Introdução a Biologia Molecular
Profª Daniela de Oliveira Pinto
NOS SERES HUMANOS
NÚCLEO
CÉLULA
ORGANISMO
CROMOSSOMOS
(DNA+PROTEÍNAS)
DNA
- Informação
das proteínas e
RNAs que serão sintetizadas
pelas células do organismo ao
longo da sua vida.
-Capacidade de se autoduplicar para originar outras
células.
•1953: Watson and Crick
Estrutura do DNA
Dogma
Central da
Biologia
Molecular
• 1961 – BRENNER, JACOB e MESELSON
• mRNA é a molécula que leva informação do DNA no
núcleo para a maquinaria de produção de proteínas
no citoplasma
O CÓDIGO GENÉTICO É
DESVENDADO!!!
1966 – NIRENBERG, KHORANA
e OCHOA
Seqüências sucessivas de três
nucleotídeos do DNA (codon)
determinam a seqüência de
aminoácidos de uma proteína
A CÉLULA
DNA
1. Regulação transcricional
HnRNA
2. Regulação no
processamento do
RNA primário
3. Regulação no
transporte do
mRNA para o
citoplasma
RETÍCULO
ENDOPLASMÁTICO
RUGOSO
4. Regulação da
síntese proteíca
5. Regulação
pós-síntese
Proteína
sintetizada
- DIFERENCIAÇÃO
- CRESCIMENTO
- FUNÇÃO CELULAR
- RESPOSTA AO
AMBIENTE
Núcleo
DNA
Cromossoma
Gene
Promotor
Exon
Intron
DNA
ÁCIDO DESOXIRRIBONUCLEICO (DNA)
Contém toda a informação genética de um organismo
Esta informação está arranjada em unidades hoje
conhecidas como genes
ESTRUTURA DOS
ÁCIDOS NUCLEICOS
As moléculas de DNA e RNA são compostas por quatro
diferentes nucleotídeos:
• Adenina, Guanina e Citosina – comum para DNA e
RNA
• Timina – encontrada somente no DNA
• Uracila – encontrada somente no RNA
ESTRUTURA DOS
ÁCIDOS NUCLEICOS
Todos os nucleotídeos apresentam uma
estrutura em comum:
radical fosfato
pentose
ESTRUTURA DOS
ÁCIDOS NUCLEICOS
As bases nitrogenadas podem ser divididas em dois
grupos de acordo com sua estrutura:
ESTRUTURA DOS
ÁCIDOS NUCLEICOS
O grupo hidroxil ligado ao carbono
3 da pentose de um nucleotídeo
forma uma ligação fosfodiéster com
o fosfato do outro nucleotídeo
5’ C-A-G 3’
DNA
• Duas fitas de polinucleotídeos associadas formando uma estrutura
de dupla hélice onde as pentoses e os radicais fosfato compõe a fita
e as bases projetam-se para o interior da mesma
• As fitas mantêm-se unidas através da formação de pontes de
hidrogênio entre as bases o que contribui para a estabilidade da
dupla hélice
. Adenina (A) pareia com Timina (T) através de 2 pontes de
hidrogênio
. Guanina (G) pareia com Citosina (C) através de 3 pontes de
hidrogênio
DNA
Antiparalelismo
As fitas do DNA
estão dispostas em
direções opostas
Complementariedade
Cada base de uma fita é pareada com a base complementar da outra fita
Complementariedade
Fita velha
Durante a replicação do
DNA as duas fitas velhas
ou mães servem de
molde para cada fita
nova ou filha
complementar, que está
sendo sintetizada.
Fita nova
A Dupla Hélice
Fatores que estabilizam a dupla hélice:
• interações hidrofóbicas
• forças de van der Walls
• pontes de hidrogênio
• interações iônicas
Entre as bases
nitrogenadas
Entre os grupos fosfato
do DNA e os cátions
(Mg2+) presentes na
solução fisiológica
A Dupla Hélice
A dupla hélice apresenta dois tipos
de sulcos aos quais se ligam as
proteínas da cromatina
Sulco menor
Sulco maior
Proteínas:níveis de complexidade estrutural
O Empacotamento do DNA:
a estrutura terciária do DNA
DNA em procariontes: DNA circular nas formas não-superhelicoidal (esquerda) e super-helicoidal (direita)
A Dupla Hélice
A forma predominante de torção da espiral do DNA é para a
direita ou sentido horário
Propriedades Químicas e Físicas do DNA
REPLICAÇÃO DO DNA
 Conservativa ou Semiconservativa?
 Unidirecional ou Bidirecional?
REPLICAÇÃO
SEMICONSERVATIVA
Evidência baseada em um experimento clássico de Meselson-Stahl em
1958
• Células de E. coli foram inicialmente colocadas em um meio para
crescimento contendo sais de amônia preparados com 15N (nitrogênio
pesado – “heavy”) até todo o DNA celular conter o isótopo.
• As células foram, então, transferidas para um meio contendo
(nitrogênio leve – “light”).
14N
• As amostras foram analisadas com gradiente de densidade que
separa as duplas H-H, L-L e H-L em bandas distintas.
PNAS
44:671, 1958
A replicação é semi-conservativa
•The Meselson-Stahl experiment
ORIGEM DA REPLICAÇÃO
Experimento com SV40 (Simian Virus)
• DNA viral de células infectadas com SV40 foi cortado com a
enzima de restrição EcoRI, que reconhece um sítio único.
• A partir de um “ponto” vai se formando uma bolha
chamada bolha de replicação comprovando a existência de
um ponto de origem da replicação
Características da origem de replicação:
. estrutura repetitiva
. seqüências ricas em AT
ORIGEM DA REPLICAÇÃO
ORIGEM
Sítio de restrição
EcoRI
Cromossomo viral
circular
EcoRI
Bolha de
replicação
ORIGEM DA REPLICAÇÃO
REPLICAÇÃO
BIDIRECIONAL
Um experimento através da autoradiografia de
moléculas de DNA marcadas de culturas de células
mamárias revelou grupos de replicons (unidades de
replicação) com um ponto de origem de replicação
central
OR
OR
Síntese de DNA em Eucariontes: As “Bolhas de
Replicação”
• Nos eucariontes, a replicação
requer “múltiplas origens”,
devido ao tamanho de seu
genoma. A replicação é
bidirecional e, em ambas as
fitas, simultânea.
• Este processo gera “bolhas de
replicação”.
Regiões Codificadoras e
Não-Codificadoras do DNA
O DNA é formado por 2 regiões:
Intergênicas
Gênicas
Região Gênica
É a porção que codifica para um
produto final, que pode ser
uma cadeia polipeptídica ou
um RNA
Intergênicas
Gênicas
Região Intergênica
É a porção regulatória, que
sinaliza o início ou o final de um
gene, que influencia a
transcrição gênica, ou que é o
ponto de início para a
replicação do DNA
PROCESSO DE REPLICAÇÃO
Os mecanismos celulares responsáveis pela
replicação
do
DNA
foram
descobertos
primeiramente em bactérias.
A replicação em eucariotos ocorre através de
proteínas análogas e com processos semelhantes à
replicação do DNA de E. coli
PRINCIPAIS ENZIMAS ENVOLVIDAS
(SISTEMA DE REPLICAÇÃO DO DNA)
1.
2.
3.
4.
5.
6.
DNA Polimerases
Endonucleases
Helicases
Topoisomerases
Primases
Telomerases
DNA POLIMERASE
• São incapazes de quebrar as pontes de hidrogênio
que ligam as duas fitas do DNA
• Só alongam uma fita de DNA/RNA pré-existente
• Catalisam a adição de um nucleotídeo no radical
hidroxil da extremidade 3’ da cadeia que está se
formando. Desta forma, as fitas só podem crescer no
sentido 5’ 3’
DNA Polimerases
• principais enzimas envolvidas no processo; responsáveis
pela adição de nucleotídeos e reparo
• requerem um modelo e um primer (segmento de RNA
sintetizado pela primase) complementares para início –
alongamento
• 3 tipos principais : I, II, III
I : importante no sistema de reparo
III: principal e mais complexa (mais de 10 subunidades)
Adição de nucleotídeos
1
2
3
NUCLEASES
- Degradam o DNA, clivando-o em pedaços
menores
1. EXONUCLEASES: clivam o DNA a partir do
final da molécula
2. ENDONUCLEASES: clivam em qualquer
local da molécula
OUTRAS ENZIMAS ENVOLVIDAS NO
PROCESSO DE REPLICAÇÃO
HELICASES – constituem uma classe de enzimas que podem se mover
ao longo da fita dupla de DNA utilizando a energia da hidrólise de ATP
para separar as duas fitas da molécula.
SSB (“single-strand-binding”) – ligam-se a cada uma das fitas impedindo
o reanelamento das mesmas.
PRIMASE – RNA polimerase que sintetiza pequenas moléculas de RNA
utilizadas como iniciadores durante o processo de replicação do DNA.
TOPOISOMERASES – Responsáveis por aliviar a torção na parte da fita
que não está sendo replicada.
PROCESSO DE REPLICAÇÃO
O movimento da forquilha de replicação revela uma fita
molde no sentido 3’ 5’ e outra no sentido oposto 5’ 3’
Desta forma, as fitas novas são sintetizadas em sentidos
opostos
FITA “LEADING” – crescimento segue a
direção do movimento da forquilha
de replicação
FITA “LAGGING” – crescimento no
sentido oposto ao movimento da
forquilha de replicação
PROCESSO DE REPLICAÇÃO
FITA “LEADING” – sintetizada continuadamente a partir de um
iniciador na fita molde 3’ 5’
FITA “LAGGING” – sintetizada descontinuadamente a partir de
múltiplos iniciadores
• Sítios descobertos no molde da fita “lagging” são copiados em
pequenos iniciadores de RNA pela primase.
• Cada iniciador é alongado pela DNA polimerase resultando na
formação dos FRAGMENTOS DE OKAZAKI.
•DNA polimerase remove o primer do RNA do fragmento adjacente e
preenche os “gaps” entre os fragmentos que, então, são unidos pela
DNA ligase.
PROCESSO DE REPLICAÇÃO
PROCESSO DE REPLICAÇÃO
A síntese de DNA é feita na direção 5´ 3´ e é semidescontínua
TELOMERASE
• Os cromossomos de eucariotos são lineares e apresentam
seqüências repetitivas em suas extremidades denominadas
telômeros
• A síntese da fita “leading” continua até o término da fita
molde de DNA, no entanto, no telômero a extremidade feita
pela primase na fita “lagging” não é digerida.
• Como o iniciador é instável, ele se degrada com o tempo
diminuindo, assim, o tamanho do cromossomo.
• Telomerase age evitando a perda do fim do cromossomo.
TELOMERASE
REGULAÇÃO
-única fase regulada da replicação, de
forma que só ocorra uma vez por ciclo
celular ;
-afetada pela metilação de DNA
-DAM metilase na (5´) GATC sobre a
fita parental
Núcleo
RNA polimerase
Gene
Transcrição
hnRNA
Processamento
mRNA
Tradução
Citoplasma
proteína
O RNA ou ARN
O Ácido Ribonucléico é um polinucleotídeo que difere do
DNA em três aspectos básicos:
DN
A-T
A
T-A
G-C
C-G
RN
A-U
A
U-A
G-C
C-G
• O açúcar é uma Ribose;
• É formado, geralmente, por
uma fita simples que pode
enrolar-se;
• Não existe a base pirimídica
Timina e no seu lugar se
encontra a base Uracila.
• Os pareamentos seguem a
ordem A-U e G-C).
RNA - É o ácido ribonucléico; possui a função de síntese protéica. O
RNA é encontrado no núcleo principalmente no nucléolo, e no
citoplasma (ribossomos).
Composição química - é formada por ácido fosfórico, pentose (ribose) e
pelas bases nitrogenadas ( A, G, C e uracila (U )).
A molécula de DNA é responsável pela formação do RNA. O RNA
apresenta-se constituído por um único filamento de nucleotídeo, cuja
seqüência de bases é determinada a partir de um molde de DNA.
Tipos de RNA
1-RNA mensageiro (RNAm) - É formando no núcleo tendo como molde uma das fitas
de uma molécula de DNA. A produção de um RNAm, cujas bases são complementares
as bases de uma das hélices de uma molécula de DNA, recebe o nome de transcrição.
Este fenômeno pode ser definido de forma mais simples como sendo a passagem das
bases de uma linguagem do DNA para a linguagem de RNAm. EX:
T - A - C - T - G - A !
!
!
!
!
!
A- U-G - A - C - U
Códon início
códon
aa A
aa B
DNA
RNAm
proteína
3 bases correspondem a um aa, e um
conjunto de bases uma proteína.
Síntese Protéica
• A enzima RNA-polimerase abre a
dupla hélice do DNA e inicia a
produção de uma molécula de
RNAm, no sentido 5’  3’.
• Os nucleotídeos são ligados
respeitando a ordem A-U, G-C.
• Ao final da transcrição a RNApolimerase se desliga do DNA, a
molécula de RNAm está formada
e segue para o citoplasma onde
será traduzida.
A Transcrição
Observe a complementação de uma fita de
DNA para RNA
DNA
A T A CAT G G G C T A G A A
RNA
U A U G UA C C C G A U C U U
RNAm
Sempre com a adenina se ligando a uracila e a guanina se
ligando a citosina.
2-RNA transportador (RNAt) - é produzido
nos cromossomos a partir de DNA
especiais. É uma molécula cadeia curta, (é
o menor RNA) que transporta os aa que
estão dispersos no citoplasma até os
ribossomos. O RNAt tem formato de
“folhas de trevo” e contém outros tipos de
bases, além das comumente encontradas
nos outros RNAs. Cada RNAt é capaz de
reconhecer
um
determinado
aa
determinado códon, no RNAm. Todo RNAt
tem um filamento livre de sua molécula
composta pela seguinte seqüência de
bases: ACC. É nesse local que ocorre a
associação com o aa. Em cada região da
molécula existe uma seqüência de 3 bases
denominadas anticódon, que reconhece a
posição do aa no RNAm.
Tipos RNAs (2/2)
RNA TRANSPORTADOR
3-RNA ribossômico (RNAr) é o RNA que ocorre em
maior quantidade nas células. Esse RNA é encontrado
no nucléolo, onde é produzido, e no citoplasma,
associado às proteínas, formando os ribossomos.
Tipos de RNA
• RNAm  O RNA mensageiro é formado no núcleo e contém a
“mensagem” - o código transcrito a partir do DNA - para a síntese
das proteínas. Cada conjunto de três nucleotídeos no RNAm é
chamado de CÓDON.
• RNAt  O RNA transportador está presente no citoplasma e é
responsável pelo transporte dos aminoácidos até os ribossomos
para a síntese protéica. No RNAt existe uma seqüência de
nucleotídeos correspondente ao códon chamada de ANTI-CÓDON.
• RNAr  O RNA ribossômico ou ribossomal faz parte da
estrutura dos ribossomos e participa do processo de tradução dos
códons para construção das proteínas.
SÍNTESE DE PROTEÍNAS:
A síntese começa quando ocorre a transcrição das bases de DNA para RNA. Essa transcrição é o código
genético. O RNAm formado no núcleo passa para o citoplasma, deslocando-se para os ribossomos. Os RNAt
que estão no citoplasma, através de suas moléculas, unem-se ao aa livre levando até o ribossomo. Lá o
anticódon do RNAt reconhece no códon do RNAm o aa, que será codificado. Assim, ocorrendo
sucessivamente, até dar origem a uma proteína.
Núcleo
Núcleo
DNA
RNAm
RNAm
Transcrição
Proteínas
Tradução
DNA-RNAm
A síntese completa de uma proteína leva de 20 a 60 seg, e o mesmo
RNAm pode ser traduzido por vários ribossomos, que mantêm uma
Distância entre si de aproximadamente 80 nucleotídeos.
Os Íntrons e os Éxons
Nos eucariontes, o RNA transcrito pelo gene é normalmente chamado de préRNA, no sentido de que ele ainda não está pronto para ser traduzido,
produzindo proteínas. O pré-RNA seria, assim uma versão ainda não acabada
do RNAm, que precisa ser primeiro processado no núcleo para, em seguida,
migrar ao citoplasma.
Éxon
Íntron
Éxon Íntron
Íntron Éxon
A
Os Íntrons são retirados e os éxons são soldados um ao
outro
Síntese Protéica
A Tradução
• O RNAm transcrito no núcleo
chega ao citoplasma e se liga a um
ou mais ribossomos.
• O ribossomo “lê” o primeiro
códon e um RNAt com o
anticódon correspondente
transporta um aminoácido e se
liga ao códon.
• O ribossomo se desloca, no
sentido 5’3’ e lê o próximo
códon.
• Os aminoácidos são unidos por
ligações peptídicas.
• Ao final da tradução o
polipeptídeo se desliga e se
constituí na proteína.
O ribossomo acomoda dois tRNAs carregados
4. Terminação
Dogma Central da Biologia Molecular
•
•
•
•
•
•
•
Foi estabelecido em 1956 por Francis Crick.
Postulava que o sentido da construção das moléculas é sempre de DNA à
Proteína – fluxo unidirecional da informação.
O DNA é o “molde” para formar DNA (replicação) e RNA (transcrição). Este
por sua vez é o “molde” para formação das proteínas (tradução).
Hoje se sabe que, em alguns vírus, o RNA pode replicar-se e, em outros, o
RNA pode produzir DNA (transcrição reversa) utilizando o maquinário
genético da célula-hospedeira.
Porém, não é possível se sintetizar ácidos nucléicos a partir de proteínas.
Os novos conhecimentos permitiram que se ampliasse o dogma central
sem contudo perder a unidirecionalidade, ou seja, de ácido nucléico à
proteína.
Projeto Proteômico.
Diferenças entre RNA e DNA
O RNA é uma molécula intermediária na síntese
de proteínas, ela faz a intermediação entre o DNA
e as proteínas.
DNA
RNA
Ele é formado por uma cadeia de
ribonucleotídeos, que, por sua vez, são formados
por um grupo fosfato, um açucar (ribose), e uma
base nitrogenada (veja abaixo).
As principais diferenças entre o RNA e o DNA são
sutis, mas fazem com que o último seja mais
estável do que o primeiro. O RNA é formado por
uma fita simples, o açúcar de seu esqueleto é a
ribose e uma de suas bases pirimídicas (de anel
simples) é diferente da do DNA (uracila ao invés
de timina), além disso o açucar do RNA é a ribose
invés da desoxirribose do DNA.
DNA e RNA
Os processos de síntese de proteínas na célula são controlados pelo metabolismo de controle.As duas
principais personagens do metabolismo de controle são as moléculas de DNA e RNA. O DNA (ácido
desoxirribonucléico) é o patrimônio genético, que contém as instruções para a síntese de todas as
proteínas que a célula é capaz de realizar. O RNA atua como mensageiro (RNA mensageiro) entre o
DNA e o ribossomo, local de síntese de proteínas.
DNA (ácido desoxirribonucléico)
RNA (ácido ribonucléico)
Se localiza somente no núcleo
Se localiza no núcleo e no citoplasma
Apresenta forma de dupla hélice com
duas fitas
Apresenta apenas uma fita
É formado com a pentose (açúcar)
desoxirribose
É formado com a pentose ribose
Bases nitrogenadas participantes: A, T,
C, G
Bases nitrogenadas participantes: A, U,
C, G
Código Genético
Genoma
Conjunto de
moléculas de DNA
Codon que dá
origem à síntese de
qualquer proteína
Código Genético – correspondência entre cada tripleto (codon) de RNA e cada um
dos 20 aminoácidos habituais das proteínas (desde 1964)
No código genético há 64 trincas possíveis, apenas 61 delas correspondem a
aminoácidos. As tres trincas restantes são usadas como pontuação; elas dizem à célula
o ponto em que termina a codificação de cada proteína.
Oração do DNA
Creio no DNA todo poderoso
criador de todos os seres vivos,
creio no RNA,
seu único filho,
que foi concebido por ordem a graça do DNA polimerase.
Nasceu como transcrito primário
padeceu sobre o poder das nucleases, metilases e poliadenilases.
Foi processa, modificado e transportado.
Desceu do citoplasma e em poucos segundos foi traduzido à proteína.
Subiu pelo retículo endoplasmático e o complexo de Golgi
E está ancorado à direita de uma proteína G
Na membrana plasmática
De onde há de vir a controlar a transdução de sinais
Em células normais e apoptóticas
Creio na Biologia Molecular
Na terapia gênica e na biotecnologia
No seqüenciamento do genoma humano
Na correção de mutações
Na clonagem da Dolly
Na vida eterna.
Amém