Manuela Abelho
Protocolo 7.8
Detecção e enumeração de Clostridium perfringens
(incluindo esporos)
Método da inoculação de tubos múltiplos e contagem segundo o NMP
O Decreto-Lei nº306/2007 define o método apresentado no Protocolo 7.7 como
método analítico de referência para a pesquisa de Clostridium perfringens (incluindo
esporos). O Decreto-Lei nº 236/98 considerava como métodos analíticos de
referência para a quantificação de clostrídios sulfito - redutores em águas de
consumo humano, o aquecimento da amostra a 80 ºC e contagem dos esporos por
(i) sementeira em meio com glucose, sulfito de ferro e contagem das colónias com
halo negro; (ii) filtração através de membrana, colocação do filtro invertido sobre
meio com glucose, sulfito de ferro, recoberto de gelose e contagem das colónias
negras; e (iii) repartição em tubos de meio DRCM (diferencial reinforced clostridium
medium), subcultura dos tubos negros para meio de leite tornesolado e contagem
segundo o Número Mais Provável (NMP). Neste protocolo iremos utilizar o terceiro
método.
Primeiro tempo: elaboração de meios de cultura
Meio
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Reinforced Clostridial Medium
Extracto de carne: 4 g
Extracto de levedura: 5 g
Triptona: 10 g
Glucose: 2g
Amido solúvel: 1 g
Cloridrato de L-cisteína: 0.3 g
Cloreto de sódio: 5 g
Agar-agar: 8 g
Água destilada: 1000 mL
5. Preparar meio de concentração simples, adicionando todos os ingredientes ou
seguindo as instruções do preparado em pó (consultar o Protocolo 1.1 da Parte 1
do Manual de Monitorização Microbiológica Ambiental);
6. Preparar meio de concentração dupla (isto é, duas vezes a quantidade indicada na
embalagem para a mesma quantidade de água) numa quantidade igual a 1/3 da
quantidade de meio simples;
7.
Distribuir 10 mL dos meios de cultura em tubos de 10 mL;
8. Ajustar o pH a 7.1 e esterilizar em autoclave.
Solução de sulfito de sódio
 Sulfito de sódio: 1 g
 Água destilada: 100 mL
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9. Dissolver o sulfito de sódio na água destilada e esterilizar por filtração.
Solução de ferro amoniacal
 Sulfato de ferro III amoniacal (alúmen de ferro) ou citrato de ferro III
amoniacal: 5 g
 Água destilada: 100 mL
10. Dissolver o sulfato ou o citrato de ferro na água destilada, esterilizar por filtração
e utilizar no prazo máximo de 10 dias.
Segundo tempo: recolha das amostras, inoculação e incubação
1. Recolher, manipular e preservar as amostras de acordo com o Protocolo 7.1;
2. Distribuir a amostra de água em tubos de ensaio: 10 mL em 5 tubos de ensaio
grandes (20 mL); 1 mL em 5 tubos de ensaio pequenos (10 mL) e 0.1 mL em
tubos de ensaio pequenos (10 mL);
3. Aquecer, num banho de água, os tubos com as amostras a 80ºC durante 10
minutos, de forma a inactivar as células vegetativas que lá possam existir;
4. Deixar arrefecer e manter a 45ºC até à sua utilização;
5. Ferver em banho de água durante 15 minutos os tubos com o meio base, de forma
a regenerar as condições de anaerobiose (i.e., para eliminar o oxigénio do meio de
cultura);
6. Esperar que arrefeça e manter a 45ºC até à sua utilização;
7.
Imediatamente antes da inoculação, adicionar em cada tubo com meio base de
concentração dupla, 1 mL da solução de sulfito de sódio e 0.5 mL da solução de
ferro amoniacal;
8. Adicionar em cada tubo com meio base de concentração simples, 0.5 mL da
solução de sulfito de sódio e 0.25 mL da solução de ferro amoniacal;
9. Verter, em condições de assepsia, o meio de cultura para os respectivos tubos que
contêm a amostra:
a. Meio de cultura de concentração dupla nos tubos que contêm 10 mL de
amostra;
b. Meio de cultura de concentração simples nos tubos que contêm 1 mL e
0.1 mL de amostra;
10. Agitar suavemente, de forma a evitar a introdução de ar, e arrefecer
imediatamente em água fria;
11. Incubar a 37ºC durante 1 a 5 dias.
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Terceiro tempo: leitura de resultados
1. Verificar se no meio de cultura aparecem colónias negras, isoladas ou não, que
são indicadoras da existência de clostrídeos sulfito-redutores na amostra;
2. Contar os tubos que apresentam resultados positivos em cada diluição e usar
esses algarismos para determinar o NMP de clostrídeos na amostra;
3. O relatório deve incluir a referência à norma e a classificação da qualidade da
água em função da sua utilização e de acordo com a legislação e deve incluir
também: a identificação completa da amostra, a técnica de inoculação e o meio de
cultura utilizado, o tempo e a temperatura de incubação, os resultados obtidos
com os tubos, o NMP de enterococos na amostra e qualquer ocorrência particular
observada durante o decorrer da análise.
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