Universidade Federal de São João del-Rei
Coordenadoria do Curso de Química
Aplicação de Biossensores na Análise da
Qualidade de Bebidas: Revisão
Flávia Faria de Oliveira Porfírio
São João del-Rei – ano 2014
Aplicação de Biossensores na Análise da Qualidade de
Bebidas: Revisão
Monografia de Trabalho de Conclusão de Curso,
apresentado no 2° semestre do ano de 2014 ao Curso
de Química, Grau Acadêmico Bacharelado, da
Universidade Federal de São João del-Rei, como
requisito parcial para obtenção do título Bacharel em
Química.
Autor: Flávia Faria de Oliveira Porfírio
Docente Orientador: Arnaldo César Pereira
Modalidade do Trabalho: Revisão Bibliográfica
São João del-Rei – ano 2014
RESUMO
Na indústria alimentícia, o grande desafio é eliminar as contaminações que podem
estar presentes nos alimentos. Essa contaminação pode ser de natureza química, física ou
biológica sendo que as contaminações de natureza química e biológica são de difícil
identificação visual, exceto nos casos em que a contaminação é demasiada e ocorrem
modificações perceptíveis nas características sensoriais do produto. A adoção de novas
legislações pelos órgãos responsáveis gera um aumento do controle da qualidade dos
produtos industrializados, onde a qualidade de um produto é avaliada por meio de análises
químicas e microbiológicas periódicas. Os métodos convencionais de análise usam técnicas
tais como: cromatografia, espectrofotometria, eletroforese capilar, titulação e outros, que não
permitem uma facilidade de monitorizarão contínua, porque elas são caras, lentas, precisam
de operadores bem treinados e, em alguns casos, requerem procedimentos de extração ou
pré-tratamento da amostra, aumentando o tempo de análise. Neste contexto, o emprego de
biossensores torna-se uma alternativa interessante, pois as indústrias de bebidas precisam
de métodos rápidos e acessíveis para a determinação de compostos que não possuem um
método adequado de monitoramento ou mesmo para substituir os métodos já existentes.
Biossensores são um sub-grupo de sensores químicos, são definidos como um dispositivo
que combina a especificidade de um elemento biológico ativo com a sensibilidade de um
transdutor que converte as energias geradas nos eventos químicos da interface eletrodosolução em um sinal mensurável. Características únicas, tais como: seletividade, relativo
baixo custo de construção e estocagem, potencial para miniaturização, facilidade de
automação e construção de equipamentos simples e portáteis para uma análise rápida de
monitoramento “on line” fazem com que este tipo de sensor possa ser utilizado em alimentos
para a determinação da composição, do grau de contaminação em materiais e alimentos
processados, e para o controle em linha do processo de fermentação. Apesar da enorme
diversidade de pesquisas envolvendo biossensores para a indústria, a sua aplicação na área
de alimentos, para qualquer analito, é ainda restrita. Mesmo com o grande número de
publicações sobre biossensores aplicados aos alimentos, não foram encontrados na
literatura artigos de revisão que foquem apenas na análise de bebidas; por isso, esse
trabalho de conclusão de curso teve como objetivo fazer uma revisão dos principais
trabalhos publicados nos últimos anos nessa área.
SUMÁRIO
1.
INTRODUÇÃO .............................................................................................................................. 1
1.1.
TRANSDUTORES .................................................................................................................... 3
1.1.1.
TRANSDUTOR ELETROQUÍMICO................................................................................... 3
1.1.2.
TRANSDUTOR ÓPTICO ..................................................................................................... 4
1.1.3.
TRANSDUTOR TÉRMICO .................................................................................................. 4
1.1.4.
TRANSDUTOR PIEZOELÉTRICO .................................................................................... 4
1.2.
CLASSIFICAÇÃO DO RECONHECEDOR BIOLÓGICO ................................................... 4
1.2.1.
DISPOSITIVO BIOCATALÍTICO ........................................................................................ 5
1.2.2.
DISPOSITIVO POR BIOAFINIDADE ................................................................................ 6
2.
OBJETIVOS .................................................................................................................................. 8
3.
APLICAÇÕES ............................................................................................................................... 8
3.1.
LEITE E BEBIDAS LÁCTEAS ................................................................................................ 8
3.2.
CERVEJA, VINHO E OUTRAS BEBIDAS ALCOÓLICAS ............................................... 15
3.3.
SUCO DE FRUTA E BEBIDAS NÃO ALCOÓLICAS ........................................................ 17
4.
BIOSSENSORES COMERCIAIS ............................................................................................. 19
5.
CONCLUSÃO.............................................................................................................................. 21
6.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................................ 22
Monografia de TCC – Química – Bacharelado – UFSJ – 2014
1. INTRODUÇÃO
Atualmente, o sistema alimentar mundial é altamente complexo. Ele emprega
milhões de pessoas em todo o mundo (desde os pequenos produtores e mercados até as
grandes corporações) que produzem, processam, transportam e fornecem alimentos
diariamente para o consumidor.1
Um dos grandes desafios deste sistema é evitar a contaminação química e
biológica. Esses contaminantes podem entrar em contato com os alimentos em qualquer
ponto do sistema de produção e processamento e são responsáveis por inúmeros
problemas de saúde.1; 2
O grande número de crises mundiais relacionadas aos alimentos e o aumento da
frequência em que elas ocorrem levaram alguns governos a estabelecerem novas leis e
melhorarem a infra-estrutura de todo o sistema de produção. Em 1963, a Organização
Mundial da Saúde (WHO – World Health Organization) e a Organização das nações Unidas
para Alimentação e Agricultura (FAO - Food and Agriculture Organization) estabeleceram
um órgão intergovernamental (Comissão do “Codex Alimentarius”) para desenvolver códigos
de conduta e recomendações com o objetivo de controlar os surtos de doenças causadas
pelos alimentos.1
Hoje em dia o Codex Alimentarius é referência mundial no setor de segurança
alimentar e conta com uma extensa coleção de recomendações de segurança. O sistema
mais utilizado para o controle do processo de produção pelas indústrias é a análise de
perigos e pontos críticos de controle (APPCC), que é um método que se baseia em
princípios técnicos e científicos de prevenção, adotado pela comissão do Codex
Alimentarius a partir 2003.1; 3; 4
Apesar disso, pesquisas feitas recentemente mostraram que as doenças
transmitidas por alimentos ainda são um problema de segurança pública. Em países
desenvolvidos, de 25 a 33% da população são afetados anualmente e esses números são
ainda maiores em países em desenvolvimento. Dados da Organização Mundial de Saúde
mostram que, em países de baixa renda, essas doenças (gastrenterite, febre tifóide, febre
entérica, botulismo, colite hemorrágica dentre outras) são a segunda maior causa de
mortalidade, ficando a frente da síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS), malária e
tuberculose.1
Com isso, desde a década de 90, há um aumento da necessidade de novas
metodologias analíticas para a determinação de compostos específicos na indústria
alimentícia5; 6. Desta forma, manutenção da qualidade dos produtos industrializados
destinados à alimentação têm grande importância econômica.6
1
Monografia de TCC – Química – Bacharelado – UFSJ – 2014
O controle de produção é feito por meio de análises periódicas, a partir de métodos
capazes de fornecer informações precisas sobre as características físicas e químicas do
alimento e, principalmente, sobre possíveis contaminações. Essas análises são realizadas
normalmente
por
técnicas
clássicas,
como a
titulação,
ou
instrumentais,
como
espectrofotometria, eletroforese capilar, cromatografia (principalmente cromatografia líquida
de alta eficiência - HPLC e cromatografia gasosa - CG).6
Como desvantagens, essas técnicas não proporcionam um monitoramento fácil e
contínuo, são baseados em equipamentos caros (nas técnicas instrumentais), necessitam
de profissionais bem treinados, utilizam grande quantidade de reagentes (no caso da
cromatografia) e, muitas vezes, exigem um preparo prévio da amostra.5;
6
Além disso,
protocolos de análise rigorosos, no que diz respeito à segurança e à qualidade dos
alimentos, impostos pelos órgãos responsáveis, abrem espaço no mercado para novas
metodologias sensíveis, rápidas e baratas. Assim, a aplicação de sensores químicos se
torna uma alternativa interessante.7
O sensor químico é um dispositivo capaz de fornecer informações em tempo real
sobre o sistema estudado. Eles são muito sensíveis, portáteis, de baixo custo, fornecem a
possibilidade de miniaturização e a facilidade de automação.8;
9
A Figura 1 ilustra os
componentes de um sensor: o analito alvo é reconhecido de maneira seletiva ou específica
pelo reconhecedor e a energia gerada por essa interação é transformada em um sinal
mensurável pelo transdutor. Esse sinal é transportado pelo comunicador até um instrumento
apropriado de medida.8
Figura 1- Esquema geral dos principais componentes de um sensor
8
O desempenho do sensor depende diretamente da capacidade do reconhecedor de
interagir com o composto de interesse de forma seletiva. O dispositivo é denominado
biossensor quando o reconhecedor é de origem biológica. Esse tipo de sensor combina a
seletividade ou especificidade do reconhecedor biológico (enzima, anticorpo, DNA) com a
sensibilidade do transdutor (óptico, térmico, eletroquímico) gerando assim uma análise
complexa, porém de fácil execução.10 Esses dispositivos são importantes ferramentas para
a análise de amostras reais (matrizes complexas) e o procedimento para a construção
desses dispositivos está descrito em vários trabalhos na literatura.11-15 As suas aplicações
estão distribuídas em diferentes áreas: clínica, ambiental, agrícola e biotecnológica.6
2
Monografia de TCC – Química – Bacharelado – UFSJ – 2014
Em especial na indústria alimentícia, os biossensores têm como função a
determinação do grau de contaminação dos alimentos e controle “on line” dos processos de
fermentação e produção. Apesar dos inúmeros dispositivos desenvolvidos nos últimos anos,
suas aplicações em processos de produção real ainda são muito restritas.6
A estabilidade e a durabilidade são as principais desvantagens desses sensores,
que necessitam de condições moderadas de temperatura e pH para manter a atividade do
reconhecedor biológico, além da necessidade de um preparo prévio da amostra quando a
matriz for ácida ou hidrofóbica. Nestes casos a neutralização, diluição ou extração, hidrólise
ácida ou alcalina, digestão por microondas, extração por fluído supercrítico, evaporação e
filtração se fazem necessários.6
Basicamente, os biossensores podem ser classificados de duas formas diferentes:
baseada no transdutor ou no elemento biológico de reconhecimento. A escolha conjunta do
material biológico e do transdutor depende do analito alvo e a combinação dos dois
determinará o quão sensível e seletivo ou específico é o biossensor.7
1.1. TRANSDUTORES
Os transdutores possuem a função de transformar a energia gerada pela interação
entre o reconhecedor biológico e o analito alvo em um sinal mensurável. Sua classificação
depende do tipo de energia gerada por essa interação.16 Eles podem ser eletroquímicos,
piezoelétricos, ópticos e calorimétricos (térmicos).
1.1.1. TRANSDUTOR ELETROQUÍMICO
De acordo com a IUPAC, biossensor eletroquímico é um dispositivo capaz de
fornecer uma informação quantitativa ou semi-quantitativa a respeito do composto de
interesse utilizando um reconhecedor biológico em contato direto com o transdutor. A
interação entre o analito alvo e o reconhecedor gera ou consome elétrons, que produz o
sinal eletroquímico. Existem três tipos de transdutores eletroquímicos: amperométrico,
potenciométrico ou condutimétrico.6; 17; 18
a)
Amperométrico: Mede o fluxo de corrente gerada pela reação de oxidação ou redução
das espécies eletroativas presentes na cela eletroquímica quando o potencial é
mantido constante. O fluxo medido é proporcional à concentração do composto de
interesse.18; 19
b)
Potenciométrico: Mede o potencial no eletrodo de trabalho em relação ao eletrodo de
referência. Esse transdutor fornece informações sobre a atividade iônica em uma
3
Monografia de TCC – Química – Bacharelado – UFSJ – 2014
reação eletroquímica e a relação entre o potencial medido e a concentração do analito
é dada pela equação de Nernst.19
c)
Condutimétrico: Baseia-se na habilidade do analito (solução eletrolítica) de conduzir
corrente. A medida é realizada entre os eletrodos metálicos e o consumo de espécies
iônicas durante uma reação química, altera a condutância do meio de maneira
proporcional a concentração do analito.18; 19
1.1.2. TRANSDUTOR ÓPTICO
Podem ser de fibra óptica, guia de onda planar ou ressonância de plasma de
superfície (SPR). A quantificação das espécies é realizada pela medida do índice de
refração, pelas propriedades fluorescentes das moléculas analisadas, pela quantidade de
luz absorvida ou por meio de um transdutor químico-óptico. 20
1.1.3. TRANSDUTOR TÉRMICO
Envolve a medida do calor produzido ou consumido durante uma reação específica.
Esse calor é proporcional a entalpia molar e ao número de moléculas formadas como
produto de reação.21
1.1.4. TRANSDUTOR PIEZOELÉTRICO
Baseados na imobilização do reconhecedor biológico em um cristal piezoelétrico e
na imersão deste na solução contendo o analito. A interação específica entre o
reconhecedor biológico e o analito pode ser monitorada por meio de oscilações do cristal no
líquido onde ele se encontra submerso. A diferença entre a frequência de oscilação do
cristal sem o analito ligado aos sítios e a frequência após as ligações serem formadas é
diretamente proporcional ao aumento de massa do cristal.
1.2. CLASSIFICAÇÃO DO RECONHECEDOR BIOLÓGICO
Existem duas classificações para os biossensores que dependem da natureza do
evento que ocorre entre o reconhecedor biológico e o composto de interesse: Biossensor
biocatalítico e por bioafinidade.17
4
Monografia de TCC – Química – Bacharelado – UFSJ – 2014
1.2.1. DISPOSITIVO BIOCATALÍTICO
O princípio destes dispositivos são as reações catalisadas por macromoléculas.
Nestes sensores, o consumo contínuo do substrato é realizado ao imobilizar o reconhecedor
biológico na superfície do sensor. Os tipos mais comuns são: enzimáticos (uma ou várias
enzimas) e celulares (células eucariontes, bactérias, fungos, mitocôndrias e organelas).17
Enzimas são proteínas, consistem em uma seqüência de vinte ou mais
aminoácidos ligados por ligação peptídica e possuem atividade catalítica. A enzima acelera
a conversão do substrato em seu(s) respectivo(s) produto(s) ao diminuir a energia de
ativação. Com isso, a reação ocorre em baixas temperaturas (abaixo de 50°C) e no intervalo
de pH que varia de 5,0 a 8,0. Essas reações são muito eficientes e podem ser seletivas ou
específicas. Biossensores que utilizam esses compostos são os mais comuns e possuem o
maior potencial para serem comercializados.22; 23
A enzima a ser imobilizada na camada modificadora do biossensor é escolhida de
acordo com o analito alvo e o sucesso no desenvolvimento do dispositivo depende do
processo de imobilização, que tem por objetivo manter um contato direto entre a enzima e a
superfície do sensor de forma estável.22
Biossensores celulares empregam células inteiras como reconhecedores. Eles são
usados na determinação de um composto ou de um grupo de compostos. Dentre os
elementos biológicos utilizados como reconhecedor neste dispositivo encontra-se as
bactérias, as algas e as leveduras. As desvantagens na aplicação destas células estão
sintetizadas abaixo.24
I. As condições naturais em que a célula é encontrada na natureza, e que
mantém a célula viva, devem ser mantidas. Estas condições exigem um
controle rigoroso do meio.
II. O metabolismo das células deve ser mantido continuamente.
III. A célula deve ser imobilizada na superfície do transdutor sem que isso afete a
sua função biológica.
IV. A durabilidade do biossensor depende do tempo de vida da célula.
Em
contrapartida,
esses
biossensores
apresentam
principalmente quando comparados aos biossensores enzimáticos:
diversas
vantagens,
24; 25
I. A célula inteira é imobilizada na superfície do sensor, dispensando assim o
isolamento e purificação do componente biológico.
II. Esses reconhecedores biológicos são capazes de metabolizar uma larga
escala de compostos químicos.
III. Os reconhecedores celulares são menos sensíveis à mudança de pH e de
temperatura quando comparados a biossensores enzimáticos.
5
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1.2.2. DISPOSITIVO POR BIOAFINIDADE
Nesta classificação, encontram-se os anticorpos, antígenos e ácidos nucléicos
(fragmentos de DNA). Tem como princípio a interação do analito com uma macromolécula,
que foi isolada do seu meio natural ou sintetizada artificialmente. Esses reconhecedores
interagem de forma seletiva ou específica com o analito formando um complexo
termodinamicamente estável. Os dispositivos mais comuns desta classificação são os
imunossensores, genossensores e aptassensores.17;6
Os imunossensores fazem uso dos anticorpos (compostos que exercem papel
fundamental no sistema imunológico) que são produzidos por organismos vivos de forma a
reconhecer um composto específico (antígeno), geralmente uma proteína. Eles também
podem reconhecer vírus e bactérias por meio das proteínas encontradas na superfície
destes microorganismos. Com isso, os imunossensores podem ser empregados na
determinação de uma grade variedade de proteínas, vírus e bactérias. Está disponível no
mercado uma grande variedade de anticorpos, porém muitos deles possuem um custo
elevado.26;13
Existem inúmeros métodos para a detecção da ligação antígeno/anticorpo, sendo
os mais comuns os transdutores eletroquímicos, ópticos e piezoelétricos. Algumas
desvantagens limitam o uso desses imunossensores, como a instabilidade inerente ao
anticorpo e a limitada reversibilidade da ligação.13; 26; 27
A combinação dos ácidos nucléicos com um transdutor apropriado forma um tipo
importante de biossensor com desempenho intimamente ligado às propriedades físicas do
DNA e do RNA como pureza e comprimento da cadeia. Eles são denominados
genossensores e aptassensores.22 As informações genéticas são armazenadas em um
sistema que consiste em quatro diferentes bases nitrogenadas: guanina (G), adenina (A),
timina (T) e citosina (C) para o DNA e guanina (G), adenina (A), uracila (U) e citosina (C)
para o RNA. Tais bases só podem ser pareadas com a base correspondente, ou seja,
adenina com timina (ou uracila para o RNA) e guanina com citosina.26
Assim, sequências de bases nitrogenadas são usadas para determinar a presença
da sua sequência complementar, gerando um sinal que pode ser monitorado, fazendo
destes dispositivos uma excelente ferramenta para detectar espécies de vírus e bactérias
mesmo em matrizes mais complexas.22;26 Outros compostos que podem ser determinados
com esse biossensor são os agentes carcinogênicos, drogas e poluentes mutagênicos.
Estes sensores também podem detectar seqüências específicas de mutações genéticas
associadas a diversos tipos de doenças.28
Os Aptâmeros, chamados de “anticorpos sintéticos”, são sequências curtas de
ácidos nucléicos que interagem com as moléculas-alvo de forma específica, pois são
6
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oligonucleotídeos sintéticos. São produzidos por um processo conhecido como evolução
sistemática de ligantes por enriquecimento exponencial (Selex - systematic evolution of
ligands by exponential enrichment) que utiliza o analito-alvo como molde para formar a
sequência de bases nitrogenadas.25
As metodologias que empregam os dispositivos citados acima propõem uma
análise mais rápida, de baixo custo, (quando comparadas com as metodologias atualmente
empregadas), que podem ser adaptados para análises “on line” e são alternativas
interessantes no controle de contaminações e da qualidade do alimento produzido. A partir
destas informações, o foco deste trabalho de conclusão de curso foi apresentar uma revisão
bibliográfica dos biossensores desenvolvidos nos últimos anos para a aplicação em
alimentos, especificamente em bebidas.
As bebidas são produtos alimentícios, uma vez que são derivados de matériasprimas alimentares e podem ser divididas em alcoólicas e não alcoólicas.29 As opções de
bebidas cresceram rapidamente nos últimos anos (bebidas esportivas, energéticos, bebidas
com baixo teor calórico são alguns exemplos) e fizeram com que as indústrias de bebidas
crescessem consideravelmente,30 a maior procura atualmente é pelas bebidas funcionais,
que possuem ingredientes específicos com diversas finalidades, como o aumento de
energia, retardamento do envelhecimento e o tratamento de algumas doenças. O
consumidor procura alimentos com alto valor nutricional e com baixo teor de gorduras e
caloria. 31
O consumo mundial é controlado pela Organização das nações Unidas para
Alimentação e Agricultura. De acordo com estudos realizados a disponibilidade de bebidas
ao redor do mundo cresceu 40% nos últimos anos. A bebida mais consumida mundialmente
é o chá, cerca de 45 litros por pessoa são consumidos anualmente, seguido pelo leite (42
litros) e pela cerveja (30 litros).30; 32
O aumento do consumo de bebidas tradicionais, o desenvolvimento de novos
produtos e a necessidade de manutenção do controle da qualidade destas bebidas
estimularam o desenvolvimento de tecnologias capazes de facilitar o processo de produção.
Neste contexto, as pesquisas dedicadas ao desenvolvimento de novos biossensores
cresceram de forma considerável nos últimos anos.33 Os tópicos seguintes desta revisão
fazem um breve resumo das possíveis contaminações encontradas em alimentos em geral e
dos biossensores desenvolvidos recentemente para o controle de qualidade das bebidas.
7
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2. OBJETIVOS
Este trabalho tem como objetivo fornecer uma revisão bibliográfica dos principais
biossensores desenvolvidos no período de 2010 a 2014, com aplicações no controle de
qualidade de bebidas, assim como uma análise de alguns dos principais trabalhos da área.
3. APLICAÇÕES
Em geral, as características e a composição dos alimentos são analisados por
diversos propósitos, incluindo a construção da tabela nutricional, controle de qualidade e
contaminação. As análises são realizadas de forma continua na linha de produção ou as
amostras são coletadas em diferentes pontos do processamento e analisadas em
laboratório.34 Para qualquer produto comestível, os riscos de contaminação se agrupam em
um número pequeno de categorias:35
•
Componentes naturais da matéria-prima que são inerentemente tóxicos.
•
Contaminantes ambientais associados à matéria prima.
•
Infestações microbiológicas.
•
Contaminação do produto no transporte, armazenamento ou empacotamento.
•
Contaminações no processamento do produto.
•
Contaminação deliberada do alimento.
•
Compostos alergênicos que, embora inofensivos à maioria da população, fornecem
riscos significativos a uma minoria.
Os contaminantes que podem ser encontrados em bebidas assim como os
principais trabalhos publicados nos últimos anos, que foram aplicados com sucesso em
amostras reais. Os trabalhos citados aqui são os que foram considerados relevantes na área
e que possuem características que exemplificam as vantagens da utilização dos
biossensores. Eles estão especificados nos próximos tópicos, que foram divididos em leite e
bebidas lácteas, bebidas alcoólicas e bebidas não alcoólicas.
3.1. LEITE E BEBIDAS LÁCTEAS
Por definição, o leite é um fluído biológico complexo secretado pelas glândulas
mamárias de mamíferos, onde se encontram diversas moléculas diferentes em vários
estados de dispersão, muitas das quais ainda não foram identificadas. No entanto os
componentes majoritários do leite podem ser facilmente isolados e estudados. Tipicamente
8
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o leite bovino é composto por aproximadamente 87% de água, 3,7-3,9% de lipídeos, 3,23,5% de proteínas, 4,8-4,9% de carboidratos e 0,7% de minerais.36
O leite e seus derivados são suscetíveis ao crescimento microbiano rápido que
pode ser benéfico (como os probióticos) ou não. Os laticínios estão vulneráveis à
contaminação por fontes biológicas, químicas e físicas e a identificação e eliminação destas
fontes de contaminação são de grande interesse para a indústria alimentícia.1; 36
3.1.1. CONTAMINAÇÃO MICROBIANA
O leite comercializado, quando contaminado, transfere os microorganismos do
animal para o ser humano. Os vírus e bactérias chegam ao leite por meio da alimentação ou
do ambiente em que o animal foi mantido. Ao ser retirado e manuseado, o produto ainda
entra em contato com os microorganismos presentes nos equipamentos de ordenha, de
armazenamento do produto e outras fontes de contaminação presentes na fazenda. Como o
leite é uma matriz orgânica que facilita a sobrevivência e reprodução de microorganismos, a
contaminação inicial pode resultar em um aumento significativo na população bacteriana,
dependendo da temperatura de armazenamento.37
As espécies mais comuns de bactérias encontradas no leite são: Salmonela,
Campylobacter,
Escherichia
coli,
Staphylococcus
aureus,
Listeria
monocytogenes,
Mycobacterium bovis, Brucella abortus e Brucella melitensis.37
3.1.2. CONTAMINAÇÃO QUÍMICA
Podem ser de origem natural (toxinas produzidas por fungos) ou antropogênica
(resíduos da agricultura e das indústrias que estão presentes na água ou na alimentação do
animal). Na maioria dos casos, os resíduos químicos e contaminantes são resistentes à
degradação e não são afetados por tratamentos térmicos como a pasteurização ou a
diminuição do pH decorrente do processo de fermentação. 37
•
Contaminantes Ambientais
Alguns exemplos de contaminantes são os furanos, as dioxinas, as bifenilas
policloradas (BPC’s), os metais pesados e alguns radionuclídeos. A presença de metais
tóxicos (As3+, As5+, Cd2+, Pb2+, Hg3+ principalmente) no solo contamina a produção agrícola,
e as fontes de água potável.38 O risco para a população é a ingestão de grandes
quantidades dos compostos citados acima, pois eles tendem a ser tóxicos, bioacumulativos
e cancerígenos.37
9
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•
Contaminantes Industriais
O processamento do produto natural também pode contaminar o alimento ao
produzir substâncias como: acrilamida, benzeno, aminas biogênicas, cloropropanóis, furano,
N-nitrosaminas, hidrocarbonetos aromáticos policíclicos, bisfenol A e outros contaminantes
provenientes do processo de empacotamento do produto.1
•
Contaminantes Biológicos
Micotoxinas são metabólitos fúngicos que, quando ingeridos, inalados ou
absorvidos pela pele, podem causar doenças ou até a morte. Essa classe de compostos
apresenta os quatro tipos básicos de toxicidade: aguda, crônica, mutagênica e teratogênica,
as espécies de micotoxinas mais importantes são: aflatoxina, ocratoxina A, fumonisinas e
zearalenona.1
•
Pesticidas
Durante a segunda metade do século XX, foram desenvolvidos uma série de
novos pesticidas com o objetivo de melhorar a produtividade das atividades agrícolas.
Encontram-se nesta categoria os herbicidas, fungicidas e inseticidas. São em geral
compostos tóxicos, bioacumulativos e provocam diversos problemas de saúde na população
como danos ao sistema nervoso, aos pulmões, aos órgãos reprodutivos, aos sistemas
imunológicos e endócrinos, malformação congênita e câncer.37
•
Aditivos
São adicionados ao produto por diversos motivos: regular a acidez, reduzir a
formação de espuma, melhorar a textura e aumentar o prazo de validade do produto ao
suprimir o crescimento de microorganismos. Os aditivos podem ser naturais (ácido
ascórbico) ou sintéticos, estão presentes em pequenas quantidades nos alimentos e
geralmente não oferecem risco à saúde humana devido à baixa toxicidade.1
•
Resíduos de remédios
Fármacos administrados em animais lactantes podem estar presentes nos produtos
de origem animal em pequenas concentrações. Estes remédios são administrados para
prevenir infecções e aumentar a saúde do animal. A retirada do leite após a administração
do remédio só deve ser realizada depois de um período determinado para que a
concentração do composto atinja níveis aceitáveis.1; 37
3.1.3. CONTAMINAÇÃO FÍSICA
Trata-se da inclusão acidental de algum material no alimento nas etapas de
processamento do produto. Essa contaminação pode ser por fragmentos de plástico ou
metais, insetos, causados pelo contato humano como unha e cabelo ou até mesmo
contaminação deliberada.
10
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A Tabela 1 apresenta um resumo dos possíveis contaminantes encontrados em
laticínios
Tabela 1 – Contaminantes encontrados em laticínios.1
Contaminação Biológica
Contaminação Química
Contaminação Física
Bacillus cereus
Brucella spp.
Campylobacter jejuni
Coxiella burnetii
Cronobacter sakazakii
Cryptosporidium parvum
Escherichia coli
Enterohaemorrhagic E. coli
Listeria monocytogenes
Leptospira
Mycobacterium bovis
Mycobacetrium paratbuberculosis
Salmonella (non-typhi)
Shigella spp.
Staphylococcus aureus
Resíduos de Antibióticos
Antibióticos
Pesticidas
Hormônios
Dioxinas
Aflatoxina M1
Metais Pesados
Radionuclídeos
Bisfenol A (Processo de
empacotamento)
Fragmentos de metal (parafusos e
rebites)
Limalhas de máquinas
Pedaços de vidro
Jóias
Pedras
Isolamento/pintura
Pedaços de Plástico
Jóia, botões, fragmentos de unha
Cabelo, pó, e insetos
Melanina
Yersinia enterocolitica
hepatitis A, Salmonella typhi e
paratyphi.
Fonte: Encyclopedia of Food Safety
3.1.4. LEGISLAÇÃO
No século XIX, os laticínios eram uma fonte de transmissão de várias doenças
incluindo o antraz, difteria, febre tifóide, escarlatina e tuberculose. Essa situação começou a
mudar após a aplicação do processo de pasteurização. O desenvolvimento de novos
processos de tratamento do leite e novas legislações mudaram o panorama da indústria de
laticínios.37
No Brasil, a regulamentação do leite é feita pelo Centro Integrado de
Monitoramento da Qualidade dos Alimentos (Cquali – Leite), que é uma iniciativa conjunta
da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (Anvisa), do Departamento de Proteção e
Defesa do Consumidor (DPDC), do Ministério da Justiça e do Ministério da Agricultura,
Pecuária e Abastecimento (MAPA), no sentido de integrar as ações dos órgãos envolvidos
no controle de alimentos e fortalecer as medidas de prevenção e combate a desvios de
qualidade, incluindo irregularidades e fraudes. Os regulamentos técnicos em vigor no Brasil
são baseados nas normas, diretrizes ou recomendação da comissão do Codex Alimentarius
11
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da União Européia, do FDA (Food and Drug Administration - EUA) e de outros órgãos
reconhecidos internacionalmente.39
Apesar da melhora no processamento do leite, a sua qualidade ainda é um fator
preocupante, uma vez que surtos de doenças transmitidas por leite ainda ocorrem, apesar
da pasteurização ou ainda causada por pasteurização inadequada.40
3.1.5. BIOSSENSORES PARA ANÁLISE DE LEITE
Um dos trabalhos mais citados publicados na década de 90 sobre a aplicação de
biossensores em laticínios foi desenvolvido por Jager e colaboradores, em 1994.41 Este
trabalho descreve a utilização de eletrodos impressos (screen printed) também chamados
de
eletrodos
descartáveis,
com
as
enzimas
β-galactosidase
e
glicose
oxidase
coimobilizadas por ligação cruzada para a determinação de lactose em amostras de leite. O
biossensor amperométrico foi utilizado em um sistema de análise por injeção em batelada
(BIA). Não foi detectado nenhum tipo de interferente e não foi necessário o preparo prévio
das amostras, com faixa linear de 2,0x10-6 a 2,5x10-3 mol L-1 e sensibilidade de
250nAmmolL . O biossensor possui o mecanismo catalítico mostrado abaixo, onde o
H2O2 é a espécie monitorada.
+
& − ()*
+
!
"
#$$$$$$$$$$$% & − ( )
" . !
+ & − ()*
"
#$$$$$$$$$$% & − ()/ 0 − 1 − )
23
→
+
(1)
0 +
(2)
(3)
O biossensor apresentou estabilidade por três meses e foi aplicado em leite, Iorgute
e outros derivados do leite com resultados similares ao teste de referência.
Em 2010, Yang e colaboradores42 desenvolveram um biossensor enzimático e
óptico para análise em fluxo com mecanismo similar ao descrito anteriormente para a
determinação de lactose em amostras de leite. Com a β-galactosidase e glicose oxidase
coimobilizadas em fibra de alginato de cálcio e em AMNM (“amine modified nanosized
mesoporous sílica”). As duas primeiras etapas do mecanismo catalítico são iguais às
Equações 1 e 2 e a última etapa ocorre de acordo com a Equação 4.
)/6*0 ) + + 728
#$% 6*0 9 )
+ ℎ;(42506)(4)
Durante a reação enzimática, a lactose produz o equivalente em mols de H2O2, que
reage com o luminol em soluções básicas. A concentração da amostra é determinada pela
12
Monografia de TCC – Química – Bacharelado – UFSJ – 2014
intensidade da luminescência produzida. Alguns interferentes foram descritos, assim como
a necessidade de centrifugação da amostra de leite. A faixa linear encontrada foi de
8,0x10−8 g mL−1 a 4,0×10−6 g mL−1 e o dispositivo apresentou estabilidade por cerca de 2
meses.
Em 2004 Knecht e colaboradores43 desenvolveram o primeiro imunossensor
automatizado (denominado PASA - conjunto de sensores de afinidade em paralelo) capaz
de detectar simultaneamente dez antibióticos. Os anticorpos específicos para penicilina G,
cloxacillin, cefapirina, sulfadiazina, sulfametazina, estreptomicina, gentamicina, neomicina,
eritromicina e tilosina permitiram a análise simultânea dos respectivos analitos. Todo o
processo foi totalmente automatizado e o tempo médio de cada análise foi de cinco minutos
com limites de detecção de 0,12 µg L-1 (cefapirina) a 32 µg L-1 (neomicina). O dispositivo foi
aplicado em amostras de leite com resultados satisfatórios.
Em 2012 Mishra e colaboradores44 publicaram um artigo que descreve a utilização de
enzimas modificadas geneticamente (acetilcolinesterase (AChE) enzimas B394, B4 e B131)
para determinação de pesticidas organofosfatos em um sistema de análise em fluxo. O
tempo total de análise foi de 15 minutos com uma faixa linear de trabalho de 5×10−12 mol L-1
a 5×10−6 mol L-1, sem a necessidade de preparo da amostra e não foi detectado nenhum
tipo de interferente.
Os trabalhos citados acima descrevem dispositivos que possuem viabilidade para
aplicação em processos reais devido aos curtos tempos de análises, à possibilidade de
análises simultâneas, à miniaturização e à automação do sistema além da alta
especificidade e sensibilidade. A Tabela 2 apresenta outros biossensores desenvolvidos nos
últimos cinco anos com o objetivo de quantificar contaminantes em laticínios.
Tabela 2- Biossensores empregados na análise de leite e bebidas lácteas
Analito
Aplicação
Reconhecedor
Biológico
Transdutor
Faixa linear de resposta
Durabilidade
Ref.
Uréia
Leite
Urease
Óptico
-
7 a 8 dias
45
Ocratoxina A
Leite
Peroxidase
Amperométrico
2,38×10−8 a 2,03×10−7 mol L-1
-
46
Organofosfatos
Leite
Acetilcolinasterase
Amperométrico
5×10−6 a 5×10−12 mol L-1
-
44
-
47
4 meses
48
-
49
-
50
18 dias
51
3 semanas
52
12 dias
53
-
54
1 mês
55
-
56
Nisin
Lisina
Glicose
Leite
Leite
Leite
Patogênicos e
toxinas
Leite
Catecol
Leite
Lactose
Leite
Lactose
Leite
Herpesvirus-1
Leite
Salmonella
typhimurium (SA)
Cloranfenicol
Bactéria
Lisina oxidase
Glicose oxidase
B linfócitos Ped2E9 cellline
Lactobacillus
acidophilus
β-galactosidase e
Glicose oxidase
Celobiose
desidrogenase
ELISA
Leite
Anticorpo SA
Leite
Anticorpo
cloranfenicol
Óptico
Amperométrico
Amperométrico
-2
-1
1,3×10 CFU mL
−6
1,0×10
−4
a 6,0×10
−4
1,0×10
-1
μmol L
−4
a 8,0×10
-1
mol L
Óptico
-
Amperométrico
5,0×10−4 e 5,0×10−3 mol L-1
Amperométrico
Amperométrico
−4
1,0×10
Piezoelétrico
a 1,4×10
-1
mol L
1×10−6 a 1,5×10−4 mol L-1
Amperométrico
Condutimetrico
−2
-3
-7
-1
1,0x10 a 1,0x10 CFU mL
−10
5,0×10
−7
a 1,0×10
−1
g mL
13
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Colina
Uréia
Leite
Colina oxidase
Óptico
1,0×10−7 a 5×10−4 mol L-1
−3
−3
1×10
-1
a 2,0×10
mol L
20 dias
57
180 dias
58
Leite
Urease
Térmico
Organofosfatos
Leite
Acetilcolina
esterase e colina
oxidase
Óptico
4,84×10-11 a 4,84×10−6 mol L-1
-
59
Glicose
Leite
Glicose oxidase
Amperométrico
2,5×10−4 a 5,00×10−3 mol L-1
15 dias
60
Colina
Leite
Colina oxidase e
peroxidase
Óptico
5,0×10−7 a 2,0×10−3 mol L-1
30 dias
61
-
62
Aflatoxina M1
(AFM1)
Leite
Anticorpo AFM1
Condutimetrico
Enterotoxina
estafilocócica A
(SEA)
Leite
Anticorpo SEA
Piezoelétrico
5,0×10-5 a 1,0×10-3 g L−1
-
63
Ácido fólico
Leite
Anticorpo
Óptico
1,0×10-9 a 1,0×10-8 g mL-1
-
64
5,0×10 a 2,0×10 g kg
-
65
-
-
66
Sulfadiazina
Leite
Anticorpo
Piezoelétrico
Peróxido de
hidrogênio
Leite
Catalase
Amperométrico
-12
6,25×10
-10
a 1,00×10
-5
−1
g mL
-4
-9
-6
-1
-1
Catalase
Leite
Aptâmero
Óptico (SPR)
5×10 a 1,0×10 mol L
-
67
Íon chumbo
Leite
Urease
Potenciométrico e
colorimétrico
1,93×10-6 a 4,83×10-6 mol L-1
-
68
Leite
Anticorpo LM
Amperométrico
1,0×102 a 1,0×106 CFU mL-1
-
69
Leite
Anticorpo SMX
Amperométrico
5×10−10 a 5×10−7 g mL−1
2 semanas
70
Leite
Anticorpo
Óptico (SPR)
-
-
71
Leite
Anticorpo S.
aureus
Colorimétrico
1,5x102 a 1,5x106 CFU mL−1
-
72
Leite
Anticorpo LM
Piezoelétrico
-
-
73
Amperométrico
1,0×10−8 a 1,0×10−5 mol L-1
14 dias
74
Condutimétrico
1,0×10−9 a 1,4×10−8 g mL-1
-
75
Amperométrico
1,0x10-14 a 1,0x10-9 mol L-1
Listeria
monocytogenes
(LM)
Sulfamethoxazol
e (SMX)
Enrofloxacina ,
Cloranfenicol e
Sulfapiridina
Staphylococcus
Aureus (S.
aureus),
Listeria
monocytogenes
(LM)
Bisfenol A (BPA)
Leite
Aflatoxina M1
Leite
Enterobacteriace
ae
Leite
Tetraciclina
Biotin (vitamina
B8)
Mycobacterium
bovis
Melamina
Leite
Aptâmero AntiBPA
21-mer ss-HSDNA
(fragmento de
DNA)
DNA e
Exonuclease III
Aptâmero
Eletroquímico
Leite
Anticorpo biotin
Óptico
Leite
Fragmento de
DNA IS6110
Amperométrico
Leite
Anticorpo
Óptico
−7
5,0×10
−9
2,5×10
-
76
-6
-1
15 dias
15
−8
-1
-
77
-
78
-
79
a 5,0x10 g mL
a 7,5×10
g mL
−7
5,0×10
−6
a 1,0×10
-1
g mL
Enterotoxina
estafilocócica B
(SEB)
Leite
Anticorpo SEB
Piezoelérico
1,0×10 a 1,0×10 g mL e
1,0×10−15 a 1,0×10−4 g mL-1
-
80
Glicose
Leite sem
lactose
Glicose oxidase
Amperométrico
-
-
81
Bifidobacterium
bifidum e
Lactobacillus
acidophilus
Leite
Anticorpo BSA
Piezoelético
1×104 a 1×107 CFU mL-1
-
82
Diclofenaco
Leite
Anticorpo
diclofenaco
Óptico
3,99×10−7 a 2,227×10−6 g L−1
-
83
−8
−5
-1
Peróxido de
5,0×10−7 a 1,0×10−5 mol L-1 e
Leite
Peroxidase
Amperométrico
36 dias
84
Hidrogênio
1,0×10−4 a 1,8×10−3 mol L-1
Clostridium
botulinum
ELISA e immunoLeite
Piezoelétrico
85
neurotoxinas A e
PCR
B (PCR)
ELISA - Enzyme-Linked Immunosorbent Assay/ BlaR-CTD - carboxy-terminal of penicillin-recognizing protein BlaR/ CFU Unidades formadoras de colônias/ SPR- ressonância de plasma de superfície
14
Monografia de TCC – Química – Bacharelado – UFSJ – 2014
3.2. CERVEJA, VINHO E OUTRAS BEBIDAS ALCOÓLICAS
As bebidas alcoólicas são parte importante da vida cotidiana, pois o consumo
destes produtos é comum em todas as classes sociais. O princípio das bebidas alcoólicas é
a fermentação, onde o açúcar é convertido em etanol e outros produtos secundários. Essa
conversão pode ser realizada por diversos fungos e bactérias, que imprimem as suas
características ao processo de fermentação, produzindo bebidas de sabores característicos.
Os contaminantes normalmente encontrados em bebidas alcoólicas são os pesticidas,
contaminantes orgânicos industriais, metabólitos fúngicos, materiais inorgânicos, e outras
substâncias formadas ou adicionadas às bebidas no processo de fermentação (já discutidos
na seção 3.1.2).38
As concentrações destes contaminantes devem ser controladas regularmente
respeitando as quantidades máximas especificadas por lei.38 No Brasil, a qualidade das
bebidas alcoólicas e não alcoólicas é fiscalizada pelo Ministério da Agricultura, Pecuária e
Abastecimento. A regulamentação para padronização, classificação, registro, inspeção,
produção e fiscalização encontra-se nas leis n°8.918, de julho de 1994 e n° 7.678, de
novembro de 1998, nos decretos regulamentadores n° 6.871/09 e n° 99.066/1990 e em
Instruções normativas e Portarias.39 As principais aplicações de metodologias analíticas,
com a finalidade de controlar a qualidade do produto no processo de produção, encontramse resumidas abaixo:38
•
Monitorar o processo de produção e garantir a qualidade do produto.
•
Determinar a autenticidade da bebida.
•
Detectar aditivos fraudulentos.
•
Assegurar que o produto cumpra as exigências regulamentares.
•
Caracterizar novos componentes.
•
Investigar a existência de poluentes, toxinas naturais e seus metabólicos.
Na monitoração do processo de produção para garantir a qualidade e o sabor das
bebidas, se destacam os biossensores denominados de “nariz” e “língua” eletrônica, que
são sistemas compostos por um conjunto de sensores e um sistema de análise de dados. O
objetivo destes dispositivos é o de reconhecer características do produto como gosto, e
valores nutricionais, fazendo uma estimativa dos componentes-chave e então comparando
os valores encontrados com uma base de dados.86
Em 2011, Ghasemi-Varnamkhasti87 e colaboradores desenvolveram uma “língua
bioeletrônica”, com a enzima tirosinase e o uso de fitalocianinas como mediador de elétrons
15
Monografia de TCC – Química – Bacharelado – UFSJ – 2014
para avaliar as mudanças que ocorrem durante o processo de envelhecimento da cerveja. A
capacidade do biossensor de monitorar o processo de envelhecimento da cerveja está
relacionada com a mudança na concentração de compostos fenólicos, mais precisamente
dos flavonóides. As amostras de diferentes marcas de cerveja estudadas foram previamente
analisadas pelo conjunto de biossensores usando a voltametria cíclica. Os dados extraídos
da voltametria foram utilizados na análise do componente principal (PCA - Principal
Component Analysis) e a análise discriminante linear (LDA - Linear Discriminant Analysis)
que são procedimentos matemáticos que tem por finalidade a análise de dados visando
sumarizar os resultados que possuem muitas variáveis.88 Após os tratamentos matemáticos,
os resultados mostraram que o conjunto de biossensores foi capaz de fornecer informações
claras a respeito da bebidas analisadas. Os resultados foram confirmados pelos tratamentos
matemáticos de rede neural probabilística (PNN -Probabilistic Neural Networks), funções de
base radial (RBF - Radial Basis Functions) e Redes Feedforward e Backpropagation (BP FeedForward Networks with Backpropagation). O biossensor proposto foi capaz de
discriminar e classificar diferentes amostras de cerveja.
Vários trabalhos descrevem dispositivos capazes de monitorar a qualidade do
produto final. Em 2011, Monošik89 e colaboradores descreveram o uso em conjunto de
biossensores enzimáticos (com as enzimas glicose oxidase, glicose desidrogenase,
glicoamilase, frutose desidrogenase, álcool desidrogenase, peroxidase, glicerol quinase,
sarcosina oxidase e creatinase) no controle dos níveis de açúcar (maltose, maltotriose,
glicose e frutose) e álcool (etanol e glicerol) no processo de fermentação na produção de
cerveja. Os resultados encontrados para os biossensores foram comparados com a
cromatografia líquida de alta eficiência e a espectrofotometria. Os pesquisadores concluíram
que, para o monitoramento de maltose e maltotriose, apenas a HPLC apresentou resultados
satisfatórios. Porém os biossensores e a espectrofotometria mostraram os melhores
resultados, demonstrando a diminuição dos níveis de açúcar durante todo o processo, e
foram capazes de detectar baixas concentrações de glicose e frutose mesmo em estágios
mais avançados de fermentação. Para o etanol e o glicerol, todos os métodos mostraram se
adequados. Neste caso, os biossensores representam a melhor opção no que diz respeito
ao custo e tempo de análise. A Tabela 3 apresenta os biossensores desenvolvidos nos
últimos anos para aplicações em bebidas alcoólicas.
16
Monografia de TCC – Química – Bacharelado – UFSJ – 2014
Tabela 3 - Biossensores empregados na análise da qualidade de bebidas alcoólicas
Analito
Matriz
Reconhecedor
Biológico
Ocratoxina A
Cerveja
Peroxidase
Catecol e ácido
caféico
Polifenol e
dióxido de
enxofre
Ocratoxina A
Tiramina
Transdutor
Faixa linear de resposta
Durabilidade
Ref.
Amperométrico
2,4×10−10 a 2,06×10−9 mol L-1
-
90
24 dias
91
-
92
Cerveja
Tirosinase
Amperométrico
2,5×10−7 a 9,2×10−5 e
2,5×10−7 a 4,7×10−4 mol L-1
Cerveja
Lacase
Amperométrico
-
Cerveja
Aptâmero
Amperométrico
Cerveja
Putrescina
Cerveja
Etanol
Vinho e
cerveja
Amina Biogênica
Vinho e
Cerveja
Tiramina oxidase
Putrescina
oxidase
Peroxidase e
Álcool
desidrogenase
Diamina oxidase
Glicose oxidase
(GOD)
Álcool oxidase
(AO) e
D-frutose
desidrogenase
(FDH)
Methylobacterium
organophilium
Amperométrico
Amperométrico
−4
3,7×10
−5
1,0×10
−4
a 7,8×10
-
93
-1
2 meses
94
-1
7 a 10 dias
95
mol L
−4
a 2,5×10 mol L
Amperométrico
-
3 dias
96
Amperométrico
2,5×10−8 a 2,0×10−5 g ml-1
-
97
Amperométrico
2,0×10−5 a 7,0×10−4 mol L-1
5,0×10−5 a 5,0×10−4 mol L-1 e
5,0×10−5 a 5,0×10−4 mol L-1
6 meses GOD),
1mês (AO) e
15 dias (FDH)
98
Amperométrico
5,0×10−5 a 7,5×10−3 mol L-1
27 dias
99
-
-
100
-
101
Glicose,
frutose e
etanol
Vinho
Etanol
Vinho
Nitrogênio
Vinho
Gene GAP1m-F e
DAL4m-F
Óptico
Ocratoxina A
(OTA)
Vinho
Anticorpo OTA
Óptico
−3
−3
-1
Ácido lático
Vinho
L-lactato oxidase
Amperométrico
5×10 a 3,40×10 mol L
15 meses
102
Glicose
Bebidas
alcoólicas
Glicose oxidase
Amperométrico
1,0×10−5 a 3,0×10−4 mol L-1
2 meses
103
Compostos
fenólicos
Vinho
Lacase
Amperométrico
-
-
104
Quitosana
Vodka
Glucono-bacter
oxydans
Amperométrico
5,0×10−4 a 2,0×10−3 mol L-1
-
105
3.3. SUCO DE FRUTA E BEBIDAS NÃO ALCOÓLICAS
Nesta categoria encontram-se as bebidas que podem ou não ser de fontes naturais
e que não contém álcool em sua composição, tais como refrigerantes, energéticos, água de
coco, suco de fruta, dentre outros. O suco de fruta natural é um produto não fermentado
obtido da fruta fresca, alimento extremamente saudável e rico em vitaminas e minerais. As
frutas, no entanto, podem ser contaminadas por microorganismos como vírus e bactérias e
os diversos contaminantes químicos. Além disso, o componente principal destas bebidas é a
água; portanto a qualidade delas depende de um fornecimento adequado de água de
qualidade.1
As contaminações comuns em água são: concentração de minerais (acima ou
abaixo da ideal podem causar problemas de saúde), presença de metais pesados (devido a
ações naturais ou antropogênicas), outros contaminantes químicos (como pesticidas,
17
Monografia de TCC – Química – Bacharelado – UFSJ – 2014
dioxinas, BPC’s e compostos policíclicos aromáticos, dentre outros) e contaminações
microbiológicas.1
As cascas das frutas também podem abrigar uma grande variedade de fungos e
bactérias. Os microorganismos normalmente encontrados são as bactérias (Enterobacter,
Shigella, Salmonela, Escherichia coli 0157:H7, Bacillus cereus), certos vírus (Hepatite A,
Rotavirus e vírus Norwalk), fungos (Rhizopus, Aspergillus, Penicillum, Eurotium, Wallemia) e
leveduras (Saccharomyces, Zygosaccharomyces, Hanseniaspora, Candida, Debaryomyces
e Pichia sp).106 As contaminações citadas acima foram discutidas na seção 3.1.2.
Um biossensor enzimático para determinação de glicose em amostras de vinho e
suco de fruta, utilizando um sensor de fibra óptica acoplado a FIA (sistema por injeção em
fluxo) foi desenvolvido em 1989 por Dremel e colaboradores.107 O sistema apresentou faixa
linear de resposta de 0,1 a 500 mmol L-1, capacidade de análise de 60 amostras por hora e
estabilidade de 400 horas em análise contínua.
Em 2007, Wcisło108 e colaboradores publicaram um artigo em que descreviam um
biossensor amperométrico, descartável e enantiosseletivo para determinação de Daminoácidos. O biossensor foi construído imobilizando a enzima D-aminoácido oxidase na
superfície do eletrodo descartável que continha grafeno modificado com azul da Prússia e
Nafion. O dispositivo apresentou alta seletividade e faixa de resposta linear de
5a200μmolL , com resultados semelhantes ao método padrão.
Um biossensor potenciométrico para determinação de Escherichia coli em amostras
de suco de frutas e leite foi desenvolvido por Zelada-Guillen e colaboradores em 2010109. O
reconhecedor biológico (aptâmero) foi imobilizado em nanotubos de carbono de parede
simples. O sistema apresentou alta sensibilidade e seletividade, com limite de detecção de
104CFUmL (Unidades formadoras de colônias mL-1). O biossensor é de fácil construção,
porém só possui estabilidade para cinco análises. A Tabela 4 apresenta outros biossensores
desenvolvidos para análise de bebidas não alcoólicas.
18
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Tabela 4 – Biossensores aplicados a análise de suco de frutas e outras bebidas não alcoólicas.
Matriz
Reconhecedor
Biológico
Transdutor
Faixa linear de resposta
Durabilidade
Ref.
Vitamina B5
Suco de fruta
Anticorpo
vitamina B5
Óptico (SPR)
1,0×10−8 a 5,0×10−6 g mL-1
-
110
Peróxido de
hidrogênio
Leite, suco de
fruta, leite de
coco
Tionina e
catalase
Amperométrico
1,0×10−4 a 2,3×10−3 mol L-1
4 semanas
111
Ocratoxina A
Leite e suco de
Frutas
Óptico (SPR)
-
-
112
Amperométrico
-
-
113
Analito
Ácido
ascórbico
Carbamato
pesticidametolcarbe
Suco de Fruta
Anticorpo
ocratoxina e
Anticorpo
aflatoxina
Fragmento de
DNA
Suco de Fruta
Anticorpo
metolcarbe
Piezoelétrico
1,0×10−4 a 5,0×10−2 g L−1
-
114
Frutose
Suco de Frutas
e
Bebidas
energéticas
Frutose
desidrogenase
Amperométrico
1,0×10−4 a 5×10−3 mol L-1
4 meses
115
Adenina
Chá
Amperométrico
5,0×10−6 a 1,0×10−4 mol L-1
-
116
L-aminoácido
Suco de Fruta
Amperométrico
1,0×10−6 a 7,0×10−2 mol L-1
120 dias
117
Ácido
Ascórbico
Suco de
Laranja
Energil C,
Energeticos,Ta
mpico,
Gatorade,
Suco de
Laranja
Amperométrico
-
-
118
Glicose oxidase e
peroxidase
Amperométrico
5,0×10−5 e 6,0×10−3 g mL–1
5 dias
119
Térmico
1,0×10−6 a 2,0×10−5 mol L-1
-
Amperométrico
2,0×10−8 a 6×10−8 mol L-1 e
1,0×10−6 a 7,5×10−6 µmol L-1
1 semana
Amperométrico
2,5×10−4 a 2,0×10−3 mol L-1
Glicose
Adenina
deaminase
L-aminoácido
oxidase
Ascorbato
oxidase
Tioureia
Suco de Fruta
Tecido de
cogumelo
(Agaricus
bisporus) e
polifenol oxidase
Xantina
Suco de Fruta,
Bebidas
energéticas e
vinho
Xantina oxidase
Suco de Fruta
Glicose oxidase
e Chá
SPR- ressonância de plasma de superfície
Glicose
-
14
120
121
4. BIOSSENSORES COMERCIAIS
Nos últimos anos, diversos trabalhos que descrevem a construção de biossensores
com potencial para aplicação em processos reais foram publicados na literatura. Eles
empregam diversos tipos de reconhecedores biológicos e são capazes de detectar centenas
de compostos de forma rápida e sensível. Apesar disso, a quantidade de biossensores
comerciais ainda é muito limitada. A Tabela 5 apresenta alguns dos biossensores
comerciais disponíveis no mercado.
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Monografia de TCC – Química – Bacharelado – UFSJ – 2014
Tabela 5 – Biossensores comerciais para analise de bebidas
Analito
Aplicação
Etanol, Latato, Glicose, Glicerol, Metanol,
Sucrose e Lactose
Bebidas
Alcoólicas
Bacillus Diarrhoeal enterotoxina,
Campylobacter sp, Escherichia coli, Listeria
spp, Pseudomonas spp, Saumonella aureus,
Salmonella spp, Staphylococcal Enterotoxins
A-E
Bebidas
alcoólicas, não
alcoólicas e
leite
Bacillus spp., Campylobacter jejuni / lari / coli
Clostridium perfringens, Cronobacter sakazakii
Listeria spp., Salmonella spp.,
Escherichia coli, Shigella spp.
Staphylococcus aureus, Vibrio cholera
Vibrio parahaemolyticus, stx1A gene
Leite
Glicose
Bebidas
Lactato
Glicose, Lactato, Malato
+
2+
-
-
-
+
2-
NH4 , Ca , Cl , I , NO3 , K , S , Na
+
Leite
Vinho,
Suco de fruta
Indústria
Alimentícia
Nome do
Biossensor
Am2, Am3, Am5,
Gl10, Gl16
BDEVIA48,
BP0298500,
BP0120500,
BP0253500,
TPEBMED500,
TSGMED500,
SALVIA96,
SETVIA48
Empresa
Ref.
Analox
122
3M
123
VereFoodborne™
Veredus
Laboratory
Pte. Ltd.
124
Answer 8000
Gwent
sensors
125
Microzyme
Biosentec
126
Senzytech one
Tectronik
127
YSI TruLine Ion
Selective
Yellow
springs
instruments
126
O primeiro biosensor comercial foi lançado em 1974 pela Yellow Springs Instrument
e detectava glicose por meio da enzima glicose oxidase imobilizada sobre um eletrodo de
platina. As pesquisas sobre o desenvolvimento de novos biossensores para glicose
cresceram e hoje cerca de 85% do mercado de biossensores são destinados à
determinação de glicose no sangue.128
A viabilidade da comercialização de um biossensor depende da versatilidade e do
baixo custo do sensor. Um dos principais problemas encontrados deve-se ao fato de que o
dispositivo deve funcionar continuamente por longos períodos de tempo (a maioria dos
sensores não cumpre esse requisito devido à fragilidade do reconhecedor biológico) e o
mercado é limitado para análise de apenas um composto. Em contrapartida, o biossensor
permite a troca do reconhecedor biológico imobilizado na superfície, tem a possibilidade de
miniaturização, automação e facilidade de operação que faz com que eles possam ser
empregados em processos reais a um preço competitivo que justifique os investimentos
iniciais necessários.129
A necessidade de novas metodologias cresce anualmente junto com novas
legislações e regulamentos.130 As análises em alimentos devem ser feitas de forma a
satisfazer os requerimentos básicos da indústria e dos órgãos governamentais. Neste
sentido elas são usadas para confirmar se o produto atende às normas previstas na
legislação. Além disso, a diversidade de alimentos disponíveis, a adição de nutrientes aos
alimentos, a adulteração acidental ou deliberada e a demanda por produtos mais saudáveis
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Monografia de TCC – Química – Bacharelado – UFSJ – 2014
por parte do consumidor contribuem para o desenvolvimento do campo de pesquisa em
biossensores.131
Novas tecnologias específicas, como biossensores acoplados a celulares132, a
utilização de novas matrizes para o suporte dos componentes biológicos associados a
novas técnicas de imobilização105;
aptassensores
133;
134
, o desenvolvimento de genossensores, e
135
, dispositivos que promovem análises simultâneas43; 136; 137, microeletrodos
e eletrodos descartáveis,54;
90; 138
dentre outras desenvolvidas para esse mercado nos
últimos anos, e serão capazes de fornecer informações específicas sobre possíveis
contaminações (como pesticidas, metais pesados, poluentes e compostos tóxicos) e sobre a
qualidade do produto final.139
Com isso, o uso de biossensores na análise de alimentos são uma alternativa para
suplementar os métodos existentes. A possibilidade de uma análise rápida, de baixo custo,
sensível, que pode ser feita tanto em laboratório quanto no local de produção e dispositivos
que podem ser construídos de forma que um operador não especializado possa utilizá-los
fazem com que os biossensores possam ser usados em qualquer ponto do processo de
produção alimentar.140
As pesquisas que procuram novas tecnologias que assegurem a durabilidade do
componente biológico e o avanço na miniaturização dos sensores levam a construção de
dispositivos cada vez mais robustos e baratos. Estima-se que o mercado de biossensor irá
sofrer um crescimento significativo nos próximos anos, com a sua receita ultrapassando a
marca de 14 bilhões de dólares em 2016. Infelizmente, apenas uma pequena parcela deste
crescimento é destinada a indústria alimentícia.128; 141
5. CONCLUSÃO
O uso dos biossensores na análise de alimentos tem por objetivo facilitar o controle
de qualidade dos produtos, permitindo uma análise rápida, eficiente e confiável. Um dos
principais problemas na aplicação de biossensores em processos reais é a durabilidade do
dispositivo. Apesar de alguns biossensores descritos na literatura apresentarem dispositivos
com estabilidade de até seis meses, eles ainda são exceção. Em geral, os biossensores
ainda não possuem a estabilidade exigida para uma aplicação prática. No entanto,
características únicas como alta seletividade e sensibilidade, tempo rápido de análise e
baixo custo de construção justificam o emprego destes dispositivos.
Ao analisar as tabelas apresentadas, percebe-se que os biossensores enzimáticos
são os mais empregados para análise em bebidas. Esses sensores são os que possuem
maior durabilidade e potencial para aplicação em processos reais. O leite e seus derivados
também são as bebidas para as quais se encontra maior número de estudos, que se deve
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Monografia de TCC – Química – Bacharelado – UFSJ – 2014
ao fato do leite estar sujeito a maiores fontes de contaminação microbiana e ser um dos
produtos mais consumidos no mundo. Além disso, as aplicações dos dispositivos
encontrados na literatura se concentraram em cinco tipos de bebidas: leite, vinho, cerveja,
suco de fruta natural e chá. Outras bebidas como o café, bebidas lácteas (Iogurte),
energéticos e bebidas esportivas foram citadas em poucos trabalhos.
A diversidade dos trabalhos encontrados na literatura demonstra a versatilidade dos
biossensores. A possibilidade de combinar os reconhecedores biológicos com diferentes
tipos de transdutores de acordo com o evento bioquímico na interface eletrodo-solução, os
novos materiais desenvolvidos nos últimos anos, a possibilidade de usar um conjunto de
biossensores para análise simultânea e a possibilidade de acoplar os biossensores com o
sistema de FIA e BIA fornece aos dispositivos uma ampla faixa de aplicação. Para a
indústria alimentícia, em especial, esses dispositivos podem analisar os contaminantes
presentes de forma rápida e sem a necessidade de longos processos de preparo de
amostra.
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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