(11) (21)
República Federativa do Brasil
PI 0406819-0 A
(22) Data de Depósito: 16/01/2004
(43) Data de Publicação: 27/12/2005
(RPI 1825)
Ministério do Desenvolvimento, Indústria
e do Comércio Exterior
Instituto Nacional da Propriedade Industrial
(54) Titulo: CONJUGADOS OBTIDOS POR AMINAÇÃO
REDUTORA DO POLI-SACARÍDEO CAPSULAR DO
PNEUMOCOCO DE SOROTIPO 5
(30) Prioridade Unionista:
(71) Depositante(s):
(72) Inventor(es):
(74) Procurador:
17/01/2003 FR 03/00488
Sanofi Pasteur (FR)
Noêlle Mistretta, Emilie Danve, Monique Moreau
Andréa Gama Possinhas Tardin
(86) Pedido Internacional:
PCT FR2004/000089 de 16/01/2004
(87) Publicação Internacional:
WO 2004/067574 de 12/08/2004
IB
01
(51) Int. C1 7 .:
CO8B 37/00
A61K 39/09
A61 K 39/385
(57 ) Resumo: "CONJUGADOS OBTIDOS POR AMINAÇÃO REDUTORA
DO POLI-SACAR(DEO CAPSULAR DO PNEUM0b0C0 DE SOROTIPO
5". A invenção tem por objeto conjugados oriundos da aminação redutora
do poli-sacarideo capsular do pneumococo de sorotipo 5. As condições de
aminação redutora se distinguem das condições clássicas pelo fato de
permitirem evitar o aparecimento de um composto, indesejável que é
prejudicial à imunogenecidade dos conjugados. Em espectrometria RMN
do Carbono, esse composto indesejável se caracteriza por um sinal de
ressonância entre 13 e 14 ppm. Os poli-sacarídeos aminados que entram
na produção dos conjugados possuem, portanto, um espectro RMN
Carbono desprovido de sinal de ressonância entre 13 e 15 ppm. As
condições de aminação redutora oferecidas pela invenção são em número
de duas. De acordo com um primeiro processo, a aminação redutora é
conduzida com pH ligeiramente ácido (4-6,5) durante no máximo 4 horas.
De acordo com um segundo processo, o poli-sacarídeo é inteiramente
reduzido, depois fragmentado e enfim submetido a uma aminação redutora
propriamente dita, em condições clássicas ou não. De acordo com o
processo aplicado, a estrutura do poli-sacarídeo aminado pode variar
(conversão ou não do resíduo Sug da unidade repetitiva em quinovosamina
N-acetilada e em fucosamina N-acetilada); mas essas variações, tais como
registradas em espectrometria RMN do Carbono, não têm efeito sobre a
imunogenicidade:
1/42
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CONJUGADOS OBTIDOS POR AMINAÇÃO REDUTORA DO POLI-SACARÍDEO
CAPSULAR DO PNEUMOCOCO DE SOROTIPO 5
A presente invenção tem notadamente por objeto uma
forma aminada particular do poli-sacarídeo capsular do
5 pneumococo tipo 5, os conjugados incorporando essa forma,
assim como os processos de produção que permitem obtê-lo.
O pneumococo (streptococcus pneumoniae)
é uma bactéria
encapsulada Gram-positiva, responsável pelas meningites e
por bacteremias. Ele acarreta também uma grande parte das
10 infecções respiratórias, tais como bronquites, rinites e
otites com complicações tanto no adulto, quanto na criança.
Os pneumococos são divididos em sorotipos, segundo a
estrutura dos poli-sacarídeos que formam a cápsula. A
sorotipagem dos pneumococos é realizada com o auxílio de
15 uma bateria de imuno-soros, cada imuno-soro sendo
específico de um só tipo de poli-sacarídeo capsular. Mais
de 90 sorotipos diferentes, quaisquer patógenos para o
homem, foram recenseados. Os sorotipos 6B, 14, 18C, 19F e
23F são prevalentes nas jovens crianças e são a causa de
20 pneumonias e de otites. Os sorotipos 1 e 5 são mais
freqüentemente encontrados nos países em via de
desenvolvimento do que nos países industrializados.
Vacinas que protegem contra os principais sorotipos
encontrados em clínica humana foram desenvolvidas ou estão
25 em curso de desenvolvimento. Uma vacina que compreende os
poli-sacarídeos capsulares de 23 sorotipos diferentes
responsáveis por 90 % das infecções com pneumococos (1, 2,
3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F,
18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 33F) é eficaz no adulto e na
30 criança de mais de dois anos. Ao contrário, a criança de
•• •.
••
•• •
2/42
menos de dois anos, devido à imaturidade de seu sistema
imunitário, não responde a essa vacina constituída de
antígenos poli-sacarídicos T-independentes. Esse obstáculo
foi superado, desenvolvendo-se vacinas que contêm poli5 sacarídeos capsulares de diferentes sorotipos de
pneumococos acoplados (conjugados) a uma ou várias
proteínas portadoras (WO 98/51339). Esses conjugados
induzem o desenvolvimento de uma imunidade humoral
protetora T-dependente na jovem criança, traduzindo-se pela
10 produção de anticorpos específicos dirigidos contra os
poli-sacarídeos dos diferentes sorotipos utilizados nesses
conjugados.
Os poli-sacarídeos capsulares dos diferentes sorotipos
de pneumococo são todos formados da repetição de uma
15 unidade de base (unidade repetitiva) constituída de vários
açúcares. A título de ilustração, indica-se que a unidade
de base do poli-sacarídeo do pneumococo tipo 5 é
constituída de 5 hexoses: a glicose, a fucosamina Nacetila, a pneumosamina N-acetilada (2-acetamido-2,6
20 deoxitalose), o ácido glicurônico e um açúcar denominado
Sug (2-acetamido-2,6-deoxi-hexose-4 ulose) ligados uns aos
outros para formar uma estrutura química cuja fórmula
condensada é a seguinte:
4)-13-D-G1cp-(1 --)4)-a-L-FucpNAc-(1--)3)13-D-Sugp- -->
3
1
-GIcAp
a-L-PnepNAc,-(132)-p-D
11
A fórmula que corresponde a isso é a fórmula (I) tal
25 como se segue:
3/42
na qual Sug significa 2-acetamido-2,6-deoxi-hexose-4-ulose;
PneNAc significa 2-acetamido-2,6-deoxitalose, também
denominado pneumosamina N-acetilada; FucNAc significa 2acetamido-2,6-deoxigalactose também denominada fucosamida
5 N-acetilada; G1cA significa ácido glicurônico; e Glc
significa glicose.
Essa fórmula foi dada por Jannson P.E. et al.,
Carbohydrate Research (1985) 140 (1): 101. Todavia, não é
impossível que uma baixa percentagem das unidades
10 repetitivas do poli-sacarídeo apresente um grupamento
hidroxil no lugar da função cetona.
Existem numerosos processos que permitem acoplar um
poli-sacarídeo a uma proteína portadora. Dentre estes, os
processos que colocam em jogo, a título preliminar, uma
15 aminação redutora do poli-sacarídeo são de uso comum. Por
exemplo, conforme é descrito em EP 562 107, o polisacarídeo é inicialmente acoplado por aminação redutora a
um espaçador bifuncional do tipo NH2-R-NH2; depois o polisacarídeo assim derivatizado e aminado é acoplado a um
20 agente de ligação bifuncional notadamente capaz de reagir
com uma função amina. O poli-sacarídeo assim ativado é em
4/42
seguida conjugado a uma proteína portadora. Segundo outras
variantes, pode-se também acoplar diretamente o polisacarídeo à proteína por aminação redutora ou ainda omitir
o espaçador.
5
Conforme é bem conhecido, uma reação de aminação
redutora é feita em dois tempos. Em um primeiro tempo,
forma-se um composto intermediário denominado base de
Schiff de fórmula R-CH=NH+R', resultante da interação entre
um grupamento aldeído de uma primeira molécula (R-CHO) e um
10 grupamento amina primária (R'-NH 2 ) de uma segunda molécula.
A base de Schiff é em seguida reduzida em um segundo tempo
sob a forma de um composto aminado R-CH2 -NH-R' em presença
de um agente redutor. Utiliza-se um agente redutor seletivo
capaz de reduzir a função imina da base de Schiff de
15 maneira específica, tal como um hidrogênio ativado por um
catalisador, o cianoboro-hidreto de sódio (NaCNBH 3 ) ou uma
amina borano. Utiliza-se, de preferência, o cianoborohidreto ou o piridina borano.
À medida que todos os poli-sacarídeos possuem uma
20 função aldeído na extremidade de cadeia (função aldeído
terminal), os processos de conjugação comportando uma
aminação redutora do poli-sacarídeos são de aplicação muito
geral e, quando não existe nenhuma outra função aldeído na
unidade repetitiva (função aldeído intracadeia), esses
25 processos permitem obter conjugados nos quais uma molécula
de poli-sacarídeo é acoplada a uma molécula única de
proteína portadora.
De maneira inteiramente clássica, um poli-sacarídeo é
submetido a uma aminação redutora, em presença de um agente
30 redutor seletivo da base de Schiff, durante pelo menos 24 a
5/42
48 horas, com um pH neutro ou básico.
Assim, US 4.761.283 descreve a aminação redutora do
poli-sacarídeo capsular do pneumococo de tipo 6A
(previamente fragmentado por hidrólise ácida) por um
5 mutante não tóxico da toxina diftérica (mutante CRM 197),
em presença de cianoboro-hidreto de sódio. O pH do meio
reacional é básico (pH=8) e a duração de incubação é de 18
dias a 37 °C.
EP 477 508 descreve a aminação redutora dos poli10 sacarídeos do pneumococo de tipo 6A, 14, 19F e 23F por
diaminometano ou diaminoetano, em presença de piridina
borano que exerce o papel de agente redutor da base de
Schiff. O pH do meio reacional é de 9,2. A reação prossegue
durante 48 horas.
15
Em EP 562 107 citada mais acima, a aminação redutora
do poli-sacarídeo é conduzida com pH 8, durante 6 dias.
À medida que o poli-sacarídeo capsular do pneumococo
de tipo 5 comporta uma função cetona intracadeia, dever-seia em teoria esperar que essa função cetona, além da função
20
aldeído terminal, fosse amino-reduzida durante a aminação
redutora do poli-sacarídeo. Ora, quando se submete em
paralelo o poli-sacarídeo capsular do pneumococo de tipo 5
e um poli-sacarídeo capsular de um outro sorotipo ou de uma
outra espécie que não comporta funções aldeído e cetona
25 intracadeias, as taxas de aminação são equivalentes; o que
parece bem confirmar que só a função aldeído terminal do
poli-sacarídeo capsular do pneumococo de tipo 5 é aminada e
que só essa função é modificada durante a reação. Ora, em
verdade, esse não é o caso.
30
Com efeito, descobriu-se que a estrutura química da
6/42
unidade repetitiva do poli-sacarídeo do pneumococo de tipo
5 era modificado após aminação redutora segundo o método
clássico. Isto foi mostrado por espectrometria de
ressonância magnética nuclear (RMN) e por cromatografia de
5 troca de ânions elevado desempenho acoplado a uma detecção
amperométrica em campo pulsado (cromatografia HPAEC-PAD): a
grande maioria do resíduo Sug desaparece em proveito de
três novos compostos: (I) a P-D-quinovosamina N-acetilada
proveniente da redução da função cetona do resíduo Sug em
10 função álcool e (II) um composto X resultante de uma
transformação mais importante do resíduo Sug. O terceiro
composto não é outro senão o isômero da P-D-quinovosamina
N-acetilada, isto é, a P-D-fucosamina N-acetilada,
proveniente também da redução do resíduo Sug e da qual se
15 observa um ligeiro aumento.
Em espectrometria RMN é tal como mostrado na figura 1,
o poli-sacarídeo do pneumococo de tipo 5 sob sua forma
nativa simplesmente fragmentada, apresenta na zona de
ressonância dos carbonos dos grupamentos metilas em posição
20 6 (C6) dos açúcares, os três sinais de ressonâncias
características dos grupamentos metilas da pneumosamina Nacetilada (PneNAc), da fucosamina N-acetilada (FucNAc) e do
resíduo Sug (figura 1 - espectro 1). A fragmentação não
modifica em nada o espectro, mas melhora sua resolução.
25 Após aminação clássica pelo diamino-hexano, em presença de
cianoboro-hidreto de sódio (NaCNBH 3 ), nota-se que o sinal
de ressonância característica do grupamento metila do
resíduo Sug (em resumo "sinal característico do resíduo
Sug") é substancialmente diminuído e que essa diminuição é
30 acompanhada do aparecimento de dois novos sinais de
7/42
ressonâncias: um entre 17 e 18 ppm, característico da
quinovosamina N-acetilada (QuiNAc) e o outro entre 13 e 14
ppm, que assinala um composto novo, cuja estrutura não é
conhecida e que, por essa razão, é denominado composto X
5
(fig 1 - espectro 4).
Em cromatografia HPAEC-PAD, quando se comparam os
cromatogramas dos produtos da hidrólise pelo ácido
trifluoroacético 2N, durante 2 horas a 120 °C do polisacarídeo nativo ou despolimerizado e do poli-sacarídeo
10 obtido após aminação redutora clássica, tais como mostrado
na figura 2 (curva em tracejado), constata-se o
aparecimento de um primeiro pico (entre 5,50 e 6,10 min,
quando a cromatografia é realizada nas condições
especificadas mais adiante) correspondente a um composto
15 proveniente da aminação redutora cuja estrutura é não
identificada (composto X), assim como um segundo pico
(entre 6,90 e 7,40 min, quando a cromatografia é realizada
nas condições especificadas mais adiante), característico
da quinovosamina. Por outro lado, a intensidade do pico
20 correspondente à fucosamina é sensivelmente aumentada.
Convém notar que os cromatogramas, aí incluído aquele do
poli-sacarídeo nativo ou despolimerizado, não comportam
pico correspondente ao resíduo Sug. Com efeito, para ser
submetido a uma cromatografia HPAEC-PAD, o poli-sacarídeo
25 deve inicialmente ser hidrolisado. Essa hidrólise destrói o
resíduo Sug; ela tem também por efeito converter a QuiNAc,
o PneNAc e a FucNAc em quinovosamina (QuiN), pneumosamina
(PneN) e fucosamina (FucN).
Por
outro
lado,
descobriu-se
também que
a
30 transformação do composto Sug em composto X era nefasta à
8/42
imunogenicidade
do
poli-sacarídeo,
mesmo
se
essa
transformação for apenas parcial - isto é, que ocorreu
apenas em determinadas das unidades repetitivas do polisacarídeo e não na totalidade.
Ao contrário,
a
5 transformação em QuiNAc ou FucNAc não tem nenhuma
influência notável.
Portanto, pareceu desejável pesquisar meios que
permitissem evitar o aparecimento do composto X. Isto foi
tornado possível, modificando-se o modo operacional
10 clássico da aminação redutora. De maneira alternativa,
pode-se também reduzir previamente as funções cetona (C =
O) do poli-sacarídeo nativo (não fragmentado). Isto pode
ser aplicado utilizando-se um agente redutor forte tal como
o NaBH4 . Esse agente redutor não gera composto indesejável.
15 Ele reduz apenas as funções cetona e aldeído. Mas como
reduz estas, é necessário fragmentar em seguida o polisacarídeo reduzido, a fim de reintroduzir grupamentos
aldeídos terminais. A redução das funções cetona impede
qualquer modificação posterior, quando o poli-sacarídeo é
20 submetido na seqüência a uma aminação redutora qualquer.
É por isso que a invenção tem por objeto:
um poli-sacarídeo capsular do pneumococo de tipo 5
aminado ao nível do grupamento aldeído terminal e que
apresenta (I) um espectro RMN do Carbono ( 13 C) desprovido
25 de sinal de ressonância entre 13 e 14 ppm limites
incluídos; (II) um cromatograma HPAEC-PAD, substancialmente
desprovido de pico entre os picos de fucosamina e
pneumosamina, o cromatograma sendo obtido por purificação a
partir de uma coluna Carbopac Tm PA10, em uma solução de soda
30 18 mM, a uma vazão de 1 ml/min durante 15 min, mono-
9/42
sacarídeos oriundos da hidrólise desse poli-sacarídeo; ou
(III) os dois.
(II) Um conjugado no qual o poli-sacarídeo, de acordo
com a invenção, é acoplado a um polipeptídeo portador (P).
5 (III) Um primeiro processo de produção de um polisacarídeo capsular do pneumococo de tipo 5 aminado, segundo
o qual se submete o poli-sacarídeo a uma aminação redutora
em presença de um agente redutor seletivo de uma base de
Schiff, com um pH de 4 a 6,5, de preferência de 5 a 6, por
10 uma duração que não excede 4 horas.
(IV) Um segundo processo de produção de um polisacarídeo capsular do pneumococo de tipo 5 aminado, segundo
o qual (I) se faz reagir o poli-sacarídeo com um agente
capaz de reduzir uma função cetona (II) se fragmenta o
15 poli-sacarídeo reduzido obtido em (I) e (III) se submete o
poli-sacarídeo reduzido e fragmentado a uma aminação
redutora.
Na seqüência do texto, denomina-se "poli-sacarídeo
aminado" um poli-sacarídeo capsular do pneumococo de tipo 5
20 que é aminado ao nível do grupamento aldeído terminal; isto
é, oriundo da reação da função aldeído terminal com uma
função amina.
A aminação redutora de um poli-sacarídeo pode ser
realizada, fazendo-se reagir a função aldeído terminal de
25 um poli-sacarídeo com compostos muito diversos, mas
evidentemente todos caracterizados pelo fato de possuírem
pelo menos uma função amina primária. Esses compostos podem
ser polipeptídeos ou compostos químicos. Esses compostos
polipeptídeos e esses compostos químicos serão evocados de
30 maneira mais detalhada na seqüência da descrição. Quando se
1 0/ 42
trata de um polipeptídeo, o produto da aminação redutora é,
na realidade, um conjugado poli-sacarídeo-polipeptídeo.
Para uso nos processos, de acordo com a invenção, um
poli-sacarídeo capsular do pneumococo de tipo 5 é
5 previamente vantajosamente purificado a partir de uma
cultura bacteriana, por exemplo, segundo o método de
Gotschlich et al., J. Exp. Med. (1969) 129: 1349.
O poli-sacarídeo pode ser utilizado tal qual (fala-se
então de forma nativa) ou bem fragmentado. Com efeito, o
10 tamanho do poli-sacarídeo não é absolutamente crítico. Sob
sua forma nativa, o poli-sacarídeo contém aproximadamente
300 unidades repetitivas. Um poli-sacarídeo fragmentado
pode ser constituído de pelo menos 4 unidades repetitivas,
em geral de 25 a 100 unidades repetitivas. Se necessário,
15 pode-se determinar o tamanho de um poli-sacarídeo, segundo
métodos conhecidos, por exemplo pela determinação de seu KD
por gel de filtragem ou pela medida de sua massa molecular
por SEC-tripla detecção (cromatografia de exclusão-difusão
acoplada a uma tripla detecção: refractometria,
20 viscosimetria, difusão da luz).
Um poli-sacarídeo pode ser fragmentado, segundo
diversos métodos bem conhecidos do técnico, por exemplo por
hidrólise ácida ou básica feita ou despolimerização
radicalar oxidativa, tal como descrita em EP 562 107.
25
No primeiro processo, de acordo com a invenção, se
utiliza, de preferência, um poli-sacarídeo fragmentado; no
segundo, um poli-sacarídeo nativo.
A fim de caracterizar a presente invenção, a
espectrometria de ressonância magnética nuclear (RMN) pode
30 ser
utilizada
segundo
protocolos
inteiramente
11/42
convencionais; em particular, os dados podem ser coletados
a partir de qualquer tipo de aparelho destinado para isso.
A espectrometria RMN do Carbono já foi amplamente utilizada
para estudar as unidades repetitivas de um certo número de
5 poli-sacarídeos capsulares, notadamente aqueles do
pneumococo. A título de exemplo, cita-se C. Jones et al.,
Carbohid. Res. (2000) 325: 192. O técnico no domínio da
análise espectral dispõe, portanto, suficientemente de
informação para utilizar ele mesmo a análise do poli10 sacarídeo de tipo 5 por espectrometria RMN do carbono.
Todavia, a título de exemplo, indica-se um protocolo
de preparo das amostras que é notadamente apropriado para
medida posterior em um espectrofotômetro Bruker DRX500 com
uma sonda de medida banda larga (largura espectral: 27500
15 Hz). 12 a 17 mg de um liofilizado de um poli-sacarídeo de
tipo 5 são dissolvidos em 0.5 ml de água deuterada (D20).
Essa amostra é colocada em um tubo de 5 mm especialmente
concebido para a análise RMN. Depois os espectros são
registrados a 70 °C (343 K).
20
Com a finalidade de caracterização, a cromatografia
HPAEC-PAD deve ser feita em condições bem precisas
referentes ao tipo de coluna, as soluções de purificação e
a vazão de purificação. A seguir se fornece um modo
operacional completo.
25
Convém inicialmente hidrolisar os poli-sacarídeos
aminados em mono-sacarídeos. Para isto, tratam-se 5 a 20 gg
de poli-sacarídeo aminado em solução na água deionizada a
uma concentração de 10-40 gg/ml, por 500 gl de ácido
trifluoroacético 2 N, durante 2 horas a 120 °C em frasco
30 fechado hermeticamente. Os hidrolisados são secados sob um
12/42
fluxo de nitrogênio a 40 °C, de forma a eliminar o ácido
trifluoroacético. Os resíduos são então dissolvidos em 400
gl de água deionizada.
A cromatografia é utilizada sobre uma coluna analítica
5 CarboPac TM PA10 (4 x 250 mm) comercializada por Dionex.
Essa coluna é constituída de um suporte à base de
poliestireno e de divinil benzeno sulfonatado com um °C de
reticulação de 55 % recoberto de micro-esferas de látex
enxertadas com grupamentos amônio quaternário. O
°C de
10 reticulação do látex (micro-esferas de látex) é de 5 %; o
diâmetro das micro-esferas é de 400 nm.
Injetam-se 5 gg de hidrolisado na coluna. Depois se
submete a coluna a um fluxo de uma solução de soda 18 nM
durante 15 minutos com uma vazão de 1 ml/min, a fim de
15 purificar os mono-sacarídeos e oligo-sacarídeos não
carregados, tais como as hoxoses e hexosaminas. Para
concluir o cromatograma pode-se em seguida aumentar
gradualmente a molaridade da solução de soda até 100 mM e
enfim purificar os mono-sacarídeos e oligo-sacarídeos
20 ácidos restantes com o auxílio de um substrato de soda 100
mM/acetato de sódio 300 mM. Por toda a duração da
purificação a vazão é de 1 ml/min e a temperatura é de
30 °C.
Nessas condições, a distância entre os picos de
25 fucosamina e de pneumosamina é de aproximadamente 2
minutos. Quando os picos de fucosamina e de pneumosamina
aparecem a 4,75 e 6 ,75 min respectivamente, o pico X se
tiver de aparecer, sai entre 5,50 e 6,10 (5,80 min).
Os produtos obtidos por cada um dos dois processos, de
30 acordo com a invenção, respondem ambos à definição do
13/42
produto, de acordo com a invenção; mas diferentes no que se
refere à percentagem de composto Sug e de quinovosamina Nacetilada.
Quando o primeiro processo, de acordo com a invenção,
5 (que especifica condições de aminação redutora otimizada) é
utilizado, obtém-se um poli-sacarídeo aminado que
apresenta:
(I) um espectro RMN do Carbono que compreende um
sinal de ressonância entre 11,5 e 12,5 ppm, limites
10 incluídos, característica do composto Sug, e um sinal de
ressonância situado entre 17 e 18 ppm limites incluídos,
característica da quinovosamina N acetilada, cuja
intensidade é menor por comparação com o sinal situado
entre 17 e 18 ppm, limites incluídos, no espectro RMN ( 13 C)
15 de um poli-sacarídeo capsular do pneumococo de tipo 5
obtido após aminação redutora, em presença de cianoborohidreto de sódio, com pH 8, durante 48 horas; ou
(II) um cromatograma HPAEC-PAD que compreende um pico
purificado
imediatamente
após
a
pneumosamina,
20 característica da quinovosamina, cuja intensidade é menor
por comparação com o pico equivalente no cromatograma
HPAEC-PAD de um poli-sacarídeo capsular do pneumococo de
tipo 5 obtido após aminação redutora, em presença de
cianoboro-hidreto de sódio, com pH 8, durante 48 horas; ou
25
(III) os dois.
Não é possível quantificar no absoluto a percentagem
de resíduos Sug que foram modificados após aminação
redutora, em uma molécula de poli-sacarídeo considerada
separadamente ou em um conjunto de moléculas. Ao contrário,
30 é possível indicar que a taxa de modificação dos resíduos
14/42
Sug é diminuído de pelo menos 65 % - quando não é de pelo
menos 70 ou 75 % - quando o poli-sacarídeo capsular do
pneumococo de tipo 5 é obtido sob a forma aminada pelo
primeiro processo, de acordo com a invenção, por comparação
5 com um poli-sacarídeo capsular do pneumococo de tipo 5
aminado, de acordo com um processo clássico. Após aminação
redutora de acordo com o primeiro processo, de acordo com a
invenção, o essencial das modificações que persistem se
refere à transformação de certos resíduos Sug do poli10 sacarídeo em quinovosamina N-acetilada; o composto X não é
formado de maneira substancial como prova o espectro RMN do
Carbono e o cromatograma HPAEC-PAD (figura 1 - 2 ° espectro
- e figura 2- curva em tracejados). Com efeito, o espectro
não apresenta sinal de ressonância compreendido entre 13 e
15 14 ppm limites incluídos, característica do composto X e o
cromatograma apresenta simplesmente um pico largo de
intensidade muito fraca entre o pico de fucosamina e de
pneumosamina (entre 5,50 e 6,10 min).
Pelo primeiro processo, de acordo com a invenção, é
20 mesmo possível obter um poli-sacarídeo aminado que
apresenta (I) um espectro RMN do Carbono quadradamente
desprovido de sinal de ressonância entre 17 e 18 ppm; (II)
um cromatograma HPAEC-PAD desprovido de pico quinovosamina
(entre 6,90 e 7,40 min), o pico observado com o poli25 sacarídeo aminado segundo um processo de aminação clássica,
reduzindo-se até ser apenas um simples rebordo do pico
precedente (pico da pneumosamina); ou (III) os dois.
O segundo processo, de acordo com a invenção, requer
previamente a redução dos grupamentos cetona do poli30 sacarídeo
nativo.
Nessas
condições,
compreende-se
15/42
facilmente que os resíduos Sug sejam essencialmente
transformados em quinovosamina e fucosamina N-acetiladas.
Nesse caso, fala-se de poli sacarídeo reduzido. A aminação
-
redutora, segundo um modo operacional clássico do poli5 sacarídeo reduzido e fragmentado, não tem qualquer
influência notável sobre a estrutura das unidades
repetitivas. Isto é bem mostrado na figura 2 - curva em
tracejado ponto.
Assim, quando o segundo processo, de acordo com a
10 invenção, é empregado, obtém-se um poli-sacarídeo aminado
que apresenta:
(I) um espectro RMN do Carbono desprovido de sinal de
ressonância entre 11,5 e 12,5 ppm, limites incluídos
característico do composto Sug, que compreende um sinal de
15 ressonância situado entre 17 e 18 ppm limites incluídos,
característico da quinovosamina N-acetilada, cuja
intensidade é aumentada por comparação com o sinal de
ressonância situado entre 17 e 18 ppm, limites incluídos,
no espectro RMN ( 13 C) de um poli-sacarídeo capsular do
20 pneumococo de tipo 5 obtido após aminação redutora, em
presença de cianoboro-hidreto de sódio, com pH 8, durante
48 horas; ou
(II) um cromatograma HPAEC-PAD que compreende um pico
situado imediatamente após o pico de pneumosamina,
25 característico da quinovosamina, cuja intensidade é
aumentada por comparação com o pico equivalente no
cromatograma HPAEC-PAD de um poli-sacarídeo capsular do
pneumococo de tipo 5 obtido após aminação redutora, em
presença de um cianoboro-hidreto de sódio, com pH 8,
30 durante 48 horas; ou
16/42
(III) os dois
Em outros termos, um poli-sacarídeo aminado, de acordo
com a invenção, aminado ao nível do grupamento aldeído
terminal, é essencialmente constituído de unidades
5 repetitivas de fórmula (II):
P1,3
ÇO
10
OH
na qual A é de maneira independente e aleatória C=0 ou
15 CHOH.
Por
"poli-sacarídeo
aminado
essencialmente
constituído", entende-se um poli-sacarídeo aminado ao nível
do grupamento aldeído terminal, no qual a percentagem de
unidades repetitivas de fórmula (II) é de pelo menos 85%,
20 de preferência de pelo menos 90%, de maneira inteiramente
preferida de pelo menos 95%.
Em função do processo utilizado para produzibr polisacarídeos aminados, de acordo com a invenção, a proporção
das unidades repetitivas de fórmula (II), na qual A é C=0
25 (fórmula II') pode variar consideravelmente; e, em
conseqüência, o mesmo ocorre com a proporção das unidades
repetitivas de fórmula (II), na qual A é CHOH (fórmula
II").
O segundo processo, de acordo com a invenção, gera um
30 poli-sacarídeo aminado no qual as unidades repetitivas
17/42
correspondem à formula (II"), já que, em RMN, o sinal de
ressonância correspondente ao resíduo Sug desaparece em
proveito do sinal de ressonância correspondente à
quinovosamina N-acetilado. O poli-sacarídeo contém pelo
5 menos 95% de unidades repetitivas de fórmula (II").
Ao contrário, utilizando-se o primeiro processo, de
acordo com a invenção, produz-se um poli-sacarídeo aminado
no qual a relação unidades de fórmula (II') / unidades de
fórmula (II") é bem diferente. Com efeito, em RMN, o sinal
10 de ressonância correspondente ao resíduo Sug é visível
assim como aquele correspondente à quinovosamina Nacetilada. O poli-sacarídeo contém de 85 a 95 % de unidades
repetitivas de fórmula (II').
Conforme assinalado anteriormente, um poli-sacarídeo,
15 de acordo com a invenção, pode ser aminado com o auxílio de
diversos compostos. Quando o poli-sacarídeo, de acordo com
a invenção, é destinado à produção de conjugados, o
composto que permite aminar o poli-sacarídeo é
vantajosamente escolhido, segundo a estrutura que se quer
20 dar a esses conjugados. De maneira geral, os conjugados,
segundo a presente invenção, correspondem à fórmula Ps-CH2NH-R na qual:
Ps designa o poli-sacarídeo capsular do pneumococo
tipo 5 essencialmente constituído das unidades repetitivas
25
de fórmula (II);
R é um polipeptídeo portador P;
um composto de fórmula (III) L-P, na qual um
polipeptídeo portador é ligado a um agente de ligação (L);
OU
30
um composto de fórmula (III') S-L'-P, na qual um
18/42
polipeptídeo portador P é ligado a um espaçador (S), por
intermédio de um agente de ligação (L');
C designa o átomo de carbono do grupamento aldeído
terminal do poli-sacarídeo; e
5
N designa o átomo de nitrogênio do grupamento amino
portado por R.
Os compostos P, L e S serão abordados depois na
descrição, na seção consagrada aos conjugados. Nota-se
todavia desde então que esses compostos devem todos
10 evidentemente comportar um grupamento amina primária livre,
capaz de reagir com uma função aldeído. Eles podem ser
empregados em cada um dos dois processos, de acordo com a
invenção, sem distinção nenhuma.
No primeiro processo, de acordo com a invenção, a
15 aminação redutora, à qual é submetido o poli-sacarídeo
consiste notadamente em fazer reagir o poli-sacarídeo com
um composto que comporta uma função amina, tal como os
compostos P, L ou S, em presença de um agente redutor
seletivo de uma base Schiff, tal como o cianoboro-hidreto
20 ou a piridina borano, nas condições de pH e de tempo já
especificadas, de preferência entre 30 minutos e 4 horas.
A fim de se obter uma taxa de aminação similar àquela
obtida em condições clássicas, preconiza-se uma duração de
incubação compreendida entre 2 e 4 horas, limites inclusos.
25 Quando a duração de incubação não excede 2 horas, os
compostos Sug não são modificados. Além de 2 horas,
observam-se Dug reduzidos sob a forma de P-D-quinovosamina
N-acetilada e/ou de 0-D-fucosamina N-acetilada coexistente
geralmente com Sug não modificados na cadeia poli30 sacarídica. Por conseguinte, quando mais considerável for a
19/42
duração de incubação, mais considerável será a proporção de
Sug reduzido. Além de 4 horas, identifica-se por RMN o
composto X indesejável.
A fim de não prolongar a duração da reação de aminação
5 redutora além do tempo requerido, esta deve ser parada por
métodos rápidos, notadamente por precipitação seletiva do
poli-sacarídeo aminado. O poli-sacarídeo aminado é, por
exemplo, purificado por precipitação alcoólica, quando o
composto aminado é um agente de ligação ou um espaçador.
10 Prefere-se a precipitação ao sulfato de amônio, quando o
composto aminado é um polipeptídeo. Os processos de
purificação por precipitação são processos clássicos, bem
conhecidos do técnico.
A aminação redutora é feita geralmente em um meio
15 tamponado tal como o tampão citrato / fosfato, mas um outro
tampão, cujo pKa se situa entre 2,5 e 6, é também
conveniente. A título de exemplo, pode-se utilizar um
tampão citrato, acetato ou succinato. Excluem-se, todavia,
os tampões cuja fórmula química comporta compostos
20 portadores de grupamento aminado, como, por exemplo, um
tampão glicina.
A temperatura do meio reacional se situa em geral
entre 4 e 70 °C, segundo o composto aminado utilizado, de
forma preferida entre 20 e 50 °C, e de forma ainda mais
25 preferida entre 20 e 37 °C, quando o composto aminado é um
polipeptídeo.
Para uso no primeiro processo, de acordo com a
invenção, o poli-sacarídeo pode ser seja nativo, seja
fragmentado previamente. Não importa que método de
30 fragmentação pode ser conveniente, à
condição
que ele
20/42
conserve a integridade estrutural do poli-sacarídeo nativo.
O método de fragmentação por radicais livres, descrito mais
adiante, é particularmente conveniente.
Embora as razões ponderais entre o poli-sacarídeo,
o
5 composto aminado e o cianoboro-hidreto não sejam críticos,
são obtidos melhores rendimentos em poli-sacarídeos
aminados na faixa de razões ponderais poli-sacarídeo /
composto aminado / cianoboro-hidreto que vão de 1 / 0,1 /
0,02 a 1 / 5 / 0,2 quando se utiliza como composto aminado
10 um agente de ligação L ou um espaçador S; ou na faixa de
razões ponderais que vão de 1 / 0,2 / 0,02 a 1 / 1/ 0,2
quando se utiliza como composto aminado um polipeptídeo
portador P. Os rendimentos ótimos em poli-sacarídeos
aminados são obtidos com relação 1 / 1 / 0,1, quando o
15 composto aminado é um polipeptídeo portador.
Para uso no segundo processo, de acordo com a
invenção, o poli-sacarídeo é, de preferência, um polisacarídeo nativo, não despolimerizado, já que, quando da
utilização desse segundo processo, o poli-sacarídeo é
20
necessariamente submetido a uma fragmentação, após redução,
para reintroduzir grupamentos aldeído terminais.
No segundo processo, de acordo com a invenção, a
redução do poli-sacarídeo é feita de maneira convencional,
isto é, à temperatura ambiente, em meio aquoso, com pHa
25 básico, de preferência com um pH compreendido entre 8 e 10.
O agente redutor muito específico das funções cetona e
aldeído é utilizado em excesso, isto é, com uma
concentração molar de pelo menos 10 vezes, de forma
preferida de pelo menos 100 vezes mais forte do que aquela
30 do poli-sacarídeo. Um boro-hidreto, tal como o boro-hidreto
de sódio (NaBH4 ), é um agente redutor de escolha. O tempo
reacional pode ser de 30 minutos a 2 horas, de preferência
1 hora. O poli-sacarídeo reduzido pode ser em seguida
purificado por um método qualquer, de preferência por
5 precipitação alcoólica.
A despolimerização do poli-sacarídeo reduzido por ser
feita notadamente por hidrólise feita. Utiliza-se, de
preferência, o método de despolimerização radicalar
oxidativa tal como descrita em EP 562 107. Os poli10 sacarídeos fragmentados podem ser em seguida purificados de
maneira convencional, isto é, por precipitação alcoólica
antes da etapa de aminação redutora.
No segundo processo, de acordo com a invenção, a
aminação redutora pode ser utilizada segundo qualquer
15 condição, aí incluídas as condições clássicas, pois não
existe mais composto Sug na estrutura do poli-sacarídeo
reduzido e fragmentado; e, por conseguinte, maior risco de
formar o composto X indesejável.
Assim, no segundo processo, de acordo com a invenção,
20 a aminação redutora, à qual é submetido o poli-sacarídeo,
requer simplesmente a reação do poli-sacarídeo com um
composto que comporta uma função amina, tal como os
compostos, P, L ou S, em presença de um agente redutor,
seletivo de uma base de Schiff.
25
Podem-se utilizar as condições descritas para o
primeiro processo, de acordo com a invenção; e, conforme
nesse caso, a duração de incubação, assim como o pH não
crítico, com ou sem as limitações de duração ou as
restrições referentes à gama de pH. Geralmente, nas
30 condições clássicas, o pH do meio reacional se situa em uma
22/42
ampla faixa que vai de 5 a 9, mas se escolhe, de
preferência, um pH compreendido entre 5 e 8. Um tempo de
incubação geralmente compreendido entre 2 e 48 horas dá
bons rendimentos em poli-sacarídeo aminado. A temperatura
5 de incubação está geralmente compreendida entre 20 e 50 °C.
Uma vez que a aminação redutora empreendida, purificase o poli-sacarídeo aminado do meio reacional com o auxílio
de métodos usuais, isto é, por precipitação alcoólica ou ao
sulfato de amônio, por diálise, por cromatografia de
10 exclusão-difusão ou por ultrafiltragem, conforme as
necessidades.
Assim como anteriormente mencionado, um poli-sacarídeo
aminado pode ser já um conjugado, quando o composto que
reage com a função aldeído terminal do poli-sacarídeo é um
15 polipeptídeo portador. Esse conjugado é de fórmula Ps - CH2 NH-P,naqulopi-scaríde(P)éitamencopld
ao polipeptídeo portador (P).
É por isso que a invenção tem também por objeto:
a. um processo de produção de um conjugado, de acordo
20 com a invenção, de fórmula (IV) Ps-CH 2 -NH-P, na qual Ps
designa o poli-sacarídeo capsular do pneumococo de tipo 5;
processo segundo o qual- se-faz reagir o poli-sacarídeo com
um polipeptídeo portador (P), em presença de um agente
redutor seletivo de uma base de Schiff, com um pH de 4 a
25 6,5, de preferência de 5 a 6, por uma duração que não
excede 4 horas.
Um processo de produção de um conjugado, de acordo com
a invenção, de fórmula (IV) Ps-CH 2 -NH-P, na qual Ps designa
o poli-sacarídeo capsular do pneumococo de tipo 5; processo
30 segundo o qual (I) se reduz o poli-sacarídeo nativo com um
23/42
agente redutor muito específico das funções cetona e
aldeído, (II) se fragmenta o poli-sacarídeo reduzido e
(III) se submete o poli-sacarídeo reduzido e fragmentado a
uma aminação redutora em presença de um polipeptídeo
5
portador P.
Um processo de produção de um conjugado, de acordo com
a invenção, de fórmula (V) Ps-CH 2 -NH-L-P, segundo o qual:
(I) se faz reagir um poli-sacarídeo capsular do
pneumococo de tipo 5 (Ps)
com um agente de ligação
(L)
que
10 possui pelo menos uma função amina primária, em presença de
um agente redutor seletivo de uma base de Schiff, com um pH
de preferência de
de 4 a 6,5,
não excede
4
5
a 6,
por uma duração que
horas, a fim de se obter um poli-sacarídeo
ativado de fórmula (VI) Ps-CH 2 -NH-L; e
(II)
15
se acopla o poli-sacarídeo ativado a um
polipeptídeo portador (P), a fim de se obter o conjugado de
fórmula (V) Ps-CH 2 -NH-L-P; ou alternativamente,
um processo de produção de um conjugado segundo a
invenção de fórmula
20
segundo o qual se
(V) Ps-CH 2 -NH-L-P,
faz reagir um poli-sacarídeo capsular do pneumococo de tipo
5 (Ps)
com um polipeptídeo portador ativado de fórmula
(VII) L-P, na qual L é um agente de ligação que possui pelo
menos uma função amina primária e P um polipeptídeo
portador, em presença de um agente redutor seletivo de uma
25
base de Schiff, com um pH de 4 a 6,5, de preferência de 5 a
6,
por uma duração que não excede
4
horas, a fim de se
obter o conjugado de fórmula (V) Ps-CH 2 -NH-L-P.
Um processo de produção de um conjugado, de acordo com
a invenção, de fórmula
30
(I)
(V) Ps-CH 2 -NH-L-P,
segundo o qual:
se faz reagir um poli-sacarídeo capsular do
24/42
pneumococo de tipo 5 (Ps) com um agente capaz de reduzir
uma função cetona;
(II) se fragmenta o poli-sacarídeo reduzido;
(III) se acopla por aminação redutora o poli-sacarídeo
5 reduzido e fragmentado com um agente de ligação (L) que
possui pelo menos uma função amina primária a fim de se
obter um poli-sacarídeo ativado de fórmula (VI) Ps-CH 2 -NHL; e
se acopla o poli-sacarídeo ativado a um polipeptídeo
10 portador (P), a fim de se obter o conjugado de fórmula (V)
Ps-CH 2 -NH-L-P; ou alternativamente.
Um processo de produção de um conjugado, de acordo com
a invenção, de fórmula (V) Ps-CH 2 -NH-L-P, segundo o qual:
(I)
se faz reagir um poli-sacarídeo capsular do
15 pneumococo de tipo 5 (Ps) com um agente capaz de reduzir
uma função cetona;
(II) se fragmenta o poli-sacarídeo reduzido; e
(III) se acopla por aminação redutora o poli-sacarídeo
reduzido e fragmentado com um polipeptídeo portador ativado
20 de fórmula (VII) L-P, na qual L é um agente de ligação que
possui pelo menos uma função amina primária, a fim de se
obter o conjugado de fórmula (V) Ps-CH 2 -NH-L-P.
Um processo de produção de um conjugado, de acordo com
a invenção, de fórmula (VIII) Ps-CH 2 -NH-S-L'-P, segundo o
25 qual:
(I) se faz reagir um poli-sacarídeo capsular do
pneumococo de tipo 5 com um espaçador (S) que possui pelo
menos uma função amina primária, em presença de um agente
redutor seletivo de uma base de Schiff, com um pH de 4 a
30 6,5, de preferência de 5 a 6, por uma duração que não
25/42
excede
4
horas, a fim de se obter um poli-sacarídeo
derivatizado de fórmula (IX) Ps-CH 2 -NH-S;
(II) se acopla o poli-sacarídeo derivatizado com um
agente de ligação
5
(L'),
ativado de fórmula
a fim de se obter um poli-sacarídeo
(X) Ps-CH 2 -NH-S-L';
e
(III) se acoplar o poli-sacarídeo ativado com um
polipeptídeo portador (P), a fim de se obter o conjugado de
fórmula (VIII) Ps-CH 2 -NH-S-L'-P; ou alternativamente,
h. um processo de produção de um conjugado, de acordo
10 com a invenção, de fórmula
(VIII) Ps-CH 2 -NH-S-W-P,
segundo
o qual:
(I)
se faz reagir um poli-sacarídeo capsular do
pneumococo de tipo 5 com um espaçador (S) que possui pelo
menos uma função amina, em presença de um agente redutor
15
seletivo de uma base de Schiff, com um pH de 4 a 6,5, de
preferência de
5
a 6, por uma duração que não excede 4
horas, a fim de se obter um poli-sacarídeo derivatizado de
fórmula (IX) Ps-CH 2 -NH-S; e
(II) se acopla o poli-sacarídeo derivatizado com um
20
polipeptídeo portador ativado de fórmula
L'
(XI) L'-P,
na qual
é um agente de ligação e P um polipeptídeo portador, a
fim de se obter o conjugado de fórmula
(VIII) Ps-CH 2 -NH-S-
L'-P.
Um processo de produção de um conjugado, de acordo com
25
a invenção, de fórmula
(VIII) Ps-CH 2 -NH-S-L'-P,
segundo o
qual:
(I) se faz reagir um poli-sacarídeo capsular do
pneumococo de tipo
5 (Ps)
com um agente capaz de reduzir
uma função cetona,
30
(II) se fragmenta o poli-sacarídeo reduzido;
26/42
(III) se acopla por aminação redutora o poli-sacarídeo
reduzido e fragmentado a um espaçador (S) portador de pelo
menos uma função amina primária, a fim de se obter um poli(IX) Ps-CH 2 -NH-S;
sacarídeo derivatizado de fórmula
5 (IV)
se acopla o poli-sacarídeo derivatizado a um
agente de ligação
ativado de fórmula
(V)
(L'),
a fim de se obter um poli-sacarídeo
(X) Ps CH 2 NH S L';
-
-
-
-
e
se acopla o poli-sacarídeo ativado a um
polipeptídeo portador (P), a fim de se obter o conjugado de
10 fórmula (VIII) Ps-CH 2 -NH-S-L'-P; ou alternativamente.
J. Um processo de produção de um conjugado, de acordo
com a invenção, de fórmula (VIII) Ps-CH 2 -NH-S-L'-P,
segundo
o qual:
(I)
15
se faz reagir um poli-sacarídeo capsular do
pneumococo de tipo
5 (Ps)
com um agente capaz de reduzir
uma função cetona;
(II) se fragmenta o poli-sacarídeo reduzido;
(III) se acopla por aminação redutora o poli-sacarídeo
reduzido e fragmentado a um espaçador (S) portador de pelo
20
menos uma função amina primária, a fim de se obter um polisacarídeo derivatizado de fórmula (IX) Ps-CH 2 -NH-S; e
(IV) se acopla o poli-sacarídeo derivatizado com um
polipeptídeo portador ativado de fórmula
L'
25
(XI) L'-P,
na qual
é um agente de ligação e P um polipeptídeo portador, a
fim de se obter o conjugado de fórmula
(VIII) Ps-CH 2 -NH-S-
W-P.
Em seu alcance mais geral, o termo de polipeptídeo
portador (P) designa uma cadeia de ácidos aminados,
quaisquer que sejam seu tamanho e suas modificações pós30 traducionais que puderam ocorrer, compreendendo pelo menos
27/42
um epitopo "T-helper". Sabendo-se que um epitopo T-helper
pode ser constituído por 10-15 ácidos aminados, o termo de
polipeptídeo portador engloba os peptídeos. Evidentemente,
ele engloba também as proteínas.
5
Por epitopo "T-helper" entende-se um encadeamento de
ácidos aminados que, no contexto de uma ou várias moléculas
do MHC, ativa os linfócitos T-helper. O polipeptídeo
portador do conjugado provoca o desenvolvimento de uma
imunidade T-dependente específico do poli-sacarídeo do
10 pneumococo de tipo 5 com produção de anticorpos específicos
dirigidos contra o poli-sacarídeo na seqüência da
administração do conjugado. Ele induz também uma elevação
da taxa de anticorpos específicos, quando de uma vacinação
de reforço.
Para o uso nos conjugados, de acordo com a invenção, o
15
polipeptídeo portador pode ser uma anatoxina bacteriana
obtida por destoxificação química, como a anatoxina
tetânica ou obtida por mutação genética como a anatoxina
diftérica (CRM 197, a título de exemplo), a exoproteína A
20 de
Pseudomonas aeruginosa
Staphylococcus aureus.
ou a exotoxina A de
Podem-se também utilizar as
proteínas de membrana externa das bactérias, como as
proteínas OMP1 ou OMP2 de Nelsseria meningitidis. As
proteínas lamB, OmpC, OmpA, OmpF e PhoE de Escherichia
25 coli, a proteína CotC ou CotD de Bacillus subtilis, as
porinas bacterianas como a porina de classe 1 de Neisseria
meningitidis B, a porina P40 de Klebsiella pneumoniae;
também as lipoproteínas como OspA de Borrelia burgdorfi,
PspA de
30
streptococcus pneumoniae,
a
Transferrine binding
protein type 2 (TBP2) de Neisseria maningitidis,
TraT de
28/42
Escherichia coli, a adesina A de streptococcus pneumoniae.
As proteínas de origem viral, como a hemaglutinina do vírus
gripal podem também exercer o papel de polipeptídeo
portador, assim como os peptídeos p 24E, p 24N, p 24M, p
5 24H descritos em WO 94/29339 portanto um epitopo
T helper,
ou os peptídeos PADRE (PanDR T helper epitopos) descritos
por Del guercio et al (Vaccine (1997), vol 15/4, p441-448).
A produção dos conjugados de fórmula (IV) Ps-CH2-NH-LP é feita em uma única etapa, a reação de aminação redutora
10 do poli-sacarídeo assegurando também a conjugação do polisacarídeo ao polipeptídeo. Ao contrário, a produção dos
conjugados de fórmula (V) Ps-CH 2 -NH-L-P ou (VIII) Ps-CH 2 NH-A-L'-P é realizada em várias etapas distintas, a
primeira etapa sendo constituída pela utilização de um dos
15 dois processos de produção de um poli-sacarídeo aminado, de
acordo com a invenção, chegando à aminação redutora do
poli-sacarídeo pelo composto L ou S.
O espaçador S e os agentes de ligação L e L' são
compostos que possuem pelo menos dois grupamentos
20 funcionais e dispostos no meio do composto, segundo
direções relativamente opostas. No que se refere ao
espaçador S e ao agente de ligação L, um dos grupamentos
funcionais deve ser capaz de reagir com o aldeído terminal
do poli-sacarídeo, quando da aminação redutora, o outro
25 sendo respectivamente capaz de reagir com um agente de
ligação L' ou com um polipeptídeo portador. No que se
refere ao agente de ligação L', um dos grupamentos
funcionais deve ser capaz de reagir com o espaçador, o
outro sendo capaz de reagir com um polipeptídeo portador.
30
Para os fins da presente invenção, o agente de ligação
29/42
L é um composto de fórmula (XII) R1-A-R2, na qual:
A designa uma cadeia alifática, aromática, ou uma
cadeia mista alifática e aromática, substituída ou não,
saturada ou insaturada;
5
R1 designa uma amina primária ou um radical químico
portador de uma amina primária, como, por exemplo, o
radical hidrazida, NH2 -NH-CO; e
R2
designa um grupamento funcional capaz de reagir com
um grupamento funcional do polipeptídeo portador.
10
De maneira vantajosa, A designa um alquila, um
alquileno ou um ditioalquil, compreendendo de 1 a 12,
vantajosamente de 2 a 8, de preferência de 2 a 6 átomos de
carbono.
De maneira vantajosa,
R2
é capaz de reagir com um
15 grupamento carboxil, tiol ou amina. Assim,
R2
pode ser
independentemente de R1 , um grupamento amina ou um radical
portador de um grupamento amina, tal como o radical
hidrazida.
R2
pode também ser um grupamento tiol ao
carboxil.
20
Assim, um composto de fórmula R1-A-R2 pode ser um
alquil di-hidrazida, tal como o ácido adípico di-hidrazida;
um tio alquil monoaminado, tal como a cisteína ou a
cisteamina, ou diamino etano e o diamino-hexano.
Para fins da presente invenção, o espaçador S é um
25 composto de fórmula (XIII) R 1 -A-R2 1 , na qual:
- A designa uma cadeia alifática e/ou aromática,
substituída ou não, saturada ou insaturada;
R1 designa uma amina primária ou um radical químico
portador de uma amina primária, como, por exemplo, o
30 radical hidrazida, NH2-NH-CO; e
30/42
R2'
designa um grupamento funcional capaz de reagir
com um grupamento funcional de um agente de ligação L'.
De acordo com modo particular, o espaçador S pode ser
escolhido dentre os compostos de fórmula (XII)
R1 - A - R2.
5 Para a finalidade da presente invenção, a escolha do
agente de ligação L' é condicionada, em primeiro lugar,
pelo grupamento funcional
R2'
portado por S, depois pelo
grupamento funcional do polipeptídeo portador que deve
intervir na operação de conjugação. O agente de ligação L'
10 é um composto de fórmula (XIV) R 3 -B-R4 , na qual:
B designa uma cadeia alifática e/ou aromática,
substituída ou não, saturada ou insaturada;
R3
designa um grupamento funcional capaz de reagir com
e
o grupamento funcional R2';
R4
designa um grupamento
15 funcional capaz de reagir com o grupamento funcional do
polipeptídeo portador.
De maneira vantajosa, B designa um alquila ou um
alquileno, substituído ou não, compreendendo de 1 a 12, de
forma preferida de 2 a 8 átomos de carbono; um aril, um
20 alquilaril ou um arilalquileno, compreendendo de 7 a 12
átomos de carbono; um fenil ou um fenileno substituído ou
não.
Quando
R2' é
um grupamento tiol,
R3
pode ser um
grupamento tiol; um carbonil a ou P. insaturado ou um grupo
25 imidil, em particular um grupo maleimidil; um halogeneto de
acila ou um halogeneto de alquila, no qual o halogênio é um
bromo, um cloro, ou um iodo.
De maneira vantajosa,
R4
é capaz de reagir com um
grupamento carboxil, tiol ou amina. Assim, se o grupamento
30 funcional do polipeptídeo portador que deve intervir na
31/42
operação de conjugação for um tiol,
R4
pode ser um
grupamento maleimida. Da mesma forma, se o grupamento
funcional do polipeptídeo portador que deve intervir na
operação de conjugação é uma amina,
R4
pode ser um
5 grupamento carboxil ou, de preferência, um grupamento Nhidróxi succimidil ou N-hidróxi sulfo-succinimidil.
Quando o espaçador S é
aminotiol tal como a
um
cisteína, a cisteamina, ou a cistamina, o agente de
ligação. L é, de maneira vantajosa, um succinimidil
10 maleimidil alquil. Este pode ser notadamente o ácido y
maleimido butírico N-hidróxi-succinimida éster ou n sulfosuccinimida éster (GMBS ou sulfo-GMBS), o ácido E maleimido
capróico N-hidróxi-succinimida éster (MCS), o succinimidil4-(p-maleimidofenil)-butirato (SMPB) ou o sulfo15 succinimidil-4-(p-maleimidofeni1)-butirato (sulfo-SMPB), o
ácido maleimido benzóico N-hidroxi-succinimida éster (MBS)
ou o ácido maleimido benzóico N-hidroxi-sulfo-succinimida
éster (sulfo-MBS), o ácido 4-(N-maleimidometil) ciclohexano carboxílico N-hidróxi-succinimida éster (SMCC) ou o
20 ácido 4-(N-maleimidometil) ciclo-hexano carboxílico Nhidróxi-sulfo-succinimida éster (sulfo-SMCC).
Quando o espaçador S é um diaminoalquil ou dihidrazida, o agente de ligação L' é vantajosamente
escolhido dentre os compostos
di succinimidyl alkyls
-
ou
25 succinimidyl maleimido alkys de fórmula (XIV) R 3 -B-R4 na
qual B é um grupamento alquil,
succinimidil e
R4 é
R3 é
um grupamento
um grupamento succinimidil ou
maleimido.
O composto disuccinimidil pode ser o di-succinimidil
30 suberato (DSS), o bis (sulfosuccinimidil)suberato (BS 3 ), o
32/42
di-succinimidil glutarato (DSG), o succinimidildiéster do
ácido adípico (SIDEA) ou o succinimidiléster do ácido
succínico. Os grupamentos succinimidiis e/ou sulfo
succinimidil são capazes de reagir com um grupamento amina.
5 O composto succinimidil maleimido alquil pode ser um
daqueles citados mais acima.
Nos processos de conjugação a a j, as etapas de
derivatização, de ativação e de conjugação propriamente
ditas podem ser utilizadas segundo modos operacionais bem
10 conhecidos do técnico. Eles são notadamente descritos na
obra de referência intitulada
(1996) Ed Academic press.
Bioconjugate Techniques
A título de exemplo, será feita
referência a essa obra para indicar que reações de
conjugação que colocam em jogo um grupamento amina e um
15 grupamento carboxil se realizam vantajosamente em presença
de uma carbodiimida.
As etapas de derivatização, de ativação e de
conjugação não têm efeito sobre a estrutura química das
unidades repetitivas do poli-sacarídeo.
20
Os conjugados obtidos segundo um dos processos a a j
podem ser finalmente purificados, isto é, por precipitação
ao sulfato de amônio, por ultrafiltragem, cromatografia de
exclusão-difusão ou por cromatografia de divisão, de forma
a eliminar as frações poli-sacarídica e protéica residuais
25 não conjugadas.
A invenção tem também por objeto uma composição
farmacêutica para um uso terapêutico ou profilático,
compreendendo um poli-sacarídeo, de acordo com a invenção,
de forma preferida sob a forma de um conjugado. Este pode
30 ser formulado com um diluente ou um suporte aceitável de um
33/42
ponto de vista farmacêutica, isto é, um tampão fosfato, e,
se for o caso, um excipiente de liofilização. Em geral,
esses produtos podem ser selecionados em função do modo e
da via de administração e segundo as práticas farmacêuticas
5 padrão. Os diluentes apropriados, assim como o que é
indispensável à elaboração de uma composição farmacêutica
são descritos em
Remington's Pharmaceutical Sciences,
servindo de referência padrão nesse domínio. A composição
pode também conter um adjuvante, isto é, um hidróxido de
10 alumínio, um fosfato de alumínio ou um hidroxifosfato de
alumínio. Pode-se também utilizar um conservante, tal como
o fenoxietanolformol. Uma dose vacinal pode ser preparada
sob um volume de 0,1 ml a 2 ml, de forma preferida sob um
volume de 0,5 ml. A título de exemplo, indica-se que uma
15 dose pode conter 0,475 mg de íon PO 4 2- , 4,5 mg de cloreto de
sódio e eventualmente 300 gg de íons AL3+ . A composição
vacinal, de acordo com a invenção, pode ser também
associada a outros antígenos vacinais, notadamente
antígenos poli-sacarídicos do pneumococo conjugados ou não
20 a um portador polipeptídico. Obtém-se então uma vacina
multivalente contra o pneumococo, na qual o poli-sacarídeo
do pneumococo tipo 5 está sob uma das formas descritas na
invenção.
A invenção tem também por objeto um método de
25 tratamento ou de prevenção contra as infecções com
pneumococo tipo 5, que consiste em administrar em bebês,
jovens crianças, adultos ou pessoas idosas, uma dose
suficiente de uma composição, de acordo com a invenção,
eventualmente adjuvantada, para induzir uma resposta imune
30 específica protetora contra esse patógeno. O método é
34/42
aplicado por administração de pelo menos uma dose vacinal
da composição, de acordo com a invenção. Por exemplo,
podem-se praticar entre 1 e 3 injeções, mas, de
preferência, se praticam 3 injeções, respeitando um prazo
5 de um mês entre cada injeção. Uma composição, de acordo com
a invenção, pode ser administrada por qualquer via
convencional em uso no domínio das vacinas, em particular
por via sistêmica, isto é, parenteral, por exemplo, por via
subcutânea, intramuscular, intradérmica - ou intravenosa; ou
10 por via mucosa, por exemplo, por via oral ou nasal. A
quantidade administrada considera o polipeptídeo portador
utilizado ou da via de administração. A título de exemplo,
a dose de poli-sacarídeo necessária contínua no conjugado
para observar uma imunidade protetora face ao sorotipo 5
15 consecutiva a uma administração parenteral está
compreendida geralmente entre 0,5 gg e 10 gg; mas de forma
preferencial entre 0,5 e 5 gg, e de forma ainda mais
preferida entre 0,5 gg e 2 gg, quando a proteína portadora
é a anatoxina tetânica. Sob uma forma não conjugada, a dose
20 de poli-sacarídeo necessária está compreendida entre 10 e
50 gg de forma preferida entre 20 e 30 gg.
A presente invenção será melhor compreendida à luz dos
exemplos seguintes que servem para ilustrar a invenção sem
para tanto limitar o seu conteúdo.
25
A figura 1 representa os espectros RMN de um polisacarídeo aminado,
segundo diferentes processos de
produção.
O primeiro espectro é aquele do poli-sacarídeo do
pneumococo tipo 5 fragmentado após despolimerização
30 oxidativa radicalar. Identificam-se nas zonas dos altos
35/42
campos do espectro os sinais de ressonância dos carbonos
metílicos das 3 hexosaminas N-acetilados da unidade
repetitiva do poli-sacarídeo: a fucosamina N acetilada (C6
FucNAc), a pneumosamina N acetilado (C6 PneNAc) eo Sug (C6
5
Sug).
O segundo espectro é aquele do poli-sacarídeo aminado,
obtido de acordo com o segundo processo objeto da invenção.
Observa-se o desaparecimento do sinal correspondente ao Sug
(C6 Sug) e o aparecimento de um novo sinal correspondente à
10 quinovosamina N acetilada (C6 QuiNAc).
O terceiro espectro é aquele do poli-sacarídeo
aminado, obtido de acordo com o primeiro processo objeto da
invenção. Ele é idêntico ao espectro RMN do poli-sacarídeo
fragmentado não aminado.
15
O quarto espectro é aquele do poli-sacarídeo aminado
em condições clássicas. Nota-se a presença de dois sinais
adicionais na zona dos altos campos do espectro,
correspondente à quinovosamina N acetilado e ao composto X,
assim como a uma diminuição da altura do sinal
20 correspondente ao Sug.
A figura 2 representa o cromatograma obtido por HPAECPAD do poli-sacarídeo nativo despolimerizado (curva em
traço contínuo), do poli-sacarídeo aminado, conforme o
processo clássico de aminação redutora (curva em
25 tracejado), segundo o primeiro processo objeto da invenção
(curva em tracejado) o conforme o segundo processo objeto
da invenção (curva em tracejado pontilhado)
EXEMPLO 1: aminação redutora com pH 6, durante 2 horas, do
poli-sacarídeo capsular do pneumococo tipo 5, após
30
fragmentação.
36/42
a)
Despolimerização radicalar do poli-sacarídeo do
pneumococo tipo 5 nativo
O poli-sacarídeo com uma concentração de 2,5 mg/ml em
solução aquosa é fragmentada pelo ácido ascórbico, do
5 sulfato ferroso, assim como do sulfato cúprico. A
quantidade em número de mmoles de ácido ascórbico é cem
vezes superior àquela do sulfato ferroso e do sulfato
cúprico. A relação ponderal entre o ácido ascórbico e o
poli-sacarídeo é de 0,1. A incubação da mistura reacional é
10 feita em banho-maria a 30 °C e protegido da luz durante 1
hora e 30. O poli-sacarídeo hidrolisado é purificado por
precipitação no etanol a 80 % seguida de uma centrifugação.
O resíduo de centrifugação é dialisado, depois liofilizado.
O tamanho médio do poli-sacarídeo fragmentado é de
15 aproximadamente 30-35 unidades repetitivas, tal como medida
por cromatografia de exclusão com tripla detecção
(Viscoteck).
b) Aminação redutora do poli-sacarídeo
O poli-sacarídeo fragmentado é recolocado em solução
20 em um tampão citrato/fosfato 0,2 M, pH 6 a uma concentração
de 10 mg/ml em presença de cloridrato de diamino-hexano
(DAH) (Aldrich) e de cianoboro-hidreto de sódio (NaCNBH 3 )
(Sigma). As relações ponderais poli-sacarídeo / cloridrato
de DAH e NaCNBH 3 / cloridrato de DAH são respectivamente de
25 0,8 a 0,1. A incubação da mistura reacional é feita a 50 °C
em banho-maria durante 2 horas. A reação é em seguida
parada por precipitação do poli-sacarídeo aminado no etanol
a 80% seguida de uma centrifugação. O resíduo de
precipitação é em seguida retomado por NaC1 0,5 M à razão
30 de 10 mg/ml em poli-sacarídeo, depois submetido a 8 banhos
37/42
de diálise sucessivos (4 primeiros banhos feitos em uma
solução de NaC1 0,5 M seguidos de 4 banhos feitos na água
ultrafiltrada). O poli-sacarídeo derivatisado e assim
aminado é finalmente liofilizado.
5
EXEMPLO 2: aminação redutora do poli-sacarídeo capsular do
pneumococo de tipo 5, após redução e fragmentação
a) Redução e fragmentação do poli-sacarídeo nativo
A 10 ml de uma solução aquosa de poli-sacarídeo nativo
a 10 mg/ml ajustada com pH 9 + 0,5 com amoníaco 1N,
10 acrescentam-se 10 mg de boro-hidreto de sódio (NaBH 4 ),
depois se deixa o meio reacional à temperatura ambiente
durante 2 horas à obscuridade. O NaBH4 é em seguida
destruído por adição de algumas gotas de ácido acético
glacial. Dialisa-se em seguida o poli-sacarídeo reduzido
15 contra água, depois se fragmenta-o, utilizando-se o
protocolo descrito no parágrafo a) do exemplo 1. Obtém-se
um poli-sacarídeo, contendo em média 30-35 unidades
repetitivas. O poli-sacarídeo reduzido e fragmentado é na
seqüência liofilizado.
20
b) Aminação redutora do poli-sacarídeo reduzido e
fragmentado.
O poli-sacarídeo reduzido e fragmentado é recolocado
em solução em um tampão fosfato 0,2 M, pH 7,5 a uma
concentração de 10 mg/ml em presença de cloridrato de
25 diamino-hexano (DAH) e de cianoboro-hidreto de sódio
(NaCNBH3) preparado extemporaneamente. As relações
ponderais poli-sacarídeo/cloridrato de DAH e
NaCNBH3 /cloridrato de DAH são respectivamente de 0,8 e 0,1.
A incubação da mistura reacional é feita a 50 °C em banho30 marfa durante 48 a 72 horas. O poli-sacarídeo aminado é em
38/42
seguida purificado no etanol a 80 % seguida de uma
centrifugação. O resíduo de precipitação é retomado por
NaC1 0,5 M à razào de 10 mg/ml em poli-sacarídeo, depois
submetido a 8 banhos de diálise sucessivos (4 primeiros
5 banhos realizados em uma solução de NaC1 0,5 M seguidos de
4 banhos realizados na água ultrafiltrada). O polisacarídeo derivatizado e assim aminado é finalmente
liofilizado.
EXEMPLO 3: produção e estudo do poder imunógeno dos
10
conjugados obtidos a partir dos poli-sacarídeos
derivatizados e aminados dos exemplos 1 e 2.
a) Produção dos conjugados
Os poli-sacarídeos aminados dos exemplos 1 e 2 são
conjugados à anatoxina tetânica (ATT) por intermédio do
15 DSS. Em uma primeira etapa, ativa-se o poli-sacarídeo
aminado com DSS, depois se conjuga a anatoxina tetânica ao
poli-sacarídeo ativado.
O poli-sacarídeo aminado do exemplo 1 ou 2 é retomado
em solução aquosa a uma concentração de 40 mg/ml. O DSS é
20
retomado em uma solução de DMSO à razão de 5 mg/ml.
Acrescentam-se, gota a gota, 2,5 ml de uma solução aquosa
do poli-sacarídeo aminado em 10 ml da solução DSS sob
agitação. Após 1 h 30 de incubação, a reação é parada por
precipitação em 50 ml de acetona. Recupera-se o precipitado
25 por filtragem sobre Büchner N ° 5, que se lava em seguida 5
vezes por 20 a 50 ml de acetona. Seca-se em seguida o
precipitado sob vácuo, depois sob corrente de nitrogênio.
O precipitado contendo o poli-sacarídeo derivatizado é
retomado por um volume adequado de uma solução de anatoxina
30 tetânica a 10 mg/ml em um tampão fosfato 0,2 M de modo que
39/42
a razão ponderal entre o poli-sacarídeo derivatizado e a
anatoxina tetânica esteja compreendida entre 1 e 2. A
mistura é incubada à temperatura do laboratório, sob
agitação durante 16 a 20 horas. A reação é em seguida
5 parada por precipitação ao sulfato de amônio a 70 % após
diluição em 14 da mistura em um tampão fosfato 0,2 M. O meio
contendo precipitado é agitado durante 1 hora à temperatura
do laboratório, depois durante 4 a 20 horas a + 4 °C. Após
ter coletado o precipitado por centrifugação, este é
10 finalmente retomado e dissolvido em um tampão fosfato 0,2
M. A solução do conjugado é obtida sob uma forma
praticamente pura. As quantidades de anatoxina tetânica e
de poli-sacarídeo não conjugados são desprezíveis. A
solução é finalmente ajustada à concentração desejada com
15 vistas a uma utilização vacinal. A razão polisacarídeo/proteína no conjugado é de 1/5.
b) Estudo do poder imunógeno dos conjugados
O poder imunógeno dos conjugados assim obtidos é
comparado com aquele de um conjugado que faz uso de um
20 poli-sacarídeo capsular do pneumococo de tipo 5,
previamente submetido a uma aminação redutora clássica,
descrita como se segue: o poli-sacarídeo nativo é
inicialmente fragmentado por despolimerização radicalar,
segundo o protocolo operacional do parágrafo a) do exemplo
25 1. Obtém-se um poli-sacarídeo despolimerizado contendo 3035 unidades repetitivas. Depois o poli-sacarídeo
fragmentado é submetido a uma aminação redutora, segundo o
protocolo operacional do parágrafo b) do exemplo 2. O polisacarídeo aminado é em seguida conjugado à anatoxina
30 tetânica por intermédio do DSS nas condições operacionais
40/42
do parágrafo a) do exemplo 3. O conjugado assim obtido tem
as mesmas características de pureza e é utilizável como
vacina. A proporção poli-sacarídeo/proteína no conjugado é
de 1/5.
5
Quinze coelhos NZB repartidos em 3 grupos distintos
receberam por via intramuscular nos dias Dl e D23 um dos 3
conjugados poli-sacarídicos à razão de 0,5 gg de polisacarídeo e de 2,5 gg de anatoxina tetânica por coelho e
por injeção. O grupo 1 foi imunizado com o conjugado obtido
10 a partir do poli-sacarídeo aminado do exemplo 1, o grupo 1
como conjugado obtido a partir do poli-sacarídeo aminado do
exemplo 2, o grupo 3 com o conjugado obtido a partir do
poli-sacarídeo aminado, de acordo com um processo clássico
tal como descrito no parágrafo precedente do presente
15 exemplo. Um grupo de coelhos "prova" recebeu no Dl e D23 do
soro fisiológico por via intramuscular.
Retiradas de sangue foram feitas no Dl, D23 e D36 para
controlar as taxas de anticorpos séricos específicos do
poli-sacarídeo do pneumococo tipo 5 por ELISA sobre
20 microplacas sensibilizadas com poli-sacarídeo tipo 5 por
ELISA sobre microplacas sensibilizadas com poli-sacarídeo
nativo de pneumococo tipo 5 (1 gg/micropoço). As taxas de
anticorpos contidos em cada coelho foram definidos como
sendo o inverso da diluição do soro que dá uma densidade
25 óptica de 1 ao espectrofotômetro após a revelação do teste
ELISA com o auxílio de um indicador colorido o
trimetilbenzidina. Os resultados foram agrupados na tabela
1 a seguir:
Grupo
Dl
1
< 10
D23
239*
(122-469)**
D36
2824
(1758-4535)
41/42
2
< 10
110
3
< 10
57
Prova
<10
(74-164)
(29-113)
2929 (1180-7270)
423
(166-1078)
< 20
< 20
* Representa a média geométrica das taxas de anticorpos
séricos específicos dos 5 coelhos.
** Indica o valor da taxa de anticorpos o mais baixo e o
valor da taxa a mais elevada em cada grupo.
5
Após duas imunizações, os valores médios das taxas de
anticorpos específicos dos coelhos imunizados com os
conjugados obtidos a partir dos poli-sacarídeos aminados
dos exemplos 1 e 2 são aproximadamente 5 vezes superiores
àquele dos coelhos imunizados com um conjugado obtido a
10 partir de um poli-sacarídeo aminado segundo um processo
clássico de aminação redutora.
Quando se faz variar as razões ponderais polisacarídeo / anatoxina tetânica em uma faixa que vai de
1/0,5 a 1/5, os resultados que são obtidos no teste
15 anteriormente descrito são em qualquer ponto semelhantes.
A funcionalidade desses anticorpos é controlada por um
teste de opsonofagocitose. O título opsonizante é definido
como sendo o inverso da diluição do soro que permite matar
50 % das bactérias. Os resultados foram agrupados na tabela
20
II a seguir:
D36
Grupo
Dl
D23
1
n.t
7* (3-18) **
128
(27-599)
2
n.t
2(2-3)
185
(60-565)
3
n.t
2(1-5)
35
Prova
n.t
n.t
(11-110)
n.t.
* Representa a média geométrica dos títulos opsonizantes
dos 5 coelhos.
42/42
** Indica o valor do título opsonizante o mais baixo e o
valor do título o mais elevado em cada grupo.
n.t . : não titulado.
Os títulos opsonizantes se correlacionam com os
5 títulos anticorpos séricos específicos do poli-sacarídeo do
pneumococo tipo 5.
•• •
1/9
• • • ••
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•
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• • • •
• • •
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•
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REIVINDICAÇÕES
1. Poli-sacarídeo capsular do pneumococbo de tipo
5
aminado ao nível do grupamento aldeído terminal
caracterizado pelo fato de apresentar (I) um espectro RMN
5
do Carbono ( 13 C) desprovido de sinal de ressonância entre
13 e 14 ppm limites incluídos; (II) um cromatograma HPAECPAD,
substancialmente desprovido de pico entre os picos de
fucosamida e de pneumosamina, o cromatograma sendo obtido
por purificação a partir de uma coluna Carbopac TM PA 10, em
10 uma solução de soda 18 nM, a uma vazão de 1 ml/min durante
15
minutos, mono-sacarídeos oriundos da hidrólise desse
poli-sacarídeo; ou (III) os dois.
2. Poli-sacarídeo, de acordo com a reivindicação 1,
caracterizado pelo fato de apresentar:
15
(I)
um espectro RMN do Carbono que compreende
sinal de ressonância entre
e
11,5
12,5
um
ppm, limites
incluídos, característica do composto Sug, e um sinal de
ressonância situado entre 17 e
18
ppm limites incluídos,
característica da quinovosamina N acetilada, cuja
20
intensidade é menor por comparação com o sinal situado
entre 17 e 18 ppm, limites incluídos, no espectro RMN 13 C
de um poli-sacarídeo capsular do pneumococo de tipo
5
obtido após aminação redutora, em presença de cianoborohidreto de sódio, com pH 8, durante 48 horas; ou
25
(II)
um cromatograma
HPAEC-PAD
obtido nas condições
específicas na reivindicação 1, que compreende um pico
situado imediatamente após o pico da pneumosamina,
característica da quinovosamina, cuja intensidade é menor
por comparação com o pico equivalente no cromatograma
30
HPAEC-PAD
de um poli-sacarídeo capsular do pneumococo de
2/9
tipo 5 obtido após aminação redutora, em presença de
cianoboro-hidreto de sódio, com pH 8, durante 48 horas; ou
(III) os dois.
3. Poli-sacarídeo, de acordo com a reivindicação 1 ou
5 2,
caracterizado pelo fato de apresentar (I) um espectro
RMN do Carbono inteiramente desprovido de sinal de
ressonância entre 17 e 18 ppm; (II) um cromatograma HPAECPAD desprovido do pico da quinovosamina, o pico observado
com o poli-sacarídeo, aminado segundo um processo de
10 aminação clássica, sendo reduzido até ser apenas um simples
rebordo do pico precedente (pico da pneumosamina), o
cromatograma sendo obtido nas condições especificadas na
reivindicação 1; ou (III) os dois.
4.
Poli-sacarídeo
15 reivindicação 1,
aminado,
de
acordo
com a
caracterizado pelo fato de apresentar:
(I) um espectro RMN do Carbono que compreende um sinal
de ressonância entre 11,5 e 12,5 ppm, limites incluídos,
característica do composto Sug, que compreende um sinal de
ressonância situado entre 17 e 18 ppm limites incluídos,
20 característica
da
quinovosamina N acetilada,
cuja
intensidade é menor por comparação com o sinal situado
entre 17 e 18 ppm, limites incluídos, no espectro RMN
de um poli-sacarídeo capsular do pneumococo de tipo 5
obtido após aminação redutora, em presença de cianoboro25 hidreto de sódio, com pH 8, durante 48 horas; ou
(II) um cromatograma HPAEC-PAD que compreende um pico
situado imediatamente após o pico da pneumosamina,
característica da quinovosamina, cuja intensidade é
aumentada por comparação com o pico equivalente no
30 cromatograma HPAEC-PAD de um poli-sacarídeo capsular do
3/9
pneumococo de tipo 5 obtido após aminação redutora, em
presença de cianoboro-hidreto de sódio, com pH 8, durante
48 horas, o cromatograma sendo obtido nas condições
especificadas na reivindicação 1; ou
5
(III) os dois.
5. Poli-sacarídeo capsular do pneumococo de tipo 5
aminado ao nível do grupamento aldeído terminal,
caracterizado pelo fato de ser constituído de unidades
repetitivas, das quais pelo menos 85 % das unidades
10 repetitivas correspondem à fórmula (II):
na qual A é de maneira independente e aleatória C=0 ou
CHOH.
6. Poli-sacarídeo, de acordo com a reivindicação 5,
caracterizado pelo fato de pelo menos 90 % das unidades
15 repetitivas corresponderem à fórmula (II).
7. Poli-sacarídeo, de acordo com a reivindicação 6,
caracterizado pelo fato de pelo menos 95 % das unidades
repetitivas corresponderem à fórmula (II).
8.
Poli-sacarídeo, de acordo com qualquer uma das
20 reivindicações 5, 6 ou 7,
caracterizado pelo fato de pelo
menos 95% das unidades repetitivas corresponderem à fórmula
4/9
(II) correspondentes à fórmula II:
C OH •
043
ÇO
5
eNac
'
HO
HO
CO
O
HO
Ti
aL-PneNAc
(Ir
OH
ÇO
CH3
na qual A é CHOH.
9.
Poli-sacarídeo, de acordo com qualquer uma das
reivindicações 5, 6 ou 7,
caracterizado pelo fato de 85 a
5 95 % das unidades repetitivas corresponderem à fórmula II:
na qual A é C=O.
10. Conjugado de um poli-sacarídeo de qualquer uma das
reivindicações 1 a 9,
caracterizado pelo fato ser acoplado
a um polipeptídeo portador (P).
10
11. Processo de produção de um polipeptídeo capsular
do pneumococo de tipo 5 aminado,
caracterizado pelo fato de
se submeter o poli-sacarídeo a uma aminação redutora em
5/9
presença de um agente redutor seletivo de uma base de
Schiff, com um pH de 4 a 6,5, por uma duração que não
excede 4 horas.
12.
5
Processo, de acordo com a reivindicação 11,
caracterizado pelo fato de se submeter o poli-sacarídeo a
uma aminação redutora com um pH de 5 a 6.
13. Processo, de acordo com a reivindicação 11 ou 12,
caracterizado pelo fato de se submeter o poli-sacarídeo a
uma aminação redutora por uma duração que não excede 2
10 horas.
14. Processo, de acordo com a reivindicação 11, 12 ou
13, caracterizado pelo fato de o agente redutor seletivo de
uma base de Schiff ser o cianoboro-hidreto ou o complexo
piridina borano.
15. Processo de produção de um poli-sacarídeo capsular
15
do pneumococo de tipo 5 aminado, caracterizado pelo fato de
(I) se fazer reagir o poli-sacarídeo com um agente capaz de
reduzir uma função cetona, (II) se fragmentar o polisacarídeo reduzido e (III) se submeter o poli-sacarídeo
20 reduzido e fragmentado a uma aminação redutora.
16. Processo, de acordo com a reivindicação 15,
caracterizado pelo fato do poli-sacarídeo colocado para
reagir com o agente capaz de reduzir uma função cetona
estar sob a forma nativa.
17. Processo, de acordo com a reivindicação 15 ou 16,
25
caracterizado pelo fato do agente capaz de reduzir uma
função cetona ser o NaBH4.
18. Processo, de acordo com a reivindicação 15, 16 ou
17,
caracterizado pelo fato de se fragmentar o poli-
30 sacarídeo
reduzido
por
despolimreização
radicalar
6/9
oxidativa.
19. Processo de produção de um conjugado de fórmula
Ps-CH 2 -NH-P,
caracterizado pelo fato de se utilizar o
processo de qualquer uma das reivindicações 11 a 14, no
5 qual o poli-sacarídeo capsular do pneumococo de tipo 5 (Ps)
reduzido e fragmentado é acoplado por aminação redutora com
um polipeptídeo portador (P) em presença de um agente
redutor seletivo de uma base de Schiff, com um
6,5,
e de preferencia de
5
a
6
pH de 4 a
por uma duração que não
10 excede 4 horas.
20. Processo de produção de um conjugado de fórmula
Ps-CH 2 -NH-P,
caracterizado pelo fato de se utilizar o
processo de qualquer uma das reivindicações
15
a 18, no
qual o poli-sacarídeo capsular do pneumococo de tipo 5 (Ps)
15
reduz o fragmento que está acoplado por aminação redutora
com um polipeptídeo portador (P).
21. Processo de produção de um conjugado de fórmula
Ps-CH 2 -NH-L-P,
caracterizado pelo fato de:
(I) se utilizar o processo, de acordo com uma das
20
reivindicações 11 a 14, no qual o poli-sacarídeo capsular
do pneumococo de tipo
5 (Ps)
redutora a um agente de ligação
é acoplado por aminação
(L)
que possui pelo menos
uma função amina primária, para formar um poli-sacarídeo
aminado e ativado de formula
Ps-CH 2 -NH-L,
e acoplado a um
25 poli- sacarídeo ativado a um polipeptídeo portador (P), a
fim de se obter o conjugado de fórmula
Ps-CH2 -NH-L-P; ou
alternativamente,
(II) se utilizar o processo, de acordo com uma das
reivindicações 11 a 14, no qual o poli-sacarídeo capsular
30 do pneumococo de tipo
5 (Ps)
é acoplado por aminação
7/9
redutora a um polipeptídeo portador ativado de fórmula L-P,
na qual L é um agente de ligação que possui pelo menos uma
função amina primária, a fim de se obter o conjugado de
fórmula Ps-CH2 -NH-L-P.
22.
5
Processo de produção de um conjugado de
fórmula Ps-CH 2 -NH-L-P, caracterizado pelo fato de:
(I) a) se utilizar o processo, de acordo com uma das
reivindicações
15
a 18, no qual o poli-sacarídeo capsular
do pneumococo de tipo
5 (Ps)
reduzido e fragmentado é
10 acoplado por aminação redutora a um agente de ligação
(L)
que possui pelo menos uma função amina primária, para
formar um poli-sacarídeo aminado e ativado de fórmula PsCH 2 -NH-L;
b)
15
e
se acoplar o poli-sacarídeo ativado a um
polipeptídeo portador (P), a fim de se obter o conjugado de
fórmula Ps-CH 2 -NH-L-P; ou alternativamente;
(II) se utilizar o processo, de acordo com uma das
reivindicações
15
a 18, no qual o poli-sacarídeo capsular
do pneumococo de tipo
20
5 (Ps)
reduzido e fragmentado ser
acoplado por aminação redutora a um polipeptídeo portador
ativado de fórmula L-P,
na qual L é um agente de ligação
que possui pelo menos uma função amina primária, a fim de
se obter o conjugado de fórmula Ps-CH2-NH-L-P.
23.
Processo de fabricação de um conjugado de fórmula
25 Ps-CH 2 -NH-S-L'-P,
caracterizado pelo fato de:
(I) a) se utilizar o processo, de acordo com uma das
reivindicações 11 a 14, no qual o poli-sacarídeo capsular
do pneumococo de tipo
5 (Ps)
é acoplado por aminação
redutora a um espaçador (S) possuindo pelo menos uma função
30
amina primária, para formar um poli-sacarídeo aminado e
8/9
derivatizado de fórmula Ps-CH 2 -NH-S; e
b) se acoplar o poli-sacarídeo derivatizado com um
agente de ligação
(L'),
ativado de fórmula
a fim de se obter um poli-sacarídeo
Ps-CH 2 -NH-S-L',
depois se acoplar o
5 poli-sacarídeo ativado com polipeptídeo portador (P), a fim
de se obter o conjugado de fórmula
Ps-CH 2 -NH-S-L'-P; ou
alternativamente;
(II) b) se acoplar o poli-sacarídeo derivatizado, com
um polipeptídeo portador ativado de fórmula L'-P,
10 L'
na qual
é um agente de ligação, a fim de se obter o conjugado de
fórmula Ps-CH 2 -NH-S-L'-P.
24. Processo de produção de um conjugado de fórmula
Ps-CH 2 -NH-S-L'-P,
a)
caracterizado pelo fato de:
se utilizar o processo, de acordo com uma das
15 reivindicações 15 a 18, no qual o poli-sacarídeo capsular
do pneumococo de tipo 5 (Ps) reduzido e fragmentado é
acoplado por aminação redutora a um espaçador (S) que
possui pelo menos uma função amina primária, para formar um
poli-sacarídeo aminado e derivatizado de fórmula Ps-CH 2 -NH20
S; e
b)
se acoplar o poli-sacarídeo derivatizado com um
agente de ligação (L'), a fim de se obter um poli-sacarídeo
ativado de fórmula
Ps-CH 2 -NH-S-L',
depois se acoplar o
poli-sacarídeo ativado com um polipeptídeo portador (P), a
25 fim de se obter o conjugado de fórmula Ps-CH2 -NH-S-L'-P; ou
alternativamente,
(II) b) se acoplar o poli-sacarídeo derivatizado, com
um polipeptídeo portador ativado de fórmula L'-P,
L'
na qual
é um agente de ligação, a fim de se obter o conjugado de
30 fórmula Ps-CH 2 -NH-S-L' -P.
9/ 9
25. Processo, de acordo com qualquer uma das
caracterizado pelo
reivindicações 19, 20, 21, 22, 23 ou 24,
fato do polipeptídeo portador P ser a anatoxina diftérica
ou tetânica.
5
26. Processo, de acordo com a reivindicação 21 ou 22,
caracterizado pelo fato do agente de ligação (L) ser um
composto de fórmula R 1 -A-R2 , na qual:
A designa uma cadeia alifática, aromática ou uma
cadeia mista alifática e aromática, substituída ou não,
10 saturada ou insaturada;
R1 designa uma amina primária ou um radical químico
portador de uma amina primária; e
R2 designa um grupamento funcional capaz de reagir com
um grupamento carboxila, tiol ou amina.
15
27. Processo, de acordo com a reivindicação 26,
caracterizado pelo fato do agente de ligação
(L)
ser um
alquil, di-hidrazida ou um diaminoalquil.
28. Processo, de acordo com a reivindicação 23 ou 24,
caracterizado pelo fato do espaçador ser um aminotiol e o
20 agente de ligação L' ser um succinimidil maleimidil alquil.
29. Processo, de acordo com a reivindicação 23 ou 24,
caracterizado pelo fato do espaçador ser um diaminoalquil
ou um di-hidrazida, e o agente de ligação L'
ser escolhido
dentre os compostos di-succinimidil alquiis ou succinimidil
25 maleimido alquiis de fórmula (XIV) R 3 -B-R4 , na qual B é um
grupamento alquil,
R3 é um grupamento succinimidil e
R4 é
um grupamento succinimidil ou maleimido.
30.
Composição
farmacêutica,
caracterizada
por
compreender o conjugado da reivindicação 10 ou ser obtido
30 pelo processo de qualquer uma das reivindicações 19 a 29.
FIGURA 1
C6 FucNAc
Cl FucNAc
Cl PnevNAc
Cl Sug
Cl Glc
/ C6 PneNAc
/ C6 Sug
Cl GIGA
r(C4 Sug
PS fragmentado
41,44~ffit
C6 QuiPiAc
PS aminado do
;10001.0exemplo 2
PS amimado do
exemplo 1
PS aminado
segundo os
métodos
clássicos
k)
no
150
là
NO
66
-Lsinal característico da guinovosamina
* :Sinal característico do composto X
0
H acetilado
3o
X20 "
gn
Zona de ressonância dos
grupamentos metilas
350
FIGURA 2
390
o
250
200
150
cv
O
1:4 -50
O 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34
Tempo de retenção (min)
345
PneN MuiN
f.
300
S
250
FucN
Pn5
Pn5
Pn5
Pn5
despolimerizado
aminado do exemplo 1
aminado do exemplo 2
aminado clássico
124 200
ro
tl
150
o
W na
1:4
X
50
0,
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0
6.5
7.0
Cromatogramas HPAEC-PAD sobre coluna CarboPac PA 10 do poli-sacarídeo do pneumococo de tipo 5
(Pn5) após hidrólise pelo TFA
Q uiN = quinovosamina
p neN = pneumosamina
X a composto X
Gi c A = ácido glicorônico
di-sacarideo ácido glicorônico - fucosamina
GIGA - FucN
FueN = fucosamina
1/1
•• • • ••
t•. »
J•
e)
•
•
J
•
•
• ,
• • • • •• e • •• ' • •• .•• ••
•• •. •
••
•
•
• • •• • -: • •
•
• •
•
CONJUGADOS OBTIDOS POR AMINAÇÃO REDUTORA DO POLI-SACARÍDEO
CAPSULAR DO PNEUMOCOCO DE SOROTIPO 5
A invenção tem por objeto conjugados oriundos da
aminação redutora do poli-sacarídeo capsular do pneumococo
5 de sorotipo 5. As condições de aminação redutora se
distinguem das condições clássicas pelo fato de permitirem
evitar o aparecimento de um composto, indesejável que é
prejudicial à imunogenecidade dos conjugados. Em
espectrometria RMN do Carbono, esse composto indesejável se
10 caracteriza por um sinal de ressonância entre 13 e 14 ppm.
Os poli-sacarídeos aminados que entram na produção dos
conjugados possuem, portanto, um espectro RMN do Carbono
desprovido de sinal de ressonância entre 13 e 15 ppm. As
condições de aminação redutora oferecidas pela invenção são
15 em número de duas. De acordo com um primeiro processo, a
aminação redutora é conduzida com pH ligeiramente ácido (46,5) durante no máximo 4 horas. De acordo com um segundo
processo, o poli-sacarídeo é inteiramente reduzido, depois
fragmentado e enfim submetido a uma aminação redutora
20 propriamente dita, em condições clássicas ou não. De acordo
com o processo aplicado, a estrutura do poli-sacarídeo
aminado pode variar (conversão ou não do resíduo Sug da
unidade repetitiva em quinovosamina N-acetilada e em
fucosamina N-acetilada); mas essas variações, tais como
25 registradas em espectrometria RMN do Carbono, não têm
efeito sobre a imunogenicidade.
ti