EFEITO DE DIFERENTES FONTES DE NITROGÊNIO NO METABOLISMO
DE Cladonia verticillaris e C. salzmannii
Aluno: Bruno Rafael Monteiro Rodrigues
Nível: Doutorado
Área de Concentração: Ecologia Vegetal
Linha de Pesquisa: Ecofisiologia Vegetal
Orientador: Prof. Dr. Eugênia Cristina Gonçalves Pereira
Colaboradores: Prof. Dr. Carlos Vicente Córdoba
Prof. Dr. Nicácio Henrique da Silva
Prof. Dr. Maria Estrella Legaz
1. INTRODUÇÃO
Apesar do liquens serem conhecidos pela sua plasticidade e diversidade na produção de
compostos, seu reconhecimento na saúde do ecossistema veio apenas nos anos 80. Desde então
diversos estudos têm mostrado a sua utilidade no biomonitoramento. Um exemplo do seu uso no
estudo é no estudo do excesso de nitrogênio em um ecossistema, tema bastante recorrente nas
pesquisas atuais. Porém, pouco foi feito para entender como se processam esses efeitos em nível
metabólico. Portanto o objetivo deste projeto de tese é estudar o efeito do nitrogênio no
metabolismo fotossintético, enzimático e na síntese de compostos fenólicos.
2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA E JUSTIFICATIVA
Os liquens exercem um papel importante dentro dos ecossistemas, participando
da ciclagem dos nutrientes, repassando suas substâncias para o substrato (Vasconcelos
2006), ajudando a manter a microbiota próxima ao solo (Silva 2007). Além disso, atuam
como acumuladores de metais pesados (Mota-Filho et al. 2007), de substâncias
provenientes de combustíveis fósseis (Guidotti et al. 2003), atestando sua capacidade
como biomonitores da qualidade do ar atmosférico. Possuem também uma fundamental
importância na ciclagem de nitrogênio nos ecossistemas afetando a sua biomassa, as
taxas exatas da fixação de nitrogênio e a sua biodisponibilidade no sistema (Nash III
1996). Apenas na década 80, houve um reconhecimento do papel ecológico dos liquens
de solo na manutenção da saúde dos ecossistemas terrestres (Eldridge 1996).
A ação antrópica sobre áreas naturais tem aumentado em taxas sem precedentes
nas ultimas décadas, uma dessas conseqüências é o aumento das fontes nitrogenadas nos
sistemas. Em regiões com uso intenso de fertilizantes, criações de animais ou áreas
industriais a deposição de nitrogênio podem ser muitas vezes maior do que em outras
áreas Por tanto, as pesquisas atuais focam princiapalmente no efeito da saturação de
nitrogênio nos ecossitemas e os liquens se mostram como uma ferramenta crucial no
biomonitoramento destas deposições (Søchting, 1995; Hyvarinen & Crittenden, 1998a,
b; Walker et al. 2003; Curtis et al. 2005; Mitchell et al. 2005; Jovan e Mccune, 2006).
Liquens presentes nestas área de alta deposição de nitrogênio devem apresentar
algum mecanismo para lidar com o excesso de nitrogênio (Miller & Brown, 1999). De
fato, algumas espécies, chamadas de nitrofilas, são características destes locais
(Barkman, 1958), como as Xanthoria parietina que são capazes de suportar altas doses
desse composto (Gaio- Oliveira et al. 2004b, 2005a, b). Já outras se apresentam
extremamente sensíveis, experimentos com fetilização em campo foi verificado que a
introdução desse composto acarretou no o desaparecimento de diversas espécies de
Cladonia do local (Van Dobben, 1993). Em um outro trabalho, em uma área enriquecida
10 anos com nitrogênio foi visto que liquens como Alectoria nigricans e Cetraria
ericetorum apresentação uma diminuição em sua cobertura e vários apresentaram
descoloração (Fremstad et al. 2005).
Contudo, são escassos os relatos científicos a respeito dos seus efeitos desta
adição de nitrogênio sobre o metabolismo liquênico (Brown 1992; Xavier-Filho et al.
2006), sendo praticamente nulo para espécies tropicais. Portanto o objetivo deste projeto de
tese é estudar o efeito do nitrogênio no metabolismo fotossintético, enzimático e na síntese de
compostos fenólicos.
3. METODOLOGIA
As amostras com aproximadamente 3 g de talos secos de cada uma das espécies
Cladonia verticilaris e Cladonia salzmanii serão colocadas em placas de Petri à temperatura
controlada (25 oC ). As placas serão separadas por tratamento contendo água destilada
(controle), 10, 50, 100 e 200 mM de nitrato de cálcio e nas mesmas concentrações de
uréia. Cada concentração será feita com n=10 em triplicata. As análises realizadas serão
descritas nos capítulos a seguir.
CAPÍTULO 1: INFLUÊNCIA DE DIFERENTES FONTES DE NITROGÊNIO NA
PRODUÇÃO DE METABÓLITOS SECUNDÁRIOS
- Objetivo
- Verificar modificações na quantidade fenóis majoritários de Cladonia verticilaris e Cladonia
salzmanii em diferentes formas químicas e concentrações de nitrogênio
- Hipóteses
- As diferentes formas de administração de nitrogênio de afetarão a produção de fenóis nas espécies
estudadas
- Materiais e Métodos
- Obtenção de extratos
As amostras dos talos serão submetidas a extrações sucessivas por esgotamento
à temperatura ambiente (28 ± 3ºC). A primeira extração será realizada com éter
dietílico, onde a infusão será mantida por 1h em agitador mecânico e acondicionada por
24h a 10ºC. Após filtragem, o processo será repetido e, ao resíduo da filtração, será
adicionado clorofórmio, repetindo-se o mesmo procedimento. Por último o material será
extraído com acetona. Os extratos serão evaporados à temperatura ambiente e mantidos
em dessecador até manutenção do peso constante.
- Análises químicas
- Ensaios em Cromatografia em Camada Delgada – CCD
Os extratos orgânicos obtidos do líquen, serão submetidos à CCD, posteriormente
desenvolvidas no sistema de solventes A (tolueno/dioxano/ácido acético, 180:45:5, v/v)
para C. salzmanii e B (hexano/éter dietílico/ácido fórmico, 130:80:20, v/v) para C.
verticilaris (Culberson 1972). Após evaporação dos solventes as placas serão reveladas
sob luz UV curta e longa, e posteriormente pulverizadas com ácido sulfúrico a 20%, e
aquecidas a 100ºC por 1h. Os resultados serão avaliados mediante valores de Rf das
amostras testadas e dos padrões.
- Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)
Os ensaios serão realizados em cromatógrafo líquido de alta eficiência, acoplado a
um detector de UV CG. As condições de cromatografia serão, segundo Legaz &
Vicente (1983). Os resultados serão avaliados mediante a determinação do tempo de
retenção (TR) das substâncias na coluna e a área dos picos, respectivamente. A
quantificação dos fenóis nas amostras será realizada mediante curva de calibração,
utilizando os padrões específicos.
CAPÍTULO 2: EFEITO DE DIFERENTES FONTES DE NITROGÊNIO NO
METABOLISMO FOTOSSINTÉTICO
Objetivo
- Verificar mudanças no metabolismo fotossintético em Cladonia verticilaris e Cladonia
salzmani submetidas a diferentes tratamentos com compostos nitrogenados.
- Analisar as trocas gasosas e fluorescência da clorofila a
- Analisar mudanças na produção de carboidratos
- Quantificar e qualificar pigmentos fotossintéticos
- Hipóteses
- As fontes de nitrogênio afetarão de formas diferentes o metabolismo fotossintético
- O fornecimento de fontes de nitrogênio exógeno irá aumentar a capacidade fotossintética do líquen
- Materiais e Métodos
• Trocas gasosas e Fluorescência da Clorofila a
A taxa de assimilação líquida de carbono será mensurado com um analisador de
gases a infravermelho portátil. Já os parâmetros de fluorescência da clorofila a serão
com realizados com um fluorômetro portátil de pulso modulado.
• Quantificação de carboidratos
Para análise de açúcares totais serão utilizados 100mg de talo fresco macerados em etanol 80%. Esse
extrato será centrifugado a 15000g e o sobrenadante será retirado para análise. Parte do sobrenadante
será analisada pela técnica do fenol-ácido descrita por Dubois e colaboradores (1956). O resultado
será expresso em mmol de carboidratos por grama matéria fresca.
• Quantificação de pigmentos fotossintéticos
Amostras de 1g talo serão lavadas com acetona e CaCo3 (6-10 vezes), de modo a remover
substâncias liquênicas que influenciem na quantificação da clorofila (Brown & Hooker 1977).
Posteriormente esses fragmentos serão macerados e o produto será centrifugado a 5000
rpm por 10 min. O pellet será lavado com acetona de 2-3 vezes para garantir a total
retirada dos pigmentos. O volume final será colocado em um balão de 10 ml para
normatização e as leituras do sobrenadante em espectrofotômetro utilizando as equações
de Porra (2002).
CAPÍTULO 3: EFEITO DE DIFERENTES FONTES NITROGENADAS NA
ATIVIDADE ENZIMAS LIGADAS AO METABOLISMO DO NITROGÊNIO
- Objetivo
- Verificar alterações na atividade de enzimas ligadas ao metabolismo do nitrogênio
(urease, glutamina sintetase, nitrato redutase, glutamato desidrogenase)
- Quantificação de aminoácidos, proteínas solúveis totais
- Verificar a localização exata das enzimas no talo
- Hipóteses
- O suprimento de nitrogênio exógeno irá aumentar a expressão e a atividade de enzimas do ciclo de
nitrogênio.
- Materiais e Métodos
• Analise da atividade enzimática
- Atividade da glutamina sintetase (GS) e Glutamato desidrogenase (GDH)
Uma amostra de 150 mg de talo será macerada com tampão de extração (pH 8)
contendo 25 mM de Tris, 1 mM de EDTA, 1 mM de DTT, 1 mM de mercaptoetanol, 1
mM de glutationa reduzida, 10 MgSO4, 5 mM de glutamato, 2% PVPP e 0,01% de
Triton-X. A suspensão será centrifugada a 16000g por 20 min a 4 ºC, sendo o
precipitado descartado. A atividade biossintética da GS e GDH será realizada de
acordo com Robinson e colaboradores (1991).
- Atividade in vivo da Redutase do Nitrato (RN)
A atividade da RN será determinada pelo método descrito por Carelli et al.,
(1990). Amostras de 1g do talo serão coletadas com 5 mL do meio de reação (100 mM
tampão fosfato, pH 7,5, 25mM KNO3, 1% de isopropanol). Os discos infiltrados serão
incubados a 35°C por 30 min em ausência de luz e com agitação ocasional. A
atividade da enzima será medida pela quantidade de NO2 formada durante o período
de incubação e liberada dos discos foliares para o meio após 5 min de fervura.
Alíquotas de 2 ml serão misturadas em 1:1 com 1% sulfanilamida em HCl
2,4M:0,02% N- 1-naphtyl-etilenoamina, sendo a absorbância medida a 540 nm.
- Atividade da Urease
- Amostras de 150 mg de talo serão macerados cm 2 ml de tampão fosfato 0,1M, pH
7,5, contendo, 0,5 mM de MgCl2.6H2O, 10 mM EDTA, 1mM de DTT, 0,4 mM de
PMSF, a 4ºC. A atividade da urease será medida de acordo com o método de
microdifusão, pelo método de Conway (1962)
• Quantificação aminoácidos e proteínas solúveis totais
As concentrações de proteínas solúveis totais e aminoácidos serão feitas de
acordo com os métodos de Bradford (1976) e Moore & Stein (1948), posteriormente os
extratos serão verificados em um analisador de aminoácidos Beckman System 6300
(System Gold), para analisar a quantidade de cada aminoácido separadamente
(Gavilanes et al., 1982).
• Localização das enzimas no talo
A localização das enzimas no talo será feita por técnicas de histoquímica e
visualizadas com um microscópio de transmissão.
4.
ARTIGOS ESPERADOS E REVISTAS PARA PUBLICAÇÃO
Artigo esperado
Influência de diferentes fontes de nitrogênio na
Periódico
Physiology and Biochemistry
produção de compostos fenólicos de duas
espécies de Cladonia
Efeito de diferentes fontes de nitrogênio
Plant Physiology
no metabolismo fotossintético
Atividade e localização de enzimas
ligadas ao metabolismo do nitrogênio em
duas espécies de Cladonia sob diferentes
níveis de nitrogênio
New phytologist
5.
CRONOGRAMA
2010
2011
1o
2o
1o
1º capítulo
X
X
Disciplinas – PPGBV
X
Atividades
2012
2o
X
X
X
Universidad Complutense de Madrid - Espanha
X
3º capítulo
X
X
X
X
Análise de dados
X
Participação em Eventos Científicos
X
Defesa da Tese
X
X
X
X
X
X
X
X
Publicações
Qualificação
1o
X
2º capítulo
Revisão Bibliográfica
2o
X
Disciplinas – PPGBF
Apresentação de projetos PPGBV
1o
2013
X
X
X
X
X
X
X
X
X
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