Replicação do DNA Profª Marília Andrighetti Replicação do DNA • Todos os organismos devem duplicar o seu DNA com extrema precisão antes de cada divisão celular; • Mecanismos básicos de replicação: Separação das cadeias de DNA Cópia de cada cadeia que serve como molde Síntese da nova cadeia complementar Replicação semi-conservativa Existem origens de replicação • Se a replicação começasse por um extremo da molécula de DNA e terminasse em outro, estima-se que seria necessário 1 mês para o cromossomo humano se replicar; • No genoma procarioto existem uma origem de replicação; já em células eucariontes existem múltiplas origens de replicação. • Em um cromossomo médio existem, pelo menos 200 origens de replicação; • Unidades de replicação (replicons): início da replicação em várias origens ao longo do genoma. Replicação é bidirecional • Uma vez iniciada a replicação em cada ponto da origem ela se propaga para os dois lados da molécula de DNA até encontrar replicons vizinhos • Replicação bidirecional envolve duas forquilhas de replicação que se locomovem em direções opostas. Replicação é semidescontínua • A polimerização dos desoxirribonucleotídeos na síntese do DNA acontece somente na direção 5’ 3’; • Porém, as duas fitas são antiparalelas.... logo, como ambas as fitas podem ser sintetizadas simultaneamente??? • A cópia da cadeia parental 3’ 5’ pode ser sintetizada continuamente. Essa cadeia filha que avança na direção 5’ 3’ recebe o nome de cadeia líder ou cadeia contínua; • A cadeia parental 5’ 3’ deve ser copiada de forma descontínua, a qual recebe o nome de cadeia retardatária, ou cadeia descontínua. Replicação é semidescontínua • Os fragmentos da cadeia descontínua recebem o nome de fragmentos de Okazaki; • São cadeias curtas: Procariontes: 1000-2000pb; Eucariontes: 200-300pb. Origens de replicação • Locais com sequência específica fácil de separar • Ligam proteínas iniciadoras • Quando acionadas, essas proteínas permitem o início da replicação Origens de replicação Tendem a ser ativadas em grupo, formando unidades de replicação. Replicação • DNA Polimerase • Sentido 5’ → 3’ • Nucleotídeos 3P são adicionados – Liberação de Pirofosfato Micrografia, bolha de replicação Forquilhas de replicação Forquilha de Replicação Primase • Sintetiza um primer de RNA contendo aproximadamente 11 bases; fornece 3’ OH • DNA-polimerase adiciona os nucleotídeos iniciais na origem de replicação dos pequenos fragmentos de Okazaki; Replicação das fitas • Fita líder – Primase age uma vez • Fita retardada – Primase age várias vezes – Fragmentos de Okasaki Direções de replicação na Forquilha Desenovelamento do DNA • Proteínas de ligação a fita simples (SSPs) • DNA helicase – Quebra pontes de H • DNA topoisomerases - Relaxam o estresse contorcional imposto pelo desenrolamento; Forquilha de replicação Polaridade da síntese define fitas líder e retardada (descontínua) DNA polimerase • Enzimas que catalisam a reação de síntese do DNA. • Adiciona nucleotídeos trifosfato à extremidades 3’OH livre. • Alongamento da cadeia de DNA sempre é feito na direção 5’-3’. • Incapaz de fazer DNA do zero (precisa ter extremidade 3’OH livre). • Possui mecanismo de correção de erros (exonuclease 3’-5’) DNA-polimerases - Procariotos Tipo Função DNA Polimerase I Catalisa o crescimento da cadeia no sentido 5’ 3’; Atividade de exonuclease 3’5’ Remove o primer de RNA da fita descontínua. DNA Polimerase II Polimerase alternativa de reparo. DNA Polimerase III Catalisa o crescimento da cadeia no sentido 5’ 3’. É a polimerase primária durante a replicação normal do DNA DNA-polimerases - Eucariotos Tipo Função DNA Polimerase α (alfa) Replicação do cromossomo nuclear (fita descontínua) DNA Polimerase δ (delta) Replicação do filamento contínuo do cromossomo nuclear DNA Polimerase ε (épsilon) Reparo do DNA do cromossomo nuclear DNA Polimerase β (beta) É pequena e atua no reparo de DNA DNA Polimerase γ (gama) Replicação de DNA mitocondrial DNA Replication • DNA Pol precisa de um molde inicial • Primase: gera um molde de RNA complementar • A DNA Pol III agora é capaz de adicionar bases à extremidade 3’OH Eliminação dos fragmentos de Okasaki DNA Pol I Mecanismo da enzima Ligase Visão geral Repare na posição do primer de RNA Reparo pela Polimerase • Mecanismo de verificação (Proof-reading) • DNA-polimerase possui – Uma atividade de polimerização 5’→ 3’ – Uma atividade de exonuclease 3’→ 5’ Reparo pela Polimerase • Mecanismo de verificação (Proof-reading) • DNA-polimerase possui – Uma atividade de polimerização 5’→ 3’ – Uma atividade de exonuclease 3’→ 5’ DNA Repair • Checagem de pareamento incorreto (eucariotos) • Proteínas especiais para reparo do erro E as extremidades dos cromossomos? Ciclo celular • A replicação do DNA é regulada temporalmente • Fase S do ciclo celular • Ciclinas Conclusões • • • • • • • • Replicação semi-conservativa Bolha de replicação avança em duas direções Fita líder e fita retardada Helicases e topoisomerases desenrolam o DNA Primase faz o primer DNA polimerase III, DNA polimerase I DNA ligase Telomerase