quitosana
para regular a taxa de liberação do fármaco a partir da sílica porosa e obter um sistema
de liberação sustentada de drogas por via oral. Para atingir este objetivo, foi sintetizada
uma matriz de sílica e incorporou-se cadeias de quitosana na superfície da sílica por
ligações hidrogênio. O método de evaporação de solvente foi adotado para carregar o
fármaco modelo carvedilol nos compósitos sílica/quitosana. Ao contrário da abordagem
convencional para a preparação de formulações onde as partículas de droga são
estabilizadas com agentes tensoativos ou polímeros, a sílica mesoporosa pode reter a
droga num espaço menor, variando de 2 a 50 nm, e permite que o medicamento possa se
dispersar de forma eficiente. Esta técnica aumentou a estabilidade da droga e aumentar a
taxa de dissolução do fármaco.
A sílica foi combinada com a quitosana para sintetizar materiais híbridos de
sílica/quitosana pelo processo sol-gel sob condições ácidas, com vários tipos de
estruturas, tais como materiais porosos e membranas compósitas [Gordon et al., 2010;
Khunawattanakul et al., 2011; Chrissafis, et al., 2008; Gandhi & Meenakshi, 2012;
Witoon et al., 2009).
2.6.2. Dissolução ou liberação do fármaco de formas farmacêuticas sólidas
Em sistemas biológicos, a dissolução de medicamentos pode ser definida como o
processo pelo qual um fármaco é liberado de sua forma farmacêutica, tornando-se
disponível para ser absorvido pelo organismo (Abdou, 1995; Storpirtis & Consiglieri,
1995). Através do ensaio de dissolução in vitro, pode-se avaliar a velocidade e a
extensão de liberação do fármaco no meio avaliado. O resultado é expresso em
porcentagem do fármaco dissolvido em um dado período de tempo.
O teste de dissolução é requisito fundamental tanto na fase de desenvolvimento
quanto após aprovação do produto. Nos primeiros estágios do desenvolvimento
farmacocinético, a dissolução é útil para identificar variáveis críticas na produção,
escolher entre diferentes formulações, aperfeiçoá-las e fazer avaliações de risco.
Durante a fase de produção são importantes para a liberação dos lotes e testes de
estabilidade. Também são muito úteis para avaliar o impacto que certas mudanças,
como equipamento ou local de fabricação podem ter sobre o produto (Marcolongo,
2003; Brasil, 2003, Manadas et al., 2002).
Bento Pereira da Costa Neto
29
Capítulo 2. Revisão bibliográfica
Tese de doutorado
O estudo de dissolução é exigido para todas as formas farmacêuticas sólidas
orais, onde a absorção do fármaco é necessária para que o produto exerça seu efeito
terapêutico. A dissolução nos líquidos do trato gastrointestinal é um passo limitante para
que as formas farmacêuticas sólidas dispersos/suspensos em líquidos sejam capazes de
transpor membranas biológicas e exercer seus efeitos clínicos, pois a rapidez do
processo de dissolução pode afetar a velocidade e extensão da absorção de fármacos e
consequentemente sua atividade farmacológica (Rolim et al., 2005).
O conhecimento dos fatores que afetam a dissolução e seu controle favorece a
obtenção de resultados reprodutíveis. Alguns requisitos devem ser avaliados antes da
validação do método, pois contribuem para a adequabilidade do mesmo, tais como:
utilização de equipamento calibrado, condições sink, influência do filtro e estabilidade
da solução amostra. (Marcolongo, 2003).
A definição do termo sink pode variar de acordo com a fonte bibliográfica. Pode
ser definido como não menos que três vezes o volume do meio necessário para obter a
solução saturada do fármaco dentro da faixa de 500-1000 mƖ. Entretanto, atualmente se
aceita que um volume do meio de dissolução correspondente a 5 a 10 vezes o volume de
saturação é adequado para manter as condições de sink. Isto deve ser mantido para
evitar que a velocidade de dissolução seja artificialmente influenciada pela aproximação
de saturação durante a realização do teste. Condições de sink são obtidas naturalmente
in vivo, portanto, estudos de dissolução in vitro devem ser conduzidos obedecendo a
esse parâmetro visando se aproximar ao máximo das condições de dissolução in vivo
(Oliveira, 2006).
Inúmeras variáveis podem interferir nos resultados de um ensaio de dissolução,
podendo ser dependentes do sólido a ser dissolvido (liberação do soluto da matriz e
solubilização), do meio de dissolução ou relacionado ao processo de fabricação. Todos
devem ser considerados, mas alguns devem ser rigorosamente monitorados para
obtenção de resultados confiáveis. Dentre os fatores que afetam os resultados de
dissolução e envolvem a formulação (Dias, 2009), pode-se listar:
 A solubilidade do fármaco a ser dissolvido no meio de dissolução – é o fator que
mais afeta a velocidade de dissolução;
 A superfície livre das partículas – relacionada ao diâmetro médio das partículas
e a porosidade;
 Velocidade de agitação do sistema;
 Temperatura e pH do meio de dissolução.
Bento Pereira da Costa Neto
30
Capítulo 2. Revisão bibliográfica
Tese de doutorado
A importância do pH no contexto farmacêutico está relacionada a diversas
situações de relevância. O pH exerce uma influência na solubilidade das substâncias, na
estabilidade química, na compatibilidade fisiológica com os tecidos orgânicos onde a
forma farmacêutica será aplicada de forma a minimizar a irritação e o desconforto na
aplicação (Tabela 2.5, Thompson, 2004) e finalmente na garantia do efeito terapêutico
esperado para o medicamento (Thompson, 2004; Ferreira, 2002). O ajuste do pH de
uma formulação é importante ainda na aplicação do produto, na compatibilidade
fisiológica desta com o pH dos tecidos.
Tabela 2.5. pH em algumas regiões e fluidos corporais
Região do Corpo
Pele
Rosto
Axila
Cabelos
Saco conjuntival
Conduto auditivo
Vaginal
pH
~5,5
4,7 -5,5
6,1 - 6,8
~5,0
7,3 -8,0
6,0 - 7,8
4,0 - 4,5
Fluidos ou secreções
Líquido retal
Lágrima
Secreção nasal adulto
Secreção nasal crianças
Suco gástrico
Saliva
Sangue
pH
7,2 - 7,4
~7,4
5,5 - 6,5
5,0 - 6,7
1,0 - 3,0
6,9
7,4
A escolha de um sistema tampão deve se basear na faixa de pH da formulação
que se deseja tamponar, compatibilidade e na via de administração da forma
farmacêutica. Alguns sistemas tampões são exclusivamente de uso externo (ex. tampões
contendo ácido bórico ou borato de sódio) e outros podem ser aplicados também para
uso interno (ex. tampão citrato, tampão fosfato). A Tabela 2.6 relaciona alguns tampões
em função da faixa de pH e uso.
Tabela 2.6. Relação de alguns tampões em função do pH
Faixa de pH
1,0 - 3,0
2,5 - 6,5
3,6 - 5,6
6,0 – 8,0
2,8 – 8,0
8,0 – 9,0
9,0 – 11,0
6,8 – 9,1
11,0 – 13,0
Tampão
HCl
Tampão citrato
Tampão acetato
Tampão Fosfato
Tampão ácido cítrico/ fosfato
dissódico
Bicarbonato de sódio
Bicarbonato de sódio/Carbonato de
sódio
Tampão borato
NaOH
Bento Pereira da Costa Neto
Uso
Externo, Interno e oftálmico
Externo e Interno
Externo, Interno e oftálmico
Externo, Interno e oftálmico
Externo, Interno e oftálmico
Externo e Interno
Externo e Interno
Externo e oftálmico
Externo e Interno
31
Capítulo 2. Revisão bibliográfica
Tese de doutorado
2.6.3. Modelos matemáticos no estudo do perfil de dissolução
O modelo denominado cinética de ordem zero baseia-se na liberação lenta da
substância ativa a partir de formas farmacêuticas que não desagregam, desde que sua
área não se modifique e que não se atinja condições de equilíbrio, ou seja, a velocidade
de difusão do fármaco, do interior para o exterior da matriz, é menor que a respectiva
velocidade de dissolução, formando uma solução saturada, que permite a cedência
constante do fármaco (Lopes; Sousa; Costa, 2005). As formas farmacêuticas que
seguem este perfil liberam a mesma quantidade de fármaco por unidade de tempo, o
qual é o modelo ideal para as formas farmacêuticas de liberação prolongada como é o
caso dos comprimidos matriciais, sistemas osmóticos e das formas revestidas (Manadas;
Pina; Veiga, 2002).
A aplicação do modelo de cinética de primeira ordem aos estudos de dissolução
foi proposta pela primeira vez por Gibaldi e Feldman em 1967 e mais tarde por Wagner
em 1969. Este modelo tem sido também, muito empregado para descrever a absorção
e/ou eliminação de alguns fármacos. As formas farmacêuticas que seguem este perfil de
dissolução, tais como as que contêm fármacos hidrossolúveis em matrizes porosas,
liberam o fármaco de forma proporcional à quantidade remanescente no seu interior de
tal modo que a quantidade de fármaco liberada por unidade de tempo diminui
(Manadas; Pina; Veiga, 2002).
Entre os anos de 1961 e 1963, Higuchi desenvolveu diversos modelos teóricos
destinados a liberação de fármacos, tanto pouco solúveis como muito solúveis, contidos
em matrizes sólidas e semi-sólidas (Agnes; Ortega, 2003). O modelo Higuchi é
frequentemente utilizado para descrever a velocidade de liberação controlada do
fármaco a partir de um sistema matricial. Este modelo descreve o mecanismo de
liberação dos fármacos como um processo de difusão baseado na lei de Fick, estando
dependente da raiz quadrada do tempo. O modelo Higuchi pode ser aplicado com maior
exatidão a matrizes unidimensionais pouco solúveis, que não apresentam capacidade de
intumescimento (Lopes; Sousa; Costa, 2005).
No modelo Hixon Crowell a velocidade de liberação é limitada pela velocidade
de dissolução das partículas do fármaco e não pela difusão que possa ocorrer através da
matriz polimérica. Este modelo tem sido usado para descrever o perfil de liberação
tendo em vista a diminuição da superfície das partículas de fármaco à medida que a
dissolução ocorre (Lopes; Sousa; Costa, 2005). A tabela 2.7 resume a ordem e os
modelos de cinética de dissolução.
Bento Pereira da Costa Neto
32
Capítulo 2. Revisão bibliográfica
Tese de doutorado
Tabela 2.7. Ordem/modelos de cinética de dissolução avaliados.
Ordem/modelo
Ordem zero
Primeira ordem
Higuchi
Hixson-Crowell
Equação
Q = Q0 – K.t
ln Q = ln Q0 – K.t
Qt = K.t1/2
1/3
Q = Q01/3 – K.t
Q: concentração de ativo dissolvido em um tempo t; t: tempo de dissolução; Q0: Concentração
inicial do ativo na solução; K: constante de velocidade de dissolução.
2.6.4. Princípios ativos utilizados - cloridrato de propranolol e rifampicina
Dois princípios ativos foram utilizados nos estudos de liberação controlada desta
tese. Um princípio de caráter hidrofílico (cloridrato de propranolol) e outro princípio
ativo de caráter hidrofóbico (rifampicina).
O Cloridrato de propranolol (Figura 2.11) é um bloqueador beta-adrenérgico,
que bloqueia igualmente os receptores β1 e β2. Também é indicado na terapêutica
preventiva do infarto do miocárdio, arritmias cardíacas e tremor essencial (Rang et al.,
2007). O cloridrato de propranolol inibe a ação de agentes adrenérgicos e reduz a taxa
de batimento e a força de contração muscular do coração, na redução da permeabilidade
da membrana para os íons sódio, potássio e cálcio e possui uma ação anestésica local
(Sweetman, 2002).
Figura 2.11. Fórmula molecular do cloridrato de propranolol.
Entre as principais desvantagens na utilização do propranolol por via oral nas
formas farmacêuticas convencionais são os efeitos adversos resultantes da ação dos β bloqueadores:
bradicardia,
depressão
cardíaca,
broncoconstrição,
hipoglicemia
(originada pela liberação de glicose em resposta à adrenalina), fadiga (resultante da
redução do débito cardíaco) e extremidades frias, proveniente da perda da vasodilatação
mediada pelos receptores beta (Rang et al., 2007). Portanto, uma maneira de minimizar
esses efeitos indesejados seria a liberação do fármaco de forma controlada, pois o
Bento Pereira da Costa Neto
33
Capítulo 2. Revisão bibliográfica
Tese de doutorado
mesmo permaneceria por um maior tempo na faixa terapêutica, evitando a concentração
sub-terapêutica e a superdosagem (Alves, 2011).
A rifampicina pertence à classe dos fármacos hidrofóbicos possuindo baixa
solubilidade em água e alta permeabilidade intestinal (Mehta; Kaur; Bhasin, 2007). A
recomendação da Organização Mundial da Saúde (OMS) para o tratamento da
tuberculose é à base de rifampicina em associação com outros fármacos, principalmente
isoniazida, pirazinamida e etambutol, para evitar o surgimento do fenômeno de
resistência bacteriana.
A rifampicina, 3(4-metil-1-piperalizil-iminometil) (Figura 2.12) é um pó
cristalino vermelho, com ponto de fusão entre 183-188°C. É muito solúvel em
clorofórmio e dimetilsulfóxido, solúvel em acetato de etila, metanol e tetrahidrofurano e
levemente solúvel em acetona e tetracloreto de carbono. A solubilidade em água varia
em função do pH. Em pH 2, a solubilidade é igual a 100 mg/mƖ, em pH 5,3 é reduzida
para 4,0 mg/mƖ e em pH 7,5 a solubilidade é de 2,8 mg/mƖ (Gallo, Radaelli, 1976). O
caráter ácido da rifampicina é associado aos grupos hidroxilas nos carbonos C1, C4 e
C5 (pKa=1,7). A função básica é associada ao grupamento amina da piperazina
(pKa=7,9) (Connors et al., 1986).
Figura 2.12. Estrutura molecular da rifampicina.
O sucesso do tratamento depende da compreensão e adesão do paciente, já que o
esquema de dosagem deve ser rigorosamente obedecido. Os fármacos associados e
encapsulados trazem algumas vantagens tais como: a diminuição no número de
administrações, maior adesão ao tratamento, diminuição do surgimento de bacilos
resistentes, facilidade na prescrição, facilidade de gerenciamento de estoque, facilidade
de transporte e distribuição, menor gasto com produção e diminuição dos gastos do
Ministério da Saúde nos programas de tratamentos da tuberculose (Se, et al., 2002).
Bento Pereira da Costa Neto
34
Capítulo 2. Revisão bibliográfica
Tese de doutorado
Os efeitos adversos encontrados com o uso da rifampicina podem ser icterícia
assintomática; mal-estar abdominal, dor muscular e articular, alteração da função
hepática em pacientes que já tenham comprometimento desse órgão, prurido e erupção
cutânea; coloração vermelho-alaranjada da urina, fezes, saliva, escarros, suor e
lágrimas, reação do tipo imunológica em pacientes com tratamento intermitente, com
doses elevadas, de até 1200 mg, podendo ocorrer dispinéia, chiado, púrpura e
leucopenia (Korolkovas & França, 2002).
2.6.5. Estudo de estabilidade de princípios ativos
O estudo de estabilidade acelerada de princípios ativos é necessária à seleção de
um método indicador de estabilidade, que pode ser definido como o procedimento que
permite a determinação seletiva do fármaco na presença de seus produtos de alteração.
A exposição dos fármacos a elevadas taxas de temperatura e umidade de forma
significativa, possibilita conversões polimórficas indesejáveis (Miller; Raw; Yu, 2005).
O polimorfismo é a habilidade uma molécula adquirir mais de uma forma ou estrutura
cristalina (Hilfiker, 2006). Diferentes direções no crescimento do cristal durante o
processo de cristalização geram alterações, essas variações no crescimento causam
alterações nas propriedades físico-químicas e provocam altercações entre os polimorfos
como: forma, dureza, solubilidade, densidade, faixa de fusão, entre outras
consequências (Raw et al., 2004). O polimorfismo em fármacos pode resultar não
apenas na diminuição na atividade farmacológica, mas também pode gerar compostos
tóxicos dentre os produtos de degradação da substância (Miller; Raw; Yu, 2006).
Segundo a Legislação Brasileira vigente, os testes de estabilidade acelerada são
destinados acelerar a degradação química ou mudanças físicas de um produto
farmacêutico pelo uso de condições de estresse forçadas. Os fatores ambientais, tais
como temperatura, umidade, luz e calor, os fatores relacionados ao próprio produto
(propriedades físico-químicas das substâncias ativas e dos excipientes), a forma
farmacêutica e sua composição, o processo de fabricação e o tipo e as propriedades dos
materiais de embalagem têm ação direta sobre a estabilidade dos produtos
farmacêuticos (BRASIL, 2005).
O teste de estresse é definido como teste de estabilidade para fármacos e
medicamentos sob condições extremas. A investigação da estabilidade intrínseca do
fármaco fornece abordagens de formulação e indica tipos de adjuvantes, aditivos de
proteção específicos e de acondicionamento, que provavelmente melhorarão a
Bento Pereira da Costa Neto
35
Capítulo 2. Revisão bibliográfica
Tese de doutorado
integridade do fármaco e do produto. Demonstrando-se assim, que o conhecimento do
comportamento químico pode ser usado para garantir a estabilidade da forma
farmacêutica desejada (Reynolds et al., 2002; Aulton, 2005).
As alterações na estabilidade são, portanto, um impacto sobre a segurança,
eficácia e qualidade do medicamento. Nessas circunstâncias, é importante ter controles
adequados sobre as diferentes formas polimórficas dos diferentes fármacos para
assegurar a reprodutibilidade da biodisponibilidade dos produtos durante o seu
armazenamento.
Diante disto, observa-se a importância da avaliação das características dos
fármacos quanto à presença de polimorfismo e estabilidade da formulação farmacêutica,
visto que quaisquer alterações influenciam diretamente nas características dos fármacos.
Stulzer & Silva (2006) produziram grânulos de captopril (fármaco utilizado para
tratamento de hipertensão arterial) em leito fluidizado utilizando os polímeros
etilcelulose, metilcelulose e polivinilpirrolidona. Três formulações distintas de
comprimidos foram produzidas a partir dos grânulos revestidos. O estudo de
estabilidade acelerado foi realizado durante 3 meses em diferentes condições de
temperatura, umidade relativa e luz ultravioleta. Os resultados obtidos mostraram que o
revestimento foi adequado para promover um aumento da estabilidade do fármaco,
especialmente para os grânulos revestidos com etilcelulose.
Alves (2007) aplicou a análise térmica, DRX e outras técnicas físico-químicas e
analíticas para o desenvolvimento e controle de qualidade de fármacos e medicamentos
para tratamento de tuberculose, em especial a rifampicina. Estas técnicas permitiram:
avaliar a estabilidade e o processo de decomposição da rifampicina e dos excipientes,
utilizados em formulações farmacêuticas; diferenciar os dois tipos de formas
polimórficas; desenvolver estudos para determinação de parâmetros cinéticos e avaliar
as possíveis interações entre a rifampicina e excipientes.
Lima (2008) estudou a estabilidade acelerada do anti-hipertensivo enalapril. A
estabilidade das formulações contendo o maleato de enalapril foi afetada quando
expostas a altos níveis de temperatura e umidade, sendo verificada por cromatografia
líquida de alta eficiência a formação de dois produtos de degradação: enalaprilato e
dicetopiperazina.
Santos, Aragão e Furlan (2009) avaliaram as possíveis alterações físicas e
químicas da solução de paracetamol 200mg/mƖ através da estabilidade acelerada. Cada
amostra foi armazenada em condições ambientais diferentes e foi analisada no momento
Bento Pereira da Costa Neto
36
Capítulo 2. Revisão bibliográfica
Tese de doutorado
inicial, após 60 dias e após 90 dias. As amostras foram examinadas segundo a
Farmacopeia brasileira, quarta edição, nos requisitos de aspecto, pH e doseamento.
Através do referido estudo, foi possível verificar que o método de espectrofotometria
em UV não é recomendado para estudos de estabilidade térmica de solução de
paracetamol, por sofrer interferência de seu produto de degradação.
Silva (2010) desenvolveu uma formulação inédita com os fármacos isoniazida
(H), pirazinamida (Z) e rifampicina (R), associados em comprimidos dose fixa
combinada (DFC) para serem utilizados no tratamento dos casos novos da tuberculose.
Neste estudo foi realizado teste de estabilidade em duas formulações à 40 ± 2 °C / 75 ±
5% UR. Os ensaios de estabilidade acelerada de três meses objetivaram o
acompanhamento da degradação química e/ou mudança física dos comprimidos de
DFC, da mistura física em condições forçadas de armazenamento (BRASIL, 2005).
Para tanto, foram empregadas técnicas DRX, DSC e CLAE. Evidenciaram interação
para as concentrações utilizadas nas formulações propostas demonstrando instabilidade
para a associação.
2.6.5.1.
Manitol
O manitol é um álcool hexa-hídrico usado em produtos farmacêuticos,
principalmente como diluente (10-90% em massa) em formulações de comprimidos
(Hulse et al., 2009). Sua estrutura química é dada na Figura 2.13.
Figura 2.13. Estrutura química do manitol (fórmula bruta C6H14O6)
O manitol apresenta diferentes formas polimórficas (α, β e δ) como representado
pelos seus respectivos difratogramas de raios-X (Figura 2.14). Como pode-se notar a
difração de raios-x é uma técnica discriminativa para identificar as diferentes formas do
manitol e é a técnica que tem sido usada para acompanhar variações polimórficas deste
produto em diferentes condições de produção ou estocagem. A Tabela 2.8 apresenta os
picos característicos em difratograma de raios-X destes 3 polimorfos do manitol (Hulse
Bento Pereira da Costa Neto
37
Capítulo 2. Revisão bibliográfica
Tese de doutorado
et al, 2009). Em condição ambiente a forma β-manitol é a forma termodinamicamente
estável.
Figura 2.14. Difratogramas do α Manitol, β Manitol e δ Manitol.
Tabela 2.8. Picos característicos em DRX para os polimorfos do manitol (Hulse et al 2009)
Polimorfo
Alfa (α Manitol)
Beta (β Manitol)
Delta (δ Manitol)
Posição do pico (valores de 2)
9,57 e 13,79
10,56; pico relativamente intenso em 14,71 (presente em alfa e
delta mas pouco expressivos)
Pico extremamente intenso a 9,74; sem outros picos até 14,66
O manitol foi escolhido como ativo a ser introduzido nas micropartículas de
quitosana nanoestruturadas com sílica devido ao fato de que, no processo de secagem
por spray drying, é possível que o manitol apresente diferentes formas polimórficas ou
mistura de polimorfos com material amorfo. Isto pode ocasionar mudanças nas
propriedades do sólido (Haleblian & Mccrone, 1969). Como consequência, muitas das
propriedades importantes para a área farmacêutica são afetadas quando o manitol é
usado como excipiente
como, por exemplo: velocidade
de
dissolução e,
consequentemente, biodisponibilidade, densidade aparente e verdadeira, forma do
cristal, compactação e escoamento do pó, além da estabilidade química e física dos
fármacos (Haleblian & Mccrone, 1969; Vippagunta; Brittain; Grant, 2001).
Bento Pereira da Costa Neto
38
Capítulo 2. Revisão bibliográfica
2.7.
Tese de doutorado
Propriedades adsorventes
A adsorção é um fenômeno de superfície em que uma quantidade finita de
moléculas de um fluído (adsorbato), adere à superfície de um sólido (adsorvente). Pode
ser classificada como adsorção química ou física dependendo da intensidade das forças
envolvidas. A adsorção física abrange forças do tipo não covalente, em decorrência da
sobreposição de várias interações. Na adsorção química, as forças envolvidas no
fenômeno são do tipo covalente, ocorrem entre adsorbato e adsorvente, e os efeitos
interativos provocados por essas ligações, entre os sítios ativos e os íons do adsorbato,
ocorrem frequentemente na superfície do adsorvente (Adamson, 1990).
Na adsorção, a noção das propriedades de equilíbrio e de cinética é de extrema
importância para determinação das características de processo e da escolha do
adsorvente. Um sistema adsorbato-adsorvente está em equilíbrio quando não há mais
variações na concentração do adsorbato no meio em estudo (Torres, 2006).
Ao se comparar o desempenho de sistemas de adsorção, alguns parâmetros têm
importância fundamental, tais como a estabilidade química do sistema, a composição do
meio, a capacidade máxima de adsorção do adsorvente (q m) e a constante cinética de
dissociação do complexo: molécula de interesse e adsorvente (Kd).
O método do tanque agitado emprega uma série de frascos, na forma mais
apropriada ao experimento, com diferentes concentrações do adsorbato, em contato com
certa quantidade de adsorvente. O sistema tem valores de temperatura, pH e agitação
controlados durante o experimento até que se atinja o equilíbrio. Após equilíbrio, as
amostras são analisadas quanto ao adsorbato remanescente na fase fluida (Pereira,
1999). O balanço de massa da Equação 2.2 é usado para determinar a quantidade
adsorvida partindo de uma concentração inicial de adsorbato.
(Equação 2.2)
Onde Q é a massa adsorvida de adsorbato por grama de adsorvente, V é o
volume da solução, Ci é a concentração inicial de adsorbato, Cf é a concentração final
de adsorbato no equilíbrio e m é a massa de adsorvente. Equilíbrios de fases podem ser
representados por isotermas, curvas que relacionam os dados de concentração da fase
adsorvida no equilíbrio e a concentração remanescente de adsorbato na fase fluida.
Bento Pereira da Costa Neto
39
Capítulo 2. Revisão bibliográfica
Tese de doutorado
Alguns modelos matemáticos podem ser usados com o objetivo de descrever esses
dados obtidos (Torres, 2006).
A cinética de adsorção fornece o tempo necessário para que esse equilíbrio seja
atingido. Os valores obtidos são influenciáveis pelos parâmetros da fase fluida,
características geométricas do adsorvente, velocidade de agitação, temperatura e
solvente da fase fluida. Existem vários modelos matemáticos que podem ser usados para
descrever o comportamento cinético do sistema adsorbato-adsorvente em estudo
(Torres, 2006).
Segundo Gerard et al. (1997), quando a molécula é relativamente pequena, ela se
torna facilmente acessível aos ligantes imobilizados na matriz porosa, e o balanço
global e dinâmico da adsorção acontece rapidamente. Com isso, o equilíbrio local se
torna válido. A isoterma de Langmuir representa um modelo simplificado no caso de
adsorção de proteínas, uma vez que este modelo assume: (a) sistema ideal; (b) as
moléculas são adsorvidas e aderem à superfície do adsorvente em sítios definidos e
localizados; (c) cada sítio pode acomodar uma e somente uma molécula adsorvida; (d) a
energia da molécula adsorvida é a mesma em todos os sítios da superfície e não depende
da presença ou ausência de outras moléculas adsorvidas nos sítios vizinhos; e (e) todos
os sítios de adsorção têm a mesma afinidade com as moléculas de proteína.
As curvas das isotermas de Langmuir são obtidas de acordo com as Equações
2.3 e 2.4, nas formas normal e linearizada, respectivamente. Nestas expressões, Qe
representa a quantidade adsorvida no equilíbrio; Ce é a concentração em solução no
equilíbrio; Kads e Qmax têm os seus significados já mencionados. Tais curvas
referentes a esse modelo (Ce/Qe em função de Ce) apresentam, para muitos casos, uma
equação da reta que será utilizada nos cálculos para obtenção dos valores de Qmax e
Kads, a partir dos coeficientes linear e angular que estas retas apresentam.
(Equação 2. 3)
(Equação 2.4)
Bento Pereira da Costa Neto
40
Capítulo 2. Revisão bibliográfica
Tese de doutorado
2.7.1. Adsorção de proteína
A adsorção de proteínas em matrizes poliméricas é uma questão de interesse em
vários processos. O fenômeno envolve a proteína (adsorbato), o adsorvente (polímero)
fixo ou em suspensão, a existência de sítios de adsorção e diversos tipos de interação.
As interações entre as proteínas e os adsorventes são combinações de forças
intermoleculares importantes no entendimento dos eventos de adsorção que ocorrem
muitas vezes em ambientes complexos. Além disso, as características do solvente
presente no meio são de fundamental importância (Branden e Tooze, 1991).
As proteínas são polímeros de aminoácidos envoltos em uma estrutura
tridimensional, principalmente por interações dipolo-dipolo, ligações de hidrogênio, por
interações de Van der Waals e por ligações covalentes. As proteínas exibem cadeias
laterais hidrofóbicas preferencialmente no seu interior enquanto as cadeias laterais
hidrofílicas se localizam principalmente na sua superfície. Desta forma as proteínas
podem ser consideradas como polieletrólitos capazes de se dissolverem em água, um
exemplo é a BSA que possui solubilidade em água de 585 mg/mƖ (Kozinski &
Lightfoot, 1972). A estabilidade das proteínas em solução baseia-se na competição entre
as interações solvente-soluto com interações intramoleculares, necessárias para manter a
estrutura das proteínas (Hidalgo & Hansen, 1969). A proteína albumina do soro bovino
(BSA) é uma das proteínas mais vastamente pesquisadas em todo mundo. São várias as
pesquisas sobre a estrutura e as propriedades da BSA assim como suas interações com
outros materiais.
Araujo (1996) adotou duas técnicas experimentais para a obtenção de isoterma
de adsorção de proteínas em solução líquida utilizando-se resinas macroporosas
trocadoras de íons como sólido adsorvente. A técnica de experimentos em tanques
agitados permitiu impetrar informações sobre a cinética de adsorção e também as
isotermas de equilíbrio para dois adsorventes, ambos contendo grupos do tipo amino
quaternário, na adsorção da BSA. A outra técnica, experimentos em colunas de
adsorção, permitiu obter as curvas do tipo breakthrough e consequentemente a isoterma
de equilíbrio para apenas um dos adsorventes na adsorção da mesma proteína. O
tratamento matemático das isotermas através do modelo de Langmuir conduziu aos dois
parâmetros do modelo para uma temperatura de 240 C para o sistema BSA. A
modelagem matemática das curvas cinéticas obtidas permitiu aperfeiçoar os parâmetros
que exprimem a convecção externa e a difusão interna às partículas para os
experimentos em tanques agitados para o sistema BSA. As curvas indicaram um
Bento Pereira da Costa Neto
41
Capítulo 2. Revisão bibliográfica
Tese de doutorado
comportamento similar para colunas operando em leito fixo e em leitos fluidizados. Nos
experimentos em leito fixo, foi obtido o parâmetro tempo estequiométrico, que possui
importância na interpretação da adsorção com relação ao balanço de massa e à
ampliação de escala do processo.
Rezwan et al. (2005) estudaram a adsorção da BSA, (carregada negativamente) e
da lisozima (carregada positivamente) a pH = 7,4 em partículas de sílica sem
revestimento e com revestimento de AlOOH (AlOOH2 +) numa faixa de pH desde
ácido a básico, por análise de potencial zeta e por espectroscopia de UV-Visível. Os
autores observaram que a albumina se adsorve em maior quantidade nas partículas de
sílica com revestimento, enquanto a lisozima apresenta maior afinidade para as
partículas de sílica sem revestimento. Estes resultados sugerem que neste pH, as
interações de atração eletrostática governam o processo de adsorção das duas proteínas,
em superfícies de óxidos.
Torres (2006) produziu microesferas de quitosana com tamanho controlado e
porosidade influenciada pela técnica de Spray dryer e coagulação. As microesferas
produzidas foram modificadas quimicamente com anidrido acético, epicloridrina e
glutaraldeído com objetivos de aperfeiçoar suas características iniciais de resistência e
estabilidade. As microesferas obtidas foram analisadas quanto às suas propriedades
estruturais, capacidade de adsorção e dessorção. As microesferas foram utilizadas em
sistemas de adsorção em banho finito e coluna de leito fixo. Os adsorbatos utilizados
foram as proteínas: BSA, lisozima e um concentrado protéico (condição real) obtido do
soro do leite. As proteínas BSA e lisozima apresentam pontos isoelétricos distintos de
4,8 e 11, respectivamente, permitindo assim avaliar o sistema adsorvente-adsorbato
pelas isotermas de adsorção, cinética de equilíbrio, capacidade de dessorção e
regeneração dos adsorventes, em condições distintas de pH.
Li et al. (2008) produziram micropartículas de quitosana recobertas com
alginato, visando sua utilização na adsorção de antígenos. O método utilizado para
produção das micropartículas foi à gelificação ionotrópica e a albumina do soro bovino
(BSA) foi utilizada como proteína-modelo. As micropartículas foram produzidas e, em
seguida, a BSA foi adicionada a solução contendo as micropartículas de
quitosana/alginato. Esta solução permaneceu sob agitação em condições controladas de
laboratório. Para determinar adsorção da BSA nas micropartículas de quitosana, os
pesquisadores centrifugaram a mistura e avaliaram a concentração de BSA livre no
sobrenadante. Os resultados indicaram uma eficiência de adsorção de 60%. Na
Bento Pereira da Costa Neto
42
Capítulo 2. Revisão bibliográfica
Tese de doutorado
dessorção da BSA in vitro, as micropartículas foram dispersas em solução tampão
fosfato (pH 7,4) a uma temperatura de 37ºC e 100 rpm. Os resultados de dessorção
indicaram uma liberação de mais de 95% da BSA em 5 horas.
Ferreira (2009) estudou interação da albumina do soro bovino (BSA) com
substratos sintéticos. Foi estudado a viabilidade de substratos de vidro, quartzo, mica e
ITO (óxido de índio e estanho) modificado com quitosana, phtalocyanines (Ni, Fe e Ni)
e poli (alilanina hidroclorada) (PAH) na adsorção de BSA em forma dos filmes
produzidos pela técnica camada por camada. Os filmes foram estudados por UV-Vis e
espectroscopia de fluorescência estática e resolvida no tempo. A caracterização
morfológica dos filmes foi realizada por microscopia de força atômica e microscopia
óptica. Os resultados mostram que os filmes de BSA / HAP cresceram com eficiência
quatro vezes maior do que os filmes feitos de quitosana, que o quartzo tem a melhor
janela de trabalho de UV-vis e há uma relação entre o pH da BSA e o tempo vida de
fluorescência do filme resultante.
Sari (2011) estabeleceu parâmetros de trabalho utilizando micropartículas de
quitosana produzidas por coacervação simples, de modo a padronizar a utilização da
quitosana como matriz de adsorção proteica, em processos de formulação de vacinas.
Inicialmente, foi avaliada a influência do tensoativo sobre a metodologia de
quantificação de proteínas totais, que posteriormente foi utilizada na medida da
eficiência de adsorção da BSA. Em seguida, foi determinada a concentração do agente
precipitante para precipitação da quitosana e formação de micropartículas. Finalmente,
foi determinada a eficiência de adsorção BSA. Verificou-se que o tensoativo,
Polisorbato 80, possui significativa influência na leitura de amostras proteicas pelo
método de Bradford (1976), a 595 nm em espectrofotômetro, à medida que o tensoativo
Poloxamer não apresentou influência. A concentração de agente precipitante, a solução
de Na2SO4 (sulfato de sódio) a 20% (m/v), foi estabelecida em 1,5 mƖ, para uma
solução de 50 mƖ de quitosana a 0,25% (m/v), na presença de 1,25% (m/v) de tensoativo
Poloxamer. A eficiência de adsorção pela metodologia proposta variou de 32,55% a
40,37% para a faixa de concentração inicial de 0,5 a 3,0 mg/mƖ de BSA. A metodologia
proposta se mostrou aplicável para a formulação de vacinas de liberação controlada
contra o botulismo em animais.
Bento Pereira da Costa Neto
43
Capítulo 2. Revisão bibliográfica
2.8.
Tese de doutorado
Ensaios biológicos
A avaliação de segurança de compostos como drogas, cosméticos, aditivos
alimentares, pesticidas e produtos químicos industriais está crescendo ano a ano.
Ensaios de citotoxicidade estão entre os primeiros métodos de bioensaios in vitro
utilizados para prever a toxicidade de substâncias para vários tecidos. Eles são
utilizados para determinação de proliferação, viabilidade e ativação celular. Por isso,
surge a necessidade de ensaios confiáveis, sensíveis e quantitativos, que possibilitem a
análise de um grande número de testes em estudos pré-clínicos (Xenometrix, 2014).
Análise colorimétrica para quantificação de integridade de membrana e
viabilidade celular em resposta à exposição a compostos farmacêuticos, químicos e
ambientais e também a nutrientes (Xenometrix, 2014).
A citotoxicidade é determinada pela quantificação dos danos à membrana. A
enzima intracelular lactato desidrogenase (LHD) é rapidamente liberada das células
danificadas para o sobrenadante da cultura de células. O consumo de NADH
(nicotinamida adenina dinucleótido hidreto), medido cineticamente no sobrenadante da
célula, é correlacionado com a quantidade de LDH liberada (LDHe). A viabilidade
celular é inversamente proporcional à quantidade de LDH liberada (Xenometrix, 2014).
Bento Pereira da Costa Neto
44
CAPÍTULO 3
Micropartículas de quitosana nanoestruturadas
com sílica
Capítulo 3. Micropartículas de quitosana nanoestruturadas com sílica
3.1.
Tese de doutorado
Metodologia experimental
As micropartículas de quitosana nanoestruturadas com sílica foram obtidas por
processo de spray drying através de um estudo experimental que foi desenvolvido em
diferentes etapas sucessivas, como esquematizado na Figura 3.1.
Solubilização da quitosana em meio
ácido (aquoso)
(a)
Etapa de dispersão de sílica na solução
aquosa de quitosana
Secagem por spray drying
(b)
Obtenção de microparticulas
de quitosana-silica
(c)
Caracterização das microparticulas de
quitosana-silica
Figura 3.1. Fluxograma de obtenção das micropartículas de quitosana-sílica
Primeiramente definiu-se o procedimento experimental de dispersão das
nanopartículas de sílica (Aerosil 200 et Aerosil R972) na solução de quitosana.
Diferentes técnicas de dispersão foram testadas, dentre elas: ultrassom, ultra turrax e
homogeneizador de alta pressão (HAP). Uma vez definida a técnica de dispersão,
procedeu-se o estudo de sensibilidade paramétrica variando-se condições de processo e
de formulação e verificando-se o efeito destas variáveis nas características dos produtos
obtidos como granulometria, capacidade de sorção de umidade, estabilidade ácida,
carga superficial e liberação de princípios ativos.
O procedimento experimental, as técnicas de caracterização empregadas e os
resultados obtidos são apresentados a seguir. Os materiais e equipamentos utilizados na
realização de todo o trabalho de tese são apresentados no Anexo 1.
Bento Pereira da Costa Neto
46
Capítulo 3. Micropartículas de quitosana nanoestruturadas com sílica
Tese de doutorado
3.1.1. Dispersão das sílicas Aerosil R972 e Aerosil 200 na solução
de quitosana
Para este estudo, preparou-se 100 ml de uma solução de quitosana a 1% em
massa, cujo pH foi ajustado para 5 com ácido acético glacial. Com a finalidade de
promover uma boa dispersão das nanopartículas de sílica, à esta solução adicionou-se
lentamente 1 g de sílica Aerosil 200 utilizando-se três diferentes métodos de
dispersão: agitação mecânica pelo uso de um ultraturrax, homogeneização por alta
pressão (HAP) e uso de ultrassom.
A dispersão com ultra turrax (Heidolph Diax 900) foi realizada sob agitação de
27050 rpm (método 1). A dispersão com HAP (APL 50 –Artepecas) foi realizada sob
uma pressão de 600 bar (método 2). Na dispersão com sonda de ultrassom (Elma,
Modelo T460) foi utilizada frequência ultrassônica de 35 kHz (método 3). O grau de
dispersão foi avaliado através do monitoramento do diâmetro das nanopartículas de
sílica (aparelho LS 230 COULTER ® granulometer) em função do tempo durante 10
minutos.
A dispersão de sílica Aerosil R972 na solução aquosa de quitosana necessitou
o desenvolvimento de um procedimento específico em função de suas características
hidrofóbicas e tendência à aglomeração em meio aquoso devido à não afinidade com
este meio. A estratégia empregada foi o uso de um solvente orgânico (etanol) miscível
com a solução aquosa de quitosana e capaz de molhar a sílica Aerosil R972. A
composição do meio contendo o co-solvente foi determinada analisando-se o ângulo de
contato deste meio com Aerosil R972 em função da proporção água-etanol, descrito a
seguir (item 2.2.2).
3.1.2. Determinação do ângulo de contato entre Aerosil R972 e
mistura água-etanol (gota séssil)
Através deste método da gota séssil, uma gota de líquido é depositada sobre a
superfície de um sólido por meio de micro-seringa. A gota é analisada com uma lente e
o ângulo de contato é medido através de um goniômetro. O valor do ângulo de contato
da gota de líquido depende da energia de superfície da amostra e da tensão superficial
do líquido e varia de 0 a 180 graus. Como regra geral, um líquido molha um substrato
quando o ângulo de contato formado entre o líquido e o sólido é menor que 90°
(Martinez, 1998).
Bento Pereira da Costa Neto
47
Capítulo 3. Micropartículas de quitosana nanoestruturadas com sílica
Tese de doutorado
Para os ensaios, pastilhas de sílica hidrofóbica (1 x 0,5 cm) foram preparadas e
uma gota de solução etanol/água (EtOH/H2O) em diferentes proporções volumétricas
(0, 5, 10, 15 e 20% etanol v/v) foi depositada na superfície das mesmas, como
esquematizado na Figura 3.2.
Figura 3.2. Representação esquemática da medida do ângulo de contato líquido-sólido em função
da concentração do etanol na solução água/etanol em uma pastilha de Aerosil R972.
3.1.3. Medida da viscosidade das suspensões de quitosana e sílica
Neste estudo, avaliou-se o efeito da adição da sílica na viscosidade de uma
solução de quitosana de 1% (massa/volume). Essa solução de quitosana de baixo peso
molecular a 1% (m/v) foi preparada solubilizando-se a quitosana em água e ajustando-se
o pH para 5,5 – 6,0 com 0,5 M NaOH. A esta solução adicionou-se uma massa de sílica
Aerosil 200 ou Aerosil R972, variando de 0 a 1,1g.
As viscosidades destas
suspensões foram medidas em viscosímetro Brookfield, com coleta automática dos
dados pelo software Rheocalc V3.1-1. A temperatura de ensaio foi de 25 ± 0,2 ºC,
mantida por banho termostático. A velocidade aplicada foi de 5 rpm, utilizando spindle
SC4-31.
3.1.4. Secagem das dispersões de quitosana e sílica por spray drying
3.1.4.1.
Ensaios preliminares
Testes preliminares foram inicialmente realizados com soluções de quitosana em
concentrações de 1% e de 2% (massa/volume) para obtenção das micropartículas via
spray dryer. O equipamento utilizado para a secagem foi um mini-secador spray dryer
Büchi B 190 com capacidade nominal de evaporação de 1,5 kg H2O/h, dotado de um
Bento Pereira da Costa Neto
48
Capítulo 3. Micropartículas de quitosana nanoestruturadas com sílica
Tese de doutorado
sistema de aquecimento de ar, um sistema de injeção e um sistema de exaustão de gases
(Figura 3.3). O spray dryer operou continuamente com taxa de alimentação de 3ml/min,
com fluxos co-correntes de ar e solução de quitosana e com um bico atomizador tipo
duplo fluido com mistura externa de fluidos (liquido a secar e ar). O material
particulado produzido foi aspirado e coletado por um ciclone conectado à extremidade
inferior do secador. Os finos não retidos no ciclone foram coletados por um filtro manga
colocado na linha de evacuação de gás do laboratório.
Figura 3.3. Secador tipo Spray Dryer Büchi B 190. Fonte: arquivo pessoal, 2013.
Nesta fase de ensaios preliminares, investigou-se o efeito das seguintes
variáveis:
 Temperatura de entrada do ar de secagem: 105°C ou 150°C;
 Diâmetro do orifício do bico atomizador: 0,5 mm ou 0,7mm.
Os produtos da secagem foram analisados pelo diâmetro, carga superficial,
densidade (ρtap), diâmetro aerodinâmico e teor de umidade das micropartículas secas,
descritos posteriormente.
3.1.4.2.
Produção de micropartículas de quitosana-sílica
Após a série de ensaios preliminares avaliando-se o efeito de variáveis do
processo de secagem, fixou-se as condições experimentais para a produção de amostras
de micropartículas de quitosana/sílica.
Bento Pereira da Costa Neto
49
Capítulo 3. Micropartículas de quitosana nanoestruturadas com sílica
Tese de doutorado
Para produção destas micropartículas, o seguinte procedimento experimental foi
utilizado: A solução de quitosana (1g) de 80 ml foi preparada solubilizando o polímero
em água ultra pura contendo 3% w/v de ácido acético. A solução foi mantida em
agitação mecânica por aproximadamente 30 min. Após a completa dissolução da
quitosana o pH foi ajustado para 5,5-6,0 com NaOH 0,5 M.
Com o intuito de facilitar a dispersão das nanopartículas de sílica na solução de
quitosana, essas foram primeiramente dispersas no meio adequado. As nanopartículas
de Aerosil R972 foram dispersas em etanol e as nanopartículas de Aerosil 200 em
água ultra pura. Em seguida a suspensão de sílica (aproximadamente 25ml de etanol ou
20 ml de água) foi adicionada à solução de quitosana e mantida agitação de 200 rpm.
Posteriormente, a suspenção contendo quitosana e sílica foi homogeneizada, a fim de
quebrar partículas agregadas, usando-se um homogeneizador de alta pressão (model
APV- 2000, Stansted Fluid Power, APV, USA) operando a 800 bar por cinco ciclos de
homogeneização.
As condições experimentais usadas no spray dryer para a produção das
micropartículas são apresentadas na Tabela 3.1.
Tabela 3.1. Condições operacionais usadas nos experimentos de spray drying.
Formulação
1
2
3
4
5
6
Vazão de alimentação (mƖ/min)
3
3
3
3
3
3
Vazão do ar de atomização (NL/h)
600
600
600
600
600
600
Tipo de Aerosil*
R972
R972
R972
200
200
200
Concentração de Sílica na solução (1%)
1
0,5
0,1
1
0,5
0,1
Temperatura de entrada - Tentrada (ºC)
105
105
105
105
105
105
Temperatura de saída - Tsaída(ºC)
80
80
80
80
80
80
* Aerosil 200: sílica fumegada hidrofílica. Aerosil R972: Sílica fumegada hidrofóbica;
3.1.5. Caracterização das micropartículas
Após a secagem, os produtos secos obtidos foram caracterizados quanto à
granulometria, densidade aparente, diâmetro aerodinâmico, área superficial, morfologia
e potencial zeta.
Bento Pereira da Costa Neto
50
Capítulo 3. Micropartículas de quitosana nanoestruturadas com sílica
3.1.5.1.
Tese de doutorado
Granulometria
As distribuições de tamanho de partícula foram determinadas utilizando análise
de difração a laser no espalhamento diferencial de intensidade de polarização (PIDs)
modo óptico (Beckman Coulter, modelo LS 230, Miami, FL). As amostras das
micropartículas nanoestruturadas com sílica foram dispersas em óleo minfoil, até que a
obscuração necessária fosse alcançada (aproximadamente 40% PIDS). O diâmetro
médio de partícula foi expresso como o diâmetro médio volumétrico (d 4.3), equivalente
ao diâmetro de uma esfera que possui a mesma área projetada que a partícula. A
polidispersão é dada por um índice de distribuição de tamanho de partícula (span),
calculada pela Equação 3.1:
Span = (d0,9 - d0,1)/ d0,5
(Equação 3.1)
onde d0,1, d0,5 e d0,9 representam os diâmetros acumulados de 10, 50 e 90 % das
partículas, respectivamente. As medidas foram realizadas em triplicata.
3.1.5.2.
Densidade aparente.
A densidade aparente das amostras foi medida em um aparelho automático
modelo AutoTap, marca Quantachrome. A densidade aparente de mínimo
empacotamento (ρb) foi obtida pesando-se a massa de amostra M (5g) introduzida em
um recipiente de volume conhecido (V1 = 25 mƖ). A densidade aparente compactada (ρt)
foi determinada após 3000 batidas realizadas automaticamente pelo aparelho e
medindo-se o novo volume (V2) ocupado pela amostra. Este número de batidas foi
fixado após testes preliminares indicarem que um número superior a 3000 vezes
resultava numa variação desprezível do volume da amostra compactada.
3.1.5.3.
Diâmetro aerodinâmico
O valor do diâmetro aerodinâmico (da) (Dellamary, et al., 2000) foi obtido
através da relação envolvendo o diâmetro médio (D 4,3) e a densidade aparente
compactada (ρtap), definida pela Equação 3.2:
(Equação 3.2)
Bento Pereira da Costa Neto
51
Capítulo 3. Micropartículas de quitosana nanoestruturadas com sílica
3.1.5.4.
Tese de doutorado
Área especifica
A área especifica foi medida por meio da técnica de Brunauer, Emmett e Teller
(BET) usando o equipamento PAEA 2010, Micromeritics (EUA). As amostras de
micropartículas foram pesadas (0,5 g) em tubos de vidro e pré-tratadas para remoção da
umidade em uma estufa com circulação de ar a 50 º C durante 12h. No intervalo de
validade da isoterma do BET, a área específica foi calculada a partir da inclinação e
intercepção da linha formada por cinco pontos de medição.
O volume e o diâmetro médio dos poros das micropartículas foram obtidos pela
técnica de Barrett-Joyner-Halenda (BJH). Eles são calculados através de gás adsorvido
para uma pressão relativa próxima da saturação (P/Po≈1) (Webb & Orr, 1997).
3.1.5.5.
Microscopia eletrônica de varredura e de transmissão
As partículas foram observadas por microscopia eletrônica de varredura (MEV)
(JEOL JSM-6360LV, Japão) após recobrimento com ouro e por microscopia eletrônica
de transmissão (TEM) (Philips CM120 80kV) após a incorporação das micropartículas
em resina epóxi e corte em micrótomo para análise TEM.
3.1.5.6.
Carga superficial-potencial zeta
O potencial zeta foi avaliado por mobilidade electroforética utilizando um
DelsaNano C (Beckman Coulter, EUA). Todas as amostras foram dispersas em água
deionizada e o pH foi ajustado (4,0 a 7,4) por adição de HCl 0,5 M ou NaOH 0,5 M.
Cada valor potencial zeta relatado é uma média de 10 determinações.
3.1.5.7.
Teor de umidade
O teor de umidade foi medido por titulação de Karl Fisher em metanol seco
usando um titulador DL38 (Mettler-Toledo, Suíça). As medições foram realizadas em
triplicata. Os espectros de FTIR foram obtidas através de um espectrofotômetro Nicolet
FTIR-6700 (Thermo Scientific, EUA), utilizando uma pastilha de KBr na faixa de 500 –
4500 cm-1, resolução de 4 cm-1.
3.1.5.8.
Análise termogravimétrica
As curvas TG das amostras foram obtidas por um TG - Mettler Toledo, modelo
SDTA851. Foi utilizado um suporte de amostra padrão de cerâmica de alumina (Al 2O3).
As amostras foram pesadas em balança de precisão Mettler Toledo, modelo XS205. As
Bento Pereira da Costa Neto
52
Capítulo 3. Micropartículas de quitosana nanoestruturadas com sílica
Tese de doutorado
análises foram realizadas sob uma atmosfera de oxigénio a uma velocidade de fluxo de
50 mƖ.min-1, de 0 a 800°C a uma taxa de aquecimento de 10 ° C.min -1. O conteúdo
inorgânico das micropartículas foi determinado pela pesagem da cinza restante após a
degradação completa das amostras à 800 º C.
3.1.5.9.
Calorimetria diferencial de varredura
Os termogramas de DSC das amostras foram obtidos através de um Calorímetro
Diferencial de Varredura DSC822 (Mettler Toledo) usando um suporte de amostra de
alumínio selado, sendo as amostras pesadas numa balança de precisão Mettler Toledo
marca, modelo XS205. As análises foram realizadas sob uma atmosfera de oxigénio a
uma velocidade de fluxo de 50 ml.min-1 na faixa de temperaturas 20-450° C, a uma taxa
de aquecimento de 10° C.min-1.
3.1.5.10.
Difratometria de raios X
Para a análise de DRX, as amostras foram prensadas em um porta-amostras de
alumínio e os dados foram coletados em um difratômetro de raios X Shimadzu, XRD
6000, na radiação CuKα (λ = 1.5418 A), operando a 40 KV e 40 μA tensão e corrente
do tubo, respectivamente. A varredura foi feita no intervalo de 5 a 50 °(2Θ), com um
passo de 0,02 °(2Θ) e 5 seg/passo. Os resultados foram obtidos a partir dos programas
XRD-6000 software.
3.1.5.11.
Sorção dinâmica de vapor
A cinética de sorção de vapor de água foi medida usando-se um aparelho DVS-2
(Surface measurement systems Ltd, London, UK). O DVS-2 mede a adsorção e
dessorção de vapor por gravimetria usando uma microbalança. A Figura 3.4 mostra um
esquema do sistema de sorção dinâmica de vapor utilizado (Goalard, 2005).
Bento Pereira da Costa Neto
53
Capítulo 3. Micropartículas de quitosana nanoestruturadas com sílica
Tese de doutorado
Figura 3.4. Esquema de um sistema de sorção dinâmica de vapor (Goalard, 2005).
A umidade relativa em torno da amostra foi controlada pela mistura de correntes
de gás, seca e saturada de água em proporções controladas por um controlador de vazão.
A temperatura foi mantida constante. Antes de ser exposta a qualquer vapor de água, a
amostra foi seca a 0% de umidade relativa para remover qualquer água presente. Em
seguida, a amostra foi exposta a uma umidade relativa desejada e a adsorção de água foi
medida. Isto foi realizado através de uma série de umidades relativas a 25°C. A
quantidade de água adsorvida e/ou dessorvida foi expressa como uma porcentagem da
amostra seca. Aproximadamente, 100 mg de amostra foi pesada e colocada em
atmosfera de umidade relativa variável, em ciclos de sorção - dessorção, a passos de 10
% por hora na faixa de 0 – 90 % de umidade relativa. A sorção de equilíbrio para cada
passo de umidade foi determinada pela variação da massa em relação ao tempo de 0,007
dm/dt.
3.1.5.12.
Caracterização biológica
3.1.5.12.1. Produção de óxido nítrico por macrófagos
Os macrófagos foram obtidos por lavagem peritoneal de ratos BALB/c. As
células peritoneais foram deixadas aderidas a 96 poços das microplacas de cultura (TPP)
em 4x 105 células/poço em 100 μl de meio DMEM (Meio de Eagle modificado por
Dulbecco). Após 1 h, a 37 º C e 5% de CO2, as células não-aderentes foram removidas e
os macrófagos aderentes foram cultivados durante mais 48 horas na presença ou
ausência de concentrações crescentes de micropartículas de quitosana nanoestruturadas
com sílica em 200 μl de meio DMEM mais 10% inativado pelo calor de soro fetal de
vitelo e 1% de DMSO (Dimetilsulfóxido). Para a estimulação positiva, as células foram
Bento Pereira da Costa Neto
54
Capítulo 3. Micropartículas de quitosana nanoestruturadas com sílica
Tese de doutorado
cultivadas com 1 μg.mƖ-1 de lipopolissacarídeo (LPS). As células não tratadas foram
cultivadas em meio isolado. No final da incubação, as placas de cultura foram
centrifugadas a 500 rpm durante 5 minutos, e a produção de óxido nítrico foi
indiretamente determinada nos sobrenadantes das culturas de células por seu produto de
oxidação de nitrito usando o método colorimétrico de Griess (Green et al., 1982).
3.1.5.12.2. Citotoxicidade
A liberação de lactato desidrogenase citoplasmática (LDH) é indicativo de lise
celular. Os macrófagos foram cultivados e tratados com as micropartículas
nanoestruturadas com sílica como já descrito (item 3.2.5.12.1). No final da incubação,
os sobrenadantes foram recolhidos. Para máxima liberação, as células foram cultivadas
em 2% de Triton X-100, e para a liberação espontânea, as células foram cultivadas em
meio isolado. A atividade de LDH foi determinada por um kit comercial colorimétrico
(a partir de Doles), de acordo com as instruções do fabricante. A porcentagem de
liberação específica foi calculada através da seguinte Equação:
(teste de liberação – liberação espontânea) x 100
(Equação 3.3)
(máxima liberação – liberação espontânea)
Bento Pereira da Costa Neto
55
Capítulo 3. Micropartículas de quitosana nanoestruturadas com sílica
3.2.
Tese de doutorado
Resultados e discussão
3.2.1. Dispersão das sílicas na solução de quitosana
3.2.1.1. Definição do procedimento de dispersão da sílica aerosil 200
Como descrito anteriormente, três diferentes técnicas de dispersão foram
testadas: dois métodos envolvendo agitação mecânica (uso de uma turbina ultra turrax e
de um homogeneizador de alta pressão) e uso de ultrassom, com o monitoramento do
diâmetro das nanopartículas de sílica. Os resultados são apresentados na Tabela 3.2.
Tabela 3.2. Efeito do modo e do tempo de dispersão na granulometria da sílica hidrofílica
(Aerosil 200) dispersa na solução aquosa de quitosana
Diâmetro das partículas de sílica (µm)
t (min)
Dispersão com
Dispersão com
Dispersão com
Ultrassom (µm)
Ultra Turrax (µm)
HAP (µm)
2
30,4 ± 3,3
22,1 ± 3,4
0,6 ± 0,1
4
28,4 ± 2,9
17,2 ± 3,9
0,4 ± 0,1
6
27,3 ± 1,1
14,6 ± 0,1
0,3 ± 0,1
8
26,9 ± 2,6
13,5 ± 0,5
0,3 ± 0,1
10
25,2 ± 2,1
11,4 ± 1,1
0,2 ± 0,1
A Tabela 3.2 mostra que as partículas de sílica hidrofílica, apesar de terem uma
dimensão nanométrica enquanto partículas primárias (20 nm, segundo o fabricante)
apresentam tendência a permanecerem aglomeradas como indica a medida de tamanho
na escala micrométrica. Os aglomerados formados têm um tamanho característico
próximo de valores citados na literatura e em fichas técnicas dos produtos comerciais
entre cerca de 0,2 e 0,3 μm (Bittnar et al., 2009).
A Tabela 3.2 apresenta que a melhor dispersão destes aglomerados é obtida com
a passagem da suspensão em homogeneizador de alta pressão (HAP), com o qual se
atinge a dispersão máxima esperada (0,1-0,3µm). O método de dispersão em
homogeneizador de alta pressão foi escolhido para a continuidade do trabalho. Novos
ensaios foram realizados, aumentando a pressão de homogeneização e realizando-se
medidas de tamanho a cada 3 minutos (Figura 3.5).
Bento Pereira da Costa Neto
56
Capítulo 3. Micropartículas de quitosana nanoestruturadas com sílica
Tese de doutorado
Figura 3.5. Diâmetro das partículas de sílica Aerosil 200 em função do tempo de dispersão em
HAP
O efeito positivo do procedimento de dispersão desenvolvido nesta etapa do
trabalho pode ser comprovado através de imagens de microscopia eletrônica de
varredura das micropartículas obtidas após secagem por spray drying de suspensões de
quitosana e sílica submetidas ao procedimento descrito em comparação a
micropartículas produzidas a partir da dispersão da sílica por simples agitação mecânica
após introdução da mesma na solução aquosa de quitosana (Figura 3.6).
Figura 3.6. Microfotografias (MEV) de partículas de quitosana nanoestruturadas com sílica: a)
sílica Aerosil 200 introduzida na solução de quitosana sem dispersão; b) sílica Aerosil 200
dispersa na solução de quitosana em homogeneizador de alta pressão (HAP).
Bento Pereira da Costa Neto
57
Capítulo 3. Micropartículas de quitosana nanoestruturadas com sílica
3.2.1.2.
Tese de doutorado
Determinação do ângulo de contato entre Aerosil R972 e uma
mistura água-etanol (gota séssil)
A sílica Aerosil R972 é hidrofóbica e, portanto, difícil de ser dispersa em
solução aquosa. Para assegurar a dispersão da sílica Aerosil R972 na solução de
quitosana, optou-se pela adição de etanol ao sistema. Para determinar a concentração
adequada de etanol a ser adicionada, mediu-se o ângulo de contato de uma soluçãoetanol contendo de 0 a 25% v/v de etanol sobre pastilhas de Aerosil R972 (dimensão 1
x 0,5 cm). A Figura 3.7 apresenta a variação do ângulo de contato formado por uma
gota de uma mistura água-etanol sobre a pastilha de Aerosil R972 em função do
volume de etanol na mistura. Os resultados mostram que a transição de meio não
molhante (Θ>90º) para meio molhante (Θ<90º) se fez para uma mistura água-etanol
com concentração em álcool próxima de 15% v/v. Este valor corrobora com a faixa de
valores apresentados na literatura para ângulo de contato entre sílica hidrofóbica e uma
mistura água-etanol, como sendo em torno de 20% v/v (Cugniet, 2003).
A partir destes resultados, fixou-se a concentração de 20% de etanol em volume
como co-solvente para garantir a completa dispersão do Aerosil R972 na solução
aquosa de quitosana.
Figura 3.7. Variação do ângulo de contato entre sílica Aerosil R972 e solução água/etanol em
função da concentração do etanol.
Bento Pereira da Costa Neto
58
Capítulo 3. Micropartículas de quitosana nanoestruturadas com sílica
3.2.1.3.
Tese de doutorado
Definição do tempo de homogeneização em HAP
A sílica Aerosil R972 foi dispersa na solução de quitosana utilizando-se o
mesmo procedimento desenvolvido para a dispersão da sílica Aerosil 200, ou seja,
homogeneização em HAP. O tempo de dispersão foi igualmente estudado através do
acompanhamento do diâmetro dos agregados de sílica após passagem pelo
homogeneizador nas mesmas condições fixadas para a sílica Aerosil 200. A Figura
3.8 apresenta os resultados obtidos. Uma melhor dispersão da sílica hidrofílica é
observada nos primeiros 10 min.
Figura 3.8. Diâmetro das partículas de sílica Aerosil R972 em função do tempo de dispersão em
HAP (homogeneização a 800 bar).
3.2.2. Efeito da sílica na viscosidade das suspensões de quitosana
A viscosidade da quitosana em solução aquosa é influenciada por muitos fatores,
tais como: grau de desacetilação do polímero, peso molecular, concentração, força
iônica, pH e temperatura. Geralmente com o aumento da temperatura, a viscosidade da
dispersão polimérica diminui. Contudo, a mudança do pH pode levar a diferentes
resultados, dependendo do tipo de ácido empregado. Por exemplo, com ácido acético, a
viscosidade da quitosana tende a aumentar com a diminuição do pH (Li et al., 1997).
A viscosidade desempenha também um papel importante na determinação das
propriedades de micropartículas produzidas pela técnica de spray drying, podendo
alterar propriedades tais como morfologia, tamanho e eficiência de encapsulação (Ré,
1998).
Bento Pereira da Costa Neto
59
Capítulo 3. Micropartículas de quitosana nanoestruturadas com sílica
Tese de doutorado
As medidas de viscosidade efetuadas em função do teor de sílica são dados na
Tabela 3.3 e estão representados graficamente na Figura 3.9. Os resultados mostram que
a viscosidade das suspensões varia entre 20 e 70 cp com a adição de sílica, o que não
representa um problema para a nebulização destas suspensões através do bico
atomizador do spray dryer utilizado.
Figura 3.9. Influência da concentração de sílica sobre a viscosidade da solução aquosa de quitosana.
Tabela 3.3. Influência da concentração de sílica sobre a viscosidade da solução aquosa de quitosana.
Proporção teórica de massa
Quitosana:Sílica
1:0
10:1
10:2
10:3
10:4
10:5
10:6
10:7
10:8
10:9
10:10
10:11
Bento Pereira da Costa Neto
Viscosidade (cp)
Viscosidade (cp)
(Aerosil 200)
(Aerosil R972)
20,3 ± 0,1
21,3 ± 0,2
22,1 ± 0,2
22,9 ± 0,1
23,6 ± 0,1
24,6 ± 0,1
25,8 ± 0,1
26,8 ± 0,1
28,1 ± 0,1
29,5 ± 0,9
30,7 ± 0,3
31,7 ± 0,1
20,3 ± 0,1
28,2 ± 0,2
29,5 ± 0,1
31,8 ± 0,4
34,4 ± 0,1
37,1 ± 0,3
41,3 ± 0,2
44,6 ± 0,1
48,1 ±0,3
51,8 ± 0,8
60,4 ± 0,5
69,2 ± 0,2
60
Capítulo 3. Micropartículas de quitosana nanoestruturadas com sílica
Tese de doutorado
3.2.3. Secagem das suspensões de quitosana nanoestruturadas com
sílica por spray drying: definição das condições de processo
Os ensaios preliminares mostraram que as soluções com uma concentração
mássica de quitosana maior que 1% eram muito viscosas para garantir, durante a
atomização, a formação de gotas com tamanho e morfologia controlados. Estes
primeiros resultados levaram à escolha de uma concentração de quitosana em solução
de 1% (massa/volume) para o desenvolvimento deste trabalho de doutorado.
Os ensaios de secagem de formulações preparadas com ambas as sílicas,
Aerosil 200 e Aerosil R972 foram realizados, variando-se condições de secagem
como temperatura de entrada do ar de secagem (105°C e 150°C) e diâmetro do bico
atomizador (0,5 e 0,7mm) com o intuito de verificar o impacto de condições que podem
influenciar o tamanho das gotas e a velocidade de secagem. As condições de operação e
características físicas das micropartículas são apresentadas na Tabela 2.3.
Tabela 2.3. Condições operacionais e dados dos ensaios preliminares
Aerosil
-
R972
R972
200
200
Tentrada (ºC)
105 ± 2
105 ± 2
150 ± 2
105 ± 2
150 ± 2
Bico(mm)
0,5
0,5
0,7
0,5
0,7
d4,3(µm)
5,1 ±0,1
5,9 ±0,1
5,7 ±0,1
4,6 ±0,1
4,0 ±0,1
ρtap (g/cm3)
0,55 ±0,1
0,20 ±0,1
0,18 ±0,1
0,77 ±0,1
0,78 ±0,1
Da (µm)
3,78
2,61
2,45
4,06
3,57
% umidade
6,2 ±0,9
4,1 +0,1
4,7 +0,1
3,7 ±0,1
4,9 ±0,1
PZ (mV)
34,8 ±2,2
16,8 ±0,21
14,1 ±0,56
14,2 ±0,35
9,6 ±0,63
Tinlet : Temperatura de entrada; ρtap :densidade aparente; Da: diâmetro aerodinâmico; PZ : potencial zeta.
Analisando-se as condições de maior temperatura (maior velocidade de
secagem), maior bico atomizador (maiores gotas) dos ensaios realizados nesta etapa do
trabalho (Tabela 2.3), pode-se observar que:
 De uma maior temperatura poderia se esperar uma maior gota (formação mais
rápida da crosta sólida na superfície). No entanto, comparativamente aos
ensaios realizados à menor Tentrada, as gotas são inicialmente maiores (maior
bico), o que torna difícil a comparação direta entre tamanhos de partículas
que são, de qualquer modo, bastante próximos.
Bento Pereira da Costa Neto
61
Capítulo 3. Micropartículas de quitosana nanoestruturadas com sílica
Tese de doutorado
 Maior umidade, provavelmente por causa da formação da crosta sólida que
torna o processo de evaporação mais lento para um mesmo tempo de
residência no secador.
 Menor potencial zeta, provavelmente pela retenção de água que compete com
a quitosana na formação de pontes de hidrogênio com os grupos silanóis
dissociados da sílica.
 No caso das partículas de sílica, observa-se que as mesmas, quando dispersas
em meio aquoso, adquirem carga superficial negativa devido ao processo de
dissociação de grupos silanol (=Si–OH) de sua superfície (Behrens e Grier,
2001), representado por = SiOH SiO- + H+ .
 Os grupos amina da quitosana, por sua vez, encontram-se dissociados (NH3+)
na dispersão formada com a sílica em meio ácido e pontes de hidrogênio
podem se formar entre estes grupos reduzindo a carga da quitosana que é
positiva na ausência da sílica (+34,8 ±2,2mV, Tabela 3.4).
Nota-se ainda na Tabela 3.4 uma grande diferença de densidade aparente entre
as partículas secas de quitosana nanoestruturadas com as diferentes sílicas, Aerosil
200 e Aerosil R972. Este comportamento foi investigado nas etapas seguintes do
trabalho e será discutido posteriormente.
Com base nos dados obtidos nos ensaios iniciais e não observando variação
extensa dos dados analisados na Tabela 3.4, optou-se por dar continuidade ao estudo
com a temperatura mais baixa (~105ºC) e com o bico atomizador de 0,5mm. A
proporção mássica entre quitosana e sílica é o parâmetro de estudo da próxima etapa do
trabalho (item 3.2.4).
3.2.4. Micropartículas de quitosana nanoestruturadas com sílica
Aerosil: produção e caracterização
3.2.4.1.
Caracterização física
Definida as condições operacionais no spray dryer e a concentração de quitosana
na solução (1%), a concentração de Aerosil foi o parâmetro de estudo considerado.
Foram estudadas sete formulações.
Bento Pereira da Costa Neto
62
Capítulo 3. Micropartículas de quitosana nanoestruturadas com sílica
Tese de doutorado
As formulações com Fi em sua sigla representam as amostras cuja a formulação
possui Aerosil 200 e as formulações com Fo em sua sigla representam as amostras
cujas formulações possuem Aerosil R972.
A primeira formulação (F1) se refere às micropartículas de quitosana sem a
presença de sílica. As formulações Fi2 e Fo2 possuem 0,1% de Aerosil. As
formulações Fi3 e Fo3 possuem 0,5% de Aerosil. As formulações Fi4 e Fo4 possuem
1,0% de Aerosil na solução polimérica de quitosana.
As micropartículas nanoestruturadas com sílica Aerosil foram caracterizadas
quanto ao diâmetro das partículas, densidade aparente, diâmetro aerodinâmico, teor de
umidade e potencial zeta. As Tabelas 3.5 e 3.6 resumem os resultados para ambas
sílicas.
As Tabelas 3.5 e 3.6 mostram que, apesar do aumento da viscosidade das
dispersões, o aumento da concentração de Aerosil praticamente não afetou o diâmetro
médio para as diferentes amostras. Nenhuma relação direta pode ser estabelecida entre a
concentração de Aerosil e o diâmetro das partículas, o que sugere que o método de
produção das partículas gera uma distribuição de tamanho dentro de uma faixa estreita,
independentemente da concentração de sílica. No entanto, verifica-se que as partículas
de quitosana nanoestruturadas com Aerosil R972 são menores que as partículas
nanoestruturadas com Aerosil 200, provavelmente, devido à maior viscosidade das
suspensões contendo Aerosil R972.
Tabela 3.5. Características físicas das micropartículas (quitosana/Aerosil 200)
Micropartículas produzidas por
Formulação
spray drying
Quitosana:
Aerosil 200
Diâmetro (µm)
ρtap
Da
TU
PZ
3
Visc.
(g/cm
)
(µm)
(%)
Amostra PTM
D4,3 D0,1 D0,5
D0,9
Span
(mV)
(cp)
20,3
5,11 1,89 6,54 17,50
2,39
5,5
6,2
34,8
3,8
±0,1
± 0,1 ± 0,1 ± 0,5 ± 2,1
± 0,1
± 0,1
± 0,9
±2,2
21,3
4,82 1,15 4,38 8,96
1,78
0,46
6,6
14,1
10:1
3,1
Fi2
± 0,2 ± 0,1 ± 0,1 ± 0,2 ±0,1
± 0,1
± 0,1
± 0,1
±0,1
24,6
4,89 2,43 4,56 8,25
1,27
0,77
4,4
13,9
2:1
4,3
Fi3
± 0,1
± 0,1 ± 0,1 ± 0,1 ± 0,3
± 0,1
± 0,1
±0,1
±1,1
30,7
4,63 2,38 4,01 6,69
1,08
0,77
3,7
14,2
1:1
4,1
Fi4
± 0,3
± 0,1 ± 0,4 ± 0,5 ± 0,4
± 0,1
± 0,1
±0,1
±0,3
PTM: Proporção teórica de massa; Visc: viscosidade; Da: diâmetro aerodinâmico; TU: teor de
umidade; AS: área superficial; PZ: potencial zeta.
F1
1:0
Bento Pereira da Costa Neto
63
Capítulo 3. Micropartículas de quitosana nanoestruturadas com sílica
Tese de doutorado
Tabela 3.6. Características físicas das micropartículas (quitosana/Aerosil R972)
Micropartículas produzidas por spray drying
Formulação
Quitosana:
Aerosil R972
Amostra
PTM
Diâmetro (µm)
Visc.
(cp)
D4,3
D0,1
D0,5
D0,9
Span
ρtap
(g/cm3)
Da
(µm)
TU
(%)
20,3 5,1
1,9
6,5 17,5 2,4
0,55
6,2
3,8
±0,1 ±0,1 ±0,1 ±0,5 ±2,1 ±0,1
±0,1
±0,9
28,2 6,6
0,9
5,9 15,3 2,4
0,38
6,6
10:1
4,1
Fo2
±0,2 ±0,5 ±0,1 ±0,1 ±0,6 ±0,1
±0,1
±0,1
37,1 7,9
2,6
6,7 14,1 1,7
0,28
5,3
2:1
4,2
Fo3
±0,4 ±0,1 ±0,1 ±0,1 ±0,6 ±0,2
±0,1
±0,1
60,4 5,9
2,1
5,1 10,5 1,6
0,20
4,1
1:1
2,6
Fo4
±0,4 ±0,1 ±0,1 ±0,8 ±0,5 ±0,1
±0,1
±0,1
PTM: Proporção teórica de massa; Visc: viscosidade; Da: diâmetro aerodinâmico;
umidade; AS: área superficial; PZ: potencial zeta.
F1
1:0
AS
(m2/g)
PZ
(mV)
3.0
34,8
±0.2
±2,2
4.1
15,8
±0.3
±0,2
8.8
15,5
±0.3
±0,5
21.7
16,8
±0.7
±0,2
TU: teor de
A umidade residual analisada por Karl Fisher comprovou que o aumento de
concentração de Aerosil nas micropartículas de quitosana diminuiu a umidade
residual em ambos os casos.
A Microscopia Electrônica de Varredura (MEV) e a Microscopia Electrônica de
Transmissão (MET) foram as técnicas utilizadas para analisar a estrutura de superfície
das amostras. Microscopias das amostras F1, Fi4 e Fo4 (MET e MEV) são apresentadas
nas Figuras 3.10 e 3.11, respectivamente. Como mostrado por estas micrografias, as
micropartículas consistem de estruturas esféricas.
Figura 3.10. Micrografias (microscopia eletrônica de transmissão) do produto seco gerado por
spray drying: Fi4:A e B; Fo4:C e D.
Bento Pereira da Costa Neto
64
Capítulo 3. Micropartículas de quitosana nanoestruturadas com sílica
Tese de doutorado
Figura 3.11. Micrografias (microscopia eletrônica de varredura) dos produtos secos
gerados por spray drying. A e B: F1; C e D: Fi4; E e F: Fo4.
Para complementação dos dados, o potencial zeta das micropartículas
nanoestruturadas com Aerosil, micropartículas de quitosana, as nanopartículas de
Aerosil foram analisadas em função do pH e os resultados são apresentados nas
Figuras 3.12 e 3.13. Observa-se que as cargas superficiais das micropartículas de
quitosana (F1) são positivas no intervalo de pH de 4,5 a 7,4. Devido às suas
características catiônicas, a quitosana pode interagir com o material carregado
negativamente da sílica Aerosil, também apresentado na Figuras 3.12 e 3.13. No
entanto, apesar dessas interações eletrostáticas prováveis, as cargas superficiais das
micropartículas nanoestruturadas permaneceram sempre positivas, mesmo para Fi4 e
Bento Pereira da Costa Neto
65
Capítulo 3. Micropartículas de quitosana nanoestruturadas com sílica
Tese de doutorado
Fo4, que são estruturas fortemente carregadas com sílica na superfície. Quando se
compara as cargas superficiais das amostras nanoestruturadas com Aerosil R972 e
Aerosil 200 (Fo4 e Fi4, respectivamente) em pH 7,4, observa-se uma pequena
diminuição da carga das micropartículas nanoestruturadas com Aerosil 200 (+14,25
mV) com as micropartículas nanoestruturadas com Aerosil R972 (+16,8 mV), o que
pode ser devido à carga mais negativa da sílica Aerosil 200 (maior número de grupos
silanóis na superfície).
Figura 3.12. Potencial zeta das micropartículas de quitosana, micropartículas compósitas de
quitosana e Aerosil R972 e Aerosil 200 em função do pH.
Figura 3.13. Potencial zeta das micropartículas de quitosana, micropartículas compósitas de
quitosana e Aerosil R972 e Aerosil R972 em função do pH.
Bento Pereira da Costa Neto
66
Capítulo 3. Micropartículas de quitosana nanoestruturadas com sílica
3.2.4.2.
Tese de doutorado
Propriedades térmicas
A análise termogravimétrica (TG) e análise térmica diferencial (DSC) foram
realizadas sob atmosfera de oxigênio para determinação do conteúdo inorgânico das
micropartículas nanoestruturadas e para investigação da estabilidade térmica.
A Figura 3.14 apresenta as curvas termogravimétricas das micropartículas
nanoestruturadas com diferentes concentrações de Aerosil 200, em comparação com
as micropartículas contendo apenas quitosana. Pode-se notar que estas micropartículas
de quitosana se degradam na faixa de 198 - 243°C (Tpico a 226°C).
Figura 3.14. Termogramas de TG das micropartículas com diferentes concentrações de
Aerosil 200: (a) F1, (b) Fi2 (16,5%), (c) Fi3 (31,7%), (d) Fi4 (46%), (e) Aerosil 200.
Os principais resultados destas análises são o deslocamento da temperatura de
decomposição para valores mais elevados, que se observa para as amostras contendo
16,5% (Fi2), 31,7% (Fi3) e 46% (Fi4) de Aerosil 200, como mostrado na Figura 3.14
e na Tabela 3.6 que resume os parâmetros térmicos obtidos da análise
termogravimétrica para os dois diferentes tipos de formulações (Fi e Fo). O teor de
material inorgânico restante após a completa degradação térmica do material orgânico a
800 ° C (Tabela 3.7): variou de 16 % a 46 % nas micropartículas nanoestruturadas com
Aerosil 200 e de 21 % a 58 % nas micropartículas nanoestruturadas com Aerosil
R972.
Bento Pereira da Costa Neto
67
Capítulo 3. Micropartículas de quitosana nanoestruturadas com sílica
Tese de doutorado
Tabela 3.7. Parâmetros térmicos, obtidos a partir de análise termogravimétrica
Temperatura de
decomposição da
quitosana
Quitosana:
Aerosil
(Proporção
mássica
teórica)
Material
inorgânico
(%)
*
Tonset (°c)
Tpeak (°C)
F1
1:0
0
198
226
Fi2
10:1
16,5±0,3
205
252
Fi3
2:1
31,7±0,4
214
238
Fi4
1:1
46,0±0,7
269
297
Fo2
10:1
21,5±0,3
217
248
Fo3
2:1
39,9±0,4
251
282
Fo4
1:1
58,1±0,7
252
285
Amostra
*cinza restante após a degradação completa das amostras a 800°C
Por sua vez, a Figura 3.15 apresenta as curvas de TG das micropartículas
nanoestruturadas com diferentes cargas de Aerosil R972. No estudo com a sílica
Aerosil R972 foi observado, para as amostras 21,5% (Fo2), 39,9% (Fo3) e 58,1% (Fo4),
a mesma influência da sílica na temperatura de decomposição da quitosana (Tabela 2.6).
Este resultado sugere que a adição das nanopartículas de Aerosil promove a
estabilização contra a degradação oxidativa da quitosana. Em resumo, quando os
resultados das micropartículas de quitosana pura são comparados com os resultados de
micropartículas
quitosana
nanoestruturadas
com
Aerosil,
em
termos
de
comportamento térmico, existem diferenças importantes, o que pode ser devido à
interação entre quitosana e Aerosil.
Figura 3.15. Termogramas de TG das micropartículas com diferentes concentrações de
Aerosil R972: (a) F1, (b) Fo2 (21.5%), (c) Fo3 (39.9%), (d) Fo4 (58.1%), (e) Aerosil R972.
Bento Pereira da Costa Neto
68
Capítulo 3. Micropartículas de quitosana nanoestruturadas com sílica
Tese de doutorado
Os resultados das análises de DSC são apresentados na Figura 3.16. Os
termogramas de DSC mostram largos picos endotérmicos ao longo de um grande
intervalo de temperaturas (<100 º C), o que é atribuído à perda de água devido à
evaporação de água absorvida.
Figura 3.16. Termogramas de DSC das micropartículas com diferentes concentrações de Aerosil
200: (a) F1, (b) Fi2, (c) Fi3, (d) Fi4, (e) Aerosil 200.
O evento principal destas curvas de calorimetria mostradas na Figura 3.16 é um
pico exotérmico centrado em torno de 200-300°C para quitosana (F1) e micropartículas
nanoestruturadas (Fi2, Fi3 e Fi4), devido à degradação térmica das micropartículas. O
pico das micropartículas de quitosana pura é lido em 226°C. Com a adição de Aerosil
200, este pico exotérmico deslocou-se para a região de temperaturas mais elevadas
(252-297°C).
Já com Aerosil R972 (Figura 3.17), o pico exotérmico centrado em torno de 250310°C para quitosana (F1) e micropartículas nanoestruturadas (Fo2, Fo3 e Fo4) pode ser
atribuído à degradação térmica das micropartículas. Com a adição de Aerosil R972,
este pico exotérmico foi deslocado para a região de temperaturas de 288-309°C.
Bento Pereira da Costa Neto
69
Capítulo 3. Micropartículas de quitosana nanoestruturadas com sílica
Tese de doutorado
Figura 3.17. Termogramas de DSC das micropartículas com diferentes concentrações de
Aerosil R972: (a) F1, (b) Fo2 (21.5%), (c) Fo3 (39.9%), (d) Fo4 (58.1%), (e) Aerosil R972.
Em suma, pode-se concluir que as análises de DSC confirmaram os resultados já
demonstrados por análise TGA para ambas as sílicas estudadas: o aumento do teor de
Aerosil 200 e de Aerosil R972 nas formulações aumentou a estabilidade térmica das
micropartículas de quitosana.
3.2.4.3.
Caracterização estrutural
3.2.4.3.1. Difração de Raios X
A difratometria de raios X baseia-se na propriedade intrínseca de cada cristal em
desviar, em um ângulo específico, a direção dos raios X emitidos sobre ele. O ângulo de
desvio da radiação é único para cada forma do cristal permitindo assim caracterizá-lo. A
denotação matemática deste desvio é descrita pela lei de Bragg (Kahn, 2004; Cuffini,
Pitaluga e Tombari, 2009). Uma vantagem da difratometria de raios X de pós está na
possibilidade de uma relação linear entre a intensidade dos picos de identificação da
Bento Pereira da Costa Neto
70
Capítulo 3. Micropartículas de quitosana nanoestruturadas com sílica
Tese de doutorado
forma cristalina e sua concentração, permitindo a quantificação de diferentes polimorfos
em misturas com várias formas ou o acompanhamento das transformações polimórficas
ou em formas amorfas (hidratadas ou não).
Os padrões de difração de raios-X (Figuras 3.18 e 3.19) mostram que as
nanopartículas de Aerosil, as micropartículas de quitosana e as micropartículas
nanoestruturadas podem ser identificadas como amorfas, devido à inexistência de picos
cristalográficos associados a planos cristalinos específicos presentes na estrutura.
Figura 3.18. Difratogramas de raios X das micropartículas com diferentes concentrações de
Aerosil 200: (a) F1, (b) Fi2, (c) Fi3, (d) Fi4, (e) Aerosil 200.
Bento Pereira da Costa Neto
71
Capítulo 3. Micropartículas de quitosana nanoestruturadas com sílica
Tese de doutorado
Figura 3.19. Difratogramas das micropartículas com diferentes concentrações de Aerosil
R972: (a) F1, (b) Fo2 (21.5%), (c) Fo3 (39.9%), (d) Fo4 (58.1%), (e) Aerosil R972.
3.2.4.3.2. Espectroscopia no infravermelho por transformada de fourier
A estrutura de ligação das micropartículas foi investigada por espectroscopia no
infravermelho por transformada de Fourier (FTIR). Os espectros das micropartículas de
quitosana pura (F1) (Figuras 3.20.a e 3.21.a) mostraram uma banda de absorção larga a
3444 cm-1 atribuída às vibrações de estiramento dos grupos OH, as quais são
sobrepostas à vibração de alongamento do NH. A característica de absorção da
quitosana é a banda a 1595 cm-1, atribuída à vibração de estiramento do grupo amino da
quitosana e 1325 cm-1 que é atribuída a vibração de CH. O pico em 1085 cm-1 faz
referência ao estiramento vibracional do grupo CO (Souza et al., 2009; Krishna et al.,
2006). Os picos em torno de 895 e 1155 cm-1 correspondem às vibrações de estiramento
dos grupos C-O-C na estrutura de sacarídeo da quitosana (Miya et al., 1980;
Radhakumary et al., 2003).
Os espectros de FTIR das amostras Fi2, Fi3 e Fi4 (Figura 3.20) apresentam picos
característicos da quitosana e Aerosil 200.
Bento Pereira da Costa Neto
72
Capítulo 3. Micropartículas de quitosana nanoestruturadas com sílica
Tese de doutorado
Figura 3.20. Espectro FTIR das micropartículas com diferentes concentrações de Aerosil
200: (a) F1, (b) Fi2, (c) Fi3, (d) Fi4, (e) Aerosil 200.
Os espectros de FTIR da Aerosil 200 (Figura 3.20.e) revelaram uma banda
larga em 3445 cm-1 que corresponde ao estiramento de bandas OH de moléculas de água
ligadas por ligações de hidrogênio (H-O-H ∙∙∙ H) e SiO-H - estiramentos dos silanóis pontes de hidrogênio ligados à molécula de água (SiO-H∙∙∙H2O) (Brinker & Scherer,
1990). As bandas de absorção correspondentes às moléculas de água referentes a
vibrações de deformação aparecem em 1635 cm-1 (Socrates, 2001). A adsorção de
moléculas de água na superfície das micropartículas de sílica é devido à existência dos
grupos silanóis na superfície e, portanto, à natureza hidrófila da sílica Aerosil 200. As
intensas vibrações das ligações covalentes entre o silício e o oxigénio aparecem
principalmente no intervalo de 1200-1000 cm-1 revelando a existência de uma rede
densa de sílica, em que os átomos de oxigénio desempenham o papel das pontes entre as
duas ligações do silício (Duran et al., 1986). Por outro lado, o estiramento simétrico do
Si-O-Si aparece em 800 cm -1 (Brinker & Scherer, 1990).
Os espectros FTIR das micropartículas nanoestruturadas mostram as bandas
características de ambos: quitosana e Aerosil 200 (Figuras 3.20.b a 3.20.d). Eles são
Bento Pereira da Costa Neto
73
Capítulo 3. Micropartículas de quitosana nanoestruturadas com sílica
Tese de doutorado
semelhantes, no entanto, várias bandas características foram deslocadas, deformadas ou
mesmo desapareceram, sobretudo na região entre 800 e 1600 cm -1.
Também para a quitosana, a banda de absorção de amida II (1595 cm -1) foi
deslocada para um menor comprimento de onda (1.558 cm-1) e as bandas características
da quitosana em 1155 e 895 cm-1 são observadas com fraca intensidade ou
desapareceram (ver Figura 3.20.d), sugerindo que estes grupos estão possivelmente
interagindo com Aerosil 200.
Figura 3.21. Espectro FTIR das micropartículas com diferentes concentrações de Aerosil
R972: (a) F1, (b) Fo2 (21.5%), (c) Fo3 (39.9%), (d) Fo4 (58.1%), (e) Aerosil R972.
Os espectros de FTIR de Aerosil R972 (Figura 3.21.e) mostraram um pico de
absorção a cerca de 1109 cm-1, atribuído às vibrações de estiramento assimétricas das
ligações Si-O-Si do óxido de silício, enquanto que o pico em 810 cm-1 pode ser
atribuído à deformação simétrica das ligações Si-O-Si. Estas são as bandas típicas de
absorção para Si-O-Si (Prado et al., 2005).
Os espectros FTIR das micropartículas nanoestruturadas mostram as bandas
características de ambos: quitosana pura e Aerosil R972 (Figuras 3.21.b à 3.21.d).
Eles se apresentam de forma semelhante, no entanto, várias bandas características
também foram deslocadas, deformadas ou desapareceram, especialmente na região entre
1000 e 1400 cm-1.
Bento Pereira da Costa Neto
74
Capítulo 3. Micropartículas de quitosana nanoestruturadas com sílica
Tese de doutorado
Também para a quitosana, a banda de absorção de amida II (1595 cm -1) foi
ligeiramente deslocada para um menor comprimento de onda (1.560 cm -1) e as bandas
características em estrutura da quitosana em 1032, 1155 e 895 cm -1 são observadas com
menor intensidade ou mesmo desapareceram (ver Figura 3.21.d). Isso constitui uma
evidência de que os grupos dessas bandas interagem com Aerosil R972.
3.2.4.4.
Sorção dinâmica de vapor (DVS)
O objetivo deste estudo foi verificar possíveis efeitos de “barreira” das sílicas
Aerosil 200 e Aerosil R972 contra absorção de umidade pelas micropartículas de
quitosana nanoestruturadas.
As isotermas de equilíbrio de sorção de umidade (DVS) são representadas
graficamente na Figura 3.22 (primeiro ciclo de sorção), para as amostras formuladas
com sílica Aerosil R972 (F1, Fo2, Fo3 e Fo4), enquanto que para a sílica Aerosil
200 o estudo foi realizado apenas para a formulação com maior teor de sílica (Fi4) e os
resultados são dados na Figura 3.23.
Embora dois ciclos tenham sido realizados para cada material (sorção e
dessorção), a umidade de dessorção a partir do primeiro ciclo foi reversível.
Subsequentemente, estes dados estão sendo omitidos para maior clareza entre as
amostras.
Figura 3.22. Isotermas de sorção de umidade das micropartículas com diferentes concentrações de
Aerosil R972.
Bento Pereira da Costa Neto
75
Capítulo 3. Micropartículas de quitosana nanoestruturadas com sílica
Tese de doutorado
Figura 3.23. Isotermas de sorção de umidade das micropartículas com uma concentração de
Aerosil 200 de 58% (em massa) nas micropartículas quitosana-sílica.
As Figuras 3.22 e 3.23 mostram que a presença de ambas as sílicas modifica a
capacidade de adsorção de umidade das micropartículas de quitosana nanoestruturadas.
Mais especificamente, a Figura 3.22 mostra que quanto maior a concentração de
Aerosil R972 nas micropartículas menor a adsorção de umidade. Essa propriedade das
micropartículas de reduzirem a adsorção de umidade pode ser apontada como uma
vantagem para encapsulação de fármacos, visto que a exposição dos fármacos à
umidade possibilita conversões polimórficas indesejáveis (Miller; Raw; Yu, 2005).
O teor de massa absorvida na umidade de 70% foi escolhido como parâmetro de
comparação entre as amostras que apresentaram maior concentração de sílica e menor
absorção de umidade: Fo4 (Aerosil R972) e Fi4(Aerosil 200). A amostra
nanoestruturada com Aerosil R972 absorveu 11,9% enquanto que a amostra
nanoestruturada com Aerosil 200 absorveu 13,6%. A menor massa absorvida de
umidade na amostra Fo4 era esperada devido ao caráter hidrofóbico da Aerosil R972.
3.2.4.5.
Ensaios biológicos preliminares com micropartículas nanoestruturadas
com aerosil 200 e aerosil r972
As micropartículas com maior concentração de Aerosil (Fi4 e Fo4) foram
escolhidas para testes biológicos. A capacidade para ativar os macrófagos para produzir
óxido nítrico foi testada como uma indicação do potencial pró-inflamatório.
Bento Pereira da Costa Neto
76
Capítulo 3. Micropartículas de quitosana nanoestruturadas com sílica
Tese de doutorado
Micropartículas contendo apenas quitosana pura (F1) foram também testadas como
controle.
A Figura 3.24 apresenta que concentrações de ambas partículas da ordem de
1000 μg/mƖ não estimulam os macrófagos para produzir óxido nítrico, compatível com
uma baixa ação pró-inflamatória. A capacidade das amostras de induzir citotoxicidade
foi avaliada pela capacidade em induzir a liberação de LDH do citoplasma de
macrófagos.
Figura 3.24. Falta de estimulação da produção de óxido nítrico por macrófagos. Representante de
dois experimentos diferentes, utilizando diferentes lotes de amostras.
A Figura 3.25 apresenta que, apesar das suas concentrações similares necessárias
para produzir 50% de lise celular (IC50, 220 μg.ml -1 e 237 μg.ml-1, respectivamente),
em concentrações inferiores a 100 μg.ml -1, F4 é menos (p <0,05) citotóxica do que F1.
Juntos, estes resultados indicam que as amostras não são propensas a induzir a
inflamação, e que a nanoestruturação com 58% de Aerosil R972 (F4) rendeu as
micropartículas mais biocompatíveis. Este efeito é devido ao fato da sílica Aerosil
R972 impedir a forte interação eletrostática catiônica da quitosana com a membrana
celular carregada negativamente.
Figura 3.25 A citotoxicidade de macrófagos. Representante de dois experimentos diferentes,
utilizando diferentes lotes de amostras.
Bento Pereira da Costa Neto
77
Capítulo 3. Micropartículas de quitosana nanoestruturadas com sílica
3.3.
Tese de doutorado
Conclusões parciais
Através dos resultados obtidos nesta etapa do trabalho, pode-se concluir que o
processo de secagem via spray drying possibilitou a obtenção de micropartículas de
quitosana nanoestruturadas com sílica.
A introdução de sílica na estrutura das
micropartículas de quitosana resultou em uma mudança nas propriedades físicas e
químicas quando comparada às micropartículas de quitosana pura.
Foi observado que as partículas de quitosana nanoestruturadas com Aerosil
R972 possuíam diâmetros médios superiores aos das partículas nanoestruturadas com
Aerosil 200, provavelmente, devido à maior viscosidade das suspensões contendo
Aerosil R972. A incorporação de sílica nas partículas de quitosana também diminuiu a
umidade residual em ambos os casos.
Outro dado analisado foi a carga superficial das micropartículas. O potencial
zeta das micropartículas de quitosana é de aproximadamente +35mV. A carga
superficial das micropartículas nanoestruturadas com sílica caem para valores da ordem
de +10 à +17mV. Estes dados de potencial zeta comprovam a presença de sílica na
superfície das micropartículas de quitosana, em ambos os casos (Aerosil 200 e Aerosil
R972).
As análises de sorção dinâmica de vapor confirmaram para ambas
micropartículas que o aumento da concentração de sílica nas micropartículas, resulta em
redução da capacidade das micropartículas nanoestruturadas em absorver umidade,
quando comparadas às micropartículas sem sílica.
Estudos in vitro indicaram baixa citotoxicidade e baixa capacidade de ativar a
produção de óxido nítrico das células, sendo compatível com uma baixa ação próinflamatória. Juntas, essas informações incentivam a exploração das micropartículas
nanoestruturadas com sílica desenvolvidas neste trabalho como novos sistemas de
carreamento de princípios ativos através de vias orais ou mucosas.
Bento Pereira da Costa Neto
78
CAPÍTULO 4
Estudos de estabilidade de micropartículas
nanoestruturadas
Capítulo 4. Estudos de estabilidade de micropartículas nanoestruturadas
4.1.
Tese de doutorado
Metodologia experimental
O capítulo 3 deste manuscrito mostra o potencial de dois tipos de sílica
fumegada com diferentes químicas de superfície (hidrofílica e hidrofóbica) em alterar
propriedades de microesferas de quitosana tais como modificação de carga de superfície
(potencial zeta) e efeito na estabilidade térmica das micropartículas (alteração da
temperatura de degradação).
O presente capítulo reúne os principais resultados de dois diferentes estudos de
estabilidade e verificação do efeito “barreira” da nanoestruturação das micropartículas
de quitosana com sílica Aerosil® 200 e Aerosil® R972.
O primeiro método baseia-se no fato de que a quitosana é solúvel em pH ácido.
Dessa forma, o propósito deste estudo de estabilidade em meio ácido foi medir o efeito
dos dois diferentes tipos de sílica na solubilidade das micropartículas nanoestruturadas.
A propriedade medida é a porcentagem de luz transmitida através de uma suspensão de
micropartículas em meio ácido.
O efeito “protetor” foi também avaliado através de um segundo estudo realizado
utilizando-se uma forma solida de manitol de baixo grau de cristalinidade, capaz de
evoluir para uma forma solida mais estável quando exposta a condições de estocagem
envolvendo umidade elevada. Para este estudo, diferentes tipos de microesferas
nanoestruturadas com sílica foram produzidas por spray drying contendo manitol. Estes
produtos foram submetidos a condições controladas de temperatura e umidade durante
um período de 6 meses. Durante este período, avaliou-se o efeito da exposição às
condições de umidade e temperatura fixadas caracterizando-se amostras das
micropartículas por técnica de difratometria de raios-X para análise do estado sólido. A
metodologia utilizada e os resultados obtidos são apresentados neste capítulo.
4.1.1. Estudo de estabilidade física das micropartículas nanoestruturadas
com sílica em meio ácido
A estabilidade das micropartículas de quitosana nanoestruturadas com sílica foi
determinada pela incubação de 0,5% (m/v) de suspensão das micropartículas em HCl
0,1 N por 60 minutos e medida da transmissão de luz das amostras em 500 nm
(Spectrophotometer CINTRA 10E, GBC Melbourne, Australia) (Berthold et al., 1996;
Dhawan et al., 2005), segundo esquema do protocolo experimental dado na Figura 4.1.
Bento Pereira da Costa Neto
80
Capítulo 4. Estudos de estabilidade de micropartículas nanoestruturadas
Tese de doutorado
Micropartículas
quitosana/sílica
(0.5% em peso/volume)
0.1N HCl
t =60 min
T=25°C
ALTA
TRANSMISSÃO
micropartículas
são dissolvidas
BAIXA
TRASMISSÃO
micropartículas
não são dissolvidas
(Alta estabilidade)
Espectrofotômetro
UV-VIS
Cintra 10E
T (500 nm)
Figura 4.1. Esquema do protocolo experimental para medida da estabilidade das
micropartículas nanoestruturadas em meio ácido.
4.1.2. Estudo da estabilidade de manitol encapsulado nas micropartículas
nanoestruturadas com sílica quando exposto a condições de estresse
de umidade e temperatura
4.1.2.1.
Produção de micropartículas de quitosana, manitol e sílica
Para este estudo, nove formulações sólidas foram preparadas por spray drying para
serem comparadas após estocagem sob condições controladas de temperatura e
umidade. São elas:
-
Micropartículas de quitosana/sílica contendo manitol (Fm1 e Fm2).
o O manitol foi adicionado à suspensão quitosana–sílica antes de ser
homogeneizada no HAP.
-
Micropartículas de quitosana contendo manitol (Fm3)
Bento Pereira da Costa Neto
81
Capítulo 4. Estudos de estabilidade de micropartículas nanoestruturadas
Tese de doutorado
o A quitosana foi dissolvida em água juntamente com o manitol.
-
Manitol (Fm6)
o Uma solução aquosa de manitol foi seca via spray dryer para produção
de um sólido de baixa cristalinidade ou amorfo;
-
Microesferas de quitosana e sílica Aerosil® 200 (Fm4)
-
Microesferas de quitosana e sílica Aerosil® R972 (Fm5)
-
Microesferas de quitosana (Fm7)
-
Aerosil® 200 (Fm8)
-
Aerosil® R972 (Fm9)
As formulações correspondentes encontram-se resumidas na Tabela 4.1.
Tabela 4.1. Formulações das micropartículas de quitosana, manitol e sílicas para estudo de
estocagem sob condições controladas de temperatura (40°C) e umidade (75%).
Formulação
Fm1
Fm2
Fm3
Fm4
Fm5
Fm6
Fm7
Fm8
Quitosana
(g)
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
-
Aerosil
200 (g)
1,0
1,0
1,0
Aerosil
R972 (g)
1,0
1,0
-
Manitol
(g)
0,5
0,5
0,25
1,0
-
Agua
(g)
99
80**
99
99
80**
99
99
99
Fm9
-
-
1,0
-
80**
** 80 ml de agua + 20 mƖ de etanol para dispersar a sílica Aerosil R972
Todas as formulações, Fm1 a Fm9, foram secas em spray dryer de bancada
modelo B 190 marca BUCHI com temperatura de entrada de 105±2ºC, temperatura de
saída de 80±3ºC e taxa de alimentação de 3 ml/min. O atomizador duplo fluido com
abertura do bico de 0,5 mm foi usado nestes experimentos.
Bento Pereira da Costa Neto
82
Capítulo 4. Estudos de estabilidade de micropartículas nanoestruturadas
4.1.2.2.
Tese de doutorado
Estocagem em condições controladas de temperatura e umidade
Foram pesados aproximadamente 2,5 g de cada formulação (Fm1 a Fm9) e
acondicionados em placas de vidro. As amostras foram submetidas a condições de
estresse com temperatura de 40ºC ± 2 e umidade relativa de 75% ± 5 por um período de
seis meses (Brasil, 2005), através do uso de dessecador e solução saturada de NaCl para
controle da umidade relativa e uso de incubadora para o controle da temperatura.
4.1.2.3.
Análise de DRX
As formulações Fm1 a Fm9 submetidas às condições de estresse relatadas no
item 4.1.1.2. foram analisadas por DRX. As amostras foram prensadas em porta
amostras de alumínio e os dados foram coletados em um difratômetro de Raios-X
Shimadzu, Modelo XRD – 6000, na radiação CuKα (λ = 1.5418 A), operando com 40
KV e 40 μA de tensão e corrente do tubo, respectivamente. A varredura foi feita no
intervalo de 5 a 50 °(2Θ), com um passo de 0,02 °(2Θ) e 5 seg/passo. Os resultados
foram obtidos a partir dos programas XRD-6000 software.
4.1.2.4.
Teste de contato das micropartículas de quitosana e de
micropartículas nanoestruturadas com Aerosil® R972 com
atmosfera úmida (vapor d’agua) em
microscópio eletrônico de
varredura
Contrariamente a um microscópio eletrônico de varredura convencional que
opera sob vácuo na câmera de observação, o sistema de vácuo de um microscópio
eletrônico de varredura ambiental permite a introdução de um gás dentro da câmera e
atinge pressões até 10 torrs. Nestas condições de pressão, as amostras não condutoras
podem ser observadas em estado natural sem metalização. A escolha do gás permite
igualmente observar as amostras em um meio ambiente especifico (umidade elevada por
exemplo). Aplicando-se este princípio, e utilizando-se um microscópio eletrônico de
varredura
ambiental
XL30 ESEM
FEG (Philips) observou-se
amostras de
micropartículas nanoestruturadas com sílica Aerosil® R972 em comparação a amostras
de quitosana pura. A observação foi feita de forma dinâmica em uma atmosfera de
vapor de água com um porta-amostra resfriado por efeito Peltier. O controle da pressão
de vapor d’água e da temperatura permitiu a variação da umidade na câmera de
observação (observação dinâmica das amostras sob efeito da absorção de umidade).
Bento Pereira da Costa Neto
83
Capítulo 4. Estudos de estabilidade de micropartículas nanoestruturadas
Tese de doutorado
O vácuo foi feito na câmera de observação seguido de purga afim de substituir o
ar por vapor de agua. No final da primeira purga, a amostra foi resfriada à 2°C com uma
pressão de 0,3 torr. Aumentou-se progressivamente a pressão, introduzindo-se vapor de
agua na câmera de observação (valor de umidade não conhecido) e mantendo-se a
temperatura à 2°C.
Bento Pereira da Costa Neto
84
Capítulo 4. Estudos de estabilidade de micropartículas nanoestruturadas
4.2.
Tese de doutorado
Resultados e discussão
4.2.1. Estudo de estabilidade física das micropartículas nanoestruturadas
com sílica em meio ácido
4.2.1.1.
Micropartículas nanoestruturadas com sílica Aerosil®
Os dados de transmissão de luz na Tabela 4.2 são apresentados como
porcentagens. O HCI 0,1 N é a amostra-referência que representa a transmissão de
100%.
Microesferas de quitosana (F1) foram dissolvidas no meio ácido, o que conduz a
um meio mais transparente (92% de transmissão). No entanto, se as partículas não se
dissolvem, a transmissão de luz através do meio diminui. Uma vez que a diminuição da
turvação é diretamente dependente da dissolução das micropartículas, a transmissão é
uma medida da concentração de micropartículas não dissolvidas. Em resumo, uma baixa
transmissão indica alta estabilidade das micropartículas em meio ácido (lenta taxa de
dissolução), enquanto uma transmissão elevada implica que as micropartículas foram
dissolvidas em HCl.
Tabela 4.2. Estabilidade em meio ácido (HCL 0,1N) das micropartículas nanoestruturadas com
silica Aerosil®
Quitosana:
Amostra
Tipo de
Aerosil®
Aerosil®
(Proporção
mássica
Material
inorgânico
Transmissão
(%)
(%)
teórica)
F1
-
1:0
0
92,1±0.3
Fo2
R972
10:1
21,5±0.3
72,9±0.4
Fo3
R972
2:1
39,9±0.4
30,0±0.8
Fo4
R972
1 :1
58,1±0.7
10,6±2.8
Fi2
200
10:1
16,5±0,3
81,4±3,2
Fi3
200
2:1
31,7±0,4
14,1±0,4
Fi4
200
1 :1
46,0±0,7
8,0±0,6
Bento Pereira da Costa Neto
85
Capítulo 4. Estudos de estabilidade de micropartículas nanoestruturadas
Tese de doutorado
A Tabela 4.2 apresenta que o aumento da concentração de dois diferentes tipos
de sílica Aerosil® nas micropartículas reduziu a porcentagem de transmissão de luz
através da suspensão, o que sugere que as micropartículas dissolveram mais lentamente.
Presumidamente, esta estabilidade em meio ácido deve-se ao revestimento da superfície
das micropartículas com a sílica (estável em meio ácido), impedindo assim o contato
entre o ácido e a quitosana, a qual, de outra forma, se dissolveria. Assim, uma maior
concentração de sílica Aerosil®200 ou Aerosil® R972 resulta em melhores condições
de estabilidade das micropartículas quitosana-sílica em meio ácido.
A Figura 4.2 compara o efeito do teor de ambas as sílicas na estabilidade em
meio ácido das micropartículas de quitosana nanoestruturadas (% transmissão de luz).
Nota-se que, a sílica Aerosil® R972 é eficaz no controle da estabilidade das
micropartículas em concentrações superiores a 58% enquanto que menores
concentrações de sílica Aerosil® 200 (>42%) asseguram a mesma estabilidade (uma %
transmissão de cerca de 10% é tomada neste trabalho como referência para uma
estabilidade boa em meio ácido). Tal comportamento é provavelmente devido à química
de superfície destas sílicas: a sílica hidrofílica (Aerosil® 200) apresenta maior número
de grupos hidroxila o que promover maior interação com a quitosana através de ligações
hidrogênio e, consequentemente, podendo conferir maior estabilidade em meio ácido.
Figura 4.2. Efeito do teor de sílica na estabilidade em meio ácido das micropartículas
de quitosana nanoestruturadas.
Bento Pereira da Costa Neto
86
Capítulo 4. Estudos de estabilidade de micropartículas nanoestruturadas
Tese de doutorado
4.2.2. Estudo da estabilidade de manitol encapsulado nas micropartículas
nanoestruturadas com sílica quando exposto a condições de estresse
de umidade e temperatura
4.2.2.1.
Efeito da secagem na estrutura cristalina do manitol
A difração de raios-X (DRX) é o método mais rápido e simples de se determinar
as informações básicas sobre a estrutura de um material cristalino. Consequentemente,
este método foi utilizado para avaliar o estado sólido de cada amostra.
Para o estudo de estabilidade acelerada, uma amostra de manitol seco por spray
drying foi produzida a fim de se obter material sólido de baixa cristalinidade ou mesmo
amorfo. A secagem por spray drying geralmente produz compostos amorfos, devido ao
rápido processo de secagem, o que impede a organização de uma fase cristalina (Asada
et al, 2004).
A Figura 4.3 permite a comparação entre duas formas sólidas do manitol: o
produto comercial e a amostra Fm6, produzida da secagem por spray drying de uma
solução aquosa de manitol. A amostra comercial apresenta picos característicos do
delta-manitol (9,57) e do beta-manitol (14,71). A amostra Fm6 apresenta picos
característicos das fases beta-manitol e alfa-manitol (13,79), no entanto, observa-se
também uma perda considerável de intensidade dos picos. Este tipo de comportamento
provavelmente traduz uma modificação do estado sólido ou de morfologia das
micropartículas secas após secagem por atomização, mais provavelmente, de
morfologia.
Figura 4.3. Difratograma do manitol: (a) Manitol; (b) Manitol obtido via spray drying.
Bento Pereira da Costa Neto
87
Capítulo 4. Estudos de estabilidade de micropartículas nanoestruturadas
4.2.2.2.
Efeito da exposição das micropartículas
Tese de doutorado
a condições de estresse de
umidade e temperatura
4.2.2.2.1. Manitol
O efeito da exposição das microparticulas de manitol obtidas da secagem por
spray drying à temperatura de 40ºC ± 2 e umidade relativa de 75%± 5 durante 180 dias
é avaliado comparando-se os difratogramas de raios-X das micropartículas de manitol
(Fm6) antes (T0) e após (T180) exposição (Figura 4.4).
As micropartículas Fm6 consistiam de uma mistura de beta-manitol e alfa-manitol
(forma menos estável). Os seis meses de exposição às condições de temperatura e
umidade descritas levou a uma transformação polimórfica total à forma mais estável do
manitol (beta-manitol).
Figura 4.4. Difratograma do manitol no início do estudo (T0) e após os 180 dias de exposição (T180).
4.2.2.2.2. Micropartículas de quitosana, quitosana nanoestruturadas com sílica,
Aerosil® 200, Aerosil® R972 (sem manitol)
Antes de analisar o efeito da incorporação do manitol nas formulações com
quitosana pura (Fm3) e com quitosana e sílica (Fm1 e Fm2), o efeito da exposição de
micropartículas de quitosana pura (Fm7), de micropartículas de quitosana e Aerosil®
200 (Fm4), de micropartículas de quitosana e Aerosil® R972 (Fm5), de micropartículas
de Aerosil® 200 (Fm8) e de micropartículas de Aerosil® R972 (Fm9) foi
primeiramente analisado (micropartículas ‘brancas’).
Bento Pereira da Costa Neto
88
Capítulo 4. Estudos de estabilidade de micropartículas nanoestruturadas
Tese de doutorado
Os difratogramas de raios-X destas amostras antes e depois da exposição podem
ser comparados através das Figuras 4.5 e 4.6. A forma dos difratogramas revela
estruturas de baixa (ou nenhuma) cristalinidade. Através de ambas as figuras pode-se
verificar que os difratogramas de raios-X de todas estas estruturas preparadas sem
manitol (micropartículas “brancas”) permaneceram invariáveis frente às condições de
temperatura e umidade a que foram submetidas por um período de 6 meses.
Figura 4.5. Difratogramas das formulações no início do estudo de estabilidade acelerada
indicado pelo número 1 e no final dos 180 dias indicado pelo número 2. (a) Micropartículas
de quitosana; (b)Aerosil® R972; (c)Aerosil® 200.
Figura 4.6. Difratogramas das formulações no início do estudo de estabilidade acelerada
indicado pelo número 1 e no final dos 180 dias indicado pelo número 2. (a) Micropartícula
nanoestruturada com Aerosil® R972; (b) micropartícula nanoestruturada com Aerosil® 200.
Bento Pereira da Costa Neto
89
Capítulo 4. Estudos de estabilidade de micropartículas nanoestruturadas
4.2.2.2.3. Micropartículas
de
quitosana,
quitosana
Tese de doutorado
nanoestruturadas
com
Aerosil®, (com manitol)
Os difratogramas de raios-X das amostras contendo manitol encapsulado pelas
micropartículas de quitosana (Fm3) e de quitosana nanoestruturadas com Aerosil® 200
(Fm4) e com Aerosil® R972 (Fm5) são apresentados na Figura 4.7.
Quando comparado ao sistema de micropartículas de quitosana (a1 e a2) e o
sistema de micropartículas de quitosana nanoestruturadas com Aerosil® R972 (b1 e b2)
e Aerosil® 200 (c1 e c2), se verifica menor evolução dos picos característicos da forma
beta-manitol. Ou seja, a exposição a condições de estresse de umidade e temperatura
favorece a evolução da estrutura polimórfica do manitol, no entanto, esta evolução é
mais lenta quando a sílica está presente nas micropartículas, o que pode ser atribuído ao
efeito “barreira” à umidade que estas novas estruturas (quitosana nanoestruturada com
sílica) representam.
Figura 4.7. Difratogramas das formulações no início do estudo de estabilidade acelerada
indicado pelo número 1 e no final dos 180 dias indicado pelo número 2. (a) Formulação
Fm3; (b) Formulação Fm2; (c) Formulação Fm1.
4.2.2.2.4. Teste de contato das micropartículas de quitosana e de micropartículas
nanoestruturadas com Aerosil® R972 com atmosfera úmida (vapor
d’agua) em microscópio eletrônico de varredura ambiental
Um acompanhamento visual do contato das micropartículas com uma atmosfera
carregada em umidade (não conhecida, análise qualitativa) foi feita à temperatura
ambiente dentro de um microscópio eletrônico de varredura ambiental.
A Figura 4.8 mostra a evolução da morfologia através da observação direta das
partículas em contato com vapor de água. Como pode-se notar, o efeito “barreira”
Bento Pereira da Costa Neto
90
Capítulo 4. Estudos de estabilidade de micropartículas nanoestruturadas
Tese de doutorado
observado com o manitol concorda com a observação nestas micrografias onde observase que as micropartículas de quitosana pura (parte inferior do campo de observação)
absorvem a umidade mais rapidamente que as micropartículas de quitosana
nanoestruturadas com Aerosil® R972 (parte superior do campo de observação).
Microparticulas
de quitosana
nanoestruturada
s com Aerosil
R972
Microparticulas
de quitosana
nanoestruturadas
com Aerosil R972
Microparticulas
de quitosana
Microparticulas
de quitosana
Microparticulas
de quitosana
nanoestruturadas
com Aerosil R972
Microparticulas
de quitosana
nanoestruturadas
com Aerosil R972
Microparticulas
de quitosana
Microparticulas
de quitosana
Figura 4.8. Microscopias das micropartículas de quitosana e de micropartículas
nanoestruturadas com Aerosil® R972 em atmosfera úmida.
Bento Pereira da Costa Neto
91
Capítulo 4. Estudos de estabilidade de micropartículas nanoestruturadas
4.3.
Tese de doutorado
Conclusões parciais
Comparativamente às micropartículas de quitosana pura, as micropartículas
nanoestruturadas com sílica apresentam:
 Maior estabilidade em meio ácido.
 Reduzida reatividade à umidade, estabelecendo um efeito “barreira à absorção
de umidade”.
Bento Pereira da Costa Neto
92
CAPÍTULO 5
Micropartículas de quitosana nanoestruturadas
com sílica Aerosil 200 e sílica Aerosil R972
como matrizes de encapsulação e liberação de
princípios ativos de interesse farmacêutico
Capítulo 5. Encapsulação e liberação de princípios ativos
5.1.
Tese de doutorado
Metodologia experimental
Nesta etapa do trabalho, testou-se a potencialidade das micropartículas de
quitosana nanoestruturadas desenvolvidas nesta tese de doutorado como sistemas de
encapsulação e liberação de princípios ativos de interesse farmacêutico.
Duas moléculas de interesse farmacêutico e características diferentes
(solubilidade em meio aquoso) foram escolhidas para este estudo:
1. Rifampicina, molécula pouco solúvel em água para liberação em meio ácido (pH
1.2);
2. Cloridrato de propranolol, molécula solúvel em água para liberação em meio
básico (pH 7.4).
A metodologia utilizada e os resultados obtidos são apresentados a seguir.
5.1.1. Produção de micropartículas de quitosana nanoestruturadas com
sílica como matrizes de encapsulação
5.1.1.1.
Encapsulações de cloridrato de propranolol
Para este estudo, quatro diferentes formulações sólidas foram obtidas por spray
drying para serem comparadas quanto à eficiência de encapsulação e liberação in vitro:
-
Micropartículas de quitosana/Aerosil® 200 contendo cloridrato de
propranolol (Ficp).
o O cloridrato de propranolol foi adicionado à suspensão quitosana–
sílica antes de ser homogeneizada no HAP.
-
Micropartículas de quitosana/Aerosil® R972 contendo cloridrato de
propranolol (Focp).
o O cloridrato de propranolol foi adicionado à suspensão quitosana–
sílica antes de ser homogeneizada no HAP.
-
Micropartículas de quitosana contendo cloridrato de propranolol (Fqcp)
o A quitosana foi dissolvida em água juntamente com o cloridrato
de propranolol.
-
Cloridrato de propranolol (Referência)
As formulações correspondentes encontram-se resumidas na Tabela 5.1.
Bento Pereira da Costa Neto
94
Capítulo 5. Encapsulação e liberação de princípios ativos
Tese de doutorado
Tabela 5.1. Formulações de micropartículas de quitosana nanoestruturadas com sílica contendo
cloridrato de propranolol.
Formulação
Ficp
Focp
Fqcp
Referência
(CP)
Quitosana
(g)
1,0
1,0
1,0
-
Aerosil
200(g)
1,0
-
Aerosil
R972(g)
1,0
-
Cloridrato de
propranolol(g)
0,1
0,1
0,05
0,1
Água
(g)
99
80**
99
99
** 80 ml agua + 20 ml etanol para dispersar a silica Aerosil ® R972
5.1.1.2.
Encapsulação de rifampicina
Para este estudo, quatro diferentes formulações sólidas foram preparadas por
spray drying para serem comparadas quanto à eficiência de encapsulação e liberação in
vitro:
-
Micropartículas de quitosana/Aerosil® 200 contendo rifampicina (Fir).
o A rifampicina foi adicionada à suspensão quitosana–sílica antes
de ser homogeneizada no HAP.
-
Micropartículas de quitosana/Aerosil® R972 contendo rifampicina (For).
o A rifampicina foi adicionada à suspensão quitosana–sílica antes
de ser homogeneizada no HAP.
-
Micropartículas de quitosana contendo rifampicina (Fqr)
o A quitosana foi dissolvida em água juntamente com a rifampicina.
-
Rifampicina (referência)
As formulações correspondentes encontram-se resumidas na Tabela 5.2.
Tabela 5.2. Formulações de micropartículas de quitosana nanoestruturadas com sílica contendo
rifampicina.
Formulação
Fir
For
Fqr
Referência
(R)
Quitosana
(g)
1,0
1,0
1,0
-
Aerosil
200(g)
1,0
-
Aerosil
R972(g)
1,0
-
Rifampicina
(g)
0,1
0,1
0,05
0,1
Água
(g)
99
80**
99
99
** 80 ml agua + 20 ml etanol para dispersar a silica Aerosil ® R972
Bento Pereira da Costa Neto
95
Capítulo 5. Encapsulação e liberação de princípios ativos
Tese de doutorado
5.1.2. Caracterização das microparticulas contendo ativos
5.1.2.1.
Granulometria
Estas medidas foram realizadas utilizando-se um granulômetro laser MasterSizer
3000 (Malvern Instruments, Inglaterra) com um intervalo de leitura de 0,01-3500 μm.
As amostras foram dispersas em óleo mineral e adicionadas ao aparelho até obtenção da
boa obscuração. Os resultados foram analisados à partir da distribuição granulométrica
em volume ou pelos valores D4,3 et D3,2 que indicam respectivamente o diâmetro médio
em volume e o diâmetro médio em superfície-volume (ou diâmetro de Sauter). A
polidispersão é dada por um índice de distribuição de tamanho de partícula (span),
calculada pela Equação 3.1 (Capitulo 3).
5.1.2.2.
Morfologia
As imagens foram obtidas com um microscópio eletrônico de varredura Philips
XL30 FEG (Philips, USA), tensão de aceleração de 20 kV.
5.1.2.3.
Análise do estado sólido por difração de raios-X e calorimetria
diferencial de varredura
Difratometria de raios-X. Para a análise de DRX, as amostras foram prensadas
em um porta amostras de alumínio e os dados foram coletados em um difratômetro de
raios X (Philips X’Pert), na radiação CuKα (λ = 1.5418 A), operando a 45 KV e 40 mA
tensão e corrente do tubo, respectivamente. A varredura foi feita no intervalo de 8 à 40
°(2Θ), com um passo de 0,02 °(2Θ) e 5 seg/passo.
Calorimetria diferencial de varredura. Os termogramas de DSC das amostras
foram obtidos através de um Calorímetro Diferencial de Varredura DSC Q200 (TA
Instruments, França). As análises foram realizadas sob uma atmosfera de nitrogênio a
uma velocidade de fluxo de 50 ml.min-1, a uma taxa de aquecimento de 10° C.min-1. A
faixa de temperatura dependeu do tipo de amostra: Para o cloridrato de propranolol 2
ciclos de aquecimento-resfriamento foram realizados. As amostras foram analisadas à
5°C/min de 25 à 200°C; Para a rifampicina, foi realizado um primeiro ciclo de
aquecimento de 25°C à 110°C para eliminar a agua residual. A amostra foi em seguida
aquecida de 25 à 300°C à 5°C/min.
Bento Pereira da Costa Neto
96
Capítulo 5. Encapsulação e liberação de princípios ativos
5.1.2.4.
Tese de doutorado
Eficiência de encapsulação
Para o cálculo da eficiência dos ativos (cloridrato de propranolol e rifampicina)
pelas micropartículas foi realizada a seguinte metodologia: uma massa de 0,1g de
partícula foi pesada e dispersa em 10 ml de solvente (etanol para cloridrato de
propranolol e metanol para rifampicina). A dispersão foi filtrada em membrana de 0,22
µm de diâmetro de poro e lavada com 40 ml de solvente (etanol ou metanol). A
membrana foi introduzida em um dessecador até a evaporação total do solvente, em
seguida foi imersa em um erlenmeyer no qual foram adicionados 100 ml de 0,1 M HCl
e deixados em agitação magnética (100 rpm) por 2 horas.
O teor de cloridrato de propranolol nas micropartículas nanoestruturadas foi
determinado através de espectrofotometria no UV, no comprimento de onda 290 nm, de
acordo com a farmacopeia britânica (BP, 2000). As concentrações de cloridrato de
propranolol presentes na superfície das micropartículas (dissolvido no etanol) e
encapsulado (determinada após dissolução dos micropartículas em HCl) foram
determinadas à partir das equações das retas obtidas pelas curvas de calibração nos
respectivos meios, etanol e HCl, sendo todas as leituras realizadas em triplicata.
O teor de rifampicina nas micropartículas nanoestruturadas foi determinado
através de espectrofotometria no UV, no comprimento de onda 334 nm, de acordo com
a farmacopeia brasileira (5ª Ed.). As concentrações de rifampicina livre (dissolvida no
metanol) e encapsulada (determinada após dissolução das partículas em HCl) foram
determinadas à partir das equações das retas obtidas pelas curvas de calibração nos
respectivos meios, metanol e HCl, sendo todas as leituras realizadas em triplicata.
5.1.2.5.
Avaliação do perfil de liberação in vitro
5.1.2.5.1. Cloridrato de propranolol
O perfil de liberação das micropartículas contendo cloridrato de propranolol foi
monitorado por um período de 4 horas, através da medida da absorção no UV em
290nm (Pérez et al.,2000; Cerchiaraa et al., 2005; BP, 2000). Uma massa de
aproximadamente 0,5 g de micropartículas foi dispersa em 500 ml de solução tampão
fosfato pH 6, simulando o meio nasal. O sistema foi mantido sob agitação (100 rpm), a
37 ± 1°C. Alíquotas de 5,0 ml foram coletadas através de uma seringa hipodérmica
equipado com um filtro Millipore 0,4 mm e substituído com o mesmo volume de
solução de tampão pré-aquecida para manter um volume constante (Dandagi et al.,
2007).
Bento Pereira da Costa Neto
97
Capítulo 5. Encapsulação e liberação de princípios ativos
Tese de doutorado
O ensaio de liberação foi realizado em triplicata e as leituras das medidas de
absorção em quintuplicata. A porcentagem de ativo liberada é apresentada em função do
tempo (em horas), com os respectivos desvios-padrão.
5.1.2.5.2. Rifampicina
Segundo a Farmacopeia USP 29 e a Farmacopeia brasileira (5ª Ed.), o meio
oficial de dissolução para cápsulas/comprimidos de rifampicina é HCl 0,1M, pois
simula o meio presente no estômago. A dissolução de fármacos hidrofóbicos como a
rifampicina é uma tarefa difícil, pois o fármaco não é molhado facilmente pelo meio
aquoso de dissolução, formando aglomerados que flutuam na superfície e sua
solubilidade se mostra dependente do pH (Panchanula & Bhardwaj, 2008).
Para a determinação do perfil de liberação das micropartículas contendo
rifampicina em HCl 0,1M, uma massa de aproximadamente 0,5 g de micropartículas foi
dispersa em 500 ml de solução HCl 0,1M. Como a solubilidade da rifampicina nesse
meio é de 200mg/ml, à 37°C (Sigma, 2014), o volume de 500 ml utilizado corresponde
a 20 vezes o volume de saturação, sendo adequado para manter as condições ‘sink’. O
sistema foi mantido sob agitação (100 rpm), a 37°C ± 1. Foram coletadas alíquotas de
5,0 ml através de uma seringa hipodérmica equipada com um filtro Millipore 0,4 mm,
sendo este mesmo volume substituído com volume equivalente de solução de HCl 0,1M
pré-aquecida para manter um volume constante (Dandagi et al., 2007). A concentração
de rifampicina dissolvida no meio de dissolução foi monitorada durante 2 horas, através
da medida da absorção no UV em 334 nm (Dias, 2009). A porcentagem de ativo
liberada foi apresentada em função do tempo (min.), com os respectivos desvios-padrão.
O ensaio de liberação foi realizado em triplicata e as leituras das medidas de absorção
em quintuplicata.
5.1.2.5.3. Modelo cinético
Os resultados obtidos a partir dos perfis de liberação do cloridrato de
propranolol e da rifampicina das micropartículas de quitosana nanoestruturadas com
sílica foram submetidos a testes de modelos cinéticos com o objetivo de identificar o
mecanismo de liberação e a cinética correspondente. Os modelos testados foram (Tabela
5.3): de primeira-ordem, de Higuchi e de Hixson-Crowell (Serra, Storpirtis, 2007;
Mahle, et al., 2008). A constante de velocidade de dissolução (k), correspondente ao
Bento Pereira da Costa Neto
98
Capítulo 5. Encapsulação e liberação de princípios ativos
Tese de doutorado
coeficiente angular, foi determinada matematicamente a partir da equação da reta de
regressão que melhor definiu os perfis de dissolução.
Tabela 5.3. Modelos cinéticos usados na avaliação dos perfis de liberação de micropartículas de
quitosana nanoestruturadas com sílica
Modelo
Primeira ordem
Hixson-Crowell
Equação
æQ ö
ln çç t ÷÷ = K1t
èQ ø
com K1 : constante de
ordem 1
æ
ö1/3
'
Q
1- ç1- t ÷ = K HCt
ç Q ÷
è
ø
com KHC : constante de
Hixson-Crowell
Qt = K H t
Higuchi
com Kh : constante de
Representação gráfica
( )
ln Q t x tempo é uma
reta
Gráfico de 3 Qt' x tempo
é uma reta
Gráfico de Q x √t é uma
reta
Natureza do
mecanismo
Liberação dependente
da concentração do
ativo dissolvido
Liberação controlada
pela dissolução
acompanhada por uma
variação da área
especifica e do
diâmetro das partículas
Liberação controlada
pela difusão
Higuchi
onde Q0 representa a quantidade inicial da molécula na solução (geralmente, Q0 = 0), Qt é a
quantidade dissolvida no tempo t (%), Qt' é a quantidade não dissolvida no tempo t (%) e K1, KHC
et KH são as constantes dos modelos de primeira ordem, de Hixson-Crowell e de Higuchi,
respectivamente.
5.2.
Resultados e discussão
5.2.1. Características das micropartículas
5.2.1.1.
Granulometria, morfologia e eficiência de encapsulação
A Tabela 5.4 apresenta características como granulometria e eficiência de
encapsulação das micropartículas contendo rifampicina ou cloridrato de propranolol. As
Figuras 5.1 e 5.2 mostram respectivamente as imagens MEV das micropartículas de
quitosana nanoestruturadas com sílica contendo cloridrato de propranolol e rifampicina.
Os resultados das análises granulométricas (Tabela 5.4) mostram que a
incorporação de ambos os ativos, cloridrato de propranolol e rifampicina nas
micropartículas de quitosana nanoestruturadas com sílica representa uma redução de
tamanho, comparando-se as granulometrias das partículas obtidas com a granulometria
dos cristais de ambas as moléculas inicialmente utilizadas (produtos comerciais) ou as
imagens MEV (Figuras 5.1 e 5.2).
Bento Pereira da Costa Neto
99
Capítulo 5. Encapsulação e liberação de princípios ativos
Tese de doutorado
Tabela 5.4. Granulometria e eficiência de encapsulação das micropartículas de quitosana
nanoestruturadas com sílica contendo cloridrato de propranolol e rifampicina.
Molécula
farmacêutica
(PA)
PA :
quitosana:
Sílica
(proporção
mássica)
Eficiência de
encapsulação
(%)
Granulometria
(µm)
Span
Cloridrato de
propranolol
0,1:1:0
84,86 ± 0,03
-
-
Formulação
Matriz
Fqcp
Quitosana
Focp
Quitosana /
Aerosil
R972
Cloridrato de
propranolol
0,1:1:1
83,73 ± 2,12
Ficp
Quitosana /
Aerosil
200
Cloridrato de
propranolol
0,1:1:1
76,68 ± 0,66
Fqr
Quitosana
Rifampicina
0,1:1:0
77,94 ± 0,30
For
Quitosana /
Aerosil
R972
Rifampicina
0,1:1:1
53,46 ± 1,00
Fir
Quitosana /
Aerosil
200
Rifampicina
0,1:1:1
66,76 ± 0,50
Referência
(CP)
-
Cloridrato de
propranolol
-
Produto
comercial
Referência
(R)
-
Rifampicina
-
Produto
comercial
D10 1,89 μm
D[3,2] 4,10 μm
D50 6,54 μm
D[4,3] 7,51 μm
D90 14,20 μm
D10 1,65 μm
D[3,2] 3,06 μm
D50 3,86 μm
D[4,3] 4,34 μm
D90 7,67 μm
-
1,88
1,56
-
D10 1,65 μm
D[3,2] 3,50 μm
D50 5,27 μm
D[4,3] 6,15 μm
D90 11,80 μm
D10 2,07 μm
D[3,2] 3,95 μm
D50 5,16 μm
D[4,3] 6,11 μm
D90 11,70 μm
D10 23,6 μm
D[3,2] 51,9 μm
D50 76,3 μm
D[4,3] 86,5 μm
D90 165,0 μm
D10 39,4 μm
D[3,2] 42,2 μm
D50 286,0 μm
D[4,3] 303,0 μm
D90 602,0 μm
1,93
1,87
1,85
1,97
No caso da rifampicina, as micropartículas de quitosana nanoestruturadas com
sílica Aerosil 200 e Aerosil R972 apresentam uma granulometria bastante similar
representada por um diâmetro médio d[4,3] de cerca de 6 µm, numa faixa granulométrica
variando de cerca de 2 µm (d10) à 12 µm(d90). Estas micropartículas são caracterizadas
por uma eficiência de encapsulação de rifampicina de 53% ( For, Aerosil R972) à
66% (Fir, Aerosil 200), menores que a eficiência de encapsulação das
micropartículas constituídas apenas de quitosana ( Fqcp, 78%).
Bento Pereira da Costa Neto
100
Capítulo 5. Encapsulação e liberação de princípios ativos
Tese de doutorado
No caso do cloridrato de propranolol, as micropartículas nanoestruturadas com
sílica Aerosil R972 são maiores que as micropartículas nanoestruturadas com sílica
Aerosil 200. A capacidade de encapsular o cloridrato de propranolol é superior que à
de encapsular rifampicina por ambas as sílicas [77% (Ficp, Aerosil 200) à 84%
(Focp, Aerosil R972)].
Fqcp: cloridrato de propranolol – produto comercial
Ficp: cloridrato de propranolol - quitosana-Aerosil
Focp: cloridrato de propranolol - quitosana-Aerosil
200 (0.1g; 1g;1g)
R972 (0.1g; 1g;1g)
Ficp: cloridrato de propranolol - quitosana-Aerosil
Focp: cloridrato de propranolol - quitosana-Aerosil
200 (0.1g; 1g;1g)
R972 (0.1g; 1g;1g)
Figura 5.1. Imagens MEV de micropartículas de quitosana e sílica contendo cloridrato de
propranolol.
Bento Pereira da Costa Neto
101
Capítulo 5. Encapsulação e liberação de princípios ativos
Tese de doutorado
Fqr: rifampicina – produto comercial
Fir: rifampicina - quitosana-Aerosil 200 (0.1g; 1g;1g)
For: rifampicina - quitosana-Aerosil R972 (0.1g; 1g;1g)
Fir: rifampicina - quitosana-Aerosil 200 (0.1g; 1g;1g)
For: rifampicina - quitosana-Aerosil R972 (0.1g; 1g;1g)
Figura 5.2. Imagens MEV de micropartículas de quitosana e sílica contendo rifampicina.
5.2.1.2.
Análise do estado sólido por difratometria de raios-x e calorimetria
exploratória diferencial
5.2.1.2.1. Difração de Raios -X
A Figura 5.3 apresenta de forma comparativa os difratogramas de raios-X do
produto comercial cloridrato de propranolol e das micropartículas nanoestruturadas com
ambas as sílicas estudadas neste trabalho contendo este mesmo produto (solubilizado e
Bento Pereira da Costa Neto
102
Capítulo 5. Encapsulação e liberação de princípios ativos
Tese de doutorado
seco por spray drying). A não presença de picos nos difratogramas das micropartículas
analisadas confirma a formação de um produto amorfo por spray drying em ambos os
casos. Um mesmo comportamento é observado no caso da rifampicina (Figura 5.4).
Figura 5.3. Difratogramas das micropartículas de quitosana e sílica contendo cloridrato de
propranolol.
Figura 5.4. Difratogramas das micropartículas de quitosana e sílica contendo rifampicina.
Bento Pereira da Costa Neto
103
Capítulo 5. Encapsulação e liberação de princípios ativos
Tese de doutorado
5.2.1.2.2. Calorimetria exploratória diferencial
Cloridrato de propranolol. A Figura 5.5 apresenta primeiramente o termograma
para o produto comercial cloridrato de propranolol. Dois ciclos de aquecimentoresfriamento foram realizados para este produto. No primeiro ciclo mostrado na Figura
5.3, identifica-se uma fusão à 164°C com um ∆H de 124,7J/g. Durante a fase de
resfriamento o produto permanece amorfo, sem traço de recristalização. Os
termogramas das micropartículas nanoestruturadas com sílica Aerosil 200 e Aerosil
R972 (Ficp e Focp) também mostrados nesta mesma figura apresentam picos
endotérmicos entre 25°C e 250°C, associadas com as sílicas, porém estes termogramas
não apresentam o pico referente à fusão do cloridrato de propranolol à 164°C. A Figura
5.6 mostra os resultados do segundo ciclo de aquecimento realizado para as
micropartículas de quitosana nanoestruturadas com sílica Aerosil 200, que confirma que
estas micropartículas não apresentam nem o pico de recristalização nem de fusão do
cloridrato de propranolol. Estes resultados confirmam a natureza amorfa das
micropartículas também identificadas por difratometria de raios-X.
.
Figura 5.5. DSC comparativo do cloridrato de propranolol incorporado às micropartículas
nanoestruturadas com Aerosil® e Livre(Referência) : 5°C/min, 25-200°C, N2 - primeiro ciclo de
aquecimento
Bento Pereira da Costa Neto
104
Capítulo 5. Encapsulação e liberação de princípios ativos
Tese de doutorado
Figura 5.6. DSC comparativo do cloridrato de propranolol incorporado às micropartículas
nanoestruturadas com Aerosil®200 e Livre(Referência)_ 5°C/min_25-200°C : 5°C/min, 25-200°C, N2
- segundo ciclo de aquecimento.
Rifampicina. A Figura 5.7 apresenta os termogramas das micropartículas de
quitosana nanoestruturadas com sílica contendo rifampicina, em comparação ao
termograma do produto de referência.
Na amostra de referência (rifampicina) foi
realizado um primeiro ciclo de aquecimento de 25°C a 110°C para eliminação da água
absorvida pela amostra. Esta evaporação de água é representada pelo pico endotérmico
a cerca de 100°C visto na Figura 5.7. A amostra foi, em seguida, aquecida à 25-300°C a
5°C / min. Uma transformação exo-endo-exo é identificada entre 150°C e 210°C, que
pode corresponder à cristalização da forma polimórfica II seguido da fusão deste
polimorfo e de sua recristalização na forma I. Este ciclo se termina com um evento
exotérmico de degradação da forma I à 250°C.
A Figura 5.7 apresenta também os termogramas das micropartículas Fir e For
em comparação à este da amostra de referência. Estes termogramas apresentam picos
endotérmicos entre 100 e 200°C, provavelmente, devido à sílica que podem mascarar as
transformações observadas entre 150°C e 250°C para a amostra referência. Outra
hipótese para o não aparecimento dos picos característicos das transformações
polimórficas da rifampicina observadas no produto de referência (cristalino) é a
amorfização da rifampicina pelo processo de produção das micropartículas. Pode-se
Bento Pereira da Costa Neto
105
Capítulo 5. Encapsulação e liberação de princípios ativos
Tese de doutorado
observar que próximo a 270°C há um pico exotérmico muito provavelmente referente à
degradação da quitosana.
Figura 5.7. DSC das micropartículas nanoestruturadas com Aerosil® e rifampicina de referência.
Ciclo de aquecimento 25-110-25-300°C; N2; 5°C/min.
5.2.1.3.
Avaliação do perfil de liberação dos ativos in vitro
A determinação da cinética de liberação dos dois princípios ativos a partir das
micropartículas de quitosana/Aerosil® foi avaliada após a determinação da
concentração do fármaco dissolvido no meio de liberação ao longo do tempo. Os
resultados expressos em porcentagem de fármaco liberado no tempo podem ser
observados nas Figura 5.8 e 5.9, para cloridrato de propranolol e rifampicina,
% liberação de Cloridrato
de Propanolol
respectivamente.
100
80
60
Referência
Fqcp
Focp
Ficp
40
20
0
0
1
2
3
4
Tempo (h)
Figura 5.8. Representação gráfica dos perfis de liberação do cloridrato de propranolol em tampão
fosfato pH 6, 37°C.
Bento Pereira da Costa Neto
106
Capítulo 5. Encapsulação e liberação de princípios ativos
Tese de doutorado
Na Figura 5.8 observa-se que as micropartículas de quitosana pura liberam
rapidamente o cloridrato de propranolol no meio de dissolução. O efeito burst
observado nas micropartículas de quitosana está relacionada principalmente à
protonação do grupo amina da quitosana em meio aquoso (pKa = 6,3-6,7) Torres (2006)
que faz com que a quitosana se solubilize no meio de dissolução de pH 6, ocasionando a
rápida liberação do ativo (Goosen, 1996; Roberts, 1992). O efeito da presença das
sílicas é observado nas primeiras duas horas, o que se traduz por uma dissolução mais
lenta, sobretudo com a sílica Aerosil 200 (Ficp). O mesmo efeito é constatado para as
micropartículas contendo rifampicina (Figura 5.9).
A distribuição do fármaco preferencialmente no interior e não na
superfície das partículas, facilita o controle da liberação do ativo. Porém, um dos fatores
que influenciam essa liberação mais lenta nas micropartículas nanoestruturadas com
sílica é a interação da sílica com a quitosana que fortalece a parede da micropartícula
tornando-a menos permeável ao meio e diminuindo o efeito de protonação da quitosana.
Figura 5.9. Representação gráfica dos perfis de liberação da rifampicina em HCl 0,1M, 37°C.
5.2.1.4.
Modelos matemáticos
Para descrever a cinética de dissolução do cloridrato de propranolol e da
rifampicina a partir das micropartículas de quitosana nanoestruturadas com sílica, 3
diferentes modelos cinéticos foram testados: primeira ordem, de Higuchi e de HixsonCrowell. O modelo matemático que melhor descreve a cinética de dissolução das
formulações (60 min) foi selecionado após a construção das curvas dos modelos citados
acima e análise da regressão linear (Tabela 5.5). O ajuste dos valores demonstrou que as
Bento Pereira da Costa Neto
107
Capítulo 5. Encapsulação e liberação de princípios ativos
Tese de doutorado
micropartículas nanoestruturadas com sílica (Ficp, Focp, Fir, Focp) apresentaram uma
velocidade inicial de liberação que se aproximou mais do modelo de primeira ordem, na
qual a quantidade liberada do fármaco em função do tempo é dependente da quantidade
de fármaco remanescente na formulação.
Como pode-se observar na Tabela 5.6, para ambos os fármacos, as
micropartículas nanoestruturadas com sílica hidrofílica (Aerosil 200) apresentaram
uma liberação inicial de liberação mais rápida. Por exemplo, as micropartículas de
quitosana contendo sílica hidrofílica (Fqcp) liberam um percentual de cloridrato de
propranolol de 50% em 15 min (K=2,9 min-1), enquanto que as micropartículas
contendo sílica hidrofílica (Ficp) liberam cerca de 35% (K=1,7 min-1).
Tabela 5.5. Coeficiente de correlação linear (R2) obtido através de linearização do perfil de
liberação do cloridrato de propranolol
Amostra
Ordem/Modelo
R2 - 1º Ordem
R2 - Higuchi
Ficp
Focp
Fqcp
0,9990
0,9934
0,7613
0,9932
0,9971
0,7887
R2 - HixonCrowell
0,9954
0,9914
0,6249
Fir
For
Fqr
0,9707
0,9461
0,3465
0,9708
0,8688
0,5315
0,9715
0,8572
0,3045
Tabela 5.6. Constante de liberação (k) segundo a equação da reta ajustada pelo modelo de
primeira ordem; Porcentagem de cloridrato de propranolol e rifampicina liberada no tempo.
Amostra
K(min-1)
Ficp
Focp
Fqcp
1,73
2,91
-
Fir
For
Fqr
0,05
0,06
-
Bento Pereira da Costa Neto
% liberada
no tempo
15 min
35,1
50,1
95,2
37,9
31,8
86,9
% liberada
no tempo
30 min
56,0
71,4
98,2
52,4
62,3
97,0
% liberada
no tempo
60 min
82,4
94,6
99,1
63,5
84,2
97,2
108
Capítulo 5. Encapsulação e liberação de princípios ativos
5.3.
Tese de doutorado
Conclusões parciais
Nesta etapa do trabalho investigou-se a possibilidade de uso das micropartículas
de quitosana nanoestruturadas com sílica Aerosil 200 e sílica Aerosil R972 como
matrizes de encapsulação e liberação de dois princípios ativos de interesse
farmacêutico: rifampicina como molécula pouco solúvel em agua para liberação em
meio ácido (pH 1.2) e cloridrato de propranolol como molécula solúvel em agua para
liberação em meio básico (pH 7.4).
Os resultados obtidos comprovaram o efeito da nanoestruturação das
micropartículas de quitosana na capacidade de reter e liberar princípios ativos com
características hidrofílicas ou hidrofóbicas, baseando-se na análise dos perfis de
liberação in vitro dos ativos-modelo utilizados.
Comparativamente a outros métodos de encapsulação para efeito de liberação
modificada/controlada, o método proposto neste trabalho é interessante visto sua
capacidade de retenção dos ativos no interior das micropartículas que é superior à 50% e
nos melhores casos chegando à 80%, superior ao que se obtém com técnicas que
utilizam sistemas aquosos, como por exemplo 38 % no caso da rifampicina encapsulada
(Zaniboni et al. 2001) pela técnica de liofilização a partir de metilcelulose e ftalato de
hidroxipropilmetilcelulose ou 37 % no caso do propranolol encapsulado por Pérez e et
al., pela técnica de emulsão A/O (Perez et al, 2000).
A cinética de liberação foi modificada por dois mecanismos: aumento da
solubilidade pela amorfização dos fármacos (comprovada por DRX) e efeito ‘barreira à
difusão’ estabelecido pela estrutura das micropartículas compósitas. Este efeito barreira
levou à diminuição do efeito burst quando comparado às micropartículas de quitosana,
sugerindo que este tipo de formulação poderá ser otimizado a fim de prolongar a
liberação do ativo no tempo. A quantidade liberada do fármaco em função do tempo é
dependente da quantidade de fármaco remanescente na formulação (ajuste pelo modelo
cinético de primeira ordem).
Bento Pereira da Costa Neto
109
CAPÍTULO 6
Adsorção e dessorção de albumina de soro bovina
Capítulo 6. Adsorção e dessorção de albumina de soro bovina
6.1.
Tese de doutorado
Metodologia experimental
Nesta etapa do trabalho, as micropartículas de quitosana nanoestruturadas com
sílica Aerosil 200 e Aerosil R972 foram analisadas quanto às suas propriedades
estruturais e capacidade de adsorção e dessorção. O adsorbato utilizado foi a proteína
BSA (albumina de soro bovina) que apresenta um ponto isoelétrico de 4,8.
O objetivo foi de verificar se as modificações físico-químicas das
microparticulas de quitosana alteram o número de sítios de adsorção e as características
dos grupos funcionais inicialmente presentes na cadeia macromolecular devido a
interações com as silicas.
6.1.1. Capacidade de adsorção de BSA em função do pH da solução tampão
Nos ensaios de adsorção, 8 mg de cada tipo de micropartícula de quitosana
nanoestruturadas com sílica foram incubados com 20 mg de BSA em um total de 4 ml
de PBS em diferentes pHs (4, 5, 6, 7,4, 8), ajustados com fosfato monossódico
monohidratado e fosfato dissódico heptahidratado.
As amostras foram mecanicamente agitadas (150 rpm) à temperatura ambiente
(25°C). Após 2 horas, as amostras foram centrifugadas a 8000 rpm por 5 min. As
concentrações de BSA foram dosadas nos sobrenadantes pelo método de Bradford para
a determinação da quantidade adsorvida nas micropartículas.
Os ensaios de capacidade de adsorção de BSA em função do pH da solução
tampão foram realizados em triplicata.
6.1.2. Capacidade de adsorção em função da concentração de BSA
Nos ensaios de capacidade de adsorção em função da concentração de BSA, 8
mg de cada tipo de micropartícula de quitosana nanoestruturadas com sílica foram
incubados em solução tampão fosfato (PBS) pH 6 contendo concentrações variadas de
BSA (0,2 - 0,4 - 0,6 - 0,8 - 1 - 5 e 10 mg/ml). As amostras foram mantidas sob agitação
constante de 150 rpm à temperatura ambiente (25°C).
Após 2 horas, as amostras foram centrifugadas a 8000 rpm por 5 min. As
concentrações de BSA foram dosadas nos sobrenadantes pelo método de Bradford para
a determinação da quantidade adsorvida nas micropartículas. Os ensaios de capacidade
de adsorção em função da concentração de BSA foram realizados em triplicata.
Bento Pereira da Costa Neto/2009
111
Capítulo 6. Adsorção e dessorção de albumina de soro bovina
Tese de doutorado
Para o cálculo da capacidade máxima adsortiva foi utilizado o modelo para
isotermas de equilíbrio de Langmuir. Para tanto, se considera que a adsorção se dê
mediante formação de uma monocamada na superfície do adsorvente, podendo as
moléculas do adsorvato serem adsorvidas até o completo preenchimento dos sítios
adsortivos disponíveis no adsorvente.
O modelo da Isoterma de Langmuir é representado pelas Equações 6.1 e 6.2:
Equação de Languimir
Forma linearizada
(Equação 6.1)
(Equação 6.2)
sendo que: qmax = parâmetro de Langmuir que representa a capacidade máxima
adsortiva do adsorvente (mg g-1) e k = constante de adsorção de equilíbrio, que expressa
a afinidade entre o adsorvente e adsorvato (Ɩ.g-1).
6.1.3. Estudo cinético da adsorção da BSA
Os experimentos de cinética de adsorção da BSA nas micropartículas de
quitosana nanoestruturada com sílica foram conduzidos em solução tampão fosfato
(PBS) pH 6 contendo uma concentração inicial de BSA de 5 mg.ml -1. Esta concentração
de BSA foi fixada a partir dos resultados dos ensaios realizados na etapa anterior de
estudo da capacidade de adsorção em função da concentração de BSA (item 6.1.2).
As amostras foram colocadas sob agitação constante de 150 rpm à temperatura
ambiente (25°C) até se atingir o equilíbrio de adsorção. As concentrações de BSA
foram dosadas nos sobrenadantes pelo método de Bradford para a determinação da
quantidade adsorvida nas micropartículas. Estes ensaios foram realizados em triplicata.
6.1.4. Medida do potencial zeta em função da quantidade de proteína BSA
adsorvida
Os experimentos foram realizados medindo-se o potencial zeta das
microparticulas dispersas na soluçao tampão pH 6 contendo uma concentração inicial de
de 5 mg.ml-1 de BSA. As amostras foram colocadas sob agitação constante de 150 rpm à
Bento Pereira da Costa Neto
112
Capítulo 6. Adsorção e dessorção de albumina de soro bovina
Tese de doutorado
temperatura ambiente (25°C) e leituras do potencial zeta foram feitas periodicamente
até a neutralização das cargas. Esses ensaios foram também realizados em triplicata.
6.1.5. Estudo da dessorção da BSA
A dessorção da proteína adsorvida nas micropartículas foi investigada como
segue: Uma massa de aproximadamente 4 mg de micropartículas foi dispersa em 4 ml
de solução tampão fosfato (pH 5,5 e pH 7,4), mantendo assim o volume do meio de
dissolução com uma concentração maior que 20% da concentração de saturação da BSA
(condição sink, Lai, 2006). O sistema foi mantido sob agitação (150 rpm), a 37°C ± 1.
Foram coletadas alíquotas de 20 µl através de uma pipeta de precisão e o volume de
meio retirado era reposto para manter um volume constante. A porcentagem da BSA
dessorvida no tampão PBS foi fixada em função do tempo (horas), com os respectivos
desvios-padrões.
O perfil de dessorção da BSA das micropartículas de quitosana nanoestruturadas
com sílica foi monitorado por um período de 6 horas, através da medida da absorção no
UV em 595 nm (Bradford, 1976). O ensaio de dessorção foi realizado em triplicata e as
leituras das medidas de absorção em quintuplicata.
Os resultados obtidos a partir do perfil de dessorção foram submetidos a cálculos
matemáticos com o objetivo de determinar a cinética de dessorção da BSA presente na
superfície das micropartículas. A equação de regressão da reta foi determinada através
das porcentagens dissolvidas em função do tempo, utilizando-se os modelos cinéticos
de ordem zero, de primeira-ordem, segunda-ordem, Higuchi e Hixson-Crowell (Serra,
Storpirtis, 2007; Mahle, et al., 2008).
6.1.6. Caracterização das micropartículas contendo BSA
6.1.6.1.
As
Análise granulométrica
distribuições
granulométricas
das
micropartículas
de
quitosana
nanoestruturadas com sílica com BSA adsorvida na superfície foram analisadas por
difração laser em granulômetro LS 230 COULTER ®. O tamanho médio de partículas
foi expresso com o diâmetro médio em volume (D[4,3]).
Bento Pereira da Costa Neto
113
Capítulo 6. Adsorção e dessorção de albumina de soro bovina
6.1.6.2.
Tese de doutorado
Espectrofotometria no infravermelho por transformada de fourier
Os espectros de infravermelho foram obtidos no modo de transmissão em um
espectrômetro de infravermelho por transformada de Fourier (FTIR) da Nicolet, modelo
6700, utilizando 32 varreduras por amostra na faixa de 500 – 4000 cm-1, resolução de 4
cm-1 e intervalo de 2 cm-1.
Bento Pereira da Costa Neto
114
Capítulo 6. Adsorção e dessorção de albumina de soro bovina
6.2.
Tese de doutorado
Resultados e discussão
6.2.1. Capacidade de adsorção de bsa em função do pH
A presença de grupos amino livres na quitosana é responsável por sua natureza
policatiônica em soluções ácidas. Com isso, para pHs < 6,5 a quitosana apresenta seus
grupos amino na forma protonada NH3 +.
As micropartículas estão positivamente carregadas em pH < 6,5 com mais
grupos NH2 convertidos a NH3+ na medida que o pH diminui. Interações eletrostáticas
entre as microesferas e a proteína BSA (pI = 4,8) serão repulsivas em pHs > 6,5 e pHs <
4,7, mas tornam-se atrativas em pHs entre 4,87 e 6,5 (Torres, 2006)
A Figura 6.1 representa a capacidade de adsorção (mg.g-1) da BSA nas
micropartículas nanoestruturadas com Aerosil® em função do pH. Como pode-se
constatar, a capacidade de adsorção da BSA pelas micropartículas é fortemente
dependente do pH do meio de adsorção.
A capacidade de adsorção do BSA nas micropartículas de quitosana
nanoestruturadas com Aerosil® é favorecida na faixa compreendida entre 5 e 6 com
diminuição nos valores de adsorção em pHs acima de 6,5. As interações eletrostáticas
podem explicar a diminuição observada na capacidade de adsorção em valores de pH
acima de 6,5, com a repulsão entre as cargas de mesmo sinal presentes na superfície do
adsorvente e da BSA. Entretanto, a capacidade de adsorção máxima da BSA foi
observada próximo ao ponto isoelétrico (pH 6) das micropartículas de quitosana,
conforme Tabela 6.1.
Tabela 6.1. Quantidade de BSA adsorvida sobre as micropartículas de quitosana
Aerosil® R972
Aerosil® 200
(mg/g)
(mg/g)
4
342,4 ± 0,7
265,6 ± 3,7
5
375,5 ± 0,2
298,6 ± 4,9
6
521,3 ± 0,6
451,5 ± 5,4
7,4
344,2 ± 1,1
321,9 ± 4,0
8
324,6 ± 0,7
296,0 ± 2,6
pH
Bento Pereira da Costa Neto
115
Capítulo 6. Adsorção e dessorção de albumina de soro bovina
Tese de doutorado
Figura 6.1. Capacidade de adsorção (mg.g-1) da BSA nas micropartículas nanoestruturadas com
Aerosil® em função do pH (25°C)
6.2.2. Capacidade de adsorção em função da concentração de bsa
Os dados experimentais referentes à quantidade de BSA adsorvida em função da
concentração inicial de BSA no meio são apresentados na Tabela 6.2 e representados
graficamente na Figura 6.2.
Tabela 6.2. Quantidade de BSA adsorvida em função da concentração inicial de BSA no meio de
adsorção (tampão fosfato, pH 6, 25°C)
Concentração da Solução
de BSA (mg/ml)
Capacidade de adsorção
Aerosil® 200 (mg/g)
Capacidade de adsorção
Aerosil® R972 (mg/g)
0,2
0,4
0,6
0,8
1
5
10
74,1 ± 0,1
175,1± 0,1
271,0± 0,1
364,2 ± 0,1
449,9 ± 0,1
451,5 ±0,1
440,5 ± 0,1
82,1 ± 0,1
180,5 ± 0,1
275,4 ± 0,1
369,5 ± 0,1
487,6 ± 0,1
521,3 ± 0,1
519,1 ± 0,1
Bento Pereira da Costa Neto
116
Capítulo 6. Adsorção e dessorção de albumina de soro bovina
Tese de doutorado
Figura 6.2. Capacidade de adsorção da BSA (mg.g-1) em função da concentração inicial de BSA no
meio de adsorção(mg.ml-1) (pH 6, 25°C)
Nota-se através destes resultados que a quantidade de BSA adsorvida é
diretamente proporcional à concentração inicial da proteína no meio aquoso para
concentrações iniciais até 5mg BSA/ml. A capacidade de adsorção é sextuplicada
quando a concentração inicial de BSA em solução passa de 0,2 mg/ml para 5 mg/ml. No
entanto, o aumento da concentração inicial de BSA além deste valor não resultou em
aumento da capacidade de adsorção desta proteína pelas micropartículas, o que sugere
preenchimento e saturação dos sítios de adsorção na superfície das micropartículas à 5
mg/ml nas condições estudadas (tampão fosfato, pH 6, 25°C). Esses resultados são
superiores a valores relatados na literatura referentes à adsorção de BSA em
micropartículas de quitosana reticuladas quimicamente da ordem de 134 mg.g -1 Lima
(2011) ou, ainda inferior, da ordem de 5 mg.g-1 (Torres, 2006).
A Figura 6.3 apresenta as isotermas de adsorção de Langmuir, construídas de
acordo com a Equação 6.1 a partir dos dados extraídos da Figura 6.2. Os valores dos
coeficientes de correlação R2 (Tabela 5.3), de cada reta, indicam uma boa adequação do
modelo proposto com os dados experimentais. Isso sugere que as reações de adsorção
estudadas são baseadas em possíveis processos de quimiossorção, ou seja, as interações
entre os grupos presentes na superfície das micropartículas e os grupos ligantes da BSA
são majoritariamente de natureza química (Adamson & Gast, 1997), tornando a
adsorção entre as espécies envolvidas bem mais fortes em relação a processos que
apresentassem somente interações de caráter puramente físicas.
Bento Pereira da Costa Neto
117
Capítulo 6. Adsorção e dessorção de albumina de soro bovina
Tese de doutorado
Figura 6.3. Isotermas de Langmuir referentes às adsorções da BSA nas micropartículas
nanoestruturadas com Aerosil®.
Os valores das constantes de adsorção (Kads) e das quantidades máximas
adsorvidas (Qmax) da BSA nas micropartículas nanoestruturadas com Aerosil® são
dados também na Tabela 6.3.
Tabela 6.3. Parâmetros das isotermas de Langmuir referentes às adsorções sobre Q t.
Qt
Micropartículas
Kads (mg/g)
Qmáx (mg/g)
R2
Aerosil 200
1,0
476,2
0,991
Aerosil R972
1,8
555,6
0,991
6.2.3. Velocidade de adsorção das proteínas
Pode-se observar que a adsorção foi rápida no início, tendendo a um estado de
equilíbrio após 60 min, como mostram a Figura 6.4 e a Tabela 6.4. Na primeira fase
deste processo de adsorção, a superfície das micropartículas estava relativamente livre
de BSA (Figura 6.4) e as proteínas que entraram em contato com a superfície das
micropartículas ligaram-se instantaneamente aos sítios de adsorção na superfície das
Bento Pereira da Costa Neto
118
Capítulo 6. Adsorção e dessorção de albumina de soro bovina
Tese de doutorado
micropartículas. A taxa de adsorção era controlada pelo número de moléculas de BSA
que difundiram do meio aquoso até a superfície das micropartículas.
Figura 6.4. Capacidade de adsorção (mg.g-1) da BSA em função do pH nas micropartículas de
quitosana.
Tabela 6.4. Quantidade de BSA adsorvida nas micropartículas de quitosana em função do
tempo
Tempo
(min)
0
15
30
45
60
120
Aerosil® 200
(mg/g)
6,26 ± 2,11
165,41 ± 1,54
359,44 ± 1,78
417,56 ± 1,89
452,43 ± 0,86
465,84 ± 2,93
Aerosil® R972
(mg/g)
8,05 ± 0,3
168,11 ± 0,2
380,01 ± 0,1
460,48 ± 0,4
506,97 ± 0,5
530,22 ± 0,6
6.2.4. Relação entre quantidade de bsa adsorvida e potencial zeta das
micropartículas
O princípio físico da adsorção da proteína BSA é a competição entre o ganho de
energia potencial obtido pelos monômeros ao se ligar com a superfície atrativa das
micropartículas e a perda na entropia da cadeia associada com a redução no número de
possíveis configurações das cadeias quando elas se encontram no estado adsorvido. A
Figura 6.5 e a Tabela 6.5 apresentam a evolução do potencial zeta das micropartículas em
função do tempo.
Bento Pereira da Costa Neto
119
Capítulo 6. Adsorção e dessorção de albumina de soro bovina
Tese de doutorado
Figura 6.5. Potencial Zeta em função adsorção da BSA em pH 6
Tabela 6.5.Valores do Potencial Zeta em função adsorção da BSA em pH 6
Tempo (min)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
ζ [mv] Aerosil® 200
11,96 ± 1,11
10,05 ± 0,41
8,14 ± 1,31
6,10 ± 0,45
4,12 ± 1,27
3,04 ± 1,3
2,46 ± 1,02
2,44 ± 1,08
2,43 ± 1,2
2,42 ± 1,12
ζ [mv] Aerosil® R972
10,57 ± 0,95
8,63 ± 1,28
6,55 ± 1,92
4,51 ± 1,15
2,61 ± 0,54
1,60 ± 0,60
1,16 ± 1,17
1,13 ± 1,19
1,12 ± 1,14
0,10 ± 1,03
Para facilitar a interpretação dos dados experimentais relacionando velocidade
de adsorção e variação do potencial zeta das micropartículas de quitosana, os dados
apresentados nas Figuras 6.4 e 6.5 foram associados para uma representação conjunta
nas Figuras 6.6 e 6.7.
Nota-se que inicialmente a quantidade adsorvida é diretamente proporcional ao
tempo de exposição das micropartículas no meio contendo BSA, o que corresponde à
ocupação dos sítios livres da superfície das micropartículas. Nesta fase, a adsorção é
acompanhada pela redução do potencial zeta das micropartículas. Após cerca de 40 min,
o processo desacelera-se tornando-se bem mais lento, até cessar com a ocupação total
dos sítios livres da superfície das micropartículas (potencial zeta próximo de zero).
Bento Pereira da Costa Neto
120
Capítulo 6. Adsorção e dessorção de albumina de soro bovina
Tese de doutorado
Figura 6.6. Potencial Zeta em função adsorção da BSA em pH 6, temperatura 25°C, concentração de
5mg.ml-1, tempo de adsorção de 2h.
Figura 6.7. Potencial Zeta em função adsorção da BSA em pH 6, temperatura 25°C, concentração de
5mg.ml-1, tempo de adsorção de 2h.
Estes resultados revelam uma capacidade máxima de adsorção de proteína BSA
pelas micropartículas de sílica Aerosil R 972 de 533 mg/g e de cerca de 465 mg/g pelas
micropartículas de sílica Aerosil 200.
6.2.5. Estudo de dessorção da BSA
O perfil de liberação da BSA foi seguido ao longo de 6 horas em dois diferentes
meios (pH 5,5 e pH 7,4) à temperatura de 37°C., tendo-se quantificado as amostras do
sobrenadante pelo método de Bradford (1976).
Bento Pereira da Costa Neto
121
Capítulo 6. Adsorção e dessorção de albumina de soro bovina
Tese de doutorado
Para ambas as condições testadas (pH 5,5 e pH 7,4), o sistema exibiu um efeito
de liberação rápida inicial (“burst”) nos primeiros 30 min (cerca de 40-50%), seguido de
um segundo período de menor velocidade de dessorção da BSA, até que o equilíbrio
fosse atingido (75-80% de dessorção), como mostram a Figura 6.8 e a Tabela 6.6.
A dessorção da BSA através das micropartículas de quitosana nanoestruturadas
com sílica é interessante comparada a dados da literatura referentes à dessorção de BSA
de micropartículas de quitosana reticuladas quimicamente com aldeídos ou
epicloroidrina: de 34% (Torres, 2006) à 52% (Fernandes, 2011). O ‘burst’ inicial pode
ser atribuído ao fato de que a BSA encontra-se adsorvida através de interações iônicas et
que podem ser desestabilizadas em um meio iônico (solução tampão pH 7,4 e 5,5). No
caso da Aerosil 200 nota-se que a dessorção é menos favorecida em pH 5,5. Este
comportamento pode ser atribuído à estrutura hidrofílica desta sílica com maior
probabilidade de estabelecer pontes de hidrogênio com a quitosana.
Figura 6.8. Perfil de liberação da BSA em diferentes pHs
Bento Pereira da Costa Neto
122
Capítulo 6. Adsorção e dessorção de albumina de soro bovina
Tese de doutorado
Tabela 6.6. Valores do perfil de liberação da BSA em diferentes pHs
Tempo (h)
0,25
0,5
1
2
4
6
pH 7,4
Aerosil® R972
Aerosil® 200
53,65 ± 2,78
50,83 ± 1,87
64,04 ± 1,45
63,19 ± 1,26
69,10 ± 2,33
70,64 ± 1,77
73,87 ± 3,18
76,16 ± 3,41
75,13 ± 2,11
80,47 ± 2,42
75,79 ± 4,75
80,25 ± 2,74
pH 5,5
Aerosil® R972 Aerosil® 200
58,34 ± 1,22
41,50 ± 1,98
67,94 ± 2,47
54,90 ± 3,11
74,55 ± 1,52
60,80 ± 0,70
79,70 ± 2,59
64,10 ± 2,33
84,48 ± 3,23
70,02 ± 1,49
86,05 ± 2,67
69,70 ± 1,27
Um modelo cinético para a dessorção da BSA foi testado através da linearização
do perfil de dessorção onde obteve-se o coeficiente de correlação, R2, de cada amostra
nos diferentes modelos (ordem zero, primeira ordem, Higuchi e Hixson-Crowell). O
modelo cinético que melhor representa os dados experimentais é o modelo de Higuchi.
A Tabela 6.8 apresenta o parâmetro cinético calculado pelo modelo (constante de
liberação kH).
Perfis de dessorção em duas etapas, uma liberação rápida inicial seguida por
uma liberação mais lenta, são frequentemente descritos pelo modelo de Higuchi (Ogawa
e Plepis, 2002).
Tabela 6.7. Coeficiente de correlação linear (R2) obtido através de linearização do perfil de dessorção
da BSA.
Amostra
R972 pH 7,4
R972 pH 5,5
200 pH 7,4
200 pH 5,5
Ordem/Modelo
R2- Ordem 0
R2 - 1º Ordem
R2 - Higuchi
0,8577
0,9148
0,8936
0,8405
0,8922
0,9496
0,9334
0,8750
0,9153
0,9586
0,9431
0,9014
R2 - HixonCrowell
0,9209
0,9388
0,8809
0,6933
Tabela 6.8- Parâmetros cinéticos do modelo de Higuchi
Amostra
Aerosil®
R972 pH 7,4
Aerosil®
R972 pH 5,5
Aerosil® 200
pH 7,4
Aerosil® 200
pH 5,5
Bento Pereira da Costa Neto
R2
KH (min-0,5)
0,91
3,87
0,96
4,10
0,94
4,99
0,90
4,82
123
Capítulo 6. Adsorção e dessorção de albumina de soro bovina
Tese de doutorado
6.2.6. Análise granulométrica
As micropartículas de quitosana-Aerosil® foram analisadas por difração a laser
em aparelho LS 230 COULTER® granulometer. Neste estudo acompanhou-se a
variação da granulometria das micropartículas antes e logo após a adsorção da BSA. Os
resultados são dados na Tabela 6.9, mostrando que as micropartículas triplicam de
tamanho (2,8 a 3 vezes) com o intumescimento na solução tampão fosfato durante os
experimentos.
Tabela 6.9. Análise granulométrica das micropartículas antes e após adsorção da BSA
Amostras
D4,3
D0,1
D0,5
D0,9
Span
Mpfóbica
5,9 ± 0,1
2,1 ± 0,1
5,1 ± 0,8
10,5 ± 0,5
1,6 ± 0,1
Mpfílica
4,6 ± 0,1
2,4 ± 0,4
4,0 ± 0,5
6,7 ± 0,4
1,1 ± 0,1
MpfóbicaBSA
16,6 + 0,3
4,6 ± 0,3
13,7 ± 0,33
32,2 ± 0,6
2,0 ± 0,2
MpfílicaBSA
14,2 ± 0,2
5,0±0,8
12,7 ±0,61
27,3±1,5
1,86 ±0,1
Mpfóbica: Micropartículas nanoestruturadas com Aerosil R972; Mpfílica: Micropartículas
nanoestruturadas com Aerosil 200; MpfóbicaBSA: Micropartículas nanoestruturadas com Aerosil R
972 contendo BSA; MpfílicaBSA: Micropartículas nanoestruturadas com Aerosil 200 contendo BSA.
6.2.7. Espectrofotometria no infravermelho por transformada de fourier
Análises de FTIR foram realizadas para investigação do tipo de interação entre
BSA e as micropartículas de quitosana nanoestruturadas com sílica. A região escolhida
nos espectros IR concentra as principais bandas referentes aos grupos da quitosana:
estiramento vibracional C-O de álcool primário a 1068 cm-1 (1090 cm-1-grupo éter);
aminas alifáticas a 1070 a 1100 cm-1. As bandas de amida I (1652cm-1) são provenientes
do estiramento vibracional C = O e a banda de amida II (1531) do acoplamento
vibracional do C-N e do estiramento vibracional do N-H, referentes a BSA.
Os
resultados de FTIR corroboram a presença de BSA na superfície das micropartículas
nanoestruturadas com Aerosil®, como indicado nas Figuras 6.9 e 6.10.
Bento Pereira da Costa Neto
124
Capítulo 6. Adsorção e dessorção de albumina de soro bovina
Tese de doutorado
Figura 6.9 Espectros infravermelos (a) Micropartícula nanoestruturada com Aerosil® R972; (b)
Quitosana; (c) Aerosil® R972; (d) BSA; (e) Micropartícula com BSA adsorvida na superfície.
Figura 6.10. Espectros infravermelos (a) Micropartícula nanoestruturada com Aerosil® 200; (b)
Quitosana; (c) Aerosil® 200; (d) BSA; (e) Micropartícula com BSA adsorvida na superfície.
Bento Pereira da Costa Neto
125
Capítulo 6. Adsorção e dessorção de albumina de soro bovina
6.3.
Tese de doutorado
Conclusões parciais
As micropartículas de quitosana nanoestruturadas com Aerosil® foram capazes
de adsorver a BSA utilizada como proteína-modelo.
As micropartículas nanoestruturadas com Aerosil® R972 apresentaram maior
capacidade de adsorção de BSA (cerca de 530 mg.g-1) em comparação às
micropartículas nanoestruturadas com Aerosil® 200 (aproximadamente 450 mg.g -1).
Ficou evidente a influência do pH do meio sobre os valores obtidos de adsorção
e dessorção.
O modelo de Langmuir se ajustou bem aos dados experimentais obtidos.
Bento Pereira da Costa Neto
126
CAPÍTULO 7
Conclusão geral e perspectivas
Capítulo 7. Conclusões gerais e pespectivas
Tese de doutorado
Conclusões gerais
A proposta deste trabalho foi de conceber e desenvolver um novo tipo de veículo
para liberação controlada à base de quitosana nanoestrutura com nanopartículas de sílica
fumegada. Diferentemente dos materiais híbridos à base de sílica-quitosana hoje
sintetizados por processo de sol-gel, o processo de associação aqui proposto é de
natureza física (sílicas Aerosil foram incorporadas à uma solução de quitosana para
gerar micropartículas de quitosana nanoestruturadas com sílica à partir da evaporação
do solvente por spray drying).
Primeiramente definiu-se o procedimento experimental de dispersão das
nanopartículas de sílica (Aerosil 200 et Aerosil R972) na solução de quitosana.
Diferentes técnicas de dispersão foram testadas, dentre elas: ultrassom, ultra turrax e
homogeneizador de alta pressão (HAP). Uma vez definida a técnica de dispersão,
procedeu-se o estudo de sensibilidade paramétrica variando-se condições de processo e
de formulação e verificando-se o efeito destas variáveis nas características dos produtos
obtidos como granulometria, capacidade de sorção de umidade, estabilidade ácida,
carga superficial e liberação de princípios ativos.
Através dos resultados obtidos na primeira etapa do trabalho, pode-se concluir
que a introdução de sílica na estrutura das micropartículas de quitosana resultou em uma
mudança nas propriedades físicas e químicas quando comparada às micropartículas de
quitosana pura. Dentre outras, a presença de sílica nas micropartículas ocasionou:
-
Redução considerável da carga superficial das micropartículas que
passou de +35mV (quitosana pura) para valores da ordem de +10 à
+17mV quando nanoestruturadas com sílica Aerosil 200 ou Aerosil
R972.
-
Redução da capacidade das micropartículas nanoestruturadas em
absorver umidade, quando comparadas às micropartículas sem sílica.
-
Aumento da estabilidade térmica das micropartículas de quitosana
(alteração da temperatura de degradação da quitosana).
-
Maior estabilidade em meio ácido. Além disso, a sílica Aerosil® 200
(hidrofílica) parece ter maior interação com a quitosana, provavelmente
devido a um maior número de ligações hidrogênio que podem ser
Bento Pereira da Costa Neto
128
Capítulo 7. Conclusões gerais e pespectivas
Tese de doutorado
estabelecidas através do maior número de grupos hidroxila em sua
superfície, o que torna mais lenta a dissolução da quitosana em meio
ácido comparativamente à sílica Aerosil® R972 (hidrofóbica).
-
Reduzida reatividade à umidade, estabelecendo um efeito “barreira à
absorção de umidade”, verificada através da proteção à evolução
polimórfica do manitol encapsulado nestas partículas e submetidas a
condições de estresse de umidade e temperatura durante 6 meses. Este
efeito “barreira à absorção de umidade” foi comprovado através de
análise de imagem MEV (teste dinâmico de exposição à umidade e
visualização simultânea).
Estudos in vitro indicaram baixa citotoxicidade e baixa capacidade de ativar a
produção de óxido nítrico das células, sendo compatível com uma baixa ação próinflamatória. Juntas, essas informações incentivam a exploração das micropartículas
nanoestruturadas com sílica desenvolvidas neste trabalho como novos sistemas de
carreamento de princípios ativos através de vias orais ou mucosas.
Testou-se
assim
a
potencialidade
das
micropartículas
de
quitosana
nanoestruturadas com ambas as sílicas, hidrofílica (Aerosil® 200) e hidrofóbica
(Aerosil® R972) desenvolvidas nesta tese de doutorado como sistemas de encapsulação
e liberação de princípios ativos de interesse farmacêutico. Duas moléculas de interesse
farmacêutico e características diferentes (solubilidade em meio aquoso) foram
escolhidas para este estudo: - rifampicina como molécula pouco solúvel em agua para
liberação em meio ácido (pH 1.2); - Cloridrato de propranolol como molécula solúvel
em agua para liberação em meio básico (pH 7.4). Os resultados obtidos comprovaram o
efeito da nanoestruturação das micropartículas de quitosana com os dois tipos de sílica
testados na capacidade de reter e liberar princípios ativos com características
hidrofílicas ou hidrofóbicas, baseando-se na análise dos perfis de liberação in vitro dos
ativos-modelo utilizados.
Comparativamente a outros métodos de encapsulação para efeito de liberação
modificada/controlada, o método proposto neste trabalho é interessante visto sua
capacidade de retenção dos ativos no interior das micropartículas que é superior à 50% e
nos melhores casos chegando à 80%.
Finalmente, as micropartículas de quitosana nanoestruturadas com sílica
Aerosil 200 e Aerosil R972 foram analisadas quanto às suas propriedades estruturais
Bento Pereira da Costa Neto
129
Capítulo 7. Conclusões gerais e pespectivas
Tese de doutorado
e capacidadede adsorção e dessorção. O adsorbato utilizado foi a proteína BSA
(albumina de soro bovina).
O objetivo foi de verificar se as modificações físico-
químicas implementadas sobre a quitosana alteram o número de sítios de adsorção e as
características dos grupos funcionais inicialmente presentes na cadeia macromolecular
devido a interações com as sílicas. Os resultados obtidos mostraram que as
micropartículas nanoestruturadas com sílica são capazes de adsorver e dessorver BSA,
em quantidades interessantes quando comparadas a dados encontrados na literatura : adsorção da ordem de 460-530 mg.g-1 em comparação a capacidades inferiores à 134
mg.g-1 ; - dessorção de 75-80% em comparação a 34-52%), o que pode ser promissor
para outros tipos de proteínas visto a importância da quitosana como adsorvente em
processos de recuperação e/ou purificação de bioprodutos de alto valor agregado, como
proteínas.
Perspectivas
Na continuidade deste trabalho, seria interessante prosseguir com:
 Aprofundar estudo físico-químico de caracterização das interações entre
as micropartículas nanoestruturadas com as sílicas estudadas;
 Determinar cinéticas de liberação de outras moléculas de caráter
hidrofóbico e hidrofílico para melhor compreensão do mecanismo de
liberação
dos
ativos
encapsulados
nestas
micropartículas
nanoestruturadas com sílica;
Prosseguir com a investigação referente à capacidade de uso destas micropartículas
como adsorventes (testes de adsorção-dessorção com novas proteínas).
Bento Pereira da Costa Neto
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Bento Pereira da Costa Neto
160
Anexo 1
Materiais e equipamentos
utilizados
MATERIAIS
 Quitosana de baixo peso molecular (75-85% de desacetilação) - Sigma-Aldrich;
 Sílica hidrofóbica (Aerosil R972) com área superficial de 110±20 m2/g e
tamanho de partículas primárias de 16 nm - Evonik Degussa GmbH;
 Sílica hidrofílica (Aerosil 200) 200 ± 25 m2/g e tamanho de partículas
primárias de 12 nm - Evonik Degussa GmbH ;
 Manitol Oral USP - Henrifarma;
 Albumina do soro bovino - Sigma-Aldrich;
 Rifampicina – produto comercial fornecido pela Farmanguinhos;
 Cloridrato de propranolol – Sigma-Aldrich;
 Ácido acético glacial (protonação da quitosana) - Sigma-Aldrich;
 Álcool etílico absoluto PA ACS para a dispersão de Aerosil R972 e análise de
granulométrica – MERCK.
 Etanol absoluto (álcool etílico) PA ACS – MERCK.
 Metanol PA – MERCK
 Tampão fosfato em diferentes pHs.
 Água ultrapura;
EQUIPAMENTOS
 ASAP 2010, Micromeritics;
 Autoclave Horizontal AB 25, PHOENIX;
 Autotap, TAPPED DENSITY ANALYZERS da Quantachrome
 Balança analítica Ohaus, Modelo E12140.
 Balança de precisão Marca Mettler Toledo, Modelo XS205;
 Banho termostático Haake DC 30;
 Beckman Coulter - LS230 Laser Diffration Particle Size Analyzer;
 Centrífuga Selecta, Modelo Medifriger-BL;
 Difratômetro de Raios-X Shimadzu, Modelo = XRD – 6000.
 Dissolutor Nova Ética, modelo 299;
 DSC- Marca Mettler Toledo, Modelo DSC822;
 Espectrofotômetro Cintra, Modelo Cintra 10E;
 Espectrômetro da Nicolet, modelo 6700;
 Estufa a vácuo EDG, modelo Edgcon 5P;
 Homogeneizador de pistão de alta pressão – APL 50 –Artepecas;
 Incubadora Nova Ética, Modelo 430;
 Karl Fischer marca Mettler Toledo modelo DL38;
 Medidor de potencial Zeta - DelsaNano C, Beckman Coulter;
 Metalizador Baltec MED 010;
 Microscópio Eletrônico de Transmissão Philips, Modelo CM120;
 Microscópio Eletrônico de Varredura Jeol, Modelo JSM-6360LV;
 pHmetro DIGIMED, Modelo DM 21;
 Potencial Zeta Marca Beckman Coulter, Modelo Delsa™Nano C
 Spray Dryer Büchi, Modelo B 190;
 Surface área and Pore Size Analyser – Micromeritics – Modelo Gemini V;
 Tensiometer Dataphysics DCAT 21;
 TG - Marca Mettler Toledo, Modelo SDTA851;
 Ultrassom Elma, Modelo T460;
 Ultraturrax, Heidolph Diax900;
 Viscosímetro Brookfield – Modelo DV-III Ultra.
PUBLICAÇÕES
Revistas internacionais
- B.P. DA COSTA NETO , A.L.M.L. DA MATA , MILENE V.
LOPES, B. ROSSI-BERGMANN, M.I. RÉ
Preparation and
evaluation of chitosan–hydrophobic silica composite microspheres:
Role of hydrophobic silica in modifying their properties. Powder
Technology 255 (2014) 109–119.
Congressos internacionais (com comitê de leitura/reviewers)
- B. P. DA COSTA NETO, MARIA INÊS RÉ, A. L. M. L. DA
MATA, B. L. DA SILVA COSTA, B. ROSSI-BERGMANN.
Alternative way for tailoring acid stability, barrier and/or adsorbent
properties of chitosan microspheres. XXI International Conference
on Bioencapsulation, 28-30 agosto 2013 - Berlin, Germany.
-
M. I. RE, B. P. DA COSTA NETO, A. L. M. L. DA MATA, B. L.
DA SILVA COSTA, B. ROSSI-BERGMANN. An effective and
reproducible way of tailoring chitosan microspheres properties for
intranasal delivery of drugs and vaccines, 7ème Colloque Science et
Technologie des Poudres, 4 - 6 Julho 2012, Toulouse, France.
- B. P. DA COSTA NETO, A. L. M. L. DA MATA, M. V. LOPES, B.
ROSSI‐BERGMANN,
MARIA
INES
RÉ.
Spray‐dried
chitosan/nanosio2 microspheres with improved acid stability and
barrier properties, Journée d'Information APGI & SANOFI - Le
séchage en milieu industriel, 05 de abril 2013, Castres, France.