XXV CONGRESSO BRASILEIRO DE ZOOTECNIA
ZOOTEC 2015
Dimensões Tecnológicas e Sociais da Zootecnia
Fortaleza – CE, 27 a 29 de maio de 2015
Efeitos do TNF-α sobre a expansão das células do cumulus durante a maturação in vitro de oócitos
bovinos1
Effects of TNF-α on cumulus cells expansion during in vitro maturation of bovine oocyte
Rithiele Dantas dos Santos 2, Anderson Weiny Barbalho Silva3, José Jackson do Nascimento Costa4,
Francisco Taiã Gomes Bezerra5, Joyla Maria Pires Bernardo6, Regislane Pinto Ribeiro7, Ana Kelry Carneiro
Lopes8 e José Roberto Viana Silva9
1
Parte da proposta de doutoramento de Anderson Weiny Barbalho Silva, financiado pelo Conselho Nacional
de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) – Edital 06/2011.
2
Graduando em Zootecnia, Universidade Estadual Vale do Acaraú –UVA, Sobral-CE, Brasil. Bolsista
CNPq/Capes. e-mail: [email protected]
3,4
Doutorando do Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia – Rede Nordeste de Biotecnologia
(RENORBIO), Universidade Federal do Ceará (UFC), Fortaleza-CE, Brasil.
5,6,7,8,9
Núcleo de Biotecnologia de Sobral- NUBIS, Universidade Federal do Ceará (UFC), Sobral-CE, Brasil.
Resumo: Este estudo avaliou a influencia do TNF-α na expansão das células do cumulus e expressão do
RNAm para Has-2 em CCOs bovinos maturados in vitro por 12 e 24 horas. CCOs (n=80) oriundos de
folículos antrais (3-8 mm de diâmetro) foram recuperados, selecionados e cultivados nos seguintes
tratamentos: (I) TCM-199*, e (II) TCM-199* suplementado com 100 ng/mL de TNF-α por 12 e 24 horas a
39°C em 5% CO2. Após 0 (grupo controle), 12 e 24 horas de maturação in vitro (MIV) as células do cumulus
foram removidas do oócito com auxílio do vortex e destinadas a extração de RNA total e síntese de cDNA. A
quantificação do RNAm para Has-2 nas células do cumulus foi realizada por PCR em tempo real. Os estudos
in vitro demonstraram que 100 ng/mL de TNF-α não afeta a expansão das células do cumulus, mas reduz os
níveis de RNAm para Has-2 nestas células após 12 horas de maturação in vitro.
Palavras–chave: bovino, citocina, MIV, RNAm, qPCR
Abstract: This study evaluated the influence of TNF-α in the cumulus cells expansion and in the expression
of mRNA for Has-2 in bovine COCs matured in vitro for 12 and 24 hours. COCs (n = 80) from antral
follicles (3-8 mm in diameter) were recovered, selected and cultured in the following treatments: (I) TCM199*, and (II) TCM-199* supplemented with 100 ng/mL TNF-α for 12 and 24 hours at 39°C in 5% CO2.
After 0 (control group), 12 and 24 hours of in vitro maturation (IVM) cumulus cells were removed from the
oocyte by vortexing for total RNA extraction and cDNA synthesis. Quantification of mRNA for Has-2 in
cumulus cells was performed by real-time PCR. . In vitro studies showed that 100 ng/mL of TNF-α does not
affect the cumulus cells expansion but reduces the levels of mRNA for Has-2 in these cells after 12 hours of
in vitro maturation.
Keywords: bovine, cytokine, IVM, mRNA, qPCR
Introdução
O fator de necrose tumoral-α (TNF-α) é uma citocina com um amplo espectro de bioatividades, e os
seus diferentes efeitos dependem de diferentes vias de sinalização intracelular que podem ser desencadeadas
por dois tipos de específicos de receptores: receptor de tipo 1 (TNFR1) que contém um domínio de morte
intracelular que é necessário para as vias de sinalização associadas com a apoptose e o receptor do tipo 2
(TNFR2) que pode contribuir para a sobrevivência celular sob condições fisiológicas (Sabio & Davis et al.,
2014). A ovulação em mamíferos pode ser considerada uma reação inflamatória e os folículos ovarianos
representam um local de síntese, recepção e ação do fator de necrose tumoral α (TNF-α). Nos folículos préovulatórios, a maturação meiótica dos oócitos é retomada e alcança o estágio de metáfase II, enquanto que as
células de cumulus produzem uma matriz rica em ácido hialurônico (Richards 2005). Muitos genes estão
associados com a formação desta matriz, tais como a ácido hialurônico sintetase-2 (Has-2) e o TNF-α, estes
genes apresentam impacto na expansão das células do cumulus e ovulação, respectivamente (Richards 2005).
As células da granulosa são importantes para o processo de maturação oocitária e, in vivo, o desenvolvimento
folicular, maturação e ovulação só ocorrem de forma bem sucedida quando há uma comunicação entre as
células da granulosa e o oócito (Tangue et al., 2002). Estudos recentes têm demonstrado que, dependendo da
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fase de desenvolvimento, o TNF-α pode regular a diferenciação de células da granulosa (Glister et al. 2014)
ou apoptose. No entanto, a influência do TNF-α durante o cultivo in vitro de CCOs ainda não é clara em
bovinos. Desta forma os objetivos deste estudo foram avaliar a influência do TNF-α na expansão das células
do cumulus e na expressão do RNAm para Has-2 em CCOs bovinos maturados in vitro por 12 e 24 horas.
Material e Métodos
Ovários (n=20) bovinos foram coletados em abatedouros locais e CCOs oriundos de folículos antrais
(3-8 mm de diâmetro) foram recuperados e selecionados sob um microscópio estereoscópico. O meio de
maturação utilizado foi o TCM-199 com sais de Earle e L-glutamina (GibcoLabs, Grand Island, NY, USA)
suplementado com 25 mM de HEPES, 0,2 mM ácido pirúvico, 2,2 mg/mL bicarbonato de sódio, 5,0 µg/mL
LH, 5,0 µg/mL FSH, 0,4% BSA, 100 UI/mL penicilina e 50 µg/mL sulfato de estreptomicina (TCM-199*).
Para avaliar o efeito do TNF-α na expansão das células do cumulus e na expressão gênica, CCOs (n=80)
foram cultivados nos seguintes tratamentos: (I) TCM-199*, e (II) TCM-199* suplementado com 100 ng/mL
de TNF-α por 12 e 24 horas a 39°C em 5% CO2. Os diâmetros dos CCOs foram considerados como média de
duas medições perpendiculares de cada CCO usando um estereomicroscópio (Nikon SMZ 645) com uma
ocular micrométrica (ampliação de 50X). A expansão do cumulus foi calculada pelo diâmetro do CCO na
hora 12 ou 24 menos o diâmetro do CCO na hora 0. Após 0 (grupo controle), 12 e 24 horas de maturação in
vitro (MIV) em TCM-199* sozinho ou suplementado com 100 ng/mL de TNF-α, células do cumulus foram
removidas do oócito com auxílio do vortex e destinadas a extração de RNA total e síntese de cDNA. A
quantificação do RNAm para Has-2 nas células do cumulus foi realizada por PCR em tempo real conduzida
no equipamento Step One Plus (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) com SYBR Green qRT-PCR
SuperMix (Invitrogen) e primers específicos para o gene testado. Os diâmetros médios de CCOs antes e após
o tratamento com TNF-α foram analisados pelos testes de Kruskal-Wallis e Dunn. ANOVA com o pós-teste
de Student Newman Keuls foram utilizados para avaliar o efeito do TNF-α sobre os níveis de RNAm para
Has-2 após a maturação in vitro de CCOs por 12 ou 24 horas. Os resultados foram expressos em média ±
desvio padrão (SD) e as diferenças foram consideradas significativas quando P <0,05.
Resultados e Discussão
Após o período de maturação em ambos os tratamentos, observou-se um aumento progressivo nos
diâmetros de CCOs, mas a presença de TNF-α (100 ng / ml) não afetou a expansão das células do cumulus
(Tabela 1). Em comparação ao grupo controle (TCM-199*), o tratamento in vitro com TNF-α reduziu os
níveis de RNAm para Has-2 nas células do cumulus após 12 horas de maturação in vitro, mas não após 24
horas (Figura 1). Os CCOs cultivados no meio controle por 24 horas apresentaram uma progressiva e
significativa redução na expressão de Has-2 quando comparado a 12 horas de cultivo in vitro (Figura 1).
O ácido hialurônico é um dos principais componentes da matriz extracelular produzido durante a
expansão do cumulus, que é estabilizado por várias proteínas de ligação ao ácido hialurônico, incluindo Has2 que promove sua produção (Salustri et al., 1990). Neste estudo, o TNF-α reduziu os níveis de RNAm para
Has-2 em células do cumulus após 12 horas de maturação in vitro, mas não após 24 horas. No entanto, a
redução na expressão deste gene não interferiu na expansão das células do cumulus ao final do período de
maturação.
Tabelas –
Tabela 1. Diâmetros de CCOs oriundos de folículos ovarianos bovinos (3 a 8 mm de diâmetro) (média ±
SEM) maturados in vitro por 12 e 24 horas em TCM-199 * sozinho ou suplementado com TNF-α (100
ng/mL).
Tratamentos
0h
12 h
A
TCM-199*
385.2 ± 104.3
TNF-α (100 ng/mL)
405.6 ± 116.7A
24 h
B
677.5 ± 178.0C
560.1 ± 144.6B
686.7 ± 211.4C
589.7 ± 279.7
Os dados estão apresentados como médias ± SD. Letras maiúsculas distintas (A / B / C) indicam diferenças
estatisticamente significativas entre os períodos de cultivo dentro do mesmo tratamento (P <0,05).
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Figuras -
Figura 1. Níveis de expressão do RNAm para Has-2 em células do cumulus de bovinos
após 12 e 24 horas de maturação in vitro (média ± SEM) na presença ou
ausência de TNF-α. Letras minúsculas distintas (a/b/c) representam
diferenças significativas após 24 horas de maturação; * Diferenças
significativas entre os tratamentos no mesmo tempo de maturação, P <0,05.
Conclusões
O TNF-α não afeta a expansão das células do cumulus, mas regula a expressão do RNAm para Has-2.
Assim, este trabalho fornece evidências de que na maturação in vitro de CCOs bovinos na presença de TNFα ocorre uma downregulation na expressão de RNAm para Has-2, lançando uma nova perspectiva para se
avaliar a ação deste fator na regulação da expressão gênica e na qualidade de embriões bovinos produzidos in
vitro.
Literatura citada
GLISTER, C; HATZIRODOS, N; HUMMITZSCH, K; KNIGHT, P.G; RODGERS, R.J. The global effect of
follicle-stimulating hormone and tumour necrosis factor alpha on gene expression in cultured bovine ovarian
granulosa cells. BMC Genomics, v.15, p.1-15, 2014.
RICHARDS, J.S. Ovulation: new factors that prepare the oocyte for fertilization. Molecular and Cellular
Endocrinology, v.234, n.1-2, p.75-79, 2005.
SABIO, G; DAVIS R. J. TNF and MAP kinase signalling pathways. Seminars in Immunology, v.26, p.237–
245, 2014.
SALUSTRI, A; YANAGISHITA, M; HASCALL, V.C. Mouse oocytes regulate hyaluronic acid synthesis
and mucification by FSH-stimulated cumulus cells. Developmental Biology. v. 138, p.26-32 1990
TANGUE, S; VAN SOOM, A; NAUWYNCK, H; CORYN, M; DE KRUIF, A. Minireview: functions of the
cumulus oophorus during oocyte maturation, ovulation, and fertilization. Molecular Reproduction and
Development, v. 61, n.3, p.414-424, 2002.
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