KARLA VERUSKA MARQUES CAVALCANTE DA COSTA
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE CARDIOVASCULAR INDUZIDA
PELO COMPOSTO MESOIÔNICO CMMTT EM RATOS
NORMOTENSOS E HIPERTENSOS
UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAIBA
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
LABORATÓRIO DE TECNOLOGIA FARMACÊUTICA
PROF. DELBY FERNANDES DE MEDEIROS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUTOS
NATURAIS SINTÉTICOS BIOATIVOS
JOÃO PESSOA – PB
2008
KARLA VERUSKA MARQUES CAVALCANTE DA COSTA
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE CARDIOVASCULAR INDUZIDA
PELO COMPOSTO MESOIÔNICO CMMTT EM RATOS
NORMOTENSOS E HIPERTENSOS
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Produtos
Naturais e Sintéticos Bioativos do Laboratório de Tecnologia
Farmacêutica Prof. Delby Fernandes Medeiros do Centro de
Ciências da Saúde da Universidade Federal da Paraíba, como
parte dos requisitos para obtenção do título de DOUTOR EM
PRODUTOS NATURAIS E SINTÉTICOS BIOATIVOS. Área de
concentração: FARMACOLOGIA
Orientador: Prof. Dr. Isac Almeida de Medeiros
Orientadora: Profa. Dra. Nadja de Azevedo Correia
JOÃO PESSOA – PB
2008
C377a
Costa, Karla Veruska Marques Cavalcante da.
Avaliação da atividade cardiovascular induzida
pelo composto mesoiônico CMMTT em ratos
normotensos e hipertensos/ Karla Veruska Marques
Cavalcante da Costa. João Pessoa, 2008.
169p.
Orientador: Isac Almeida de Medeiros
Orientadora: Nadja de Azevedo Correia
Tese (doutorado) – UFPB/CCS
1.
Farmacologia. 2. Composto Mesoiônico. 3.
Óxido Nítrico. 4. Artéria Mesentérica superior. 5.
Hipertensão.
UFPB/BC
CDU
615 (043)
KARLA VERUSKA MARQUES CAVALCANTE DA COSTA
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE CARDIOVASCULAR INDUZIDA PELO
COMPOSTO MESOIÔNICO CMMTT EM RATOS NORMOTENSOS E
HIPERTENSOS
TESE APROVADA EM: ____/____/____
COMISSÃO EXAMINADORA:
___________________________________________
Prof. Dr. Isac Almeida de Medeiros
Orientador
____________________________________________
Profa. Dra. Nadja de Azevedo Correia
Orientadora
____________________________________________
Profa. Dra. Katy Lisias Gondim Dias
Examinadora
____________________________________________
Profa. Dra. Simone dos Santos Maciel
Examinadora
____________________________________________
Profa. Dra. Simone Bezerra Alves
Examinadora
____________________________________________
Profa. Dra. Aurigena de Araújo Ferreira
Examinadora
Aos meus pais, Zenio e Graças,
Graças, por todo o amor,
ensinamentos, dedicação, desprendimento, alegria e por sempre
incentivarem e valorizarem a importância do conhecimento;
Ao meu amado esposo, Joseânderson pelo companheirismo,
paciência, cuidado, incentivo e, sobretudo, pelo amor verdadeiro;
Aos meus queridos irmãos, Kyara, Hallan e Hallana, pelo
apoio e exemplo de força, perseverança e família.
AGRADECIMENTOS
Expresso uma verdadeira estima e gratidão a todos que contribuíram para a realização deste trabalho, em
especial à:
À Deus por ser o meu refúgio, minha fortaleza, meu guia, minha referência de amor e, principalmente,
pela certeza que me conduziu em todos os momentos deste meu projeto de vida;
Ao meu orientador Prof. Isac Medeiros a quem estimo e admiro e sou grata pela oportunidade ,
confiança depositada , incentivo e orientação nesta longa, as vezes árdua, porém gratificante caminhada;
além das contribuições valiosas para a realização deste trabalho;
A minha querida orientadora Profa Nadja Correia pela sua amizade sincera e profissionalismo
realizado com muita dedicação, seriedade e competência, além de sua imprescindível participação e
contribuição neste trabalho;
Aos professores Joseph Miller, Aderson Dias e Bruno Lira pela colaboração e por terem fornecido o
composto para a realização deste estudo;
A José Couras
Couras pela cumplicidade na execução deste projeto, por toda a dedicação, rigor, competência e ,
sobretudo, amizade nos momentos difíceis;
As minhas amigas: Katy, Darizy, Islania que durante toda a pós-graduação estiveram comigo nos
melhores e os mais difíceis momentos, dividindo as risadas, as vitórias e lágrimas; construímos uma
história verdadeira, sólida , onde o amor, o respeito e a lealdade é base desta amizade: a vocês um
obrigada todo especial;
Ao meu querido primo Robson Veras pelo exemplo de garra, determinação e pela valiosa contribuição em
vários momentos do doutorado;
Ao extraordinário professor Gustavo Balejo por ter sido tão especial na minha formação, pelos
ensinamentos e pelo exemplo de pesquisador, de profissional e de ser humano, com quem tive a honra de
dividir a bancada;
Aos professores Maria Cristina Salgado,
Salgado, Lusiane Bend
Bendh
ndhack e Mario dos Anjos por terem me recebido em
seus laboratórios e pela contribuição valiosa para a realização deste trabalho;
Aos meus estimados amigos do Laboratório de Cardiovascular, Carminha,
Carminha Angélica, George, Júnior,
Raline, Aldeídia, Tosin, Horacina , Fabíola, Thiago, Thais Porto, Àpio, Renata, Alessandra, Aurilene,
Márcio, Êurica, Nayara, Mônica, Abraão, Karol, Marília, Camila, Bruna, Natália e Ataíde,
Ataíde por toda
ajuda, pelo companheirismo, pelos momentos de descontração e por terem contribuído direta ou
indiretamente para esta conquista.
A turma de doutorado (2004), em especial o meu amigo Fabiano,
Fabiano que foi um companheiro fiel, solidário
e que soube ao longo do nosso convívio, conquistar a minha admiração;
A José Crispim Duarte , pelo exemplo de profissional, por toda competência, dedicação, atenção; estando
sempre presente e estendendo uma mão amiga quando se precisava de uma ajuda a mais;
A comissão examinadora deste trabalho pela certeza das contribuições, dedicação, empenho e seriedade no
trabalho realizado;
Aos grandes mestres da minha vida, por terem me ensinado algo muito mais além que as letras e
números, eles me ensinaram a ter paixão pelo que se faz, e foram nestes exemplos de profissionais que eu
construí o meu sonho e edifiquei a minha realidade;
A todos os meus alunos pelo prazer imenso que vocês me proporcionaram a cada dia, a cada aula e a
cada aprendizado novo; foi com vocês que eu percebi como é gratificante a arte de aprender e ensinar
mutuamente;
A Tânia Alves,
Alves pelo seu estimado trabalho e apoio desempenhado na secretaria do programa de Pósgraduação;
A seu Luís e Adriano,
Adriano pelo seu valioso trabalho realizado com dedicação no Biotério do LTF;
À Coordenação e a todos os funcionários do Laboratório de Tecnologia Farmacêutica pela competência,
respeito e dedicação;
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Ensino Superior (CAPES
CAPES)
CAPES pelo suporte financeiro e
técnico científico através do Portal Periódicos;
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq
CNPq)
CNPq e a Universidade Federal
da Paraíba (UFPB
UFPB)
UFPB por todo apoio que têm empregado para a pesquisa;
Aos grandes amores da minha vida meu esposo Joseânderson,
Joseânderson meus pais e irmãos,
irmãos familiares e amigos
(Brígida),
(Brígida) por terem sido tão prestativos, atenciosos, companheiros e por terem dividido comigo os meus
sorrisos e as minhas lágrimas, e participado efetivamente de cada passo desta conquista e de toda a minha
vida ...
... MUITO OBRIBADA!!!
RESUMO
CAVALCANTE, K.V.M. Avaliação da atividade cardiovascular induzida pelo Composto
Mesoiônico CMMTT em ratos normotensos e hipertensos. (2008). Tese (Doutorado em
Produtos Naturais e Síntéticos Bioativos) – Laboratório de Tecnologia Farmacêutica Prof. Delby
F. de Medeiros, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal da Paraíba, João Pessoa –
PB, 2008.
O presente estudo tem por objetivo avaliar os efeitos cardiovasculares induzidos pelo composto
mesoiônico – 2 – (4 – clorofenil) – 3 – metil – 4 – ( 4 – metoxifenil) – 1 ; 3 – tiazólio – 5 – tiolato
(CMMTT) em animais normotensos e hipertensos, utilizando técnicas combinadas in vivo e in vitro.
Em ratos não anestesiados normotensos e hipertensos (L-NAME, 2R1C e ratos de Lyon-LH), o
CMMTT (0,01; 0,05; 0,1; 0,5; 1 e 5 mg/kg i.v., randomicamente) produziu uma hipotensão seguida
de uma taquicardia independente de doses. A resposta hipotensora foi significativamente
potencializada no modelo de hipertensão L-NAME (PAM (%) = -6,5 ± 0,5; -10,9 ± 2,0; -12,7 ± 0,9; 11,8 ± 2,8; -16,1 ± 2,7; -14,9 ± 2,6 mmHg) quando comparada ao normotenso (PAM (%)= -10,5 ±
2,7; -7,1 ± 0,90; -8,3 ± 2,3; -7 ± 0,90; -8,9 ± 1,3; -5,3 ± 1 mmHg). Em anéis de aorta torácica isolada
de rato, com endotélio funcional, CMMTT (10-14 – 10-5 M) induziu pequeno relaxamento sobre as
contrações induzidas por fenilefrina (10-6 M) (Emax = 39,6±8,1 %, n = 5) e esse efeito foi
significativamente atenuado pela remoção do endotélio vascular (Emáx = 12,9±5,8 %, n = 5),
corroborando com os resultados anteriores que demonstram que o mecanismo de ação do CMMTT
é dependente do endotélio. Preparações de artéria mesentérica com endotélio funcional preservado,
incubadas com caribdotoxina (100 nM) + apamina (100 nM) ou indometacina (10 µM) + atropina (1
nM), o efeito vasorelaxante induzido por CMMTT (10-14 – 10-6 M) não foi modificado
significativamente. Em adição, concentrações isoladas do CMMTT em anéis de artéria mesentérica
(10-5 e 10-6 M) e em aorta torácica (10-5 M) de rato com endotélio íntegro, induziu um aumento dos
níveis de NOx e este efeito foi completamente abolido após a remoção do endotélio vascular,
sugerindo que o relaxamento induzido pelo composto mesoiônico é mediado, principalmente, pelo
NO. Nos anéis de artéria mesentérica pré-contraída com FEN (10-5 M) e pré-incubados com KCl 20
mM, (Emáx = 29,24±8,40 %; n = 6) ou TEA (1 mM) (26,40±4,02 %, n = 9), ou 4-AP (1mM) (Emax =
12,80±8,94 %, n = 6), ou BaCl2 (30 µM) (Emáx=56,8±7,12%, n=6) o relaxamento foi significativamente
atenuado, quando comparados aos anéis com endotélio funcional na ausência dos inibidores (Emax =
80,8 ± 5,8 %, n=17). No entanto, na presença de glibenclamida (10 µM), o efeito vasodilatador foi
diminuído apenas nas últimas concentrações (Emax=59,62±6,56 %, n = 6), sugerindo o envolvimento
dos canais para K+ na resposta induzida pelo CMMTT. Adicionalmente, o efeito relaxante de
CMMTT (10-6) em anéis da artéria mesentérica superior isolada de ratos hipertensos (L-NAME), foi
significativamente maior quando comparada aos animais normotensos (Emáx=95,63±2,80; 80,8±5,8
respectivamente). Além disso, o CMMTT interferiu na reatividade vascular, potencializando a ação
da ACh e prevenido a contração induzida pela FEN em animais hipertensos L-NAME quando o
endotélio encontrava-se preservado. Interessantemente, o efeito induzido pelo CMMTT em animais
normotenso parece envolver um mecanismo de ativação da eNOS nas células endoteliais
independente do aumento da [Ca2+]i. Em conclusão, o presente estudo demonstra uma atividade
hipotensora e taquicárdica em ratos normotensos e hipertensos. Em artéria mesentérica o CMMTT
aumenta NO de maneira independente do aumento da [Ca2+]i com ativação dos canais para K+ do
tipo Kv,Kir, e BKCa2+, e nas maiores concentrações o KATP, induzindo o relaxamento, além de induzir
alteração na reatividade vascular para a FEN e ACh, de maneira dependente do endotélio em ratos
hipertensos L-NAME.
Palavras-chave:
hipertensão.
Composto
mesoiônico;
oxido
nítrico;
artéria
mesentérica
superior;
ABSTRACT
CAVALCANTE, K.V.M. Assessment of cardiovascular activity induced by the compound
mesoionic CMMTT in normotensive and hypertensive rats. (2008). Thesis (Ph.D. in Natural
Products and Sintetics Bioactivs) - Pharmaceutical Technology Laboratory of Prof. Delby F. of
Medeiros, Center for Health Sciences, Federal University of Paraiba, Joao Pessoa - PB, 2008.
This study aims to assess the cardiovascular effects induced by mesoionic 2-(4-chlorophenyl) 3 - methyl - 4 - (4 - methoxyphenyl) - 1; 3 – thiazolium – 5 -thyolate (CMMTT), in normotensive
and hypertensive animals, using a combined in vitro and in vivo approach. In non-anesthetized
rats normotensive and hypertensive (L-NAME, 2R1C Lyon rats-LH), the CMMTT (0.01, 0.05,
0.1, 0.5, 1 and 5 mg / kg iv, randomly) produced a hypotension and increase heart rate doseindependent. The hypotensive response was significantly potentiated in the model of
hypertension L-NAME (MAP (%) = -6.5 ± 0.5, -10.9 ± 2.0; -12.7 ± 0.9; -11.8 ± 2.8; -16.1 ± 2.7; 14.9 ± 2.6 mm Hg)when compared to normotensive (MAP (%) = -10.5 ± 2.7; -7.1 ± 0 , 90; -8.3 ±
2.3; -7 ± 0.90; -8.9 ± 1.3; -5.3 ± 1 mm Hg). In rings of thoracic aorta isolated from rat, with
functional endothelium, CMMTT (10-14 - 10-5 M) induced small relaxation on contractions induced
by phenylephrine (10-6 M) (Emax = 39.6 ± 8.1% , n = 5) and this effect was significantly reduced
by removal of vascular endothelial (Emax = 12.9 ± 5.8%, n = 5), confirming that the mechanism of
action of CMMTT is endothelium dependent. Preparations of mesenteric artery with functional
endothelium preserved, incubated with ChTX (100 nM) + apamin (100 nM) M) or by
indomethacin (10 µM) + atropine (1 nM), the effect vasorelaxante induced CMMTT (10-14 - 10-6
M) was not significantly changed. In addition, concentrations of isolated CMMTT in rings of
mesenteric artery (10-5 and 10-6 M) and thoracic aorta (10-5 M) of rat with intact endothelium,
induced an increase in levels of NOx and this effect was completely abolished after the removal
of vascular endothelium, suggesting that the relaxation induced by the mesoionic compound is
mediated, mainly by NO. In mesenteric artery rings of pre-contracted with PHE (10-5 M) and
pre-incubated with KCl 20 mM, (Emáx = 29.24 ± 8.40 %; n = 6) or TEA (1 mM) (26.40 ± 4.02 %, n
= 9), or 4-AP (1 mM) (Emax = 12.80 ± 8.94 %, n = 6), or BaCl2 (30 µM) (Emáx = 56.8 ± 7.12%, n=6)
relaxation was significantly attenuated when compared vasodilator effect to the rings with
functional endothelium in the absence of inhibitors (Emax = 80.8 ± 5,8 %, n=17), the). However, in
the presence of glibenclamide was diminished only in the last concentrations, suggesting the
involvement of K+ channels in the response induced by CMMTT. Additionally, the relaxing effect
on rings of superior mesenteric artery isolated from hypertensive rats (L-NAME) was significantly
higher in the concentration of 10-6 M when compared with normal animals (Emáx = 95.63 ± 2.80;
80.8 ± 5.8 respectively). Moreover, the CMMTT interfere in vascular reactivity, powering the
action of ACh and prevented the contraction induced by PHE in hypertensive animals L-NAME
when the endothelium had been preserved. Interestingly, the effect produced by CMMTT in
normotensive animals seem involve a mechanism for activation of eNOS on endothelial cells
independent of increased [Ca2 +] i. In conclusion, this study shows a hypotensive activity and
taquicárdica in normotensive and hypertensive rats. In the mesenteric artery CMMTT increases
NO independent way of increasing the [Ca2 +]i with activation of K+ channels for the type Kv, Kir,
and BKCa2+, and the largest concentrations KATP, inducing the relaxation, in addition to induce
change in vascular reactivity for PHE and ACh, so dependent on the endothelium in
hypertensive rats L-NAME.
Key words: mesoionic compounds; nitric oxide; superior mesenteric artery; hypertension.
LISTA DE ABREVIATURAS
ACh
B12
BK
b.p.m.
BSA
Ca2+
CaCl2
([Ca2+]i)
([Ca2+]c)
CaM
CaV
CE50
CEPA
Chtx
CMMTT
ºC
CO2
COX
DAG
DC
DCV
DMSO
ECA
EDHF
EDRF
Emáx
e.p.m.
ET1
FC
FEN
FLC
G
Gq
GMPc
GTP
HAS
IK
IP3
i.p.
Acetilcolina
cianocobalamina
canais para potássio ativados por cálcio de alta
condutância
batimentos por minuto
albumina sérica bovina
Cálcio
cloreto de cálcio
concentração de cálcio intracelular
concentração de cálcio citosólico
calmodulina
canais para cálcio operados por voltagem
concentração de uma substância capaz de produzir 50%
do efeito máximo
Comitê de Ética em Pesquisa Animal
Caribdotoxina
composto mesoiônico – 2 – (4 – trifluorofenil) – 3 – metil
– 4 – ( 4 – metilfenil) – 1 ; 3 – tiazólio – 5 – tiolato
graus Celsius
dióxido de carbono
ciclooxigenase do tipo 1
Diacilglicerol
débito cardíaco
doença cardiovascular
dimetil sulfóxido
enzima conversora da angiotensina
fator hiperpolarizante derivado do endotélio
fator relaxante derivado do endotélio
efeito máximo
erro padrão da média
endotelina-1
freqüência cardíaca
Fenilefrina
fosfolipase C
Gramas
Subtipo de proteína G
monofosfato de guanosina ciclíco
trifosfato de guanosina
hipertensão arterial sistêmica
canais para potássio ativados por cálcio de condutância
intermediária
trifosfato de inositol
intra-peritoneal
i.v.
K2p
KATP
Kir
KV
KCl
Kg
LC20
LH
LL
L-NAME
mg
mL
MLC
MLCK
min.
mmHg
M
MM
NaCl
NO
NO3NO2NOS
NOx
NPS
O2
O2ODQ
PA
PAD
PAM
PAS
pD2
PE
PGH2
PGI2
PKB
PKG
PLC
RVPT
SHAM
SHR
SHRSP
SK
SNC
Intravenoso
canais para potássio de dois poros
canais para potássio sensíveis ao ATP
canais para potássio retificadores de entrada
canais para potássio sensíveis a voltagem
cloreto de potássio
Quilograma
cadeia leve da miosina
rato hipertenso de Lyon
rato normotenso de Lyon
NG-Nitro-L-arginina metil ester
Miligramas
Mililitros
Cadeia leve da miosina
cinase da cadeia leve da miosina
minuto
milímetro de mercúrio
Molar
massa molecular
cloreto de sódio
óxido nítrico
Nitrato
Nitrito
sintase de óxido nítrico
nitro-compostos
nitroprussiato de sódio
oxigênio molecular
ânion superóxido
(1H-[1,2,4]oxadiazolo-[4,3-a]quinoxalin-1-one
pressão arterial
pressão arterial diastólica
pressão arterial média
pressão arterial sistólica
(-log EC50)
polietileno
prostaciclina
prostaciclina
proteína cinase B
proteína cinase G
fosfolipase C
resistência vascular periférica total
rato normotenso controle do 2R1C
ratos espontaneamente hipertensos
rato SHR susceptível a acidente vascular cerebral
canais para potássio ativados por cálcio de baixa
condutância
sistema nervoso central
SNS
SRA
TEA
TXA2
UV
VES
Vm
sistema nervoso simpático
sistema renina angiotensina
Tetraetilamônio
tromboxano A2
ultravioleta
volume de ejeção sistólica
potencial de membrana
LISTA DE QUADROS E TABELAS
Quadro 1: Aspectos químicos que caracterizam o composto
mesoiônico CMMTT .............................................................................. 49
Tabela 1: Drogas utilizadas durante a realização dos protocolos
experimentais in vivo e in vitro ............................................................... 56
Tabela 2: Relação dos sais para preparação das soluções fisiológicas
utilizadas nos experimentos in vivo e in vitro ......................................... 58
Tabela 3: Composição da solução de Tyrode (pH=7,4) ........................
58
Tabela 4: Composição da solução de Tyrode despolarizante com KCl
à 20mM (pH=7,4) .................................................................................... 59
Tabela 5: Composição da solução de Krebs Henseleit (pH=7,4) ..........
59
Tabela 6: Composição da solução de KCl 80 mM (pH=7,4) .................. 60
Tabela 7: Composição da solução de Hanks (pH=7,4) .........................
60
Tabela 8: Alterações comportamentais induzido pelo tratamento
agudo da CMMTT (doses de 50 e 100 mg/Kg i.v.) em camundongos
machos e fêmeas (n = 6 por grupo) ...................................................... 118
Tabela 9: Percentagem de mortes dos camundongos tratados com
CMMTT (n = 6 por grupo) ....................................................................... 119
Tabela 10: Peso dos órgãos vitais corrigido pelo peso de
camundongos (peso do órgão/peso do animal) machos e fêmeas
tratados com CMMTT (doses de 50 e 100 mg/Kg i.v.) (n = 6 por grupo) 120
LISTA DE FIGURA
Figura 1: Representação esquemática de um composto
mesoiônico............................................................................................... 45
Figura 2: Ratos Wistar (Rattus norvegicus) (A) e Ratos Sprague
Dawley (B) .............................................................................................. 55
Figura 3: Pletismógrafo de cauda para medida indireta da pressão
arterial em ratos .....................................................................................
65
Figura 4: Sistema de aquisição de dados de pressão arterial e
freqüência cardíaca em ratos ................................................................. 67
Figura 5: Sistema de aquisição de dados para órgão isolado ............... 70
Figura 6: Aparato utilizado para medida de cálcio intracelular .............
73
Figura 7: Aparato utilizado para medida de NOx (NOA, 280i) ..............
75
Figura 8: Representação esquemática do protocolo experimental para
avaliação da presença (A) ou ausencia (B) do endotélio funcional em
anéis de aorta torácica de rato ............................................................... 76
Figura 9: Representação esquemática do protocolo experimental para
avaliação da presença (A) ou ausência (B) do endotélio funcional em
78
anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato ............................
Figura 10: Representação esquemática do protocolo experimental
para avaliação da participação do EDHF na resposta vasorelaxante
induzida por CMMTT em anéis de artéria mesentérica superior isolada
de rato ....................................................................................................
79
Figura 11: Representação esquemática do protocolo experimental
para avaliação da participação dos metabólitos derivados da via da
COX e receptores muscarínicos na resposta vasorelaxante induzida
por CMMTT em anéis de artéria mesentérica superior isolada de
rato.......................................................................................................... 80
Figura 12: Representação esquemática do protocolo experimental
para avaliação da participação de canais para K+ na resposta
vasorelaxante induzida por CMMTT em anéis de artéria mesentérica
superior isolada de rato ..........................................................................
81
Figura 13: Representação esquemática do protocolo experimental
para avaliação da participação dos subtipos de canais para K+ na
resposta vasorelaxante induzida por CMMTT em anéis de artéria
mesentérica superior isolada de rato ..................................................... 83
Figura 14: Representação esquemática do protocolo experimental
para avaliação da reatividade vascular aguda para a FEN em anéis de
artéria mesentérica superior, com (A) e sem (B) endotélio funcional, de
rato normotenso e hipertenso (L-NAME) na presença e ausência do
CMMTT ................................................................................................... 84
Figura 15: Representação esquemática do protocolo experimental
para avaliação da reatividade vascular aguda para a ACh em anéis de
artéria mesentérica superior com endotélio funcional (A) e para o NPS
em anéis sem endotélio funcional (B), de rato normotenso e
hipertenso (L-NAME) na presença e ausência do CMMTT .................... 86
Figura 16: Representação esquemática do protocolo experimental
após a administração de CMMTT (50 e 100 mg/Kg i.v.) para avaliação
da atividade comportamental (A) e da letalidade e toxicidade dos
órgãos vitais (B) em camundongos machos e fêmeas ........................... 89
Figura 17: Representação esquemática do protocolo experimental
para registro da pressão arterial média (PAM) e frequencia cardíaca
(FC) em rato normotensos e hipertensos acordados, não-anestesiados
e com livre movimentação ...................................................................... 91
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1: Curvas concentração-resposta para o efeito relaxante
induzido pelo CMMTT (10-14 a 10-5 M) em anéis da artéria de aorta
torácica isolada de ratos com endotélio intacto () ou endotélio
ausente (), pré-contraídos com FEN (10 µM). Os valores estão
expressos com média ± e.p.m. de 05 experimentos. *p<0,05 vs
endotélio intacto ..................................................................................... 95
Gráfico 2: Curvas concentração-resposta para o efeito relaxante
induzido pelo CMMTT (10-14 a 10-5 M) em anéis da artéria mesentérica
superior com endotélio intacto, pré-contraídos com FEN (10 µM) de
ratos normotensos (controle) () e hipertensos (L-NAME) (). Os
valores estão expressos com média ± e.p.m. de 06 experimentos. *
p<0,05 vs normotensos ..........................................................................
96
Gráfico 3: Curvas concentração-resposta para o efeito relaxante
induzido pelo CMMTT (10-14 a 10-6 M) em anéis de artéria mesentérica
superior isolada de rato, com do endotélio funcional, pré-contraídos
com FEN (10 µM) na ausência () ou na presença de ChTX (100 nM)
mais apamina (100 nM) (). Os valores estão expressos com média ±
e.p.m. de 17 e 04 experimentos, respectivamente ................................. 97
Gráfico 4: Curvas concentração-resposta para o efeito relaxante
induzido pelo CMMTT (10-14 a 10-6 M) em anéis de artéria mesentérica
superior isolada de rato, com endotélio funcional, pré-contraídos com
FEN (10 µM) na ausência () ou na presença indometacina (10 µM)
mais atropina (1 nM) (). Os valores estão expressos com média ±
e.p.m. de 17 e 06 experimentos, respectivamente ................................. 98
Gráfico 5: Curvas concentração-resposta para o efeito vasorelaxante
induzido pelo CMMTT (10-14 a 10-6 M) em anéis de artéria mesentérica
superior isolada de rato, com endotélio funcional, pré-contraídos com
FEN (10 µM) na ausência (controle) () ou na presença de [K+]e = 20
mM ().Os valores estão expressos com média ± e.p.m. de 17 e 06
99
experimentos, respectivamente. *** p<0,001 vs endotélio intacto ..........
Gráfico 6: Curvas concentração-resposta para o efeito vasorelaxante
induzido pelo CMMTT (10-14 a 10-6 M) em anéis de artéria mesentérica
superior isolada de rato, com endotélio funcional, pré-contraídos com
FEN (10 µM) na ausência () ou na presença de TEA (1 mM) (). Os
valores estão expressos com média ± e.p.m. de 17 e 09 experimentos,
respectivamente. *** p<0,001 vs endotélio intacto .................................
100
Gráfico 7: Curvas concentração-resposta para o efeito vasorelaxante
induzido pelo CMMTT (10-14 a 10-6 M) em anéis de artéria mesentérica
superior isolada de rato, com endotélio funcional, pré-contraídos com
FEN (10 µM) na ausência () ou na presença de 4-aminopiridina (1
mM) (). Os valores estão expressos com média ± e.p.m. de 17 e 06
experimentos, respectivamente. *** p<0,001 vs endotélio intacto .......... 101
Gráfico 8: Curvas concentração-resposta para o efeito vasorelaxante
induzido pelo CMMTT (10-14 a 10-6 M) em anéis de artéria mesentérica
superior isolada de rato, com endotélio funcional, pré-contraídos com
FEN (10 µM) na ausência () ou na presença de glibenclamida (10
µM) (). Os valores estão expressos com média ± e.p.m. de 17 e 06
experimentos, respectivamente. * p<0,05 vs endotélio intacto ..............
102
Gráfico 9: Curvas concentração-resposta para o efeito vasorelaxante
induzido pelo CMMTT (10-14 a 10-6 M) em anéis de artéria mesentérica
superior isolada de rato, com endotélio funcional, pré-contraídos com
FEN (10 µM) na ausência () ou na presença de BaCl2 (30 µM) ().
Os valores estão expressos com média ± e.p.m. de 17 e 06
experimentos, respectivamente. ** p<0,005 vs endotélio intacto ...........
103
Gráfico 10: Curvas concentração-resposta para a FEN (10-9 a 10-5 M)
em anéis da artéria mesentérica superior com endotélio intacto de
ratos normotensos (A) e hipertensos (L-NAME) (B). Os valores estão
expressos com média ± e.p.m. da de contração dos valores
absolutos de 05 experimentos. * p<0,05 vs controle .............................. 105
Gráfico 11: Curvas concentração-resposta para a ACh (3x10-10 a 10-5
M) em anéis da artéria mesentérica superior com endotélio intacto de
ratos normotensos (A) e hipertensos (L-NAME) (B). Os valores estão
expressos com média ± e.p.m. de 06 experimentos. * p<0,05, ** p<
0,001 e *** p<0,0001 vs controle ............................................................
107
Gráfico 12: Curvas concentração-resposta para a FEN (10-9 a 10-5 M)
em anéis da artéria mesentérica superior sem endotélio funcional de
ratos normotensos (A) e hipertensos (L-NAME) (B). Os valores estão
expressos com média ± e.p.m. da de contração dos valores
absolutos de 05 experimentos ................................................................ 109
Gráfico 13: Curvas concentração-resposta para o NPS (10-9 a 10-5 M)
em anéis da artéria mesentérica superior sem endotélio funcional de
ratos normotensos (A) e hipertensos (L-NAME) (B). Os valores estão
expressos com média ± e.p.m. de 06 experimentos ..............................
111
Gráfico 14: Efeito do CMMTT (10-6 M) e ACh (10-5 M) sobre a
mobilização de Ca2+ intracelular em cultura primária de célula
endotelial de artéria mesentérica isolada de rato, após incubação com
DMSO, ACh (10-5 M) ou CMMTT (10-6 M) (n=4). * p<0,05 vs linha de
base ........................................................................................................
112
Gráfico 15: Efeito do CMMTT (10-6 e 10-5 M) sobre a liberação de
NOx em artéria mesentérica superior isolada de rato, pré-contraídos
com FEN (10-5 M) antes (valores basais) e após incubação com
DMSO, ACh (10-5 M), ou CMMTT [10-6 e 10-5 M] na presença do
endotélio (após 30 minutos de incubação) ou após a remoção do
endotélio (n=4). ** p<0,001 e *** p<0,0001 vs DMSO + FEN; +++
p<0,0001 vs Linha de Base e ### p<0,0001 vs endotélio removido ...... 114
Gráfico 16: Efeito do CMMTT (10-6 e 10-5 M) sobre a liberação de
NOx em anéis de aorta torácica isolada de rato, pré-contraídos com
FEN (10-5 M) antes (valores basais) e após incubação com DMSO,
ACh (10-5 M) ou CMMTT (10-6 e 10-5 M), após 30 (A) e 60 minutos (B)
ou após a remoção do endotélio (C) (n=4). * p<0,05 e *** p<0,0001 vs
DMSO + FEN, + p<0,05 vs Linha de Base e # p< 0,05 vs FEN + Ach
ou FEN+CMMTT ....................................................................................
Gráfico 17: Valores médios percentuais do efeito da administração
aguda de doses crescentes do composto mesoiônico CMMTT (0,05;
0,01; 0,5; 0,1; 1 e 5 mg/kg, i.v., randomicamente) sobre a pressão
arterial média (A) e freqüência cardíaca (B) em ratos normotensos
(controle) e hipertensos (L-NAME). Os valores estão expressos como
média ± e.p.m. de 6 experimentos. * p<0,05 e ** p<0,01 vs
controle....................................................................................................
116
122
Gráfico 18: Valores médios percentuais da pressão arterial sistólica
pela medida de pressão caudal em animais em ratos normotensos
(SHAM) e hipertensos (2R1C). Os valores estão expressos como
123
média ± e.p.m. de 14 animais por grupo. *** p<0,0001 vs SHAM ..........
Gráfico 19: Valores médios percentuais do efeito da administração
aguda de doses crescentes do composto mesoiônico CMMTT (0,05;
0,01; 0,5; 0,1; 1 e 5 mg/kg, i.v., randomicamente) sobre a pressão
arterial média (A) e freqüência cardíaca (B) em ratos normotensos
(SHAM) e hipertensos (2R1C). Os valores estão expressos como
média ± e.p.m. de 6 experimentos. * p<0,05 vs SHAM .......................... 125
Gráfico 20: Valores médios percentuais do efeito da administração
aguda de doses crescentes do composto mesoiônico CMMTT (0,05;
0,01; 0,5; 0,1; 1 e 5 mg/kg, i.v., randomicamente) sobre a pressão
arterial média (A) e freqüência cardíaca (B) em ratos normotensos
(LL) e hipertensos (LH). Os valores estão expressos como média ±
e.p.m. de 6 experimentos. * p<0,05 vs LL............................................... 127
1 INTRODUÇÃO
O desenvolvimento e implementações de estudos científicos efetivos sobre o
sistema
cardiovascular
baseiam-se
na relevância
entre função,
disfunção
e
incapacidade, bem como na busca, identificação e resolução de problemas no âmbito
terapêutico, contribuindo para a promoção da saúde e prevenção de doenças.
O sistema cardiovascular além de fornecer um fluxo de sangue para tecidos e
órgãos periféricos, suprindo suas demandas metabólicas, é o principal responsável pela
regulação, controle e manutenção da pressão arterial (PA), uma das funções
fisiológicas mais complexas do sistema biológico (CAMPAGNOLE-SANTOS; HAIBARA,
2001, INOUE et al., 2006).
A PA é diretamente influenciada pelo produto do débito cardíaco (DC) pela
resistência vascular periférica total (RVPT), onde o DC é determinado pelo produto
entre o volume de ejeção sistólico (VES) e freqüência cardíaca (FC) (OASTES, apud
HARDMAN et al., 1996). Além destes fatores determinantes da manutenção da PA
outros sistemas também exercem influência no controle e regulação da PA, como o
sistema neural, renal, endócrino e cardiovascular (CAMPAGNOLE-SANTOS; HAIBARA,
2001).
O sistema neural representado pelos barorreceptores, quimioreceptores e
receptores cardiopulmonares que respondem rapidamente às modificações na pressão
arterial, sendo responsável pelo controle a curto prazo (HEYMANS; NEIL, 1958); o
sistema renal, um importante mecanismo de controle que pode ser representado pelo
controle hemodinâmico que regula a PA a longo prazo e é determinada pelo balanço
hídrico dos fluidos corporais (INOUE et al., 2006), e o controle hormonal, representado
pelo sistema renina-angiotensina (CONTRERAS et al., 2003); o sistema endócrino
exerce uma importante participação com ativação e liberação de hormônios que vão
interferir sistemicamente na modulação da PA, como por exemplo o sistema simpático
(adrenalina e noradrenalina) (LI et al., 2008) e o hormônio antidiurético (RUSSELL,
2007); e os mecanismos intrínsecos do sistema cardiovascular, onde se destacam
substâncias vasoativas produzidas localmente pelo endotélio (ação autócrinas e
parácrinas) que contribui com a homeostase vascular por produzirem alterações na
RVPT e modular a PA (EVORA et al., 1995, GROSS; AIRD, 2000).
Muitas substâncias derivadas do endotélio parecem estar envolvidas na
modulação fisiológica do controle local do tônus e do fluxo vascular. Estas substâncias,
que são, em alguns casos, produzidas continuamente pelas células endoteliais em
pequenas quantidades, podem ser liberadas em quantidades bem maiores por
estímulos de agonistas ou alterações no fluxo sanguíneo, exercendo função essencial
na regulação e modificações tensionais no músculo liso vascular, alterando as taxa de
fluxo sanguíneo local e, consequentemente, interferindo no controle da PA
(FURCHGOTT et al., 1980; REES et al., 1989, BEVAN; HENRION, 1994, EVORA et al.,
1995, GROSS; AIRD, 2000).
O músculo liso vascular consiste principalmente de células musculares lisas e
matriz extracelular que forma a camada média da parede dos vasos sanguíneos. A
musculatura
lisa
vascular
apresenta
importância
fisiológica
determinante,
desempenhando um importante papel nos vasos sanguíneos, devido as suas
propriedades contráteis, o mesmo tem capacidade de regular de maneira dinâmica o
volume luminal e, consequentemente, a resistência ao fluxo sanguíneo do sistema
vascular (JACKSON, 2000).
Em relação ao músculo liso vascular, artéria de grande condutância, como a
aorta, contém múltiplas camadas de células musculares lisas alternadas por lâmina
elástica conferindo uma maior força para estes vasos resistirem às pressões
hemodinâmicas sanguíneas, que saem do coração. Já as artérias de resistência
apresentam camada de células musculares de densidade variada e são responsáveis
pelo controle da pressão sanguínea (CRIBBS, 2006).
A regulação do tônus das células musculares lisas vasculares é dependente de
uma complexa interação de substâncias vasoativas como: estímulos de hormônios
circulantes, neurotransmissores, fatores derivado do endotélio e da pressão arterial,
que integrados, resulta em um diâmetro vascular e resistência dos vasos sanguíneos.
(JACKSON, 2000; CRIBBS, 2006).
Disfunções que desencadeiam alterações no controle da pressão arterial podem
vir a repercutir no desequilíbrio da relação vasodilatação vs vasoconstrição, alterando o
tônus basal dos vasos e, portanto, promovendo um desequilíbrio sobre RVPT e sobre a
complacência venosa (TAKESHITA; MARK, 1979), que por um período prolongado
acometerá a instalação de um quadro hipertensivo (PAGE, 1987).
A regulação da resposta contrátil do músculo liso é dependente do aumento da
[Ca2+]i, enquanto o relaxamento, como anteriormente mencionado, é devido à
diminuição deste íon livre nas células do músculo liso vascular.
Os estímulos que desencadeiam o aumento deste mensageiro secundário, no
processo de contração do músculo liso vascular, envolvem dois tipos de acoplamento: o
eletromecânico, quando a contração envolve a mudança no potencial de membrana
(Vm) e o fármaco-mecânico, quando a contração é evocada por um agonista ligado a
um receptor sinalizando uma resposta final (REMBOLD, 1996).
O controle do potencial de membrana é crítico para determinar a contração do
músculo liso vascular, uma vez que alterações no potencial de membrana das células
levam a ativação dos canais para Ca2+ dependentes de voltagem que representam o
principal mecanismo de influxo de Ca2+ no músculo liso vascular (HUGHES, 1995). O
mecanismo que promove o aumento da [Ca2+]i através do acoplamento fármacomecânico envolve a formação de segundos mensageiros como o inositol trifosfato (IP3)
e diacilglicerol (DAG), a partir da ligação do agonista ao receptor promovendo a
ativação da proteína Gq-Fosfolipase C (FLC). O IP3 pelo seu caráter hidrofílico, difundese pelo citoplasma liga-se a um receptor específico no retículo sarcoplasmático
aumentando a liberação de Ca2+ dos estoques intracelulares (GRIDER; MAKHLOUF,
1988; IINO, 1990; UREÑA et al., 2007). O próprio cálcio também age como mensageiro
secundário, induzindo a liberação de mais Ca2+ ligando-se aos receptores de rianodina,
também localizados no retículo sarcoplasmático (KOMORI et al, 1995).
O aumento da [Ca2+]i é um sinal essencial para iniciar a resposta contrátil do
músculo liso vascular que ocorre como resultado da liberação de Ca2+ de estoque
intracelulares, influxo de Ca2+ extracelular, ou ambos (SOMLYO; SOMLYO, 1994)
facilitando a interação do complexo (Ca2+)4-CaM (Calmodulina), que ao sofrer uma
alteração conformacional, ativa a quinase da cadeia leve da miosina (MLCK), e, esta
por sua vez, irá fosforilar a cadeia leve da miosina (MLC20), favorecendo o
deslizamento
dos
filamentos
de
actina
sobre
os
de
miosina
e
gerando
conseqüentemente a força de contração do músculo liso (JOHNSON; SNYDER, 1995).
A [Ca2+]i nas células do músculo liso vascular depende de mecanismos que
mobilizam e regulam os seus níveis, promovendo aumento ou diminuição da
concentração deste íon livre no citoplasma. Alterações neste mecanismo tem sido
associadas ao aumento da reatividade vascular e da [Ca2+]i em modelos experimentais
de hipertensão (BOHR; WEBB, 1984; KWAN, 1985). A [Ca2+]i em células do músculo
liso de ratos hipertensos em condições basais tem sido demonstrada estarem elevadas
(SUGIYAMA et al., 1986; BENDHACK et al.,1992; CORTES et al.,1997).
Revestindo internamente as camadas do músculo liso e em contato direto com o
fluxo sanguíneo encontra-se o endotélio vascular que é uma única camada de células
que não constitui simplesmente uma membrana de diálise, mas possui intensa
atividade metabólica. O endotélio intacto está envolvido na síntese e/ou no metabolismo
de diversos mediadores endógenos que induzem vasoconstrição, tais como: endotelina1 (ET1), PGH2, tromboxano A2 (TX A2) e ânions superóxido (O2-), e compostos que
induzem vasodilatação, como o óxido nítrico (NO), fator hiperpolarizante derivado do
endotélio (EDHF), prostaciclina (PGI2) (BATLOUNI, 2001; FURCHGOTT et al, 1980;
BEVAN; HENRION, 1994).
Em condições fisiológicas, existe uma liberação balanceada de fatores
relaxantes e contracturantes responsável pelo controle do tônus de repouso, e a
integridade do endotélio é essencial à regulação do tônus vascular, do fluxo sanguíneo,
da perfusão tissular e na proteção contra espasmo, trombose e a aterogênese
(BATLOUNI, 2001), e alterações decorrentes de doenças cardiovasculares como a
hipertensão, contribui para uma futura progressão do dano vascular e dos órgãos
nobres (BRUNNER et al., 2005).
Relatos na literatura têm mostrado a participação do endotélio vascular no
relaxamento induzido por uma variedade de substâncias químicas endógenas e
exógenas (FURCHGOTT; ZAWADZKI, 1980; COHEN; VANHOUTTE, 1995; CHAUHAN
et al., 2003; DIAS et al., 2007) e uma especial atenção está voltada para o óxido nítrico
(NO) que têm sido implicadas no relaxamento dependente do endotélio (MONCADA;
VANE, 1979; FÉLÉTOU; VANHOUTTE, 1988).
Em 1980, Furchgott e Zawadzki observaram o relaxamento induzido pela
acetilcolina, em resposta à ativação dos receptores muscarínicos, nas preparações
isoladas de aorta torácica de coelho mediado por um fator dependente do endotélio. A
importância deste Fator Relaxante Derivado do Endotélio (EDRF) foi intensificada
quando em 1987, se demonstrou que o EDRF era um gás extremamente lábil e reativo
com propriedades químicas e biológicas semelhantes às do óxido nítrico (NO)
(PALMER et al., 1987).
Posteriormente, foi observado que as células endoteliais eram capazes de
produzir NO a partir da oxidação de um dos átomos de nitrogênio guanidino terminais
do aminoácido L-arginina por uma oxigenase cálcio-calmodulina dependente: a sintase
de óxido nítrico (eNOS) (PALMER et al., 1988).
O NO sintetizado no endotélio vascular se difunde para o músculo liso e ativa a
ciclase de guanil solúvel, levando a um aumento nos níveis intracelulares de GMPc
(IGNARRO et al., 1986), induzindo relaxamento do músculo liso vascular através de um
mecanismo mediado por proteínas quinases dependentes de GMPc (PKG). Um dos
alvos da PKG é a fosfatase de da cadeia leve da miosina que quando ativa resulta em
desfosforilação da cadeia leve da miosina (MLC), promovendo assim, o relaxamento do
músculo liso vascular (SURKS et al., 1999). Outros alvos da PKG é a bomba de Ca2+
presente na membrana plasmática e na membrana do retículo endoplasmático,
denominada SERCA, que após sua fosforilação vai diminui a concentração intracelular
de cálcio ([Ca2+]i). Esta proteína cinase ativa promove também, a abertura de canais
para potássio (K+) na membrana plasmática hiperpolarizando as células muscular lisa e
indiretamente inibe os canais para Ca2+ dependentes de voltagem, do tipo L; e
finalmente, ativa o trocador Na+/Ca2+ (BLAUSTEIN, 1989).
Bolotina et al. (1994) propuseram que o NO poderia ativar diretamente canais
para K+ presentes na membrana plasmática do músculo liso vascular, levando a uma
hiperpolarização e relaxamento das células musculares lisas.
Os canais para K+ são reguladores importantes do tônus arterial e com isso, do
diâmetro dos vasos sanguíneos. A abertura dos canais para K+ nas células musculares
lisas leva ao aumento no efluxo de K+, causando repolarização ou hiperpolarização do
potencial de membrana. Estes eventos culminam com o fechamento dos canais para
Ca2+ sensíveis a voltagem, podendo levar a vasodilatação (NELSON; QUAYLE, 1995;
THORNELOE; NELSON, 2005).
Segundo as normas de nomenclatura da União Internacional de Farmacologia,
os canais para K+ são classificados em quatro subgrupos: Canais sensíveis a voltagem
(Kv), canais ativados por Ca2+ (Kca), canais retificadores de entrada (Kir) e canais para
dois poros (K2p). Estes canais estão distribuídos em vários tecidos, incluindo o músculo
liso vascular (WEI et al., 2005; GUTMAN et al., 2005; KUBO et al., 2005).
Ao longo dos anos, estudos vêem sendo realizados para elucidar as
modificações envolvidas na redução do relaxamento dependente do endotélio vascular
observado na hipertensão. A resposta relaxante induzida por ACh pode variar em
diferentes modelos de hipertensão. Esse efeito foi inicialmente observado por Konishi e
Su em 1983, onde foi identificada uma resposta relaxante diminuída induzida por
acetilcolina em aortas de ratos espontaneamente hipertensos (SHR). A partir destes
estudos, outros autores também observaram que resposta a acetilcolina esta diminuída
em artérias isoladas de ratos hipertensos renais 1-rim – 1-clip (1R-1C), na hipertensão
induzida por desoxicorticosterona (Doca-sal), SHR e SHR susceptível a acidente
vascular cerebral (SHRSP) (BELL; BOHR, 1991; CRESPO et al.,1996; KÄHÖNEN et
al., 1994; WU et al., 1996; TESFAMARIAM; HALPERN, 1988; SUNANO et al., 1999;
CHAMIOT-CLERC et al., 2001).
A menor resposta relaxante, induzida por acetilcolina, em artérias de animais
hipertensos tem sido atribuída à diminuição da liberação de NO e EDHF (MANTELLI et
al., 1995; RESS et al., 1990; NISHIDA et al., 1998; SUNANO et al., 1999; MILLETTE et
al., 2000). No entanto, a redução ou o aumento da reatividade a um agente vasoativo
(vasodilatadores e vasoconstrictores) varia entre os diferentes modelos de hipertensão,
bem como, durante as diferentes fases de desenvolvimento do processo hipertensivo,
ou ainda, entre os diferentes leitos vasculares (BOHR et al., 1991; TOSTES et al.,
1997).
A hipertensão arterial sistêmica é caracterizada por um complexo contexto, com
alterações hemodinâmicas, tróficas e metabólicas, entre as quais se menciona a própria
elevação dos níveis tensionais, a atividade aumentada dos fatores de coagulação,
inflamação, estresse oxidativo, a redução da complacência arterial e a hipertrofia com
alteração da função diastólica do ventrículo esquerdo, que implicam em uma condição
patológica grave (JULIUS, 2007).
O desenvolvimento de hipertensão depende da interação entre predisposição
genética e/ou fatores ambientais. A hipertensão arterial pode apresentar-se de duas
formas, primária ou essencial e secundária ou adquirida. A hipertensão essencial
caracteriza-se por uma elevação da pressão sangüínea sem causa aparente, e está
associada a vários fatores de risco como: uma predisposição genética, obesidade,
consumo elevado de álcool, de cigarro e inatividade física. No segundo caso, quando a
causa é identificável, a hipertensão é denominada secundária. Nesse caso, algumas
situações são passíveis de cura pela remoção do fator que a motivou, geralmente, temse elevação da pressão sangüínea por ativação do sistema renina-angiotensinaaldosterona (PAGE et. al., 1999).
Para melhor compreender os mecanismos envolvidos nestas disfunções,
modelos de hipertensão desenvolvidos em ratos, que exibem características em comum
com a hipertensão humana, são desenvolvidos e bastante utilizados (DOGGRELL;
BROWN, 1998). Existem dois tipos de modelos de hipertensão experimental, o modelo
de hipertensão primária, que corresponde a alterações genéticas e o modelo de
hipertensão secundária, induzida por manipulações farmacológicas ou cirúrgicas
(FREITAS, 2003).
Dentre os vários modelos de ratos geneticamente hipertensos, a linhagem de
ratos espontaneamente hipertensos (SHR), selecionada por Okamoto e Aoki (1963) a
partir da espécie Wistar Kyoto, é sem dúvida a espécie mais estudada. Outro modelo de
ratos geneticamente hipertensos são os ratos hipertensos de Lyon (LH) que
apresentam origem da espécie Sprague Dawley e foram obtidos por cruzamento
consaguíneo entre ratos apresentando diferentes níveis de pressão arterial (DUPONT
et al., 1973).
É relatado que a hipertensão essencial humana é um complexo de doenças que
resulta da interação de diversos genes com fatores ambientais (HARRAP et al., 1994) e os
animais hipertensos de Lyon se enquadram neste modelo de hipertensão essencial, sendo
caracterizado por níveis baixos de renina e elevada sensibilidade renal para angiotensina II
(SASSARD; MING; KIAO-LING, 2003).
A linhagem LH apresenta um modelo de hipertensão moderada caracterizado por
peso corporal elevado em comparação a linhagem de ratos normotensos de Lyon (LL)
(SASSOLAS et al., 1981). Além disso, foi relatada a existência de alterações na função
endotelial em aorta e artéria mesentérica (ramo de 2º e 3º ordem) destes animais e para
os ratos LH, uma maior reatividade a agonistas vasoconstritores com uma sensibilização
aumentada ao Ca2+ (FREITAS et al., 2003).
Diante da variedade de modelos de hipertensão secundária, um modelo bastante
estudado é o modelo da hipertensão renovascular dois rins e um clip (2R1C) descrita
inicialmente por Goldblatt et al., 1934 e adaptada por Shaffenburg (1959) para animais
de pequeno porte que não apresenta componentes genéticos para a elevação da
pressão arterial sistêmica. Este modelo de hipertensão é induzido cirurgicamente pela
constrição da artéria renal esquerda, induzindo a isquemia renal e, consequentemente,
ativando um dos sistemas vasoconstrictores muito potente do organismo, que é o
sistema renina-angiotensina-aldosterona (PRIETO-CARRASQUERO et al., 2008).
Ainda
neste
modelo,
são
considerados
três
estágios
temporais
no
desenvolvimento e manutenção da hipertensão. A primeira fase consiste de um período
de aproximadamente quatro semanas após a indução cirúrgica da hipertensão e nesta
fase é observado um aumento da atividade do sistema renina-angiotensina (SRA)
plasmática e tecidual (aorta, mesentérica e pulmão). Na segunda fase, que se estende
da quarta a oitava semana, a atividade do SRA esta normalizada tanto para o plasma
quanto para os tecidos. A terceira e última fase, que é computada a partir da nona
semana da indução, observa-se novamente aumento da atividade da enzima
conversora da angiotensina (ECA) (OKAMURA et al., 1986; MARTINEZ-MALDONADO,
1991).
O sistema renina-angiotensina é ativado pela sensibilização das células
justaglomerulares renais. A isquemia renal é um dos principais estímulos para a
liberação da renina que irá atuar na conversão do angiotensinogênio, um substrato
plasmático, em um polipeptídeo, a angiotensina I. Este polipeptídeo apresenta
características bastante instáveis, sendo rapidamente convertido por ação da ECA em
angiotensina II, principalmente no endotélio dos capilares pulmonares. Sabe-se que a
vida média da angiotensina II é muito breve, sendo degradada em outros peptídeo de
menor peso molecular; porém, enquanto ativa, exerce um potente efeito vasoconstrictor
na circulação sistêmica e renal (CONTRERAS et al, 2003).
No modelo de hipertensão 2R1C foi observado em vários trabalhos a redução da
resposta relaxante dependente do endotélio em anéis de artérias aorta e mesentérica,
estudos estes, realizados até a quarta semana ou a partir da décima semana após a
indução da hipertensão (CAUVIN; PEGRAM, 1983; DOHI et al., 1991).
Outro modelo que também simula a hipertensão secundária, é a hipertensão NOdeficiente, induzida pela inibição crônica da biossíntese do NO pela administração de
um inibidor da eNOS, como por exemplo o NG-nitro-L-arginina methyl ester (L-NAME),
por exemplo (MOORE et al., 1990; REES et. al., 1990). Esta hipertensão é iniciado por
uma redução da vasodilatação NO-dependente, sendo mantida a participação do SRA
e o sistema nervoso simpático (SNS) (CUNHA et al., 1993; SANDER et al., 1995;
ZANCHI et al., 1995; SANDER; VICTOR, 1999) resultando em alterações metabólicas,
hipertensão e hipertrofia do miocárdio (BERNÁTOVÁ et al. 1999b, KUNEŠ et al. 2004).
O aumento na pressão arterial é acompanhado por um aumento na resistência vascular
e diminuição no fluxo sangüíneo em vários leitos vasculares (leito vascular renal e
mesentérico), e depressão do débito cardíaco (GARDINER et. al., 1990).
Vários autores observaram neste modelo de hipertensão uma elevação de
vasoconstrição e atenuação de vasorelaxamento em diferentes leitos vasculares,
aumento da atividade simpática e alterações no sistema renina-angiotensina em ratos
tratados L-NAME (JOVER et al. 2001, BERNÁTOVÁ et al. 2002, KUNEŠ et al . 2004,
ROSSONI et al. 2007).
O fator comum aos diferentes modelos de hipertensão estudados, bem como a
hipertensão arterial em humanos é que se trata de uma patologia cardiovascular
crônica, não transmissível, com características multifatorial, multicausal e assintomática
(DREXLER; HORNIG, 1999).
O desencadeamento de doenças cardiovasculares, ressaltando a hipertensão
arterial, adquiriu uma maior importância durante o século XX, com o aumento da
expectativa de vida da população, e tem despertado interesse científico especial por
atingirem grandes contingentes populacionais (SIMÃO et al., 2002).
Com o avanço da síntese orgânica, os produtos sintéticos começaram a se
destacar em diversidade e em competitividade comparado aos produtos naturais em
diversos setores industriais. No setor farmacêutico, por exemplo, predomina atualmente
o uso de insumos sintéticos enquanto que o uso de produtos naturais predominou na
primeira metade do século passado (FERREIRA et al., 1997).
Atualmente, a síntese orgânica é uma área de interface entre a química e a
biologia, dando origem a novas áreas, nomeada química medicinal.
Diante dos avanços científico-tecnológicos observados em diversas áreas como
a biologia estrutural, molecular e a química computacional, por exemplo, o
planejamento racional de novos fármacos tornou-se uma realidade, cujos fármacos de
origem sintética representam significativa parcela do mercado farmacêutico, e a síntese
destes fármacos pode ser considerada uma aplicação nobre, por permitir o acesso a
substâncias terapeuticamente úteis, com níveis de complexidade variáveis. Sua
aplicação na busca de novos protótipos de fármacos representa uma grande parcela
dos medicamentos disponíveis para uso clínico e movimenta cifras elevadas dentro do
mercado mundial (BARREIRO, 2002; LIMA, 2007).
De fato, entre os principais alvos escolhidos pelos químicos orgânicos sintéticos
ao longo dos anos, encontravam-se os produtos de cuja complexidade estrutural,
potência e diversificadas atividades biológicas/farmacológicas despertassem um grande
interesse científico e medicinal, como os esteróides, prostaglandinas, anti-hipertensivos,
substâncias macrocíclicas com ação antibiótica e anti-câncer, dentre outros que
propiciam o desenvolvimento de novos medicamentos, defensivos agrícolas, produtos
de aplicabilidade médica, eletroeletrônica, magnética (CORREIA et al., 2002).
A química medicinal engloba o planejamento racional de novas substâncias
bioativas, envolvendo a síntese ou a modificação molecular de substâncias; o
isolamento ou modificações de princípios ativos naturais (plantas, animais, minerais); a
identificação ou elucidação da estrutura; a descrição das moléculas desde a sua
constituição atômica até as suas características estruturais quando da interação dos
diferentes sistemas biológicos; a compreensão em nível molecular de processos
bioquímicos/farmacológicos,
toxicológicos
e
farmacocinéticos.
E,
finalmente,
proposições e validações de modelos matemáticos através dos estudos de relação
entre a estrutura química e a atividade farmacológica e/ou toxicológica, permitindo
então a proposição de novas entidades de interesse. Esta área de conhecimento,
utilizando diferentes estratégias metodológicas complementares, é tradicional e
reconhecidamente usada no planejamento de fármacos visando sua aplicabilidade na
terapêutica (AMARAL; MONTANARI, 2002).
Algumas doenças que são reconhecidamente como uma entidade de prevalência
elevada, como a hipertensão, podem ser bem controlada pela utilização de drogas
capazes de diminuir a pressão arterial, no entanto seu tratamento continua
insatisfatório, devido a ineficácia das drogas atuais reduzirem os riscos das doenças
cardiovasculares e danos nos órgãos afetados.
Este fato tem levado a busca de novas classes de medicamentos que possam
modificar tanto o aumento da pressão sanguínea como as anormalidades funcionais e
estruturais relacionadas principalmente ao coração e aos vasos sanguíneos (ZAMAN et
al., 2002).
Centenas de compostos farmacologicamente importantes são estruturalmente
derivados de heterocíclicos (POZHARSKÜ et al.,1997). A síntese de compostos
heterocíclicos medicinais levou a diminuição da mortalidade causada por várias
doenças sendo, portanto, de suma importância o estudo destes compostos. Neste
contexto, uma classe de compostos heterocíclicos que têm recebido muita atenção é a
dos compostos mesoiônicos (NEWTON; RAMSDEN, 1982).
Em 1882, Ficher e Besthorn foram os primeiros a descrever a síntese de um
composto mesoiônico seguindo esta linha de pesquisa, Max Busch, durante o período
de 1895-1905, descreveu a preparação e as propriedades químicas de vários
mesoiônicos heterocíclicos (NEWTON; RAMSDEN, 1982). Porém, somente em 1946
Simpson utilizou o termo “mesoiônico” para descrever um tipo de molécula que não
poderia
ser
representada
por
uma
estrutura
covalente,
com
características
mesoméricas e iônicas (KIER; ROCHE, 1967, NEWTON; RAMSDEN, 1982). Alguns
anos depois Baker e Ollis (1955) complementaram a definição sugerindo que um
composto pode ser chamado de mesoiônico se apresentar uma estrutura heterocíclica
com cinco ou seis membros, que não pode ser satisfatoriamente representada por uma
estrutura polar ou covalente. Deve possuir também, um sexteto de elétrons π em
associação com todos os átomos que constituem o anel. Este deve apresentar ainda,
carga positiva ou negativa e um átomo ou grupo de átomos ligados ao anel deve ter
carga oposta.
Estes compostos foram ao longo dos tempos sendo definido por diferentes
autores que visavam diferentes aspectos estruturais da molécula, e Joseph Miller
(1996) atribuiu uma definição referente aos aspectos químicos:
Compostos mesoiônicos são betaínas heterocíclicas planas de cinco membros
com, pelo menos, uma cadeia lateral, cujo átomo α também esta no mesmo
plano do anel [...] Os elétrons estão deslocalizados sobre duas regiões
separadas por duas ligações essencialmente singelas. Uma região, que inclui o
átomo “a”, na cadeia lateral, está associada com o HOMO e uma carga π
negativa enquanto a outra esta associada com o LUMO e uma carga π positiva.
(LIRA et al, 2002, p. 02).
Os compostos mesoiônicos podem ser representados esquematicamente pela
estrutura mostrada na figura 1, onde as letras de “a” até “f” representam átomos como:
carbono, nitrogênio, oxigênio e enxofre seguidos de seus respectivos substituintes,
específicos para cada tipo de composto (OLLIS; RAMSDEN, 1976, NEWTON;
RAMSDEN,1982).
Figura 1. Representação esquemática de um composto mesoiônico
Fonte: OLLIS; RAMSDEN, 1976, NEWTON; RAMSDEN,1982.
Até o ano de 1982, foram relatados mais de sessenta compostos mesoiônicos,
na qual se classifica os diferentes sistemas em: oxazóis, dioxóis, diazóis, tiazóis, ditióis,
oxadiazóis, oxatiazóis, triazóis, tiadiazóis, oxatriazóis, tetrazóis, tiatriazóis, oxatióis,
selenazois e ditiadiazóisoxazóis, diazóis, tiazóis, ditióis, tiadiazóis e tetrazóis (OLLIS;
RAMSDEN, 1976, NEWTON; RAMSDEN, 1982).
Em relação à atividade biológica, quatro classes de compostos mesoiônicos têm
sido destacadas na literatura: sidnonas (1,2,3-oxadiazólio-5-olatos), primeira classe de
compostos mesoiônicos sintetizada e também a mais estudada até a atualidade (EARL;
MACKNEY, 1935); sidnoniminas (1,2,3-oxadiazólio-5-aminidas) e os oxatriazóis,
ambas, embora menos estudada que as sidnonas, incluem derivados que exercem
efeitos biológicos importantes, principalmente no sistema cardiovascular com
propriedades doadora de NO devido à fácil clivagem da ligação (= N-NO) de suas
estruturas (ELMEDAL; MULVANY; SIMONSEN, 2005, REHSE et al., 1993 a, b, c); e os
1,3,4-tiadiazóis mesoiônicos (KIER; ROCHE, 1967). Estes compostos apresentam
características em comum que podem justificar sua aplicação terapêutica, como uma
estrutura relativamente pequena e caráter aromático planar que permitem melhor
interação com macromoléculas biológicas (KIER; ROCHE, 1967).
A variação da densidade eletrônica em torno do anel e a presença de regiões
distintamente carregadas, as quais conferem à estrutura um alto momento de dipolo,
possibilitam interações eletrostáticas com biomoléculas como o DNA e proteínas. Outro
aspecto físico-químico importante para sua função é o caráter global neutro destas
estruturas o que permite que estes compostos atravessem membranas biológicas
(KIER; ROCHE, 1967; OLLIS; RAMSDEN, 1976; NEWTON; RAMSDEN, 1982).
Substâncias químicas pertencentes aos compostos derivados do sistema
mesoiônico, são reportado na literatura, como sendo estruturas químicas sintéticas que
apresentam
uma
variedade
de
propriedades
químicas
e
atividade
biológica
comprovada, a depender da natureza dos substituintes do anel, o que levou, em alguns
casos, ao registro de patente (OLLIS; RAMSDEN, 1976).
Estes compostos heterocíclicos destacam-se por serem mencionados na
literatura científica com propiedades antitumoral, antifúngica, antimalárica (HILL, 1957),
além de derivados do 1,3,4 – tiadiazólio – 2 tiolato com atividade antibactericida (grampositivas e gram-negativas) (BARBOSA, 1979), das sidnonas e das classes 3 –
(dietilaminoetil) – 4 – metil 1,2,3 – oxadiazólio – 5 olato com atividade analgésica
(WAGNER, HILL , 1974 ; BRUZZESE, 1965 ; YASHUSKII; KHOLODOV, 1980), os
derivados da 3 – (2 – ariltio) – etil – 1,2,3 – oxadiazólio – 5 – olato com atividade
antiinflamatória (HILL, 1957 ; WAGNER, HILL, 1974), o cloridrato do mesoionico 3 –
(fenilisopropil) – 1,2,3 – oxadiazólio – 5 – imideto anticonvulsivante e antidepressiva
(WAGNER, HILL, 1974 ; BRUZZESE et al., 1965 a); o 3-(p-metoxibenzil)-sidnona
possuia atividade contra carcinoma 755 em camundongos (GRECO et al., 1962) e
outros autores sintetizaram quatorze derivados do 3-aminoalquil-sidnona e dentre estes
alguns compostos apresentaram ação analgésica, antiinflamatória e hipoglicemiante,
além de agirem sobre o sistema nervoso central de forma excitante ou depressiva
(BRUZZESE et al., 1965 b). Um derivado das sidnoniminas destacada atividade
biológica
do
molsidomina
(N-etoxicarbonil)-3-morfolinosidnonimina,
utilizada
no
tratamento de pacientes com Angina de Peito (MAJID et al., 1980), o 3-arilalquil-N-X-5sidnoniminas apresenta efeito antitrombótico e vasodilatador (REHSE et al., 1993 d),
derivados oxatriazóis denominados compostos GEA (derivados 3-aril substituídos
oxatriazóis-5-imina) mostraram-se como potentes agentes anti-agregante plaquetário,
fibrinolítico, trombolítico e broncolítico, in vivo e in vitro, os autores classificaram estes
compostos como “doadores de NO” (CORELL et al.,1994) e o mesoiônico 1,4 – difenil –
5 – (5 – nitro – 2 furanil) – 1,3,4 – tiazólio – 2 – tiol, revelou possuir potente ação
espasmolítica em musculatura lisa, tanto na traquéia de cobaia como em útero de rata
(ATHAYDE-FILHO, 1999).
Em
estudos
realizados
anteriormente
no
Laboratório
de
Tecnologia
Farmacêutica-LTF por Cavalcante et al. (2004) foi observado que o composto
mesoiônico – 2 – (4 – clorofenil) – 3 – metil – 4 – ( 4 – metoxifenil) – 1 ; 3 – tiazólio – 5 –
tiolato (CMMTT) (Quadro 1), utilizando estudos in vivo, promoveu efeito hipotensor e
taquicárdico em ratos normotensos, enquanto em estudos in vitro CMMTT induziu uma
potente atividade relaxante concentração-dependente em anéis de artéria mesentérica
superior isolada de rato (pD2=10,26±0,05; Emax=80,8±5,8 %), pré-contraídos com FEN
com endotélio intacto e este efeito foi significativamente atenuado (p<0,01), na
presença do L-NAME (inibidor da sintase do NO), do ODQ (inibidor do monofosfato de
guanosina cíclico - GMPc solúvel), da hidroxocobalamina (seqüestrador do NO) e na
ausência do endotélio funcional, sem nenhuma diferença significativa entre eles. Estes
resultados sugerem que o efeito induzido pelo composto mesoiônico CMMTT é
decorrente de um aumento dos níveis NO no endotélio vascular com consequente
ativação da ciclase de guanilil solúvel e aumento nos níveis do nucleotídeo cíclico
(GMPc) intracelulares no músculo liso vascular para promover o seu potente efeito
vasorelaxante.
Diante as considerações apresentadas, o trabalho fundamenta-se nos estudos
prévios realizados, tendo em vista que a literatura disponível, não aborda trabalhos
efetivamente
direcionados
aos
mecanismos
moleculares
ou
às
atividades
farmacológicas sobre o sistema cardiovascular, atribuídas ao composto mesoiônico em
estudo.
Portanto, a proposta de estudo enfoca aprofundar as investigações do seu
mecanismo de ação sobre o efeito relaxante atribuído ao CMMTT, além de estudar a
atividade hipotensora/anti-hipertensiva e reatividade vascular para diferentes agentes
vasoativos (vasoconstrictores e vasodilatadores), através de uma análise comparativa
em diferentes modelos de animais normotensos e hipertensos.
ASPECTOS QUÍMICOS
Nome:
COMPOSTO
MESOIÔNICO
2-(4-CLOROFENIL)-3-METIL-4-(4-
METOXIFENIL)-1; 3-TIAZÓLIO-5-TIOLATO
Nome simplificado: Composto Mesoiônico CMMTT
Fórmula Molecular: C17 H14 Cl N O S2
Estrutura Molecular:
SH
S
S1
CH3
5
4
2
3
O
+
N
CH3
Cl
Massa Molecular: 347,8
Aspecto: pó cristalino vermelho
Quadro 1: Aspectos químicos que caracterizam o composto mesoiônico CMMTT
2 OBJETIVOS
2.1 Geral
Avaliar os efeitos cardiovasculares induzidos por CMMTT em animais
normotensos e hipertensos, procurando elucidar o possível mecanismo de ação
implicado nas respostas biológicas observadas, utilizando para este fim uma
abordagem in vivo e in vitro.
2.2 Específicos
Caracterizar o efeito relaxante de CMMTT em aorta torácica isolada de rato
normotensos, através de medidas de tensão isométrica;
Investigar o envolvimento das prostaciclinas e dos receptores muscarínicos na
resposta relaxante induzida pelo CMMTT em artéria mesentérica superior isolada
de ratos normotensos;
Identificar a participação dos EDHF na resposta relaxante atribuída ao CMMTT
em artéria mesentérica superior isolada de rato normotenso;
Avaliar a participação dos canais para K+ no efeito relaxante em artéria
mesentérica superior isolada de rato normotenso, induzido pelo CMMTT;
Registrar o efeito relaxante de CMMTT em artéria mesentérica isolada de ratos
hipertensos;
Demonstrar o efeito agudo do CMMTT sobre a reatividade vascular para FEN,
NPS e ACh em animais normotensos e hipertensos L-NAME;
Estudar o efeito do CMMTT sobre a liberação de NOx em artéria mesentérica
superior isolada de rato através de medidas de quimioluminescência;
Inferir sobre a influência do CMMTT na mobilização do Ca2+ em células primárias
endoteliais de artéria mesentérica de rato, utilizando técnica bioquímica com
sonda de fluorecência FURA-2/AM;
Analisar a toxicidade aguda de CMMTT em camundongos;
Investigar os efeitos de CMMTT sobre a pressão arterial (PA) e freqüência
cardíaca (FC) em ratos normotensos (LL, SHAM) e hipertensos (LH, 2R1C e LNAME) não-anestesiados.
3 MATERIAL
3.1 Animais
Para a realização do presente estudo foram utilizados ratos Wistar (Rattus
norvegicus) (Figura 2A), ratos Sprague Dawley de Lyon (geneticamente modificados)
(Figura 2B), sendo todos machos, com idade entre 10-14 semanas, pesando entre 250300 gramas e camundongo (Mus musculus) machos e fêmeas, com idade de 10-12
semanas, pesando aproximadamente 25-35 gramas. Os animais foram provenientes do
Biotério Prof. Thomas George do Laboratório de Tecnologia Farmacêutica Prof. Delby
Fernandes Medeiros da Universidade Federal da Paraíba (LTF/UFPB). Para os estudos
bioquímicos foram utilizados apenas ratos Wistar (Rattus norvegicus), sendo estes
provenientes do Biotério Central da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da
Universidade de São Paulo (USP). Todos os animais foram mantidos sob condições
controladas de temperatura (21 ± 1ºC) e submetidos a um ciclo claro-escuro de 12
horas (fase clara de 6 - 18 horas), tendo livre acesso à alimentação (ração Purina) e
água.
A
B
Figura 2: Ratos Wistar (Rattus norvegicus) (A) e Ratos Sprague Dawley (B)
Fonte: Próprio autor (A) e (www.scanbur.eu/images/products/Lab_animals_sp, 25/12/2007) (B).
3.2 Preparação da solução-estoque de CMMTT
O CMMTT (Quadro1) é uma substância de MM = 347,88, que foi sintetizada e
disponibilizada pelos professores Dr. Bruno Farias Lira e Dr. Petrônio Athayde-Filho,
ambos do Laboratório de Química pertencente ao Laboratório de Tecnologia
Farmacêutica Prof. Delby Fernandes Medeiros da Universidade Federal da Paraíba
(LTF/UFPB).
O composto mesoiônico foi solubilizado em cremofor (0,5%) e diluído em água
destilada até a concentração de 10–1 M (solução-estoque) e conservado em
temperatura controlada e ao abrigo da luz. Imediatamente antes da realização de cada
protocolo experimental, o composto era diluído em água destilada, para experimentos in
vitro, ou em solução salina, para experimentos in vivo, até as concentrações desejadas.
3.3 Drogas utilizadas
Durante a realização dos experimentos, foram utilizadas as drogas que estão
elencadas na tabela 1:
Tabela 1: Drogas utilizadas durante a realização dos protocolos experimentais in vivo e
in vitro
SUBSTÂNCIA
LABORATÓRIO
Tiopental sódico
Cristália
Sal sódico de heparina
Roche
Oxitetraciclina
Bayer
Nitroprussiato de sódico (NPS)
Sigma
Cloridrato de L (-) fenilefrina (FEN)
Sigma
Cloridrato de acetilcolina (ACh)
Sigma
NG-nitro-L-arginina-metil éster (L-NAME)
Sigma
Sulfato de atropina
Sigma
Indometacina (Indo)
Sigma
Apamina
RBI
Caribdotoxina (ChTX)
Sigma
Brometo de tetraetilamônio (TEA)
Sigma
4-aminopiridina (4-AP)
Sigma
glibenclamida
Sigma
Dimetil sulfoxido (DMSO)
Sigma
Cremofor
Sigma
Albumina sérica bovina (BSA)
Sigma
Poli-L-lisina
Sigma
Fura-2/AM
Sigma
Para a preparação das soluções estoques, a indometacina foi dissolvida
juntamente com bicarbonato de sódio (NaHCO3) a 5% em água destilada e as demais
drogas foram dissolvidas somente em água destilada. Todas as soluções foram
mantidas a 0ºC. Para a preparação das concentrações desejadas, as drogas foram
diluídas em água destilada, para os experimentos in vitro, ou em solução salina a 0,9%
para os experimentos in vivo. O cremofor, DMSO ou NaHCO3 nas concentrações
utilizadas neste estudo, não apresentaram efeito sobre as preparações utilizadas
(dados não mostrados).
3.4 Soluções Fisiológicas
Cada protocolo experimental foi realizado na presença de soluções fisiológicas
específica para cada órgão ou condição experimental estudada. As tabelas mostram
detalhadamente os sais utilizados (Tabela 2), bem como a composição das soluções
utilizadas nas preparações de anéis da artéria mesentérica superior (Tabela 3 e 4) ou
aorta isolada de rato (Tabela 5) e nas preparações de células endoteliais de artéria
mesentérica superior ou aorta isolada de rato (Tabela 6).
Tabela 2: Relação dos sais para a preparação das soluções fisiológicas utilizadas nos
experimentos in vivo e in vitro
SUBSTÂNCIA
LABORATÓRIO
Cloreto de sódio (NaCl),
MERCK
Cloreto de potássio (KCl),
MERCK
Cloreto de cálcio di-hidratado (CaCl2.2H2O),
MERCK
Sulfato de magnésio hepta-hidratado (MgSO4.7H2O),
MERCK
Cloreto de magnésio hexa-hidratado (MgCl2.6H2O),
MERCK
Glicose (C6H12O6),
MERCK
Bicarbonato de sódio (NaHCO3),
VETEC
Fosfato de sódio mono-hidratado (NaH2PO4.H2O)
VETEC
Fosfato de potássio (KH2PO4)
VETEC
Cloreto de bário (BaCl2)
Sigma
EDTA
Sigma
HEPES
USB corporation
Tabela 3: Composição da solução de Tyrode (pH=7,4)
SUBSTÂNCIA
NaCl
CONCENTRAÇÃO (mM)
158,3
KCl
4,0
CaCl2
2,0
MgCl2
1,05
NaHCO3
10,0
NaH2PO4
0,42
Glicose
5,6
Fonte: TANAKA et al., 1999.
Tabela 4: Composição da solução de Tyrode despolarizante com KCl à 20mM (pH=7,4)
SUBSTÂNCIA
CONCENTRAÇÃO (mM)
NaCl
142,3
KCl
20,0
CaCl2
2,0
MgCl2
1,05
NaHCO3
10,0
NaH2PO4
0,42
Glicose
5,6
Fonte: Adaptado de TANAKA et al., 1999.
Tabela 5: Composição da solução de Krebs Henseleit (pH=7,4)
SUBSTÂNCIA
CONCENTRAÇÃO (mM)
NaCl
188
KCl
4,55
CaCl2
5,7
MgCl2
1,10
NaHCO3
25,0
NaH2PO4
2,52
Glicose
Fonte: OLIVEIRA et al., 1996.
11
Tabela 6: Composição da solução de Krebs despolarizante com KCl à 80mM (pH=7,4)
SUBSTÂNCIA
NaCl
KCl
CONCENTRAÇÃO (mM)
112,1
80,0
CaCl2
5,7
MgCl2
1,10
NaHCO3
25,0
KH2PO4
2,52
Glicose
11
Fonte: Adaptado de OLIVEIRA et al., 1996.
Tabela 7: Composição da solução de Hanks (pH=7,4)
SUBSTÂNCIA
CONCENTRAÇÃO (mM)
NaCl
140
KCl
5,4
CaCl2
1,6
KH2PO4
0,44
NaH2PO4
0,42
EDTA
0,03
HEPES
5,0
NaHCO3
4,17
Glicose
5,5
Fonte: DIAS et al., 2007.
4 METODOLOGIA
Para o desenvolvimento deste estudo foram empregadas abordagens in vivo e in
vitro. Nos ensaios farmacológicos in vivo, foram usados animais não anestesiados
normotensos e hipertensos. Os modelos de hipertensão utilizados foram: a hipertensão
renovascular (2R1C), a induzida pela administração crônica de L-NAME e os animais
hipertensos geneticamente modificados de Lyon. Nos ensaios farmacológicos in vitro,
utilizou-se órgãos isolados e cultura primária de célula endotelial de artéria mesentérica
e aorta de rato. Os ensaios bioquímicos de medida da concentração do oxido nítrico
(NOx), bem como a medida de cálcio intracelular foram realizadas em colaboração com
a Universidade de São Paulo – Faculdade de Farmácia e Medicina de Ribeirão Preto.
Este trabalho foi executado de acordo com padrões éticos seguidos e aprovado
pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal (CEPA) do LTF/UFPB, parecer NO. 0211/06.
4.1 Ensaios Farmacológicos in vivo
4.1.1 Triagem farmacológica comportamental e toxicidade aguda do CMMTT em
camundongos
Nesta triagem, foram estabelecidos critérios comparativos para uma variedade
de comportamentos tipicamente animais. Por se tratar de uma observação comparativa
(grupo controle vs o grupo que recebe tratamento), a ocorrência de possíveis alterações
comportamentais em decorrência de tratamentos é possível inferir uma relação com
atividade no sistema nervoso central (SNC) (ALMEIDA et al., 1999).
A triagem farmacológica experimental foi realizada de forma preliminar, para
investigar se a administração de doses elevadas do CMMTT exerceria efeito lesivo e/ou
letal sobre os animais, permitindo a realização de estudos cardiovasculares in vivo com
doses mais seguras, bem como avaliar a influência do composto mesoiônico sobre
alguns comportamentos característicos exibido pelos animais e consequentemente sua
ação central.
Para a realização dos experimentos grupos de camundongos, machos e fêmeas,
em igual proporção, foram colocados em número de 03 por caixa (n=6 para cada grupo
estudado) e administrada na veia caudal (via i.v.) as doses de 50 e 100 mg/Kg do
CMMTT, separadamente para os animais experimentais e para o grupo controle o
veículo utilizado nas preparações. Os animais ficaram sob observação durante 4 horas
no primeiro dia e possíveis alterações ocorridas foram registradas de acordo com a
metodologia descrita por Almeida et al., (1999) e durante 48 horas subseqüente ao
teste, verificava-se a cada 12 horas as possíveis mortes. Passado um período de 14
dias da data do experimento, os animais foram eutanasiados para retirada e avaliação
da toxicidade aguda dos principais órgãos vitais.
4.1.2 Indução da hipertensão renovascular - 2R1C
Para obtenção de ratos com hipertensão renovascular do tipo dois rins e um clip
(2R-1C), foi utilizada a técnica descrita por Goldblatt et al., 1934 e adaptada por
Shaffenburg (1959) para animais de pequeno porte. Um grupo com 06 animais,
pesando aproximadamente 150 g, foi anestesiado com tiopental sódico (45 mg/Kg i.p.),
em seguida foi feita uma laparotomia mediana longitudinal para a exposição do
pedículo renal esquerdo, dessecação e colocação de um clip de prata (2x5 mm) com
0,2 mm de abertura, em torno da artéria renal esquerda. Em seguida, foi realizada uma
sutura da cavidade abdominal e o clip era mantido por um período de quatro semanas.
Outro grupo de animais, também passou pelo mesmo procedimento cirúrgico,
com o objetivo de submeter o animal ao mesmo estresse cirúrgico, no entanto, não era
inserido o clip de prata na artéria renal. Este grupo funciona como o grupo controle e
são denominados animais SHAM.
Todos os animais receberam um tratamento com antibiótico, para diminuir o risco
de infecção, numa dose única de 0,1 mL/100 g de peso do animal da suspensão de
Oxitetraciclina (Bayer) por via intramuscular para animais de pequeno porte.
A instalação da hipertensão era acompanhada semanalmente pelo registro da
pressão arterial caudal dos animais pelo método indireto de plestimografia de cauda
(Figura 3), em ratos acordados e imobilizados, por um período de quatro semanas. Os
ratos SHAM apresentaram uma pressão arterial média variando entre 110 – 120 mmHg
e os animais 2R1C foram considerados hipertensos quando os valores da pressão
arterial média foram superiores a 150 mmHg. Após a 4º semana de registro indireto da
pressão arterial, os animais em estudo foram submetidos a um novo procedimento
cirúrgico para implantação de cateteres e medida direta da pressão arterial.
Figura 3: Pletismógrafo de cauda para medida indireta da pressão arterial em ratos.
4.1.3 Indução da hipertensão L-NAME - 7 dias
Este modelo de hipertensão foi produzido com administração sub-crônica de um
inibidor da sintase do oxido nítrico, enzima esta, que catalisa a produção de um
importante mediador intracelular, o óxido nítrico (NO). Ratos pesando aproximadamente
250 g foram tratados com NG-Nitro-L-Arginina Metil Éster (L-NAME), diluído em água
(0,5 mg/mL) ao longo de 7 dias, com livre acesso a comida e controlando-se
rigorosamente a ingesta da água + L-NAME, substituindo a preparação a cada dois dias
(VASQUEZ; ARAUJO, 1995), tempo suficiente para produção da hipertensão arterial
que foi monitorada com o método indireto de plestimografia de cauda (Figura 3). O
registro da PAS foi realizada em ratos acordados porém imobilizados. O peso dos
animais foi medido, a cada 2 dias. Após o 6º dia de tratamento sub-crônico com LNAME e registro indireto da pressão arterial, os animais em estudo foram submetidos a
um procedimento cirúrgico para medida direta da pressão arterial.
4.1.4 Medida direta da pressão arterial (PA) e freqüência cardíaca (FC) em ratos
normotensos e hipertensos.
Todos os animais (normotensos e hipertensos) foram anestesiados com tiopental
sódico (45 mg/kg, i.p.), e cateteres de polietileno (PE), um segmento de PE-10
(diâmetro interno e externo de 0,28 e 0,61 mm, respectivamente), soldado a um
segmento de PE-50 (diâmetro interno e externo de 0,58 e 0,96 mm, respectivamente),
foram implantados na aorta abdominal e na veia cava inferior, via artéria e veia femoral
esquerdas, respectivamente. Após a inserção e fixação, os cateteres foram tunelizados
subcutaneamente e exteriorizados através de uma incisão na região cervical posterior
do animal (scapulae) (OLIVEIRA et al., 1996).
A pressão arterial (PA) e freqüência cardíaca (FC) foram medidas 24 h após o
procedimento cirúrgico pela conexão do cateter arterial a um transdutor de pressão précalibrado (Statham P23 ID; Gould, Cleveland, OH, EUA) acoplado a um amplificador
(Modelo TBM-4M, WPI, Sarasota, FL, EUA) e conectado a um micro-computador
equipado com placa conversora analógico-digital (CIO-DAS16/JR, Computer Boards,
Inc., Mansfield, MA, EUA) e com o programa CVMS (WPI, Sarasota, FL, EUA) (Figura
4). A freqüência escolhida para amostragem dos dados foi de 500 Hz. Para cada ciclo
cardíaco, o computador calculava a pressão arterial sistólica, diastólica e média, e o
intervalo de pulso (referido como freqüência cardíaca). O cateter venoso foi implantado
para a administração das drogas.
Como a anestesia modifica os níveis de PA e FC e altera o funcionamento dos
principais sistemas envolvidos na regulação da PA (FLUCKIGER et, al., 1985;
DORWARD et al., 1985; KORNER et, al., 1968; WHITE; MCRITCHIE, 1973; ZIMPFER
et al., 1982), foi utilizada a metodologia de medida da PA, 24h após a administração da
anestesia, em animais acordados, com livre movimentação e sem influência do estresse
cirúrgico nos parâmetros cardiovasculares (SMITH; HUTCHINS, 1980; FLUCKIGER et
al., 1985).
Figura 4: Sistema de aquisição de dados de pressão arterial e freqüência cardíaca em
ratos
4.2 Ensaios Farmacológicos in vitro
4.2.1 Preparações de anéis de aorta torácica isolada de rato
Os ratos após serem eutanasiados, foi realizada uma incisão na caixa torácica
do animal para retirada da aorta torácica (OLIVEIRA et al., 1996). Anéis aórticos (3-4
mm) eram cuidadosamente dissecados dos tecidos conectivos e adiposos. Os anéis
eram mantidos em cubas de vidro contendo 10 mL de solução de Kreb’s Henseleit, a
37º C e gaseificada com uma mistura carbogênica de 95 % de O2 e 5 % de CO2. Os
anéis eram suspensos por meio de duas hastes de platina inseridas no lúmen da aorta
e fixadas ao transdutor de força isométrica (UGO BASILE, 7004, Itália) (Figura 5). Cada
anel foi submetido a uma tensão inicial constante de 2 g por um período de 60 minutos
de estabilização. Durante este tempo, o meio nutritivo foi trocado a cada 15 minutos
para prevenir a interferência de metabólitos (ALTURA; ALTURA, 1970).
Após o período de estabilização era induzida uma contração com a solução
despolarizante de KCl 80 mM e após a lavagem uma segunda contração tônica era
induzida pela administração de FEN 1 µM, para verificação da presença do endotélio
funcional. A presença de endotélio funcional foi verificada pelo relaxamento dos anéis
após adição de 10 µM de ACh. Foram considerados com endotélio, os anéis com
relaxamento superior a 70 % sobre a pré-contração com FEN. Já os anéis com
relaxamentos inferiores a 10 %, foram considerados sem endotélio (FURCHGOTT;
ZAWADZKI, 1980). Anéis com relaxamentos entre 10 e 70 % foram desprezados dos
protocolos experimentais. Uma terceira contração era induzida e o CMMTT (10-14 a 10-5
M) era adicionado cumulativamente. A porcentagem de relaxamento foi determinada
considerando que a contração induzida por FEN corresponde a 100 % e que a tensão
de repouso é igual a 0 %.
4.2.2 Preparações de anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato
Os ratos foram eutanasiados por deslocamento cervical seguida por secção dos
vasos cervicais. Através de uma incisão no abdome do animal, retirava-se a artéria
mesentérica superior. Anéis do primeiro segmento da artéria (1 - 2 mm) foram obtidos
livres de tecido conectivo e adiposo. Os anéis eram mantidos em cubas de vidro
contendo 10 mL de solução de Tyrode, a 37º C e gaseificada com uma mistura
carbogênica de 95 % de O2 e 5 % de CO2. Os anéis eram suspensos por linhas de
algodão fixadas a um transdutor de força acoplado a um sistema de aquisição (Miobath4, WPI, Sarasota, EUA) para o registro das tensões isométricas (Figura 5). Cada anel
foi submetido a uma tensão constante de 0,75 g por um período de 60 minutos de
estabilização. Durante este tempo, o meio nutritivo foi trocado a cada 15 minutos para
prevenir a interferência de metabólitos (ALTURA; ALTURA, 1970).
Duas contrações tônicas submáximas a felinefrina (FEN) 10 µM, as quais se
estabilizam em torno de 25 minutos, foram registradas. A presença de endotélio
funcional foi verificada pelo relaxamento dos anéis após adição de 10 µM de acetilcolina
(ACh). Foram considerados com endotélio (E+), os anéis com relaxamento superior a
80 % sobre a pré-contração com FEN (adaptado devido a significativa dependência do
endotélio vascular para a resposta induzida pelo CMMTT). Já os anéis com
relaxamentos inferiores a 10 %, foram considerados sem endotélio (E-) e a remoção do
mesmo era obtido pelo leve atrito mecânico entre as paredes internas do vaso com uma
haste de metal (FURCHGOTT; ZAWADZKI, 1980). Anéis com relaxamentos entre 10 e
70 % foram desprezados dos protocolos experimentais.
Uma terceira contração era induzida e o CMMTT (10-14 a 10-6 M) era adicionado
cumulativamente. A porcentagem de relaxamento foi determinada considerando que a
contração induzida por FEN corresponde a 100 % e que a tensão de repouso é igual a
0 %.
Figura 5: Sistema de aquisição de dados para órgão isolado.
4.2.3 Experimentos Bioquímicos
4.2.3.1 Preparação e carregamento de células endoteliais de artéria mesentérica
superior isolada de rato
4.2.3.1.1 Preparação das lamínulas
Em fluxo laminar, as lamínulas foram higienizadas com álcool 70% e expostas à
luz UV por 20 minutos. Em seguida foram adicionados 100 µL da solução (1/10) de poliL-lisina sobre as lamínulas, para adesão celular. Após 10 minutos o excesso foi
aspirado e as lamínulas permaneceram em fluxo laminar até a completa secagem.
4.2.3.1.2 Isolamento e cultura de células endoteliais de artéria mesentérica
superior torácica de rato
Os isolamentos das células endoteliais de mesentérica de rato foram realizados
de acordo com o método descrito por Hirano et al., (1993). Os ratos foram eutanasiados
por concussão cerebral seguida por secção dos vasos cervicais. Através de uma
incisão no abdome do animal, as artérias mesentérica superior foi retirada e isolada,
conforme descrito no item 4.2.1. Segmentos da artéria mesentérica de ratos foram
mantidos em solução de Hanks. Em seguida, foi seccionado ao meio, e seu interior foi
atritado mecanicamente com instrumento plástico semelhante a um pequeno “rodo”. As
células endoteliais ficaram dispersas no meio nutritivo de Hanks que foi centrifugado
por 5 minutos a 2000 rpm (Figura 6). O sobrenadante foi descartado e as células foram
cultivadas em lamínulas de 32 mm de diâmetro acondicionadas em placas de Petri. No
centro de cada lamínula foi semeado 200 µL da suspensão de células e mantidas em
estufa com atmosfera de CO2 5 % a 37 ºC, durante 4 horas para sedimentação e
adesão das células endoteliais antes de realizar o experimento.
4.2.3.2 Carregamento das células com a sonda de fluorescência Fura-2/AM
A medida da concentração citoplasmática de cálcio ([Ca+2]c) foi efetuada com o
indicador fluorescente de Ca+2, Fura-2, na forma acetoximetil éster (Fura-2/AM). Fura-2/AM é
um derivado do Fura-2, que tem 5 grupos acetoximetil éster ligados aos grupos COO- da
molécula de Fura-2, por ligações éster. Esta molécula é bastante hidrofóbica passando
facilmente através da membrana plasmática. Uma vez dentro das células, esterases
citoplasmáticas clivam os grupamentos acetoximetil da molécula de Fura-2, resultando em
um componente que é altamente carregado e que não pode cruzar outras membranas de
organelas intracelulares, ficando assim retida no citoplasma ligada com uma alta e específica
afinidade aos íons Ca+2 (GRYNKIEWICZ et al. 1985).
A solução estoque de Fura-2/AM 10 mM (dissolvida em dimetilsufóxido) foi diluída (1
µL) em 25 µL de BSA (albumina sérica bovina) 25 % em solução aquosa e sonicado por 2
minutos. A seguir, a solução contendo Fura-2/AM foi adicionada à solução de Hanks
contendo uma concentração suficiente de Ca2+ 1,6 mM e BSA (Fração V) 0,1 %, em
quantidade suficiente para 1 mL, resultando numa concentração final de 5 µM, sonicada por
mais 3 minutos. Este procedimento favorece a incorporação da sonda quando em contato
com a membrana citoplasmática.
As células aderidas em lamínulas foram então incubadas com 1 mL de solução de
Fura-2/AM (5 µM) em estufa com atmosfera de 5 % CO2 e temperatura de 37 ºC durante 40
minutos, sob proteção da luz, para o carregamento das células com a sonda fluorescente.
Após o período de carregamento, a lamínula foi montada em câmara aquecida à 37
ºC e as células foram imersas com solução de Hanks.
A câmara contendo as células estava acoplada a um microscópio invertido, Nikon
Diaphot D104B, equipado para epifluorescência e focalizadas com objetiva de fluorescência
e imersão a óleo com aumento de 40 vezes (Nikon Flúor) (Figura 6). Foram utilizadas células
que apresentaram intensidade de fluorescência acima de 4x105 contagens.
Figura 6: Aparato utilizado para medida de cálcio intracelular.
4.2.3.3 Determinação das concentrações de NOx
Inicialmente, todo material utilizado foi higienizado com álcool 70 %, colocado na
câmara de fluxo laminar e exposto à luz UV por 20 minutos. Em seguida, a artéria
mesentérica superior e a aorta torácica isolada de rato foram removidas como acima
mencionados, seccionada em anéis e colocadas em placas de 12 poços contendo
solução de Tyrode com volume de 0,7 ml/poço, e colocada na estufa de CO2 a 37 ºC
por um período de estabilização de 40 minutos. Após período de incubação com as
respectivas drogas, o meio de cada poço foi coletado e usado para determinação de
NOx.
Os níveis totais de NOx no meio foi determinada usando o sistema Sievers
Instrumentes, modelo NOA 280i (Figura 7). A solução saturada de cloreto de vanadium
(VCl3) em 1 M HCl foi adicionada à cuba e borbulhado ozônio a uma temperatura de 90
ºC. O sistema foi refrigerado com água através de um condensador. Vapores de HCl
foram neutralizados pelo borbulhamento de 1 M NaOH. A taxa de fluxo gasoso dentro
do aparelho foi controlada por uma válvula de pressão ajustada quando necessária e a
uma pressão constante 6 torr. Em seguida, foram injetados dentro da cuba os
reagentes (VCl3 e HCl), que converteram NOxs a NO, o qual foi detectado pela
quimioluminescência induzida por ozônio. Concentrações de NOx foram calculadas a
partir de uma curva-padrão para o nitrato de sódio. Ao final de cada experimento, os
anéis foram pesados.
Figura 7: Aparato utilizado para medida de NOx (NOA, 280i)
4.3 Protocolos experimentais in vitro
4.3.1 Curva concentração-resposta para o composto mesoiônico CMMTT em
anéis de aorta torácica isolada de rato normotenso
Após um período de estabilização de 60 minutos, foi induzida uma contração
com KCl 80 mM com intuito de ativar a maquinaria contrátil do órgão. Após a lavagem e
retorno dos valores basais, foi induzida uma nova contração com FEN e
sequencialmente adicionada a ACh (10µM) para verificar a presença do endotélio
vascular. Uma nova contração de magnitude similar foi induzida, e sobre a fase tônica e
estável (25 minutos) desta contração, concentrações crescentes do CMMTT (10-14 a 10-
6
M) foram adicionadas a cuba de maneira cumulativa, tanto em anéis com endotélio
intacto (controle) como na ausência do endotélio (Figura 8).
A
CMMTT
(10-14 – 10-6 M)
ACh (10 µM)
Lavagem
Anéis com
endotélio (E+)
?
Lavagem
KCl 80 mM
FEN (1 µM)
FEN (1 µM)
B
CMMTT
(10-14 – 10-6 M)
ACh (10 µM)
Lavagem
Lavagem
?
Anéis sem
endotélio (E-)
FEN (1 µM)
Tensão (g)
KCl 80 mM
FEN ( 1 µM)
Tempo (s)
Figura 8: Representação esquemática do protocolo experimental para avaliação da
presença (A) ou ausencia (B) do endotélio funcional em anéis de aorta torácica de rato.
4.3.2 Curva concentração-resposta para o composto mesoiônico CMMTT em
anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato normotenso e hipertenso (LNAME)
Após um período de estabilização de 60 minutos, foram induzidas três
contrações similares com FEN (10 µM). A presença do endotélio vascular foi verificada
pela contração induzida por 10 µM de FEN seguida da administração de ACh 10µM.
Uma nova contração de magnitude similar foi induzida, e sobre a fase tônica e estável
(25 minutos) desta contração concentrações crescentes do composto mesoiônico
CMMTT (10-14 a 10-6 M) foram adicionadas a cuba de maneira cumulativa, tanto em
anéis com endotélio intacto (controle) como na ausência do endotélio (Figura 9). Os
antogonistas ou bloqueadores foram administrados para realização dos protocolos
experimentais, antes de induzir a última contração, aguardando um período necessário
para a atividade dos mesmos (30 minutos). É importante salientar que não houve
diferença significante (p<0,05) entre as amplitudes de contração com FEN (10 µM) para
os anéis com endotélio funcional e para os anéis sem endotélio funcional, bem como na
presença dos bloqueadores (dados não mostrados, para p<0,05). Os valores de Emax e
pD2 foram obtidos, quando necessário, como descrito no item 4.6.
Em todos os experimentos foi mantido um anel controle para observar se o órgão
relaxava espontaneamente, fato que não foi evidenciado, visto que todos os anéis
permaneceram contraídos por todo período experimental.
A
ACh (10 µM)
CMMTT
(10-14 – 10-6 M)
Lavagem
Anéis com
endotélio
(E+)
?
Lavagem
FEN (10 µM)
FEN ( 10 µM)
FEN (10 µM)
CMMTT
(10-14 – 10-6 M)
ACh (10 µM)
B
Lavagem
Lavagem
Anéis sem
endotélio
(E-)
FEN (10 µM)
Tensão (g)
FEN (10 µM)
?
FEN ( 10 µM)
Tempo (s)
Figura 9: Representação esquemática do protocolo experimental para avaliação da
presença (A) ou ausência (B) do endotélio funcional em anéis de artéria mesentérica
superior isolada de rato.
4.3.3 Avaliação da participação do fator hiperpolarizante derivado do endotélio
funcional (EDHF) na resposta relaxante induzida por CMMTT em anéis de artéria
mesentérica superior isolada de rato normotenso
Após o período de estabilização e a verificação da integridade do endotélio,
como descrito no item 4.3.2, as preparações foram incubadas com caribdotoxina (ChTX
– 100 nM), um bloqueador dos canais para potássio ativados por cálcio de alta (BKCa2+)
e intermediaria (IKCa2+) condutância, e apamina (100 nM), um bloqueador dos canais
para potássio ativados por cálcio de baixa condutância (SKCa2+), ambos na mesma
preparação são capazes de inibir a resposta vascular atribuída ao EDHF (GHISDAL;
MOREL, 2001; ANSELM et al., 2007). Após 30 minutos, foi induzida uma nova
contração tônica com FEN (10 µM) e em seguida, uma curva concentração-resposta
para o CMMTT foi obtida (Figura 10).
A resposta obtida após a adição dos inibidores foi comparada com a resposta
obtida na ausência dos mesmos. O valor de Emáx foi obtido como descrito no item 4.6.
CMMTT
(10 -14 -10 6 M)
ACh (10 µM)
Anéis com endotélio
vascular
(E+)
?
Lavagem
Tensão (g)
FEN (10 µM)
ChTX + apamina
30 min.
FEN (10 µM)
Tempo (s)
Figura 10: Representação esquemática do protocolo experimental para avaliação da
participação do EDHF na resposta vasorelaxante induzida por CMMTT em anéis de
artéria mesentérica superior isolada de rato.
4.3.4 Verificação da participação dos metabólitos da via da ciclooxigenase e
receptores muscarínicos na resposta relaxante induzida pelo CMMTT em anéis de
artéria mesentérica superior isolada de rato normotenso
Após o período de estabilização e a verificação da integridade do endotélio,
como descrito no item 4.3.2, as preparações foram incubadas com indometacina (1
µM), um inibidor não-seletivo da ciclooxigenase (COX) (CLARK; FUCHS, 1997), e
atropina (1 nM) (SHIRAKI et al., 2001), um antagonista não-seletivo dos receptores
muscarínicos. Após 30 minutos, foi induzida uma nova contração tônica com FEN (10
µM) e em seguida, uma curva concentração-resposta para CMMTT foi obtida (Figura
11). A resposta obtida após a adição de indometacina e atropina foi comparada com a
resposta obtida na ausência do bloqueador (controle). O valor de Emáx foi obtido como
descrito no item 4.6.
CMMTT
(10 -14 -10 6 M)
ACh (10 µM)
Anéis com endotélio
vascular
(E+)
Lavagem
Tensão (g)
FEN (10 µM)
?
Indometacina +
atropina
30 min.
FEN (10 µM)
Tempo (s)
Figura 11: Representação esquemática do protocolo experimental para avaliação da
participação dos metabólitos derivados da via da COX e receptores muscarínicos na
resposta vasorelaxante induzida por CMMTT em anéis de artéria mesentérica superior
isolada de rato.
4.3.5 Verificação da participação de canais para K+ na resposta relaxante induzida
por CMMTT em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato normotenso
Após o período de estabilização e a verificação da integridade do endotélio como
descrito no item 4.3.2, a solução de Tyrode da cuba foi trocada pela solução
despolarizante de KCl 20 mM (Tabela 3) e as preparações permaneciam nesta solução
até o final do experimento. Este procedimento impede parcialmente o efluxo de K+ e
atenua relaxamentos mediados por abertura de canais para K+ (CAMPBELL; HARDER,
1999; CLARK; FUCHS, 1997). Decorridos 30 min da troca, foi induzida uma nova
contração tônica com FEN (10 µM) e, em seguida, uma curva concentração-resposta
para o CMMTT foi obtida (Figura 12). A resposta para o CMMTT observada na
presença de KCl 20 mM foi comparada com a resposta obtida na ausência do mesmo
(controle). O valore de Emax (efeito máximo) foi obtido, como descrito no item 4.6.
CMMTT
(10 -14 -10 6 M)
ACh (10 µM)
Anéis com endotélio
vascular
(E+)
Lavagem
Tensão (g)
FEN (10 µM)
?
Troca do líquido por
KCl 20 mM
30 min.
FEN (10 µM)
Tempo (s)
Figura 12: Representação esquemática do protocolo experimental para avaliação da
participação de canais para K+ na resposta vasorelaxante induzida por CMMTT em
anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato.
4.3.6 Avaliação da participação dos diferentes canais para K+ na resposta
relaxante induzida por CMMTT em anéis de artéria mesentérica superior isolada
de rato normotenso
Após o período de estabilização e a verificação da presença do endotélio, como
descrito no item 4.3.2, as preparações foram incubadas separadamente com
tetraetilamônio (TEA – 1 mM), bloqueador seletivo dos canais para K+ sensíveis ao Ca2+
de grande condutância (BKCa2+) (COX et. al., 2002), glibenclamida (GLIB – 10 µM), um
bloqueador seletivo de canais para K+ sensíveis ao ATP (KATP) (WANG et al., 2007), 4aminopiridina 1 mM, bloqueador seletivo dos canais para K sensível a voltagem (Kv)
(GHISDAL; MOREL, 2001) e BaCl2 (30 µM), bloqueador dos canais para K+ retificador
de entrada (EDWARDS et al., 1998; KAWABATA et al., 2004), permanecendo até o
final do experimento. Após 30 min, foi induzida uma nova contração tônica com FEN
(10 µM) e, em seguida, uma curva concentração-resposta para o CMMTT foi obtida
(Figura 13). As respostas obtidas após a adição dos bloqueadores foram comparadas
com a resposta obtida na ausência do mesmo (controle). Os valores de Emax (efeito
máximo) e/ou a pD2 foram obtidos, quando necessário, como descrito no item 4.6.
CMMTT
(10 -14 -10 6 M)
ACh (10 µM)
Anéis com endotélio
vascular
(E+)
Lavagem
?
Tensão (g)
FEN (10 µM)
TEA ou
BaCl2 ou
4-AP ou
glibenclamida
30 min.
FEN (10 µM)
Tempo (s)
Figura 13: Representação esquemática do protocolo experimental para avaliação da
participação dos subtipos de canais para K+ na resposta vasorelaxante induzida por
CMMTT em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato.
4.3.7 Investigação do efeito agudo do CMMTT sobre a reatividade vascular para a
FEN em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato normotenso e
hipertenso (L-NAME)
Após um período de 60 minutos de estabilização das preparações, e verificação
da presença ou ausência do endotélio funcional, como descrito no item 4.3.2, foi
induzida uma contração cumulativa com FEN (10-9 a 10-5 M) (Figura 8) e o efeito
vasoconstrictor foi avaliado tanto para animais normotensos quanto em animais
hipertensos (TASATARGIL et al., 2004). Após a lavagem e retorno dos níveis basais, os
anéis foram incubados por CMMTT (10-6 M). Decorrido 30 minutos da incubação, foi
induzida uma nova curva concentração-resposta para a FEN (10-9 a 10-5 M) para se
investigar a influência do CMMTT sobre a resposta vasoconstrictora em anéis com o
endotélio funcional intacto e com o endotélio removido (Figura 14). Após a obtenção
das curvas concentração-resposta, foram analisados os valores de Emax das curvas
individuais na presença e na ausência do CMMTT, como descrito no item 4.6.
A
ACh (10 µM)
Lavagem
?
Anéis com
endotélio
(E+)
?
Lavagem
CMMTT (10-6 M)
FEN (10-9 – 10-5 M)
FEN (10µ
µM)
B
FEN (10 -9 – 10-5 M)
ACh (10 µM)
Lavagem
Anéis sem
endotélio
(E-)
Lavagem
?
?
CMMTT (10-6 M)
FEN (10 -9 – 10-5 M)
FEN (10 -9 – 10-5 M)
Tensão (g)
FEN (10 µM)
Tempo (s)
Figura 14: Representação esquemática do protocolo experimental para avaliação da
reatividade vascular aguda para a FEN em anéis de artéria mesentérica superior, com
(A) e sem (B) endotélio funcional, de rato normotenso e hipertenso (L-NAME) na
presença e ausência do CMMTT.
4.3.8 Investigação do efeito agudo do CMMTT sobre a reatividade vascular para
diferentes agentes vasodilatadoras (ACh e NPS), em anéis de artéria mesentérica
superior isolada de rato normotenso e hipertenso (L-NAME)
Após um período de 60 minutos de estabilização das preparações, e verificação
da presença ou ausência do endotélio funcional como descrito no item 4.3.2, foi
induzida uma contração cumulativa com FEN (10-9 a 10-5 M) (Figura 8) e após o período
de estabilização (25 minutos) o efeito relaxante foi avaliado tanto para animais
normotensos como em animais hipertensos L-NAME. Concentrações crescentes de
ACh (3 x 10-10 – 10-5 M) foram adicionadas cumulativamente aos anéis de artéria
mesentérica pré-contraídos com endotélio funcional íntegro, e para os anéis com o
endotélio funcional removido, o agente vasodilatador utilizado foi o NPS (10-9 – 10-4 M)
(TASATARGIL et al., 2004). Após a lavagem e retorno dos níveis basais, os anéis foram
incubados com CMMTT (10-6 M) e decorridos 30 minutos da incubação, foi induzida
uma nova contração cumulativa para a FEN (10-9 a 10-5 M) e as contrações foram
ajustadas para obtenção de contrações de magnitude semelhante as anteriores. Na
presença do CMMTT e nos anéis pré-contraídos com FEN uma nova curva
concentração-resposta para a ACh ou NPS foi induzida (Figura 15). Após a obtenção
das curvas concentração-resposta, quando necessário foram analisados os valores de
pD2 e Emax das curvas individuais na presença e na ausência do CMMTT, como descrito
no item 4.6.
A
ACh (10 µM)
Anéis com endotélio
vascular
(E+)
ACh (3x10-10 – 10-5 M)
ACh (3x10-10 – 10-5 M)
?
?
Lavagem
CMMTT (10-6 M)
FEN (10-9 – 10-5 M)
FEN (10µ
µM)
FEN (10 -9 – 10-5 M)
B
ACh (10 µM)
NPS (10-9 – 10-4 M)
NPS (10-9 – 10-4 M)
Lavagem
Anéis sem endotélio
vascular
(E-)
?
?
Tensão (g)
CMMTT (10-6 M)
FEN (10 µM)
FEN (10 -9 – 10-5 M)
FEN (10 -9 – 10-5 M)
Tempo (s)
Figura 15: Representação esquemática do protocolo experimental para avaliação da reatividade vascular aguda para
a ACh em anéis de artéria mesentérica superior com endotélio funcional (A) e para o NPS em anéis sem endotélio
funcional (B), de rato normotenso e hipertenso (L-NAME) na presença e ausência do CMMTT.
4.4 Protocolos experimentais bioquímicos
4.4.1 Avaliação do aumento de cálcio intracelular na resposta induzida pelo
CMMTT em cultura primária de células endoteliais de artéria mesentérica e aorta
torácica isolada de rato
Após o carregamento, a célula foi selecionada e os valores basais foram obtidos
por 5 minutos. Em seguida, CMMTT (10-6 M) foi adicionada por 10 minutos, e a
fluorescência foi registrada por todo o período experimental. O mesmo protocolo
experimental foi realizado usando acetilcolina (10-5 M) como controle positivo e DMSO,
como controle negativo.
4.4.2 Avaliação da liberação de NOx induzida pelo CMMTT em anéis de artéria
mesentérica e aorta torácica superior isoladas de rato normotenso
Após o período de estabilização de 40 minutos na estufa de CO2 a 37 ºC, os
anéis de artéria mesentérica superior e aorta torácica isoladas de rato, contidos na
placa de 12 poços, foram incubados com DMSO, como controle negativo, em alguns
poços e CMMTT em outros poços, ambos por 30 minutos. Em seguida, o meio de cada
poço foi coletado e usado para determinação de NOx como descrito acima. Este mesmo
procedimento também foi realizado induzindo-se uma pré-contração com a FEN (10
µM) e decorrido 20 minutos foi administrado ACh (10 µM), como controle positivo,
DMSO, como controle negativo e o CMMTT, substância teste, sendo todas estas
substâncias adicionadas em diferentes poços e permaneceram por 30 minutos. Em
seguida, o meio de cada poço foi coletado e usado para determinação de NOx como
descrito anteriormente. O mesmo protocolo experimental foi realizado após remoção do
endotélio funcional.
4.5 Protocolos experimentais in vivo
4.5.1 Procedimento experimental para triagem comportamental e avaliação da
toxicidade aguda do CMMTT em camundongos
Para a realização dos experimentos foram formados grupos com 03 animais por
caixa, sendo separados por gênero. Tanto os machos quanto as fêmeas (total de 06 por
grupo) receberam o CMMTT na veia caudal (via i.v.) nas doses de 50 e 100 mg/Kg.
Estes animais foram comparados com animais do grupo controle que receberem salina
+ cremofor, veículo utilizado para dissolução do CMMTT utilizado nas preparações. Os
camundongos permaneceram por um período de observação de 4 horas de duração
sob a observação de dois avaliadores e as alterações ocorridas foram registradas de
acordo com a metodologia descrita por Almeida et al., (1999).
Após o período das 4 horas (0, 30, 60, 120, 180 e 240 minutos) de observação,
os animais voltavam a receber água e comida e durante as 48 horas subseqüente ao
teste, verificava-se a cada 12 horas as possíveis mortes. Passado um período de 14
dias da data do experimento, os animais eram eutanasiados por deslocamento cervical
seguida por secção dos vasos cervicais e os principais órgãos vitais (coração, rins,
fígado e pulmão) dos animais eram removidos para avaliação macroscópica
morfométrica e pesados (Figura 16). O peso dos órgãos era corrigido pelo peso do
animal para se observar possíveis alterações em relação ao grupo controle.
Figura 16: Representação esquemática do protocolo experimental após a
administração de CMMTT (50 e 100 mg/Kg i.v.) para avaliação da atividade
comportamental (A) e da letalidade e toxicidade dos órgãos vitais (B) em camundongos
machos e fêmeas.
4.5.2 Efeito de CMMTT sobre a pressão arterial média (PAM) e freqüência cardíaca
(FC) em ratos normotensos (LL, SHAM) e hipertensos (LH, 2R1C e L-NAME)
Após transcorrido o período para se alcançar as condições ideais do estudo, ou
seja 4 semanas para os 2R1C e SHAM, e 7 dias para os L-NAME (como descrito nos
itens 4.1.2 e 4.1.3, respectivamente) e 24 horas após a realizado o procedimento de
implantação dos cateteres para medida da PAM (item 4.1.4), os animais normotensos e
hipertensos foram mantidos em aclimatação por no mínimo 30 minutos para
estabilização
dos
parâmetros
hemodinâmicos.
Em
seguida,
foi
administrado
nitroprussiato de sódio (NPS) (10 µg/Kg, i.v.) para verificar a eficácia da implantação do
cateter. Após 15 minutos, doses crescentes de CMMTT (0,01; 0,05; 0,1; 0,5; 1; e 5
mg/Kg, i.v.) foram administradas randomicamente com intervalos de tempo suficiente
para que a PAM e FC retornassem aos seus valores basais (Figura 17). Os valores de
PAM e FC foram computados antes (valores da linha de base) e imediatamente após a
administração do composto mesoiônico em estudo.
Figura 17: Representação esquemática do protocolo experimental para registro da
pressão arterial média (PAM) e frequencia cardíaca (FC) em rato normotensos e
hipertensos acordados, não-anestesiados e com livre movimentação.
4.6 Análise Estatística
Os valores estão expressos como média ± erro padrão da média (e.p.m.). Para
análise estatística foram utilizados os testes t de Student e análise de variância “oneway” (ANOVA) seguido de teste de Bonferroni, onde os valores de p < 0,05 foram
considerados significantes.
Para estudar o efeito vasorelaxante induzido pelo CMMTT os parâmetros
farmacológicos foram analisados: o Emáx (resposta máximo induzida pela substância)
e/ou pD2 (-log CE50). Os valores de pD2 foram obtidos através de regressão não-linear
das curvas individuais traçadas a partir dos valores percentuais das respostas induzidas
por CMMTT para cada experimento, enquanto que os valores de resposta máxima
(Emax), para cada protocolo experimental, estão expressos como percentagem do
relaxamento máximo do tônus induzido por FEN (100 %) ou em da contração
induzida pela FEN. Para todos estes procedimentos foi utilizado o programa estatístico
GraphPad Prism versão 3.04.
5 RESULTADOS
Durante a triagem farmacológica, foi evidenciado que o tempo necessário para
que fossem obtidas as respostas máximas nas preparações funcionais de artéria
mesentérica superior e aorta torácica, para cada concentração de CMMTT, variou entre
8 a 10 minutos No final dos experimentos, a reversão do relaxamento produzido por
CMMTT foi conseguido após 20 minutos de sua retirada das cubas por meio da troca de
solução fisiológica respectiva e verificação da reposta do tecido a FEN (10 µM) que
induziu contrações de magnitude similar às induzidas antes da adição do composto
mesoiônico estudado. A reversibilidade foi sistematicamente observada, para assegurar
que o relaxamento não foi devido a alterações na contractilidade e responsividade do
tecido. A adição de CMMTT não foi capaz de modificar, de maneira significativa, o tônus
basal em anéis com endotélio funcional intacto (dados não mostrados).
Adicionalmente, nas mesmas condições experimentais, foi adicionado o veículo
(cremofor ou DMSO) nas mesmas proporções utilizadas para solubilizar o composto
mesoiônico CMMTT e não foi constatada atividade estatisticamente significante destes
veículos (dados não mostrados).
5.1 Efeitos do CMMTT em anéis de aorta torácica isolada de rato
A administração cumulativa de CMMTT (10-14 – 10-5 M) em anéis de aorta
torácica isolada de ratos, com endotélio funcional íntegro e pré-contraídos com FEN (1
µM), induziu um discreto efeito relaxante com Emax = 39,6 ± 8,1 %. A remoção do
endotélio vascular atenuou significativamente, a resposta relaxante induzida por
CMMTT (Emax = 12,9 ± 5,8 %) (Gráfico 1).
0
*
% Relaxamento
Endotélio preservado
Endotélio ausente
25
50
75
100
-15
-13
-11
-9
-7
-5
Log [CMMTT] M
Gráfico 1: Curvas concentração-resposta para o efeito relaxante induzido pelo CMMTT
(10-14 a 10-5 M) em anéis da artéria de aorta torácica isolada de ratos com endotélio
intacto () ou endotélio ausente (), pré-contraídos com FEN (10 µM). Os valores
estão expressos com média ± e.p.m. de 05 experimentos. *p<0,05 vs endotélio ausente.
5.2 Efeito do CMMTT em anéis de artéria mesentérica isolada de rato hipertenso
(L-NAME)
A administração cumulativa de CMMTT (10-14 – 10-6 M) em anéis da artéria
mesentérica superior isolada de ratos hipertensos (L-NAME), com endotélio funcional
íntegro e pré-contraídos com FEN (10 µM), induziu um relaxamento dependente de
concentração com mesma potência famacológica (pD2 = 10,21 ± 0,11, n=6 e 10,26 ±
0,05; n=17, respectivamente), no entanto a magnitude de efeito máximo dos animais
hipertensos foi significativamente maior na concentração de 10
-6
M quando comparada
aos animais normotensos (Emáx = 95,63 ± 2,80 e 80,8 ± 5,8 respectivamente) (Gráfico
2).
0
Hipe rtenso (L-Name)
% Relaxamento
Normotenso
25
50
*
75
100
-15
-13
-11
-9
-7
-5
Log [CMMTT] M
Gráfico 2: Curvas concentração-resposta para o efeito relaxante induzido pelo CMMTT
(10-14 a 10-5 M) em anéis da artéria mesentérica superior com endotélio intacto, précontraídos com FEN (10 µM) de ratos normotensos (controle) () e hipertensos (LNAME) (). Os valores estão expressos com média ± e.p.m. de 06 experimentos. *
p<0,05 vs normotensos.
5.3 Avaliação da participação do EDHF sobre a resposta relaxante induzida pelo
CMMTT em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato
Na presença de caribdotoxina (ChTX) (100 nM) mais apamina (100 nM), a curva
concentração resposta para o CMMTT (10-14 a 10-6 M) em anéis de artéria mesentérica
superior isolada de rato com endotélio funcional preservado e pré-contraídos com FEN
(10-6 M) não foi alterada quando comparada a curva na ausência dos mesmos (Gráfico
3).
% Relaxamento
0
Endotélio intacto
CTX (100 nM )
+ Apamina (100 nM )
25
50
75
100
-15
-13
-11
-9
-7
-5
Log [CMMTT] M
Gráfico 3: Curvas concentração-resposta para o efeito relaxante induzido pelo CMMTT
(10-14 a 10-6 M) em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato, com do
endotélio funcional, pré-contraídos com FEN (10 µM) na ausência () ou na presença
de ChTX (100 nM) mais apamina (100 nM) (). Os valores estão expressos com média
± e.p.m. de 17 e 04 experimentos, respectivamente.
5.4 Investigação da participação da via da COX e dos receptores muscarínicos
sobre a resposta relaxante induzida pelo CMMTT em anéis de artéria mesentérica
superior isolada de rato
Como mostra o gráfico 4, na presença de indometacina (10 µM) mais atropina (1
nM), concentrações crescentes do CMMTT (10-14 a 10-6 M) foram capazes de induzir
relaxamento dependente de concentração em anéis de artéria mesentérica com
endotélio funcional e pré-contraídas com FEN (10-6 M), cuja potência (pD2 = 10,62 ±
0,35, n = 5) e eficácia (Emax = 73,8 ± 7,8 %) não foi modificado quando comparada a
curva na ausência dos inibidores ou antagonistas (pD2 = 10,26 ± 0,05, n = 17 e Emax =
80,8 ± 4,7) (Gráfico 4).
% Relaxamento
0
Endotélio intacto
Indome tacina (10 µ M )
+ atropina (1 nM )
25
50
75
100
-15
-13
-11
-9
-7
-5
Log [CMMTT] M
Gráfico 4: Curvas concentração-resposta para o efeito relaxante induzido pelo CMMTT
(10-14 a 10-6 M) em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato, com endotélio
funcional, pré-contraídos com FEN (10 µM) na ausência () ou na presença
indometacina (10 µM) mais atropina (1 nM) (). Os valores estão expressos com média
± e.p.m. de 17 e 06 experimentos, respectivamente.
5.5 Influência dos canais para K+ na resposta relaxante induzida por CMMTT em
anéis da artéria mesentérica superior de ratos
A incubação das preparações com KCl 20 mM não alterou significantemente o
tônus basal (dados não mostrados). Nesta condição experimental, a curva
concentração resposta para o CMMTT (10-14 a 10-6 M) em anéis da artéria mesentérica
superior isolada de rato, na presença do endotélio funcional e pré-contraídos com FEN
(10 µM), foi significativamente deslocada para direita com redução do efeito máximo
(Emáx = 29,24 ± 8,40 %; n = 6) quando comparada a curva controle (Emax = 80,8 ± 5,8 %;
n = 17, p<0,0001) (Gráfico 5).
0
*** ***
Endotélio intacto
***
% Relaxamento
*** *** ***
*** ***
***
KCL 20
25
50
75
100
-15
-13
-11
-9
-7
-5
Log [CMMTT] M
Gráfico 5: Curvas concentração-resposta para o efeito vasorelaxante induzido pelo
CMMTT (10-14 a 10-6 M) em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato, com
endotélio funcional, pré-contraídos com FEN (10 µM) na ausência (controle) () ou na
presença de [K+]e = 20 mM ().Os valores estão expressos com média ± e.p.m. de 17 e
06 experimentos, respectivamente. *** p<0,0001 vs endotélio intacto.
5.6 Avaliação da participação dos canais BKCa2+ na resposta relaxante induzida
por CMMTT em anéis mesentéricos de ratos
Na presença de 1mM de TEA, a curva concentração resposta para o CMMTT
(10-14 a 10-6 M), em anéis da artéria mesentérica superior isolada de rato, na presença
do endotélio funcional e pré-contraídos com FEN (10 µM), foi significativamente
atenuado com alterações significativas nos valores de Emax (26,40 ± 4,02 %, n = 9),
quando comparada a curva na ausência do bloqueador (Emax = 80,8 ± 5,8 %; n = 17,
p<0,0001) (Gráfico 6).
0
***
*** ***
*** *** ***
Endotélio intacto
***
% Relaxamento
TEA (1mM )
***
25
***
50
75
100
-15
-13
-11
-9
-7
-5
Log [CMMTT] M
Gráfico 6: Curvas concentração-resposta para o efeito vasorelaxante induzido pelo
CMMTT (10-14 a 10-6 M) em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato, com
endotélio funcional, pré-contraídos com FEN (10 µM) na ausência () ou na presença
de TEA (1 mM) (). Os valores estão expressos com média ± e.p.m. de 17 e 09
experimentos, respectivamente. *** p<0,0001 vs endotélio intacto.
5.7 Influência dos canais para K+ sensíveis a voltagem na resposta relaxante
induzida por CMMTT em anéis mesentéricos de ratos
Como mostra o gráfico 7, na presença de 4-aminopiridina (1 mM), o efeito
relaxante induzidos por CMMTT (10-14 a 10-6 M), foi significativamente atenuado, com
alterações significativas nos valores de efeito máximo (Emax = 12,80 ± 8,94 %, n = 6),
quando comparados aos anéis de artéria mesentérica com endotélio funcional e précontraídos com FEN (10 µM) (Emax = 80,8 ± 5,8 %; n = 17, p<0,0001) (Gráfico 7).
*** *** *** *** *** *** ***
*** ***
0
Endotélio intacto
% Relaxamento
4 AP (1 mM)
25
50
75
100
-15
-13
-11
-9
-7
-5
Log [CMMTT] M
Gráfico 7: Curvas concentração-resposta para o efeito vasorelaxante induzido pelo
CMMTT (10-14 a 10-6 M) em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato, com
endotélio funcional, pré-contraídos com FEN (10 µM) na ausência () ou na presença
de 4-aminopiridina (1 mM) (). Os valores estão expressos com média ± e.p.m. de 17 e
06 experimentos, respectivamente. *** p<0,0001 vs endotélio intacto.
5.8 Influência dos canais para K+ sensíveis a ATP na resposta relaxante induzida
por CMMTT em anéis mesentéricos de ratos
Na presença de glibenclamida (10 µM), a curva concentração resposta para o
CMMTT (10-14 a 10-6 M), em anéis da artéria mesentérica superior isolada de rato, na
presença
do
endotélio
funcional
e
pré-contraídos
com
FEN
(10
µM),
foi
significativamente deslocada para a direita com redução do efeito máximo (Emax = 59,62
± 6,56 %, n = 6) e da potência farmacológica (pD2 = 10,93 ± 0,22), quando comparada a
curva na ausência do bloqueador (pD2 = 10,26 ± 0,05, Emax = 80,8 ± 5,8 %, n = 17, p<
0,05) (Gráfico 8).
0
Endotélio intacto
% Relaxamento
Glibenclamida 10 µ M
25
*
50
*
75
100
-15
-13
-11
-9
-7
-5
Log [CMMTT] M
Gráfico 8: Curvas concentração-resposta para o efeito vasorelaxante induzido pelo
CMMTT (10-14 a 10-6 M) em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato, com
endotélio funcional, pré-contraídos com FEN (10 µM) na ausência () ou na presença
de glibenclamida (10 µM) (). Os valores estão expressos com média ± e.p.m. de 17 e
06 experimentos, respectivamente. * p<0,05 vs endotélio intacto.
5.9 Investigação da influência dos canais KIr na resposta relaxante induzida por
CMMTT em anéis mesentéricos de ratos
Na presença de BaCl2 30µM, o efeito relaxante induzido por CMMTT (10-14 a 10-6
M), foi significativamente deslocado para direita com alterações significativas nos
valores de pD2 (pD2 = 9,13 ± 0,18, p<0,0001), e efeito máximo (Emáx = 56,8 ± 7,12%
p<0,05), quando comparada a curva na ausência do bloqueador (Emax = 80,8 ± 5,8 % e
pD2 = 10,26 ± 0,05; n = 17) (Gráfico 9).
0
**
Endotélio intacto
** **
% Relaxamento
** **
25
Ba Cl2 (30µ
µM )
**
**
**
**
50
75
100
-15
-13
-11
-9
-7
-5
Log [CMMTT] M
Gráfico 9: Curvas concentração-resposta para o efeito vasorelaxante induzido pelo
CMMTT (10-14 a 10-6 M) em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato, com
endotélio funcional, pré-contraídos com FEN (10 µM) na ausência () ou na presença
de BaCl2 (30 µM) (). Os valores estão expressos com média ± e.p.m. de 17 e 06
experimentos, respectivamente. ** p<0,005 vs endotélio intacto.
5.10 Efeito agudo do CMMTT sobre a reatividade vascular para a FEN, dependente
do endotélio funcional, em anéis de artéria mesentérica superior de ratos
normotensos (controle) e hipertensos (L-NAME)
Em ratos normotensos com o endotélio funcional preservado o efeito
vasocontracturante induzido pela FEN (10-9 – 10-5 M) (Emáx = 49 ± 6,24 ) foi
significativamente atenuado na presença do composto mesoiônico CMMTT (10-6 M)
(Emáx = 32,5 ± 8,5), como mostra o gráfico 10 A. Resultados similares foram obtidos
com animais hipertensos L-NAME, onde o CMMTT também foi capaz de atenuar o
efeito vasoconstrictor induzido por contrações crescentes de FEN (10-9 – 10-5 M) (Emáx =
57,5 ± 6,5), quando comparado ao efeito contrátil da FEN na ausência do CMMTT (Emáx
= 91,7 ± 10,7) (Gráfico 10 B). É importante ressaltar que a resposta contrátil induzida
pela FEN apresenta uma maior sensibilidade em animais hipertensos L-NAME (Emáx =
91,7 ± 10,7) quando comparado aos animais normotensos (Emáx = 49 ± 6,24 ).
A
100
FEN
∆ Contração (mg)
FEN + CMMTT
75
50
*
25
*
0
-9
-8
-7
-6
-5
Log [FEN] M
B
*
100
*
FEN
∆ Contração (mg)
FEN + CMMTT
75
*
50
25
0
-9
-8
-7
-6
-5
Log [FEN] M
Gráfico 10: Curvas concentração-resposta para a FEN (10-9 a 10-5 M) em anéis da
artéria mesentérica superior com endotélio intacto de ratos normotensos (A) e
hipertensos (L-NAME) (B). Os valores estão expressos com média ± e.p.m. da de
contração dos valores absolutos de 05 experimentos. * p<0,05 vs controle.
5.11 Efeito agudo do CMMTT sobre a reatividade vascular para a acetilcolina,
dependente do endotélio funcional, em anéis de artéria mesentérica superior de
ratos normotensos (controle) e hipertensos (L-NAME)
Em anéis de artéria mesentérica, com o endotélio funcional preservado, précontraída com FEN (10-9 – 10-5 M) de ratos normotensos, o efeito relaxante induzida
pela ACh (3x10-10 – 10-5 M) (Emáx = 100 ± 5,44 ) manteve-se inalterado quando
comparada ao efeito da ACh na presença do composto mesoiônico CMMTT (10-6 M)
(Emáx = 100 ± 2,89), como mostra o gráfico 11 A. No entanto, nas preparações de
animais hipertensos L-NAME, o efeito relaxante na presença do CMMTT foi deslocado
para a esquerda, com alterações significativas na potência (pD2 = 6,65 ± 0,07) e
eficácia (Emàx = 99,3 ± 4,6 %), quando comparado ao efeito vascular da ACh na
ausência do composto (Emáx = 66,7 ± 10% e pD2 = 5,99 ± 0,03) (Gráfico 11 B). Um fator
interessante nestas condições experimentais é que a ACh demonstra um efeito
relaxante significativamente menor em animais hipertensos L-NAME comparado aos
animais normotensos, na ausência do composto, e este efeito e revertido após a préincubação com o CMMTT.
A 0
ACh
pD2 = 5,71 ± 0,34
Emax = 100 ± 5,44
% Relaxamento
25
CMMTT + ACh
pD2 = 6,67 ± 0,09
Emax = 100 ± 2,89
50
75
100
125
-10
-9
-8
-7
-6
-5
Log [ACh] M
B 0
*
* ** ***
*** ***
***
***
***
25
% Relaxamento
ACh
pD2 = 5,99 ± 0,03 ***
Emax = 66,7±
± 10 ***
***
50
***
CM M TT + ACh
pD2 = 6,65 ± 0,06
Emax = 99,3 ± 4,6
75
100
125
-10
-9
-8
-7
-6
-5
Log [ACh] M
Gráfico 11: Curvas concentração-resposta para a ACh (3x10-10 a 10-5 M) em anéis da
artéria mesentérica superior com endotélio intacto de ratos normotensos (A) e
hipertensos (L-NAME) (B). Os valores estão expressos com média ± e.p.m. de 06
experimentos. * p<0,05, ** p< 0,001 e *** p<0,0001 vs controle.
5.12 Efeito agudo do CMMTT sobre a reatividade vascular para a fenilefrina (FEN),
independente do endotélio funcional, em anéis de artéria mesentérica superior de
ratos normotensos (controle) e hipertensos (L-NAME)
Em ratos normotensos sem o endotélio funcional o efeito contracturante induzido
pela FEN (10-9 – 10-5 M) (Emáx = 39,8 ± 4,5) não foi modificado quando na presença do
composto mesoiônico CMMTT (10-6 M) (Emáx = 37,0 ± 7,2), como mostra o gráfico 12 A.
Resultados similares foram obtidos com animais hipertensos L-NAME, onde o CMMTT
também não foi capaz de alterar o efeito vasoconstrictor induzido por contrações
crescentes de FEN (10-9 – 10-5 M) (Emáx = 62,0 ± 6,1) quando comparado ao efeito
contrátil da FEN na ausência do CMMTT (Emáx = 70,7 ± 5,8) (Gráfico 12 B). Além destes
dados, é importante ressaltar que a resposta contrátil induzida pela FEN apresenta uma
maior sensibilidade, em animais hipertensos L-NAME (Emáx = 70,7 ± 5,8), quando
comparado aos animais normotensos (Emáx = 39,8 ± 4,5 ).
A
FEN
100
FEN + CMMTT
∆ Contração (mg)
75
50
25
0
-9
-8
-7
-6
-5
Log [FEN] M
B
100
FEN
∆ Contração (mg)
FEN + CMMTT
75
50
25
0
-9
-8
-7
-6
-5
Log [FEN] M
Gráfico 12: Curvas concentração-resposta para a FEN (10-9 a 10-5 M) em anéis da
artéria mesentérica superior sem endotélio funcional de ratos normotensos (A) e
hipertensos (L-NAME) (B). Os valores estão expressos com média ± e.p.m. da de
contração dos valores absolutos de 05 experimentos.
5.13 Efeito da reatividade vascular para o nitroprussiato de sódio independente
do endotélio funcional em anéis de artéria mesentérica superior de ratos
normotensos (controle) e hipertensos (L-NAME)
Em anéis de artéria mesentérica, sem o endotélio funcional, pré-contraída com
FEN (10-9 – 10-5 M) de ratos normotensos, o efeito relaxante induzida pelo NPS (10-9 –
10-6 M) manteve-se inalterados quando comparada ao efeito do NPS na presença do
composto mesoiônico CMMTT (10-6 M) atingindo ambos 100% de ralaxamento em
todos os experimentos
(Gráfico 13 A). Resultados similares foram observados nas
mesmas condições experimentais, com animais hipertensos L-NAME, onde o CMMTT
também não foi capaz de alterar o efeito relaxante induzido por contrações crescentes
de NPS, como mostra o gráfico 13 B.
A
0
NPS
CMMTT + NPS
% Relaxamento
25
50
75
100
125
-9
-8
-7
-6
-5
Log [NPS] M
B
0
NPS
CMMTT + NPS
% Relaxamento
25
50
75
100
125
-9
-8
-7
-6
-5
Log [NPS] M
Gráfico 13: Curvas concentração-resposta para o NPS (10-9 a 10-5 M) em anéis da
artéria mesentérica superior sem endotélio funcional de ratos normotensos (A) e
hipertensos (L-NAME) (B). Os valores estão expressos com média ± e.p.m. de 06
experimentos.
5.14 Efeito do CMMTT sobre a mobilização de Ca2+ intracelular em cultura
primária de célula endotelial de artéria mesentérica superior
CMMTT (10-6 M) não foi capaz de promover aumento na concentração
intracelular de Ca2+ em cultura primária de célula endotelial de artéria mesentérica
superior de rato quando comparado ao DMSO, usado como controle negativo para
solubilizar o CMMTT. Entretanto, foi observado aumento da concentração intracelular
de Ca2+ promovido pela ACh (10-5 M), nas mesmas condições experimentais, usada
como controle positivo (Gráfico 14).
∆ Fluorescência
(contagens x 105)
0.075
0.050
Linha de Base
DMSO
CMMTT 10-6 M
ACh 10-5 M
*
0.025
0.000
Gráfico 14: Efeito do CMMTT (10-6 M) e ACh (10-5 M) sobre a mobilização de Ca2+
intracelular em cultura primária de célula endotelial de artéria mesentérica isolada de
rato, após incubação com DMSO, ACh (10-5 M) ou CMMTT (10-6 M) (n=4). * p<0,05 vs
linha de base.
5.15 Efeito do CMMTT sobre a liberação de NOx em artéria mesentérica superior
isolada de rato normotenso
Em anéis de artéria mesentérica, com o endotélio funcional preservado, e sem
pré-contração com FEN (10-5 M) de ratos normotensos, CMMTT (10-6 M) não foi capaz
de promover um aumento na concentração de NOx quando comparado ao DMSO,
usado como controle negativo (dados não mostrados). No entanto, nas condições
experimentais, que os anéis foram pré-contraídos com FEN (10-5 M), CMMTT e (10-6 e
10-5 M) foi capaz de promover um aumento significante na concentração de NOx em
anéis de artéria mesentérica superior com endotélio funcional, quando comparada aos
valores basais e ao DMSO, usado como controle negativo para solubilizar o CMMTT
(Gráfico 15 B). Este efeito foi completamente abolido após a remoção do endotélio
funcional. Resultados similares foram obtidos com a ACh (10 µM), usada como controle
positivo (Gráfico 15).
[NOx] pmoles/
peso úmido (mg)
12
###
***
10
8
6
4
### ###
+++ **
Linha de Base
DMSO + FEN 10-5 M
FEN + ACh 10-5 M
FEN + CMMTT 10-6 M
FEN + CMMTT 10-5 M
2
0
Endotélio
preservado
Endotélio
removido
Gráfico 15: Efeito do CMMTT (10-6 e 10-5 M) sobre a liberação de NOx em artéria
mesentérica superior isolada de rato, pré-contraídos com FEN (10-5 M) antes (valores
basais) e após incubação com DMSO, ACh (10-5 M), ou CMMTT [10-6 e 10-5 M] na
presença do endotélio (após 30 minutos de incubação) ou após a remoção do endotélio
(n=4). ** p<0,001 e *** p<0,0001 vs DMSO + FEN; +++ p<0,0001 vs Linha de Base e
### p<0,0001 vs endotélio removido.
5.16 Efeito do CMMTT sobre a liberação de NOx em aorta torácica isolada de rato
Em anéis de aorta torácica, com o endotélio funcional preservado, e précontração com FEN (10-5 M) de ratos normotensos, CMMTT (10-6 M) não foi capaz de
promover um aumento significativo nas concentrações de NOx durante os dois tempos
estudados (30 e 60 minutos), quando comparada aos valores basais e ao DMSO,
usado como controle negativo para solubilizar o CMMTT (Gráfico 16 A). No entanto, nas
mesmas condições experimentais, a concentração de 10-5 M do CMMTT foi capaz de
aumentar significativamente os níveis de NOx em anéis de aorta torácica nos dois
tempos estudados (Gráfico 16 A e B). Este efeito foi completamente abolido após a
remoção do endotélio funcional (Gráfico 16 C). Resultados obtidos com a ACh (10 µM usada como controle positivo), também demonstrou um aumento significativo para os
anéis com endotélio funcional e abolido na ausência do mesmo (Gráfico 16).
[NOx] pmoles/
peso úmido (mg)
2
Linha de Base
DMSO + FEN 10-5 M
FEN + ACh 10-5 M
FEN + CMMTT 10-6 M
FEN + CMMTT 10-5 M
2
*
+
1
Linha de Base
DMSO + FEN 10-5 M
FEN + ACh 10-5 M
FEN + CMMTT 10-6 M
FEN + CMMTT 10-5 M
B
[NOx] pmoles/
peso úmido (mg)
A
0
***
1
+
0
Após 60 min.
Após 30 min.
C
[NOx] pmoles/
peso úmido (mg)
1.0
Linha de base
DMSO + FEN (10-5 M)
FEN + ACh (10-5 M)
FEN + CMMTT (10-6 M)
FEN + ACh (10-5 M)
FEN + CMMTT (10-6 M)
+
0.5
#
0.0
#
Após 60 minutos
Endotélio
preservado
Endotélio
removido
Gráfico 16: Efeito do CMMTT (10-6 e 10-5 M) sobre a liberação de NOx em anéis de
aorta torácica isolada de rato, pré-contraídos com FEN (10-5 M) antes (valores basais) e
após incubação com DMSO, ACh (10-5 M) ou CMMTT (10-6 e 10-5 M), após 30 (A) e 60
minutos (B) ou após a remoção do endotélio (C) (n=4). * p<0,05 e *** p<0,0001 vs
DMSO + FEN, + p<0,05 vs Linha de Base e # p< 0,05 vs FEN + Ach ou FEN+CMMTT.
5.17 Triagem farmacológica comportamental em camundongos tratados com
CMMTT
A tabela 8 elenca as alterações comportamentais apresentadas pelos
camundongos (machos e fêmeas), tratados com CMMTT (doses de 50 e 100 mg/Kg
i.v.), em relação ao grupo controle. Na dose de 50 mg/Kg os sintomas apresentados
pelos machos, ao longo das 4 horas de observação foram: tremores, ptose, analgesia,
diminuição da ambulação, respiração forçada e constipação, nesta mesma dose as
fêmeas apresentaram ptose, diminuição da ambulação, constipação, respiração
forçada. Enquanto que, na dose de 100mg/Kg os camundongos machos apresentaram
tremores, catatonia, analgesia, diminuição da ambulação, respiração forçada e
constipação
e
as
fêmeas
tremores,
ptose
e
diminuição
da
ambulação.
Interessantemente, a respiração forçada foi o sintoma mais intenso para a dose de
50mg/Kg, durante a primeira hora de observação em ambos os sexos, e para a dose de
100mg/Kg permaneceu alterada durante as quatro horas, apenas para os machos,
apesar do maior índice de letalidade ser entre as fêmeas.
Tabela 8: Alterações comportamentais induzido pelo tratamento agudo da CMMTT
(doses de 50 e 100 mg/Kg i.v.) em camundongos machos e fêmeas (n = 6 por grupo)
Macho
(100mg/Kg)
0
30
60
120
180
240
Ø
+
Ø
Ø
Ø
Ø
Ø
Ø
Ø
Ø
Ø
Ø
Ø
Ø
+
Ø
Ø
Ø
Ø
Ø
Ø
Ø
++
+
+
Ø
Ø
Ø
++
++
Ø
Ø
Ø
Ø
+
+
+
Ø
Ø
0
30
60
120
180
240
Ø
Ø
Ø
Ø
Ø
Ø
Ø
Ø
Ø
Ø
Ø
Ø
Ø
Ø
Ø
Ø
Ø
Ø
Ø
Ø
Ø
Ø
++
++
++
Ø
Ø
Ø
++
+
+
Ø
Ø
Ø
Ø
Ø
Ø
Ø
Ø
0
30
60
120
180
240
Ø
+
Ø
Ø
Ø
Ø
Ø
+
+
+
+
Ø
Ø
+
+
+
+
Ø
Ø
Ø
Ø
Ø
+
+
+
+
+
Ø
++
++
++
++
++
Ø
Ø
Ø
Ø
Ø
Ø
0
30
60
120
180
240
Ø
Ø
+
+
Ø
Ø
Ø
Ø
Ø
Ø
Ø
Ø
Ø
Ø
Ø
Ø
Ø
Ø
Ø
Ø
Ø
Ø
++
++
++
Ø
Ø
Ø
++
+
+
Ø
Ø
Ø
Ø
Ø
Ø
Ø
Ø
Ptose
Respiração
forçada
Fêmea
(100mg/Kg)
Constipação
Macho
(50mg/Kg)
Tempo
Ambulação
Fêmea
(50mg/Kg)
(minutos)
Analgesia
(dose)
Catatonia
Sexo
Tremor
Principais efeitos observados
(Ø) ausência de efeito, (-) efeito diminuído, (+) efeito presente e (++) efeito intenso
5.18 Determinação da toxicidade aguda do CMMTT administrado por ia i.v. em
camundongos
Como mostra a tabela 9, o CMMTT na dose de 100 mg/Kg apresentou um maior
índice de letalidade para os camundongos fêmeas (50 %) comparado aos machos (16,6
%). No entanto na dose de 50 mg/Kg não foi observado nenhuma diferença entre os
sexos. É importante salientar que as doses utilizadas para o estudo de toxicidade foram
10 e 20 vezes maior, respectivamente que a dose utilizada nos experimentos in vivo.
Tabela 9: Percentagem de mortes dos camundongos tratados com CMMTT (n = 6 por
grupo)
Sexo
Via de
administração
Dose
Número de
animais
Número de
mortes
Macho
i.v.
100 mg/Kg
n = 06
n = 01 (16,6%)
Fêmea
i.v.
100 mg/Kg
n = 06
n = 03
Macho
i.v.
50 mg/Kg
n = 06
n = 01 (16,6%)
Fêmea
i.v.
50 mg/Kg
n = 06
n = 01 (16,6%)
(50%)
5.19 Determinação da toxicidade pela pesagem e avaliação macroscópica de
órgãos vitais, após 14 dias da administração aguda de CMMTT
Após 14 dias da administração do CMMTT (50 e 100 mg/Kg i.v.), os órgãos
avaliados não apresentaram nenhuma alteração macroscópica de forma, textura e
coloração dos órgãos (dados não mostrados). Conforme mostra a tabela 10, os
camundongos machos e fêmeas que receberam o tratamento com CMMTT (dose única)
tanto na dose de 50 mg/Kg, quanto na dose de 100mg/Kg, não apresentaram
diferenças significativas em relação ao peso dos órgãos do grupo de animais que não
receberam o tratamento (controle).
Tabela 10: Peso dos órgãos vitais corrigido pelo peso de camundongos (peso do
órgão/peso do animal) machos e fêmeas tratados com CMMTT (doses de 50 e 100
mg/Kg i.v.) (n = 6 por grupo)
50 mg/Kg
Fêmea
Macho
Controle
CMMTT
Controle
4,5± 0,3
4,4± 0,1
6 ± 0,4
Fígado
(mg)
67 ± 0,3
50 ± 3
Rins
(mg)
13 ± 1
10 ± 2
Coração
(mg)
100 mg/Kg
Fêmea
CMMTT
Macho
Controle
CMMTT
Controle
CMMTT
5,7 ± 8
6,6 ± 1
6,4 ± 1
4,2± 0,2
4,9 ± 9
59 ± 2
55 ± 2
66 ± 6
72 ± 5
64 ± 5
59 ± 4
18 ± 4
18 ± 1
14 ± 2
14 ± 3
14 ± 6
13 ± 5
5.20 Efeito do CMMTT sobre a pressão arterial média (PAM) e freqüência cardíaca
(FC) de ratos normotensos e hipertensos (L-NAME)
A administração do CMMTT (0,01; 0,05; 0,1; 0,5; 1 e 5 mg/kg i.v.) em animais
normotensos induziu uma resposta transiente, independente de dose, caracterizada por
hipotensão (PAM (%)= -10,5 ± 2,7; -7,1 ± 0,90; -8,3 ± 2,3; -7 ± 0,90; -8,9 ± 1,3; -5,3 ± 1
mmHg) associada a uma taquicardia (FC (%)= 6,5 ± 4,5; 10 ± 2,5; 10,2 ± 3,10; 12,5 ±
2,9; 8,5 ± 1,3; 10,3 ± 2 bpm). Efeitos similares foram observados nos animais
hipertensos L-NAME (PAM (%) = -6,5 ± 0,5; -10,9 ± 2,0; -12,7 ± 0,9; -11,8 ± 2,8; -16,1 ±
2,7; -14,9 ± 2,6 mmHg) e (FC (%) = 6,5 ± 4,2; 10,0 ± 2,5; 10,2 ± 3,1; 12,5 ± 2,9; 8,5 ±
1,3; 10,3 ± 2,0; 15,9 ± 3,6 bpm). Os valores de PAM dos animais hipertensos foi
potencializada nas concentrações de 1 e 5 mg/Kg, quando comparada com seus
respectivos controles, enquanto que para a FC observou-se uma potencialização do
efeito taquicárdico nas doses de 0,5 e 5mg/Kg (n=6) (Gráfico 17).
Gráfico 17: Valores médios percentuais do efeito da administração aguda de doses
crescentes do composto mesoiônico CMMTT (0,05; 0,01; 0,5; 0,1; 1 e 5 mg/kg, i.v.,
randomicamente) sobre a pressão arterial média (A) e freqüência cardíaca (B) em ratos
normotensos (controle) e hipertensos (L-NAME). Os valores estão expressos como
média ± e.p.m. de 6 experimentos. * p<0,05 e ** p<0,01 vs controle.
5.21 Acompanhamento da instalação da hipertensão pelo registro da Pressão
Arterial Sistólica (PAS) semanal dos animais normotensos (SHAM) e com
hipertensos renovascular (2R-1C)
Os valores da PAS dos animais normotensos (SHAM) e com hipertesão
renovascular (2R-1C) foi acompanhada semanalmente pelo método indireto de
plestimografia de cauda. Os valores médios para os animais SHAM vs 2R1C foram:
PAS = 111,0 ± 0,71 vs 110,6 ± 0,54, para a primeira semana, PAS = 118,1 ± 0,65 vs
146,6 ± 1,0, para a segunda semana, PAS = 124,1 ± 1 vs 183,9 ± 2,1 para a terceira
semana e PAS = 127,4 ± 0,9 vs 203,4 ± 0,78, para a quarta semana. Os valores de
pressão apresentaram diferenças significativas a partir da segunda semana da indução
da hipertensão (n=6) (Gráfico 12).
Pressão Arterial Sistólica
(mmHg)
220
***
190
2R1C
SHAM
***
160
***
130
100
0
1
2
3
4
Semanas
Gráfico 18: Valores médios percentuais da pressão arterial sistólica pela medida de
pressão caudal em animais em ratos normotensos (SHAM) e hipertensos (2R1C). Os
valores estão expressos como média ± e.p.m. de 14 animais por grupo. *** p<0,0001 vs
SHAM.
5.22 Efeito do CMMTT sobre a pressão arterial média (PAM) e freqüência cardíaca
(FC) de ratos normotensos (SHAM) e hipertensos (2R1C)
A administração do CMMTT (0,01; 0,05; 0,1; 0,5; 1 e 5 mg/kg i.v.) em animais
normotensos SHAM induziu uma resposta transiente, independente de dose,
caracterizada por hipotensão (PAM (%) = -8,4 ± 1,5; -6,3 ± 1,1; -8,6 ± 1,7; -7,7 ± 1,3; 12,4 ± 2,2; -5,5 ± 1,3 mmHg) associada a uma taquicardia (FC (%) = 5,4 ± 1,6; 5,0 ±
1,4; 5,3 ± 1,0; 7,1 ± 2,4; 7,0 ± 2,9; 6,2 ± 1,7 bpm) (FC (%). Efeitos similares foram
observados nos animais hipertensos 2R1C (PAM (%) = -9,3 ± 0,8; -8,1 ± 1,0; -9,5 ± 1,5;
-9,2 ± 1,1; -15,9 ± 2,4; -7,9 ± 1,6 mmHg) e (FC (%) = 12,4 ± 2,0; 10,5 ± 2,1; 16,3 ± 2,7;
10,9 ± 2,6; 17,4 ± 2,7; 5,4 ± 0,7 bpm). Os valores de PAM dos animais 2R1C
permaneceram inalterados quando comparada com seus respectivos controles,
enquanto que para a FC observou-se uma potencialização do efeito taquicárdico nas
doses isoladas de 0,01; 0,1 e 1mg/Kg (n=6) (Gráfico 19).
Gráfico 19: Valores médios percentuais do efeito da administração aguda de doses
crescentes do composto mesoiônico CMMTT (0,05; 0,01; 0,5; 0,1; 1 e 5 mg/kg, i.v.,
randomicamente) sobre a pressão arterial média (A) e freqüência cardíaca (B) em ratos
normotensos (SHAM) e hipertensos (2R1C). Os valores estão expressos como média ±
e.p.m. de 6 experimentos. * p<0,05 vs SHAM.
5.23 Efeito do CMMTT sobre a pressão arterial média (PAM) e freqüência cardíaca
(FC) de ratos de Lyon normotensos (LL) e hipertensos (LH)
A administração do CMMTT (0,01; 0,05; 0,1; 0,5; 1 e 5 mg/kg i.v.) em animais LL
induziu uma resposta transiente, independente de dose, caracterizada por hipotensão
(PAM (%)= -6,1 ± 1,6; -6,6 ± 2,2; -7,9 ± 2,1; -7,2 ± 2,4; -4,6 ± 1,0; -5,4 ± 2,1 mmHg)
associada a uma taquicardia (FC (%)= 10,3 ± 2,8; 5,5 ± 2,1; 5,4 ± 1,6; 4,9 ± 1,8; 7,5 ±
3,1; 11,3 ± 2,9 bpm). Efeitos similares foram observados nos animais hipertensos LNAME (PAM (%) = -8,0 ± 1,1; -6,9 ± 1,7; -7,8 ± 1,7; -9,5 ± 1,4; -12,4 ± 2,5; -7,8 ± 1,1
mmHg) e (FC (%) = 4 ± 3,1; 5,4 ± 1,4; 6,8 ± 2,1; 5,5 ± 1,4; 8,2 ± 2,1; 8,5 ± 2,8 bpm). Os
valores de PAM dos animais LH foi potencializada na dose de 1 mg/Kg, quando
comparada com seus respectivos controles, enquanto que para a FC permaneceu
inalterada (n=6) (Gráfico 20).
Gráfico 20: Valores médios percentuais do efeito da administração aguda de doses
crescentes do composto mesoiônico CMMTT (0,05; 0,01; 0,5; 0,1; 1 e 5 mg/kg, i.v.,
randomicamente) sobre a pressão arterial média (A) e freqüência cardíaca (B) em ratos
normotensos (LL) e hipertensos (LH). Os valores estão expressos como média ± e.p.m.
de 6 experimentos. * p<0,05 vs LL.
DISCUSSAO
6 DISCUSSÃO
Diante dos resultados apresentados, foi constatado que a atividade vasorelaxante
do CMMTT apresentou maior potência farmacológica, em artéria mesentérica superior
isolada de rato, quando comparada a aorta de rato. Este efeito é mediado, provavelmente,
pela ativação da enzima eNOS de maneira independente do aumento da [Ca2+]i,
aumentando a liberação de NO e culminando na ativação de canais para K+ e inativação
dos canais para Ca2+ sensíveis a voltagem na membrana plasmática da célula muscular lisa
de artéria mesentérica, induzindo o relaxamento. Além disso, contatou-se a atividade
hipotensora e taquicárdica em ratos normotensos e hipertensos, sendo responsável por
induzir alteração na reatividade vascular para a FEN e ACh, de maneira dependente do
endotélio funcional em animais hipertensos L-NAME.
Os compostos mesoiônicos é uma classe de compostos sintéticos largamente
estudados e reportados na literatura como sendo estruturas químicas que apresentam
uma variedade de atividade biológica comprovada, em diferentes sistemas biológicos,
incluindo o sistema cardiovascular (CORELL et al.,1994). Estudos anteriores realizado
com o CMMTT em ratos normotensos foram constatadas atividades hipotensora e
taquicárdica de maneira independente de dose em ratos normotensos, decorrente de
uma provável diminuição da resistência vascular periférica.
E em anéis de artéria
mesentérica o CMMTT mostrou uma potente atividade vasorelaxante dependente do
endotélio vascular, envolvendo a participação da via L-arginina- NO- GMPc (CAVALCANTE
et al., 2004). No entanto, até o momento, nenhum registro de estudos investigando o efeito
de CMMTT em outro tecido vascular ou em modelos de hipertensão foi evidenciado, fato que
proporcionou aumento no interesse de continuar nas investigações farmacológicas deste
composto inédito.
Furchgott e Zawadzki (1980), foi quem primeiro demonstrou o vasorelaxamento
dependente do endotélio vascular em aorta de coelho, em resposta a ACh.
Posteriormente outros trabalhos na literatura relataram através de estudos in vitro, que
em vasos de grande condutância como a aorta, a ACh é capaz de promover um efeito
vasorelaxante predominantemente mediado pelo NO (FREITAS et al., 2003; NAGAO et
al.,1992; SHIMOKAWA et al., 1996). Baseado neste dados, passou-se a caracterizar o
efeito vasorelaxante do CMMTT em anéis de aorta torácica de rato, visto que o
mecanismo sugerido para o efeito vasorelaxante induzido pelo CMMTT em anéis de
artéria mesentérica foi, majoritariamente, pela ativação da via L-arginina-NO-cGMP
(CAVALCANTE et al., 2004).
Em estudos preliminares foi observado que CMMTT, nas concentrações utilizadas,
induziu um vasorelaxamento discreto em anéis aorta torácica de ratos normotensos, com
endotélio intacto, pré-contraídos com FEN, um agonista α1-adrenérgico, porém o
relaxamento, na ausência do endotélio funcional, foi significativamente abolido. Estes
resultados reforçaram as premissas da necessidade do endotélio funcional integro para que
o CMMTT exerça o seu efeito vasodilatador. Entretanto, o efeito no vaso de condutância
apresentou menor potência farmacológica quando comparados aos resultados anteriormente
obtidos, realizados em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato (CAVALCANTE
et al., 2004).
É importante salientar que as respostas farmacológicas obtidas após administração
de determinadas substâncias podem variar devido a vários fatores, como por exemplo, com
a especificidade desta por determinado sítio de ação, com a densidade da molécula – alvo
sobre a qual age a substância, como também o tecido que a molécula – alvo se encontra.
Em relação às diferenças entre tecidos, os leitos vasculares são diferentes no que diz
respeito à fisiologia, a densidade e tipo de receptores que expressam, bem como a maneira
que responde as várias substâncias (VANHEEL et al., 2000; GURNEY, 1994; COX, 2002;
BYLUND, 1994; INSEL, 1996). Diante destas premissas, foram utilizadas neste estudo,
artérias mesentéricas de rato, como o órgão isolado para investigar o mecanismo de ação do
CMMTT.
O endotélio vascular desempenha um papel fundamental na regulação
do tônus vascular e pressão sangüínea (VANHEEL et al., 2000).
Vários trabalhos na
literatura têm mostrado o importante papel desempenhado pelo endotélio nos relaxamentos
induzidos por uma variedade de substâncias químicas, endógenas e exógenas
(FURCHGOTT; ZAWADZKI, 1980; COHEN; VANHOUTTE, 1995; CHAUHAN et al, 2003).
As células endoteliais, em resposta a uma variedade de estímulos fisiológicos (bradicinina,
acetilcolina, histamina, substância P, estresse de cisalhamento), liberam substâncias ativas
com propriedades vasodilatadoras (VANHEEL et al., 2000).
A vasodilatação regulada pelo endotélio é determinada por três componentes
principais; o NO, as prostaciclinas e o EDHF (MONCADA; VANE, 1979; FÉLÉTOU;
VANHOUTTE, 1988). Dentre estes fatores o NO, sintetizado pela enzima sintase do NO
(NOS), é o principal fator relaxante na maioria dos leitos vasculares (MAYER et al.,
1999) e seu envolvimento no vasorelaxamento induzido pelo CMMTT, nos estudos
prévios, é sugerido como o mecanismo de ação principal, porém faz-se necessário
avaliar a participação de outros EDRFs nesta resposta relaxante dependente de
endotélio (CAVALCANTE, et al., 2004).
Além do NO, outros EDRFs têm sido extensamente estudados (CHAUHAN et
al.,2003). Algumas evidências demonstram que o EDHF apresenta uma pequena
participação no vasorelaxamento dependente do endotélio em vasos de condutância,
sendo responsável por um maior efeito nos vasos de resistência (HWA et al., 1994;
CHAUHAN et al., 2003). Entretanto, sua identidade ainda é bastante controversa.
Alguns trabalhos sugerem alguns candidatos como o íon potássio (EDWARDS et al.,
1998), o ácido epoxieicosatrienóico (EET), um metabólito do ácido araquidônico e
derivado da via do citocromo P450 (GEREMEDHIN et al., 1992; CAMPBELL et al., 1996;
CAMPBELL; HARDER, 1999) e o peróxido de hidrogênio (H2O2), uma forma nãoradicalar de espécies reativa de oxigênio, que pode se produzido pelo endotélio e
células musculares lisas (GRIENDLING et al., 2000).
No entanto, sabe-se que ao ser liberado do endotélio, o EDHF difunde-se para
as células da musculatura lisa (CHEN et al., 1991), ativa canais para K+ aumentando o
efluxo de K+ da célula e hiperpolariza a membrana (CHEN; SUZUKI, 1989), reduzindo o
influxo de Ca2+ através do bloqueio dos canais para Ca+2 sensíveis à voltagem
(GOLDFRAIND; GOVONI, 1995) e diminuindo, portanto, a [Ca+2]i e a fosforilação da
MLC, promovendo assim o relaxamento (REMBOLD, 1996).
Alguns canais para K+ estão implicados neste efeito para diferentes leitos
vasculares, e uma especial atenção está voltada para os canais para K+ ativados por
Ca++, visto que a modulação do fluxo para K+ pela alteração da concentração de K+
extracelular (CHEN, SUZUKI, 1989) ou inibição específica de canais para K+, são
capazes de inibir a resposta atribuída ao EDHF. Os canais SK e IK parecem participar
da resposta vasodilatadora induzida pelo EDHF. A combinação da ChTX e apamina foi
capaz de inibir a vasodilatação endotelial de leitos arteriais induzida por acetilcolina,
substância P, mediada pelo EDHF (BURNHAM et al., 2002; BYCHKOV et al., 2002;
EDWARDS et al., 1999).
Diante destas considerações, foi investigado a influência do EDHF derivado do
endotélio, na resposta vasorelaxante induzida por CMMTT. Para tanto, foram realizados
experimentos com preparações pré-contraídas com FEN 10 µM, na presença de
caribdotoxina (ChTX) (100 nM) mais apamina (100 nM), inibidores da resposta vascular
atribuída ao EDHF (GHISDAL; MOREL, 2001) e nestas condições experimentais os
bloqueadores não foram capazes de alterar a resposta induzida pelo CMMTT,
sugerindo que o EDHF parece não participar no efeito vasodilatador induzido pelo
CMMTT.
Por fim, outro potente vasodilatador tanto dependente quanto independente de
endotélio é a PGI2, (SCHULZ; TRIGGLE, 1994) que participa ativamente no controle
local do tônus vascular. Nos vasos, a PGI2 é formada em células endoteliais vasculares
a partir de um aumento na [Ca2+]i que ativa uma seqüência de reações enzimáticas
iniciada pela fosfolipase A2 (PLA2). Esta enzima degrada fosfolipídeos de membrana, a
fosfatidilcolina, formando o ácido araquidônico (AA), que por sua vez sofre a ação da
ciclooxigenase do tipo 1 (COX1) para formar a PGI2 (SMITH, 1992). Somado a isto, é
conhecido que em muitos leitos vasculares, a estimulação dos receptores muscarínicos
endoteliais produz vasorelaxameto em aorta de coelho e rato via liberação de fatores
relaxantes derivados do endotélio (CHOO et al., 1996; EGLEN et al., 1985). Para
avaliar a hipótese se os metabólitos do ácido araquidônico derivados a partir da via da
ciclooxigenase e a ativação dos receptores muscarínicos poderiam participar do efeito
relaxante induzido por CMMTT, foi utilizada a indometacina (10 µM), inibidor da
ciclooxigenase (COX1) (CLARK; FUCHS, 1997), associada atropina (1 nM), antagonista
dos receptores muscarínicos não-seletivo (100 nM) (SHIRAKI, 2001) e foi evidenciado
que nem os receptores muscarínicos, nem a via da COX1 participa do efeito atribuído
ao CMMTT. Todos estes resultados que investigam da participação da via da COX1,
dos receptores muscarínicos e do EDHF, nos permite sugerir que o NO é o principal
agente vasoativo responsável pelo efeito relaxante mediado pelo composto mesoiônico
CMMTT em artéria mesentérica.
A biossíntese do NO é catalisada pela NOS que é responsável pela oxidação da
L-arginina (L-Arg) a L-citrulina (L-Cit) com geração de NO. Primeiramente, a L-Arg é
hidroxilada ao intermediário L-NG-hidroxiarginina (NOH-L-Arg; também pode agir como
substrato para NOS), através de uma oxidação análoga àquelas catalisadas pelo
citocromo P450 (GRIFFITH et al., 1995; MARLETTA, 1993; ABU-SOUD et al.,1997).
Em seguida, o NOH-L-Arg é convertido em L-Citrulina e NO, envolvendo oxidação pela
perda de um único elétron do NADPH (HEMMENS et al. 1998; LOPEZ-RAMOS et. al.,
2005). Após sua formação pelas células endoteliais (eNOS), o NO difunde-se para o
músculo liso adjacente, devido a suas características lipossolúveis, ativa a ciclase de
guanilil solúvel, levando a um aumento nos níveis intracelulares de GMPc e
conseqüente relaxamento do músculo liso vascular através de um mecanismo mediado
por proteínas cinases dependentes de GMPc (PKG) (IGNARRO et al., 1986).
A meia-vida do NO é muito curta, nitrato, nitrito e outros compostos nitrosilados
(NOxs), que são metabólitos estáveis do NO, são usualmente medidos para determinar
a produção de NO (LÓPEZ-RAMOS et al., 2005).
Para reforçar as evidências funcionais que CMMTT promoveria realmente um
aumento na síntese de NO para induzir seus efeitos relaxantes sobre o sistema
cardiovascular, foi realizado experimentos em anéis de artéria mesentérica superior e
aorta torácica isolada de rato, e mensurado os níveis de NOx como um indício da
produção de NO antes e após a administração do composto mesoiônico, comparado a
resposta obtida após administração da ACh, usada como controle positivo.
Em anéis de artéria mesentérica superior pré contraídos com FEN (10-6 M), o
CMMTT foi capaz de aumentar, de maneira dependente de concentração, os níveis de
NOx,. Interessantemente, na concentração que atingiu o efeito máximo (10-6 M) nos
experimentos funcionais, foi similar à ACh. Estes efeitos foram completamente abolidos
após remoção do endotélio funcional, sugerindo que o aumento dos níveis de NOx
induzidos pela CMMTT e pela ACh são completamente dependentes da presença do
endotélio vascular. Em anéis de aorta torácica foi observado aumento nos níveis de
NOx para a ACh e para o CMMTT na concentração de 10-5 M, nos tempos de 30 e 60
min., porém mesmo nesta concentração o valor da [NOx] pmoles é inferior aos
observados na artéria mesentérica, o aumento nos níveis de NO observados foram
abolidos na ausência do endotélio funcional. Os resultados apresentados corroboram
com os resultados funcionais obtidos para cada vaso especificamente, demonstrando
que o CMMTT, nas concentrações utilizadas, parece exercer uma resposta
farmacológica diferenciada para os diferentes tipos de vasos.
Vários autores têm apresentado evidências acerca do envolvimento direto e
indireto dos canais para K+ na via de sinalização responsável pelo vasorelaxamento
induzido pelo NO (BOLOTINA et al.; 1994; HOMER e WANSTALL, 2000). Para verificar
se os canais para K+ estão sendo ativados pelo NO liberado mediante indução do
CMMTT, experimentos foram realizados na presença de KCl 20 mM, condição esta que
promove um bloqueio parcial do efluxo de K+ por deslocar o potencial de equilíbrio do
K+ (em torno de - 84 mV para - 52 mV) para valores mais próximos do potencial de
repouso dos miócitos (em torno -60 a -40 mV) e atenuando desta forma relaxamentos
mediados pela abertura de canais para K+ (GURNEY, 1994; CLARK e FUCHS, 1997).
O aumento do K+ extracelular de 4 para 20 mM alterou significativamente o
vasorelaxamento dependente de concentração induzido pelo CMMTT, com atenuação
de seu Emax, sugerindo que a resposta relaxante induzida pelo composto mesoiônico
estudado parece envolver a ativação de canais para K+.
Vários subtipos de canais para K+ já foram caracterizados na musculatura lisa
vascular, no entanto, apenas quatro deles parecem estar envolvidos na regulação do
tônus vascular: os sensíveis ao ATP (KATP), os sensíveis ao Ca2+ de grande
condutância (BKCa2+) e de pequena condutância (SKCa2+), e os dependentes de
voltagem (Kv) (ADEAGBO, 1999). Além destes, os canais Kir são canais ativados por
potenciais de membrana e por alteração na concentração do K+ extracelular (QUAYLE,
1993).
Dentre os diferentes tipos de canais, maior ênfase esta voltada para os canais Kv,
alguns membros desta família de canais são chamados também de canais para K+
retificadores de saída, são ativados por despolarização de membrana plasmática e estão
presentes em todas as células musculares lisas. Estes canais são muito importantes na fase
de repolarização do potencial de ação (HILLE, 1992); os BKca são canais ativados por influxo
de Ca2+ (ZHANG et al., 2005), e são ricamente expressos nos miócitos vasculares da
microcirculação (ASANO, MASUZAWA-ITO E MATSUDA, 1993). São ativados por
despolarização do potencial de membrana e por Ca2+ intracelular (FARACI; SOBEY, 1998;
CAI et al., 2007).
Devido à existência destes vários tipos de canais para K+ nas células musculares lisas
e da necessidade de identificar qual subtipo de canal para potássio poderia estar
participando da resposta vasorelaxante, induzida pelo CMMTT. Foram realizados
experimentos para obtenção de curvas concentração-resposta para o composto mesoiônico
após a incubação com 4-AP (1mM), bloqueador dos canais para KV (GHISDAL;
MOREL, 2001), glibenclamida (10 µM), um bloqueador seletivo para KATP (WANG et al,
2007), TEA (1mM), bloqueadores seletivos para BKCa2+ (COX et. al., 2002) e BaCl2, um
bloqueador dos canais retificadores de entrada (EDWARDS et al., 1998; KAWABATA et al.,
2004), separadamente.
Nestes experimentos, a curva concentração-resposta do CMMTT foi deslocada
significativamente para direita apenas na presença do BaCl2 (pD2 = 9,13 ± 0,18), enquanto
que a presença do TEA e 4 AP, separadamente, foi capaz de atenuar significativamente
os relaxamentos induzidos pelo CMMTT com diminuição significativa do efeito máximo
(Emax = 26,40 ± 4,02 e 12,8 ± 8,9, respectivamente) e foi observada nas curvas
concentração-resposta obtidas na presença de glibenclamida, alterações significativas,
apenas nas últimas concentrações. Estes resultados sugerem que o mecanismo de ação do
CMMTT para induzir relaxamento em artéria mesentérica, parece envolver uma via de
sinalização celular que altera a atividade de canais para K+, principalmente canais KV, KIR e
BKCa2+, aumentando o efluxo de K+, resultando em repolarização das células musculares
lisas, fechamento dos canais para Ca2+ sensíveis a voltagem e ativação do trocador
Na+/Ca2+ na membrana. Todos estes eventos levam a uma redução da [Ca2+]i e
vasodilatação.
É importante ressaltar que o NO não apenas pode ser formado nas células
endoteliais, mas
também
nas
células musculares
lisas
vasculares
(SCHINI;
VANHOUTTE et al, 1991) e no Sistema Nervoso Central, assim como no Sistema
Nervoso Autônomo (KLIMASCHEWISKI, et. al., 1992). Embora o papel fisiológico do
NO nestes sítios não esteja completamente elucidado, o NO endógeno pode estar
envolvido na regulação da função do barorreflexo através do seu efeito nos
componentes aferente central ou eferente do arco baroreflexo, sua importância
fisiológica deve-se ao fato do NO poder atuar como um importante segundo mensageiro, ativando ou inibindo diversas moléculas-alvo envolvidas em processos tão
diversos
quanto
à
regulação
do
tônus
vascular,
controle
imunológico
e
neurotransmissão (KUMAGAI, et. al., 1993).
Baseado nestas influências do NO, principalmente sobre a PA e sobre o sistema
nervoso foi realizado um estudo preliminar comportamental, com doses elevadas do
CMMTT, primeiro para caracterizar a toxicidade aguda e segundo para observar de
modo geral as alterações comportamentais provenientes do tratamento do composto
mesoiônico e sua influência central. Neste estudo, nas doses investigadas, foram
observados efeitos sugestivos de uma possível atividade depressora do SNC e com
ação sobre o SNA, principalmente após os 120 minutos seguintes a administração,
devido à apresentação de sintomas como ptose (fechamento da pálpebra do animal),
catatonia, analgesia, diminuição da ambulação, respiração forçada e constipação. Estes
dados sugerem que os camundongos tratados com CMMTT apresentam alterações
comportamentais, sugestivas de atividades, predominantemente, sobre o sistema
autônomo e depressoras do SNC.
Adicionalmente, é necessário ressaltar, que CMMTT possui efeito tóxico
diferente entre camundongos machos e fêmeas, sendo as fêmeas mais sensíveis na
dose de 100mg/Kg e similar entre os sexos na dose de 50 mg/Kg do composto
estudado. Após 14 dias da administração de uma dose de 50 e 100 mg/Kg i.v.. O
CMMTT não causou nenhuma alteração macroscópica nos órgãos vitais estudados e,
devido aos estudos serem realizados em animais macho, é possível inferir que a dose
máxima utilizada nos experimento in vivo (5 mg/Kg), não apresenta risco de toxicidade
para o estudo.
Sequencialmente, iniciou-se a avaliação da atividade anti-hipertensiva do
CMMTT em diferentes modelos de hipertensão tais como: hipertensão L-NAME,
hipertensão renovascular 2R1C e nos ratos hipertensos de Lyon.
A pressão arterial sistólica (PAS) reflete diretamente na proporção das alterações
do débito cardíaco e a pressão arterial diastólica sobre a eficiência do mecanismo
vasodilatador local dos músculos em atividade, que é tanto maior quanto maior for a
densidade capilar local (BARROS NETO et al., 1999). Nos três modelos de hipertensão
e seus respectivos controles o CMMTT promoveu um efeito hipotensor e taquicárdico,
de maneira independente de doses. A atividade anti-hipertensiva foi observada para os
modelos de hipertensão L-NAME, nas últimas doses.
Estudos anteriores utilizando metodologia in vitro mostram que o CMMTT
apresenta um efeito relaxante em artéria mesentérica de ratos (CAVALCANTE et al,
2004), com base nestes dados e com os achados deste trabalho é possível sugerir que
a resposta hipotensora induzida pelo CMMTT nos três modelo experimental, são
similares e parece ser mediada por um efeito vascular, com diminuição da resistência
vascular periférica e consequente diminuição da PA.
Baseados nos resultados obtidos nos ensaios in vitro com artéria mesentérica
superior isolada de rato, caracterizando o envolvimento do NO na resposta
vasorelaxante, foi investigado a suposição de mudanças do efeito vasodilatador do
CMMTT em artérias mesentéricas de ratos com hipertensão NO deficiente (L-NAME),
devido ao efeito potencializado nas últimas doses. E foi observado que, em anéis
mesentéricos com endotélio funcional íntegro e pré-contraídos com FEN (10 µM), o
CMMTT induziu um vasorelaxamento dependente de concentração e com magnitude
de efeito máximo significativamente maior (Emax = 95,63 ± 2,8%). Estes resultados
demonstraram que o CMMTT apresenta, neste modelo de hipertensão, um perfil
farmacológico diferenciado, em concentrações mais elevadas, com maior eficácia
farmacológica em relação aos efeitos apresentados em normotensos, além disso, os
efeitos observados in vivo corroboram positivamente com esta hipótese.
Dados da literatura indicam que a inibição ou a produção deficiente de óxido
nítrico no organismo pode ser responsável por uma série de transformações que atuam
em sinergia com outros fatores de risco cardiovasculares (RAMOS et al, 2006). A
hipertensão L-NAME devido ao efeito prolongado na deficiência contínua da produção
do óxido nítrico pelo endotélio vascular (RIBEIRO et al., 1992), interfere em outros
sistemas como no aumento do tônus simpático (CUNHA et al, 1993), aumento da
atividade do sistema renina-angiotensa (RIBEIRO et al., 1992), aumento das
responsividade vascular a agonistas adrenérgicos (MACLEID, 1982), aumento na
sensibilidade dos canais para cálcio (ABEBE et al., 1990) e aumento do estresse
oxidativo devido ao aumento produção de radicais livres e a diminuição dos sistemas
antioxidante (BAGNES, 1992).
Diante destas constatações e dos resultados anteriormente mencionados,
passou-se a investigar a reatividade vascular sobre o efeito vasopressor da FEN e o
vasorelaxante
do
ACh
e
NPS,
dependente
e
independente
do
endotélio,
respectivamente, em anéis de artéria mesentérica isolada de ratos normotensos e
hipertensos L-NAME, usando para estes estudos a concentração do CMMTT (10-6 M)
que foi capaz de causar alteração na resposta vasorelaxante dos anéis mesentéricos
dos animais hipertensos estudados.
Os resultados apresentados mostraram um aumento significante do efeito
vasopressor da FEN dependente e independente do endotélio em animais hipertensos
em anéis de artéria mesentérica. Estes resultados iniciais estão de acordo com estudos
que demonstram que o aumento dos níveis da pressão sanguínea está associado ao
aumento da reatividade para os α-adrenoceptores, vista em algumas preparações
vasculares como anéis de aorta (OBIEFUNA et al., 1991 a,b) e preparações de leito
mesentérico (SOFOLA et al., 2002). A inibição da NOS, talvez seja suficiente para
modular a resposta contrátil da FEN, visto que o NO é uma substância que modula
negativamente a atividade dos agentes contracturantes (MARIN; SANCHEZ-FERRER,
1990; LUSCHER; TANNER, 1993). Interessantemente, quando as preparações foram
pré-incubadas com o CMMTT o aumento a responsividade vascular para o efeito
vasopressor induzido pela fenilefrina nos animais hipertensos foi atenuado nos anéis
com endotélio intacto, sugerindo que o CMMTT interferi na resposta contrátil induzida
pela FEN nas células do músculo liso vascular.
A importância do endotélio na regulação do tônus e das respostas contráteis do
músculo liso vascular pela liberação de fatores endoteliais em condições basais ou em
resposta a estímulo já é bastante conhecida (FURCHGOTT e VANHOUTTE, 1980;
REES et al., 1989). Diante destas considerações, e adicionado aos dados da
importância do endotélio sobre os efeitos do CMMTT, foi avaliada a influência do
endotélio sobre a resposta contrátil da FEN na presença e ausência do CMMTT, e os
resultados desse estudo demonstraram que em anéis de artéria mesentérica cujo
endotélio funcional foi mecanicamente removido a resposta induzida pela fenilefrina não
mostrou diferença significativa na presença nem na ausência do CMMTT dos animais
normotensos (Emax = 37 ± 7,2 e 39,8 ± 4,5, respectivamente) e hipertensos (Emax = 62 ±
6,1 e 70,7 ± 5,8, respectivamente), reforçando os achados que sugerem que o CMMTT
precisa da integridade endotelial para exercer seus efeitos (CAVALCANTE et al., 2004).
Um resultado interessante é que a sensibilidade de contração para a fenilefrina
dos animais hipertensos em anéis com o endotélio funcional mostra-se maior
comparado aos anéis sem endotélio funcional. Estes resultados estão de acordo com
alguns relatos na literatura que apontam que a liberação de fatores vasoconstrictores
derivados do endotélio pela via da ciclooxigenase, com o envolvimento dos
prostanóides (TXA2, PGH2) no efeito causado pela inibição do NO (ZIYAT et al, 1996),
também são responsáveis pelo desenvolvimento e manutenção da hipertensão e
disfunção vascular (LUSCHER; VANHOUTTE, 1986; Carvalho 1999).
É bem descrito na literatura que doenças cardiovasculares, como a hipertensão,
desencadeiam mudanças estruturais e funcionais nos vasos sanguíneos (COHUET;
STRUIJKER-BOUDIER, 2006) e a integridade das células endoteliais é essencial para o
relaxamento induzido pela acetilcolina (FURCHGOTT; ZAWADZKI, 1980). No estudo da
reatividade para a ACh, os resultados demonstram que o relaxamento dependente do
endotélio vascular foi reduzido em ratos hipertensos (Emax = 66,7 ± 10,3)
quando
comparados aos ratos normotensos (Emax = 100 ± 2,8). O efeito vasorelaxante
dependente do endotélio induzido pela ACh foi significantemente potencializado após à
incubação do CMMTT nos anéis mesentéricos dos animais hipertensos com valores
similares observados nos anéis de artéria mesentérica de animais normotensos (Emax =
99,22 ± 4,6) (dados não mostrados), porém, a pré-incubação com o CMMTT não afeta o
efeito relaxante induzido pela ACh em anéis de artéria mesentérica de ratos
normotensos. Sugerindo que o CMMTT parece modular positivamente o efeito induzido
pela ACh neste modelo de hipertensão. É importante ressaltar que o aumento na
produção do NO ou uma diminuição na degradação do mesmo contribui beneficamente
para este efeito, porém outros estudos são necessário para sugerir o mecanismo pelo
qual o CMMTT exerce este efeito.
Está claro que neste modelo de hipertensão a produção e liberação do NO
parece estar reduzida. Outros estudos reportam que o tratamento crônico de L-NAME
induz um modelo de doença hipertensiva, cuja diminuição da atividade da NOS resulta
na diminuição crônica nos níveis de GMPc nas artérias.(ARNAL et al., 1992). É relatado
também que o tratamento crônico com o L-NAME diminui os níveis de GMPc aórticos,
porém não afeta a habilidade dos vasos em produzir GMPc na estimulação por um
doador do NO (ARNAL, 1992) e os resultados deste trabalho corroboram com estes
dados, visto que o efeito vasorrelaxante independente do endotélio induzido pelo NPS,
um doador de NO que exerce seu efeito pela ativação da guanilato ciclase solúvel e
formação do GMPc, não foi alterado na presença e ausência do CMMTT, apresentando
um perfil semelhante nos animais normotensos e hipertensos. Sugerindo que o CMMTT
não interfere no efeito relaxante induzido pelo NPS, visto que a atividade relaxante do
composto só é observada na presença do endotélio funcional.
Por outro lado, a administração de CMMTT em anéis de artéria mesentérica
superior na ausência de FEN de animais normotensos não foi capaz de aumentar os
níveis de NOx, corroborando com os resultados funcionais, onde foi verificado que
CMMTT (10-6 M) não modifica o tônus basal nestas artérias (dados não mostrados),
como também não potencializa a resposta vasorelaxante induzida pela ACh de animais
normotensos. É relatado na literatura que a liberação de NO no basal é dependente do
nível de tônus vascular (ADEAGBO et. al., 1994).
As células endoteliais são capazes de produzir NO a partir da oxidação de um
dos átomos de nitrogênio guanidinico terminais do aminoácido L-arginina por uma
oxigenase cálcio-calmodulina dependente, a sintase do óxido nítrico endotelial (eNOS)
(PALMER et al., 1988).
A fim de avaliar a hipótese do aumento da [Ca2+]i ser necessária para a ativação
da eNOS na resposta induzida pelo CMMTT foi realizado experimentos bioquímicos
para medida de [Ca2+]i utilizando a sonda de fluorescência Fura-2 AM em cultura
primária de célula endotelial de artéria mesentérica superior de rato, onde pode-se
verificar que o CMMTT não foi capaz de aumentar a concentração de Ca2+ intracelular
de, e que este efeito foi observado pela ACh utilizada como controle positivo. Estes
resultados nos permite propor como possível hipótese para a ativação da eNOS como
passo necessário para observar o efeito induzido pelo CMMTT, uma via independente
do cálcio.
Relatos na literatura afirmam que a eNOS necessita do aumento do cálcio
intracelular para exercer o seu efeito (PALMER et al., 1988; COLLEEN et al.,2000),
entretanto é descrita uma via de sinalização para ativação da eNOS em baixos níveis
de cálcio, que é mediada pela Akt (PKB) que pode fosforilar a eNOS (Ser 1179), por
um mecanismo dependente de PI3 quinase, independente da liberação do cálcio
intracelular, resultando em aumento dos níveis do NO (DAVID et al., 1999; ERIC et al.,
2007). No entanto estudos adicionais são necessários para melhor caracterizar o efeito
do CMMTT sobre a ativação da eNOS e da resposta vasomotora em anéis de artéria
mesentérica de rato.
Por fim, estes resultados em conjunto sugerem que o CMMTT apresenta um
melhor efeito relaxante em anéis de artéria mesentérica de rato de maneira dependente
do endotélio funcional, que envolve liberação de NO, independente do cálcio, e ativação
de canais para K+ (Kv,Kir, KATP e BKCa ). Além disso, o CMMTT parece interferir
significativamente sobre a reatividade vascular, dependente do endotélio em animais
normotensos e hipertensos L-NAME. Este composto apresenta ainda um efeito
hipotensor e taquicárdico, independente de doses, em diferentes modelos de animais
normotensos e hipertensão. No entanto, estudos posteriores serão necessários para
elucidar claramente o mecanismo de ativação da eNOS.
7 CONCLUSÃO
O presente estudo, constatou atividade hipotensora e taquicárdica em diferentes
modelos de animais normotensos e hipertensos, e atividade anti-hipertensiva nos
animais hipertensos L-NAME. Foi demonstrado também, maior potência farmacológica
em artéria mesentérica superior isolada de rato, quando comparada a aorta de rato. Este
efeito na artéria mesentérica foi mediado, provavelmente, pela ativação da enzima eNOS
de maneira independente do aumento da [Ca2+]i, aumentando a liberação de NO e
ativação dos canais para K+ do tipo Kv,Kir, e BKCa2+, e nas maiores concentrações o
KATP, induzindo o relaxamento. Além disso, o CMMTT também foi responsável por induzir
alteração na reatividade vascular para a FEN e ACh, de maneira dependente do
endotélio funcional em animais hipertensos L-NAME.
8 PERSPECTIVAS
1) Investigar o mecanismo molecular de ativação da eNOS induzido pelo CMMTT em
anéis de artéria mesentérica superior de rato normotenso;
2) Avaliar a participação da via akt/eNOS na resposta vasorelaxante induzida pelo
CMMTT em artéria mesentérica superior isolada de rato normotenso;
3) Caracterizar, o mecanismo de ação do efeito vasorelaxante do CMMTT em
animais hipertensos L-NAME;
4) Analisar a influência do CMMTT sobre a atividade da enzima eNOS em artéria
mesentérica de ratos normotensos e hipertensos L-NAME;
5) Investigar o mecanismo molecular envolvido nos efeitos cardiovasculares
induzidos por CMMTT em animais hipertensos;
6) Estudar o efeito crônico do CMMTT em diferentes fases e modelos da hipertensão
arterial;
7) Complementar os estudos farmacológicos de toxicidade e pré-clínicos para melhor
caracterizar os efeitos cardiovasculares.
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