i
UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
FACULDADE DE BIOMEDICINA
RODRIGO JOSÉ SARAIVA DE BARROS
QUANTIFICAÇÃO DE CÍRCULOS EXCISADOS DURANTE O
REARRANJO DO RECEPTOR DE CÉLULA T (TREC) EM PACIENTES
INFECTADOS POR HTLV-1
BELÉM
2011
ii
RODRIGO JOSÉ SARAIVA DE BARROS
QUANTIFICAÇÃO DE CÍRCULOS EXCISADOS DURANTE O
REARRANJO DO RECEPTOR DE CÉLULA T (TREC) EM PACIENTES
INFECTADOS POR HTLV-1
Trabalho de Conclusão de Curso
apresentado
à
Faculdade
de
Biomedicina da Universidade Federal
do Pará, como requisito parcial para a
obtenção do grau de Bacharel em
Biomedicina.
Orientadora: Profa. Dra. Hellen Thaís Fuzii
BELÉM
2011
iii
RODRIGO JOSÉ SARAIVA DE BARROS
QUANTIFICAÇÃO DE CÍRCULOS EXCISADOS DURANTE O
REARRANJO DO RECEPTOR DE CÉLULA T (TREC) EM PACIENTES
INFECTADOS POR HTLV-1
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado à
Faculdade de Biomedicina da Universidade
Federal do Pará, como requisito parcial para a
obtenção do grau de Bacharel em Biomedicina,
aprovado com o conceito ___________________
Belém (PA), 12 de Dezembro de 2011.
Banca Examinadora:
__________________________________
Profa. Dra. Hellen Thaís Fuzii
NMT – UFPA (Orientadora)
__________________________________
Profa. Dra. Esther Iris Christina Freifrau von Ledebur
ICB – UFPA (Membro)
__________________________________
Profa. Dra. Fabíola Elizabeth Villanova
NMT – UFPA (Membro)
_________________________________
Profa. Dra. Denise da Silva Pinto
ICS – UFPA (Suplente)
iv
“Depois de algum tempo, você aprende... Que não se deve
comparar com os outros, mas com o melhor que pode ser;
Que se leva muito tempo para se tornar a pessoa que
quer ser, e que o tempo é curto; Aprende que não
importa onde já chegou, mas onde está indo;
E você aprende que realmente pode suportar...
Que realmente é forte, e que pode ir muito mais
longe depois de pensar que não se pode mais. E
que realmente a vida tem valor e que você tem
valor diante da vida.”
(Willian Shakespeare)
v
DEDICATÓRIA
Aos meus pais e irmã por todo amor,
carinho e compreensão dedicados a mim ao
longo da vida, sem o qual jamais poderia
me erguer diante dos desafios.
A todos os pacientes infectados pelo HTLV
que colaboraram com este trabalho...
As dificuldades trazidas pela doença não
comprometeram sua esperança.
Um forte exemplo de luta.
vi
AGRADECIMENTOS
A minha orientadora, Profa. Dra. Hellen Thaís Fuzii, obrigado pela paciência, pelo apoio,
incentivo, pelos ensinamentos fundamentais ao meu aprendizado, amizade e acima de tudo
obrigado por acreditar na realização deste trabalho.
Quero expressar os meus sinceros agradecimentos ao Prof. Dr. Juarez Antônio Simões
Quaresma, não só por ser um de meus orientadores, mas pela amizade e por acreditar em
minha capacidade para atuar nos projetos sob sua coordenação e, sobretudo pela ajuda em
meu crescimento científico, lutando pelas minhas causas no decorrer deste ciclo.
A grande Profa. Dra. Fabiola Elizabeth Villanova, pessoa que esteve sempre disposta a me
ajudar, ensinando as variadas técnicas, cedendo seus reagentes e contribuindo com a minha
formação; agradeço pelas conversas calorosas acerca de diversos assuntos, como
computadores e Argentina; por me apresentar a história da ciência, tornando meu aprendizado
mais estimulante, particularmente no que diz respeito à genética e virologia. Devo confessar
que antes de conhecê-la sabia pouco sobre “gigantes”.
A Profa. Dra. Lourdes Garcez, que facilitou meu acesso a fontes bibliográficas. Além disso,
conseguiu, em poucas palavras, me fazer compreender a importância dos princípios e valores
éticos na pesquisa e na vida.
Aos amigos do Laboratório de Imunopatologia, em destaque George Alberto Dias, pela
imensa ajuda na coleta de dados e amostras biológicas dos pacientes neste estudo, pelo
companheirismo e troca de informações.
A todos meus familiares e amigos, pelo carinho e apoio.
A todos que contribuíram direta ou indiretamente para a realização deste trabalho.
vii
SUMÁRIO
1
INTRODUÇÃO
1
1.1
RETROVÍRUS
1
1.2
VÍRUS LINFOTRÓPICO DE CÉLULAS T HUMANA (HTLV)
2
Biologia do HTLV
5
Patologias associadas ao HTLV
11
1.3
PARAPARESIA ESPÁSTICA TROPICAL/MIELOPATIA ASSOCIADA AO 12
HTLV (PET/MAH).
1.4
RESPOSTA IMUNOLÓGICA CONTRA O HTLV-1 NA PET/MAH
16
1.5
O TIMO HUMANO
18
2
OBJETIVOS
21
2.1
OBJETIVO GERAL
21
2.2
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
21
3
MATERIAL E MÉTODOS
22
3.1
CASUÍSTICA
22
Pacientes
22
Critérios de inclusão
22
Critérios de exclusão
22
Aspéctos éticos
23
Avaliação clínica
23
MÉTODOS LABORATORIAIS
23
Separação das células linfomononucleares
23
3.2
viii
Extração do ácido nucléico
24
Clonagem de TREC
24
Purificação do DNA plasmidal de Escherichia coli contendo TREC
25
Quantificação do DNA
26
Detecção e quantificação de partículas TREC
26
Análise estatística
27
4
RESULTADOS
28
4.1
CARACTERIZAÇÃO CLÍNICA DOS PACIENTES
28
4.2
CONTAGEM DE LINFÓCITOS T CD4+ E CD8+
28
4.3
RAZÃO CD4+/CD8+
30
4.4
QUANTIFICAÇÃO DE PARTÍCULAS TREC
31
4.5
CORRELAÇÃO DE PEARSON ENTRE CD4+, CD8+ E TREC COM A 33
IDADE
Linfócitos T CD4+ e idade
33
Linfócito T CD8+ e idade
33
Partículas TREC e idade
34
5
DISCUSSÃO
35
6
CONCLUSÕES
37
REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA
38
ANEXOS
47
ix
LISTA DE FIGURAS E TABELAS
Figura 1
Hipóteses da possível disseminação do HTLV-1 por meio do fluxo
3
migratório humano, deduzida a partir da topologia da árvore
filogenética e fundo antropológico.
Figura 2a
Mapa ilustrando a distribuição global da prevalência da infecção pelo
4
retrovírus HTLV-1.
Figura 2b Mapa ilustrando a distribuição global de populações endêmicas e
epidêmicas para a infecção pelo retrovírus HTLV-2.
4
Figura 3
Representação esquemática da estrutura morfológica do HTLV.
6
Figura 4
Representação esquemática do ciclo de replicação do retrovírus HTLV.
8
Figura 5
Estrutura esquematizada do genoma do HTLV.
9
Figura 6a
Esquema demonstrando as células gliais infectadas pelo HTLV de
acordo com a hipótese da citotoxidade direta.
14
Figura 6b Representação esquematizada da hipótese da autoimunidade na
patogênese da PET/MAH.
15
Figura 6c
Representação esquemática da hipótese do dano colateral na
patogênese da PET/MAH.
15
Figura 7
Comparação entre a contagem de linfócitos T CD4+ (a) e CD8+ (b)
entre os grupos NPA e PA.
30
Figura 8
Comparação da razão CD4+/CD8+ entre os grupos PA e NPA.
31
Figura 9
Comparação do número de TREC entre os grupos NPA e PA.
32
Figura 10
Correlação de linfócitos T CD4+ com a idade nos grupos NPA e PA.
33
Figura 11
Correlação de linfócitos T CD8+ com a idade nos grupos NPA e PA.
34
Figura 12
Correlação de partículas TREC com a idade nos grupos NPA e PA.
34
Tabela 1
Resumo dos dados referentes aos indivíduos incluídos nos grupos NPA
e PA.
28
Tabela 2
Contagem fenotípica de Linfócitos T em indivíduos dos grupos NPA e
PA
29
Tabela 3
Dados referentes à quantificação de TREC em indivíduos dos grupos
PA e NPA.
31
x
LISTA DE SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS
°C
Graus Centígrados
µL
Microlitro
µM
Micromolar
AIDS
Acquired immunodeficiency syndrome (Síndrome da Imunodeficiência Adquirida)
ATLV
Adult T cell Leukemia Virus (Vírus da Leucemia de Células T do Adulto)
CD
Cluster of Differentiation (Grupo de diferenciação)
cDNA
Complementary deoxyribonucleic acid (Ácido desoxirribonucleico complementar)
cj
Code Junction (Junção Code)
CTLs
Cytotoxic T Lymphocytes (Linfócitos T Citotóxicos)
CWC
Column Wash Solution (Solução de lavagem da coluna)
DNA
deoxyribonucleic acid (Ácido Desoxirribonucleico)
EDTA
ethylenediamine tetra acetic (Ácido Etilenodiamino Tetra Acético)
EIE
Ensaio Imunoenzimático
ERB
Endotoxin Removal Wash
FeLV
Feline Leukemia Virus (Vírus da Leucemia Felina)
GLUT-1
glucose transporter 1 (Receptor transportador de glicose 1)
gp
Glicoproteína
HIV
Human Immunodeficiency Virus (Vírus da Imunodeficiência Humana)
HTLV
Human T-cell Lymphotropic Vírus (Vírus Linfotrópico de Células T Humanas)
ID
Identificação
IL
Interleucina
INF
Interferon
Kb
Kilobase
KDa
Kilodaltons
xi
LCR
Líquido Cefalorraquidiano
LLcTA
Leucemia/Linfoma de Células T de Adultos
LTR
Long Terminal Repeats (Longa Repetição Terminais)
mL
Mililitro
mRNA
Messenger ribonucleic acid (RNA Mensageiro)
n
Número Amostral
ng
Nanograma
nm
Nanômetro
NMT
Núcleo de Medicina Tropical
p
Valor de Significância Estatística
PBS
Phophate Buffered Saline (Tampão Fosfato Salino)
PCR
Polymerase Chain Reaction (Reação em Cadeia da Polimerase)
PET/MAH Paraparesia Espástica Tropical/Mielopatia Associada ao HTLV
q-PCR
Quantitative Polymerase Chain Reaction (PCR Quantitativa)
r
Coeficiente de Correlação de Pearson
RNA
Ribonucleic Acid (Ácido Ribonucleico)
RPM
Rotações por Minuto
RTEs
Recently Thymus emigrated cells (Células Recém-emigradas do Timo)
SD
Sem Dados
SIV
Simian Immunodeficiency Virus (Vírus da Imunodeficiência Símio)
STLV
Simian T-Cell Leukemia Virus (Vírus Linfotrópico de Células T de Símio)
TBE
Tris Borato EDTA
TCR
T-cell Receptor (Receptor de Células T)
TGF
Transforming growth factor beta (Fator de Crescimento Transformador)
Th
Linfócitos T Helper
xii
TNF
Tumor necrosis factor (Fator de Necrose Tumoral)
TREC
T cell receptor excision circle (Círculo de Excisão do Receptor de Célula T)
Tregs
Linfócitos T reguladores
UFPA
Universidade Federal do Pará
xiii
RESUMO
O vírus linfotrópico de células de T humanas tipo 1 (HTLV-1) é reconhecido como agente
etiológico da paraparesia espástica tropical/mielopatia associada ao HTLV-1 (PET/MAH).
Sabe-se que o HTLV-1 infecta preferencialmente linfócitos T e que o timo é o órgão essencial
para o desenvolvimento destas células em forma naives. Este trabalho objetivou avaliar a
função tímica de pacientes portadores da infecção pelo vírus HTLV-1 através da
quantificação do número de partículas TREC em células mononucleares do sangue periférico.
O presente estudo envolveu pacientes de ambos os gêneros, residentes no estado do Pará e
atendidos no Ambulatório do Núcleo de Medicina Tropical da UFPA, com diagnóstico
positivo da infecção pelo HTLV-1. Desta população foram selecionados 23 pacientes com
idades entre 30 e 78 anos, divididos em dois grupos: pacientes acometidos por PET/MAH
(PA) e pacientes que não desenvolveram a doença neurológica (NPA). Neste estudo, a análise
comparativa da quantificação de partículas TREC entre o grupo PA e NPA mostrou que os
pacientes PA apresentavam menor número de partículas em relação aos pacientes NPA,
apesar de não ser estatisticamente significante (p = 0,3326) e a correlação do número destas
partículas com a idade, mostrou o declínio de TRECs com a idade em ambos os grupos. Em
relação às contagens de células T CD4+ e CD8+ e a razão CD4/CD8, foi encontrado que não
há diferenças entre os pacientes PA e NPA na contagem de células T CD4+ e na razão
CD4+/CD8+. Verificou-se que os pacientes PA apresentam maior número de células CD8+ em
relação aos pacientes NPA (p = 0,2369). Os resultados deste trabalho demonstraram que há a
diminuição do número de partículas TREC em pacientes acometidos por PET/MAH em
relação a pacientes que não desenvolveram PET/MAH, o que sugere diminuição da função
tímica nesses pacientes além de indicarem uma provavel expansão de células T de memória
em pacientes com PET/MAH.
Palavras-chave: HTLV-1, Timo, TREC, Linfócitos T, Paraparesia, Mielopatia.
1
1. INTRODUÇÃO
1.1 RETROVÍRUS
Os retrovírus são microrganismos pertencentes á família Retroviridae, cujos
membros são compostos por ácido ribonucleico (RNA) e providos de uma enzima RNAdependente-DNA-polimerase, como particularidade de sua estratégia para incorporar seu
genoma na célula hospedeira (Baltimore, 1970; Temim & Mizutani, 1970). Possuem um
capsídeo, constituído por glicoproteínas imunogênicas e, apresentam ainda, um envoltório
lipoprotéico o que, por este motivo, são ditos vírus envelopados (Goff, 2001). Alguns dos
mais conhecidos são o vírus da leucemia felina (FeLV), a infectar felinos domésticos e
silvestres (Jarret, 1999); o vírus da imunodeficiência símio (SIV), a infectar macacos; o vírus
linfotrópico de células T humanas (HTLV) e o vírus da imunodeficiência adquirida (HIV) a
infectar humanos (Gallo, 2002).
Os retrovírus são conhecidos há mais de oito décadas e foram, a princípio,
associados ao aparecimento de sarcoma em galinhas. Posteriormente, foram incriminados no
surgimento de adenocarcinoma mamário e de leucemias em camundongos, fato que elevou o
interesse da comunidade científica em estudar a família Retroviridae (Gallo, 2005).
Os membros desta família foram os primeiros vírus descritos dentre aqueles que
causam infecção em mamíferos. Várias doenças estão associadas a eles, incluindo neoplasias,
doenças neurológicas, imunodeficiências e doenças hematológicas. No entanto, a relação dos
membros da família Retroviridae com algumas doenças em seres humanos permaneceu
obscura até o final da década de 70, quando Poiesz et al. (1980) identificaram e descreveram
um retrovírus em uma linhagem de células T de um paciente posteriormente diagnosticado
com linfoma de células T do adulto (LcTA). Em paralelo a esta descoberta, estudos realizados
no Japão por Yoshida et al. (1982) identificaram um retrovírus que, a principio, foi
denominado de vírus da leucemia de células T do adulto (ATLV). Posteriormente, verificouse que o vírus descrito por Poiesz et al. (1980) e o ATLV japonês eram, na verdade,
semelhantes e, sendo assim, adotou-se a denominação de vírus linfotrópico de células T
Humanas (HTLV) para ambos (Coffin, 1996; Gallo, 2002; Yoshida, 2005).
2
1.2 VÍRUS LINFOTRÓPICO DE CÉLULAS T HUMANA (HTLV)
O vírus linfotrópico de células T humana foi o primeiro retrovírus com potencial
oncogênico a ser identificado em humanos (Matsuura et al., 2010). É um vírus pertencente ao
gênero Deltaretrovírus, no qual atualmente são descritos quatro tipos: HTLV-1, HTLV-2,
HTLV-3 e HTLV-4 (Champs et al., 2010). O HTLV-1 tem sido associado principalmente a
duas doenças: a leucemia/linfoma de células T de adultos (LLcTA) e a paraparesia espástica
tropical/mielopatia associada ao HTLV (PET/MAH), segundo Gessain et al. (1985). O
HTLV-2 está associado a raros casos neurológicos, e foi identificado em 1982, quando
Kalyanaraman et al. (1982), descreveram por meio de ensaios imunológicos, a existência de
um novo tipo de retrovírus que estaria relacionado ao vírus descrito por Poiesz em 1980. Em
2005, foram descritos dois novos retrovírus humanos, denominados HTLV-3 e HTLV-4,
ambos encontrados em indivíduos da África Central. O HTLV-3, descrito por Calattini et al.
(2005), foi isolado a partir de um habitante do Sul da República de Camarões, e estudos
mostraram que este retrovírus é filogeneticamente relacionado ao vírus linfotrópico de células
T de símio tipo 3 (STLV-3). O vírus descrito por Wolfe et al. (2005), o HTLV-4, foi
identificado em populações residentes em áreas rurais também de Camarões e não pôde ser
relacionado filogeneticamente com nenhum tipo de STLV.
Presume-se que a transmissão do HTLV às pessoas deu-se a partir de primatas
não humanos, pois outros retrovírus já foram isolados destes animais em localidades do
continente africano e asiático. Estudos realizados por Yamashita et al. (1998) formularam
hipóteses quanto a origem do HTLV em povos da América do Sul. Assim, segundo estes
autores, a primeira hipótese supõe que o HTLV foi trazido por imigrantes infectados, vindos
da Ásia, que chegaram via América do Norte há cerca de 10.000 anos (Figura 1); a segunda
hipótese levantada é que o vírus foi introduzido na América do Sul por escravos durante o
período de colonização no século XVI. Ambas as hipóteses se baseiam em estudos
filogenéticos que foram realizados em populações étnicas Sul americanas. A imigração
japonesa do início do século XX pode também ter contribuído para a entrada do HTLV no
Brasil. Esta hipótese foi reforçada por Yanagihara et al. (1994) através de um estudo
multicêntrico entre o Brasil e o Japão, onde foi observada pouca variabilidade genética entre
os vírus encontrados nos dois países (Miura et al., 1994; Oliveira & Avelino, 2007).
3
Figura 1 – Hipóteses da possível disseminação do HTLV-1 por meio do fluxo migratório
humano, deduzida a partir da topologia da árvore filogenética e fundo antropológico
(Adaptado de Miura et al. 1994).
O continente africano, o Japão, a Melanésia, as Ilhas do Caribe e o Brasil, juntos
abrigam as cinco maiores aglomerações de indivíduos infectados pelo vírus HTLV-1 e 2
(Segurado, 2010). Estima-se que 10 a 20 milhões de pessoas no mundo estejam infectadas
pelos dois tipos de vírus (Matsuura et al., 2010; Romanelli et al., 2010; Saito, 2010).
O HTLV-1 é visto como endêmico em diversas regiões do mundo, a exemplo do
Japão (Santos et al., 2005), Caribe e América do Sul (Kazanji & Gessain, 2003), África
Equatorial (Diop et al., 2006) e Melanésia. Segundo Santos et al. (2005), o Sul do Japão é a
área endêmica mais afetada no mundo pelo HTLV-1 (Figura 2a). A distribuição geográfica
do HTLV-2 apresenta um perfil diferenciado daquele descrito para o HTLV-1 (Figura 2b). É
o tipo mais prevalente em populações indígenas do continente Americano, apresentando taxas
elevadas nos Seminoles da Flórida, nos Navajos e Pueblos no Novo México, nos Guaymis no
Panamá, nos Wayuus e Tunebos na Colômbia, nos Tobas e Matacos da Argentina e nos Pume
da Venezuela. Soroprevalências de 14% e de 23 % do HTLV-2 foram descritas
respectivamente em povos pigmeus do Zaire e em povos da República de Camarões, na
Africa. (Ishak et al., 2003; Oliveira, 2010).
4
Figura 2a – Mapa ilustrando a distribuição global da prevalência da infecção pelo retrovírus
HTLV-1 (Adaptado de Prietti et al., 2005).
Figura 2b – Mapa ilustrando a distribuição global de populações endêmicas e epidêmicas
para a infecção pelo retrovírus HTLV-2 (Fonte: Loureiro, 2008).
5
No Brasil, estima-se haver 2,5 milhões de pessoas infectadas pelo HTLV-1, o que
representa a segunda maior prevalência para este tipo do retrovírus no mundo (CarneiroProietti et al., 2002). O HTLV-2 está presente de forma significativa nas populações
indígenas brasileiras, principalmente na região Amazônica, incluindo os Kayapó, Yanomami
e os Krahô, que apresentam uma soroprevalência variando entre 3,6% a 38%, dependendo da
tribo estudada (Ishak et al., 2003; Oliveira, 2010).
A transmissão do HTLV ocorre, principalmente, através de três vias de contágio:
a) horizontal, pelo contato sexual, presumindo-se que a ocorrência da infecção por esta via
seja consequente da presença de linfócitos infectados no sêmen e na secreção vaginal (Proietti
et al., 2005; Sousa, 2010) ou pela amamentação (Ishak et al., 2001); b) vertical, da mãe para o
filho, caracterizada por transmissão transplacentária (Van Dooren et al., 2004); c) parenteral,
pelo sangue, sobretudo mediante transplante de órgãos, transfusão de sangue ou de seus
constituintes contaminados, no canal de parto e ainda por meio do uso compartilhado de
seringas e agulhas também contaminadas (Borducchi et al., 1999).
A transmissão do HTLV via transfusão sanguínea vem sendo minimizada no
Brasil em decorrência da obrigatoriedade da triagem sorológica em bancos de sangue desde
1993; porém, os usuários de drogas intravenosas apresentam alto risco de contrair a infecção
pelo HTLV devido ao uso compartilhado de seringas e agulhas contaminadas. Diversos
estudos apontam este como o fator responsável pelo alto índice de prevalência da infecção
pelo vírus neste grupo de indivíduos, principalmente para o HTLV-2 (Biggar et al., 1991;
Proietti, 2000).
Biologia do HTLV
Sobre a sua morfologia, o HTLV consiste em uma partícula viral esférica, com
tamanho de aproximadamente 100 a 140 nm, sendo que o core (região central) contribui com
cerca de 80 a 100 nm de diâmetro do tamanho total. Assim como os demais retrovírus, o
HTLV apresenta um genoma constituído por duas moléculas semelhantes de RNA de fita
simples com polaridade positiva, medindo aproximadamente 9 Kb, contidas por um capsídeo
protéico constituído pelas proteínas p15, p19 e p24, formando assim o seu nucleocapsídeo
(Hjelle, 1991; White & Fenner, 1994; Tangy, 1996; Blut, 1999). As enzimas transcriptase
reversa, integrase, protease e RNase H também estão presentes no nucleocapsídeo e são
6
essenciais para o estabelecimento da infecção viral pelo HTLV (Höllsberg, 1999). O
núcleocapsídeo é coberto pelo envelope lipoprotéico, formado a partir da membrana
plasmática da célula hospedeira, contendo as glicoproteínas virais gp46 e gp21, que são
codificadas pelo gene viral env (Tangy, 1996; Le Blanc et al., 2001; Gessain, 2004;Figura 3).
Figura 3 – Representação esquemática da estrutura morfológica do HTLV (adaptado de
Tangy, 1996).
O HTLV possui a capacidade de infectar vários tipos celulares, tais como:
Linfócitos T e B, células dendríticas e, eventualmente monócitos e células sinoviais. No
entanto, possui tropismo por linfócitos T CD4+, posto que a eficiência de sua entrada dependa
de Proteoglicanas de Heparan Sulfato (HSPGs), moléculas estas que atuam como coreceptores da infecção pelo HTLV e que estão em grande quantidade na superfície de
linfócitos T helper, cruciais na resposta imunológica adquirida. A infecção da célula
hospedeira pelo vírus pode ocorrer de célula a célula através de uma “sinapse viral” induzida,
ou seja, o vírus induz eventos de polarização das células e facilita a junção das células
infectadas com as não infectadas, facilitando assim a passagem da partícula viral entre uma
célula e outra; ou ainda, através do vírion de forma livre, o que é visto como uma forma de
7
infecção menos eficiente (Jones et al., 2006; Majorovits et al., 2008; Satou & Matsuoka,
2010).
O ciclo de replicação do HTLV se inicia com a adsorção do retrovírus à célula
hospedeira por meio da interação entre a glicoproteína gp46, do envelope viral, com o
receptor transportador de glicose 1 (GLUT-1), presente na superfície de linfócitos T CD4+ e
T CD8+. Estima-se que esta interação também possa ocorrer através de regiões hidrofóbicas
dos aminoácidos na porção terminal da glicoproteína gp21, que atua como âncora, penetrando
na membrana da célula e assim facilitando a fusão entre o envelope viral e a membrana da
célula hospedeira (Coffin, 1996; Karpas, 2004; Oliveira, 2010) (Figura 4).
Posteriormente a etapa de interação, o retrovírus torna-se capaz de penetrar na
célula, ocorrendo o seu desnudamento, liberando todo o conteúdo viral no citoplasma. Em
seguida, a fita simples de RNA viral é transcrita a um híbrido de RNA e DNA (cDNA) pela
transcriptase reversa (Gallo et al., 1981). O RNA viral utilizado como molde é degradado pela
a ação da RNase H, e, posteriormente origina uma molécula de DNA de dupla fita. O DNA
então é transportado para o núcleo e integra-se de forma aleatória ao genoma hospedeiro
através da ação da integrase viral (Seiki et al., 1984; Santos et al., 2005). Uma vez integrado à
célula hospedeira, o provírus utiliza a maquinaria celular para promover sua transcrição
(Oliveira, 2010).
Durante a transcrição do DNA viral são formados três tipos de mRNA: um
mRNA de 4,2 Kb, apresentando um evento de processamento por splicing, e que codificará as
proteínas do envelope; um mRNA de 2,1Kb, apresentando duplo evento de processamento
splicing, que será traduzido nas proteínas reguladoras Tax e Rex; e um mRNA subgenômico
longo de 8,5 Kb, sem nenhum evento splicing (unspliced), que codifica os genes gag, pro e
pol (Ferreira Junior et al., 1997). As proteínas precursoras Gag/Pol são codificadas pelo
mesmo mRNA longo. A proteína precursora p52 é clivada em p19 (proteína da matriz), p24
(proteína do capsídeo) e p12 (nucleoproteína). Em seguida, o core viral é montado e a
partícula viral é liberada da superfície celular por brotamento, levando consigo parte da
membrana bilipídica celular como um constituinte de seu envelope (Oliveira, 2010).
8
Figura 4 – Representação esquemática do ciclo de replicação do retrovírus HTLV (Adaptado
de Lopes, 2006).
O genoma viral do HTLV-1 é constituído por três genes estruturais semelhantes
aos demais vírus pertencentes à família Retroviridae: os genes gag, pol e env, ladeados por
duas regiões de sequências repetidas não codificantes, denominadas como longas repetições
terminais (LTR, do inglês: Long Terminal Repeats) localizadas nas extremidades 5’ e 3’ do
provírus, que contêm o sítio de ligação para a RNA polimerase e para as regiões regulatórias
que controlam o nível de transcrição viral (Hjelle, 1991; Hall et al., 1996; Ferreira Jr. et al.,
1997; Souza, 2007). Cada região LTR é formada por três domínios iguais (U3-R-U5) com a
função de iniciador e finalizador da transcrição, respectivamente. Sendo a porção U3 o
domínio onde se encontram os elementos regulatórios de controle da transcrição viral
(Franchini et al., 2000). Além dos genes estruturais, o genoma viral do HTLV apresenta uma
região denominada pX, no qual são codificadas as proteínas Tax (do inglês translator) e Rex
(regulator of expression), e outro segmento denominado pro, sobreposto aos genes gag e pol,
com a função de codificar a enzima protease (White & Fenner, 1994; Coffin et al., 1996;
Tangy, 1996; Souza, 2007) (Figura 5).
9
Figura 5 - Estrutura esquematizada do genoma do HTLV. Fonte: Nicolete, 2009.
O gene gag é o primeiro gene do HTLV a ser transcrito e posteriormente
traduzido na célula hospedeira após a infecção. Codifica uma poliproteína precursora de 48
kDa que, após sofrer clivagem, fornece as proteínas estruturais do capsídeo (p24), da matriz
proteica (p19) e do nucleocapsídeo (p15) (Ciminale et al., 1992). Proteínas estas que
constituem os principais componentes dos retrovírus, portando um papel central na replicação
viral, nos passos iniciais e tardios do ciclo de replicação (Mazurov et al., 2006; Souza, 2007).
O gene pol é o responsável por codificar as enzimas virais necessárias à
replicação, são elas: a transcriptase reversa (RT, do inglês: reverse transcriptase), que
consiste em uma DNA polimerase dependente de RNA, necessária para a transcrição do RNA
viral em DNA complementar ao RNA molde (cDNA); a RNAse H, que remove a fita de RNA
do híbrido RNA-DNA, originando uma segunda fita de DNA; e a enzima integrase que atua
sobretudo no processo de integração do genoma viral ao da célula hospedeira (Hjelle, 1991;
Coffin, 1996; Burmeister, 2001). Sobreposta aos genes gag e pol encontra-se a região pro
cuja função é codificar uma protease responsável pela clivagem das proteínas virais de gag e
pol (Shimothono et al., 1985; Souza, 2007).
10
O produto de tradução da região codificadora do gene env consiste na proteína
precursora gp64 com peso molecular de 69 kDa. Esta proteína, após sofrer ação da protease e
ser glicosilada, origina a glicoproteína transmembrana gp21, que auxilia na fusão do envelope
à membrana celular, e a glicoproteína de superfície do envelope viral gp46, que está
envolvida na ligação ao receptor transportador de glicose 1 (GLUT-1) presente em vários
tipos de células do organismo humano (Coskun & Suton, 2005; Hall et al., 1994; Le Blanc et
al., 2001). As glicoproteínas gp46 e gp21 demonstraram ser altamente imunogênicas em
indivíduos infectados além de serem cruciais para o desenvolvimento do processo infeccioso
pelo HTLV (Rudholf et al.,1993).
A presença da região pX no genoma do HTLV o distingue dos demais retrovírus.
Tal região é responsável por codificar duas proteínas com funções reguladoras da expressão
viral, as proteínas Tax e Rex. A Tax é uma fosfoproteína nuclear que tem a capacidade de
regular a transcrição do genoma proviral, interagindo com fatores de transcrição celulares.
Um subproduto da proteína Tax, denominado p40tax, ativa um gene localizado no domínio
U3 da região LTR, o que consequentemente dá início ao processo de transcrição dos provírus
(Fujisawa et al., 1986; Lopes, 2006). Alguns estudos indicam que a atividade regulatória da
proteína Tax é fundamental para o desenvolvimento de doenças relacionadas ao HTLV-1.
Porém para o HTLV-2, esta relação ainda está pouco esclarecida (Orland et al., 2003). A Rex
por sua vez, é uma fosfoproteína nuclear que atua como regulador do genoma do HTLV ao
controlar o processamento do mRNA viral. Seu mecanismo de ação é tido em forma de feedback negativo, de modo que, o produto de Rex, quando atinge níveis de concentração mais
elevados que os demais produtos da replicação viral, passa a inibir a transcrição de novos
mRNA. Este mecanismo é capaz de regular os níveis de expressão dos genes codificadores
dos componentes virais, determinando uma maior ou menor síntese de partículas infectantes
(Cann & Chen, 1996; Lima, 2006). As proteínas Tax e Rex não somente regulam a expressão
viral como podem interferir nas funções da célula hospedeira, de modo a afetar a transcrição e
a tradução de vários genes celulares no hospedeiro. A expressão da proteína Tax é um fator
importante para a patogênese da PET/MAH, além de ser o principal antígeno de
reconhecimento pelas células imunológicas do hospedeiro durante a resposta contra o HTLV1 (Franchini, 1995; Ferreira et al., 1997; Malta, 2009). Recentemente, estudos realizados por
Boxus & Willems (2009) identificaram uma nova proteína denominada HBZ (HTLV-1 b-ZIP
factor), localizada na região pX do genoma viral, que, junto à proteína Tax, estão implicadas
na patogênese viral do HTLV-1 (Boxus & Willems, 2009; Satou & Matsuoka, 2010). É
11
importante comentar que, de acordo com Cann et al. (2001), Lima (2006) Segurado (2010), a
região LTR tem como uma de suas características ser a região do genoma viral na qual se
detecta o maior número de variações genéticas, ao contrário da região pX acima descrita, que
por possuir caráter regulador, é altamente conservada.
Patologias associadas ao HTLV
Dentre os quatro tipos de HTLV, apenas o HTLV-1 e, possivelmente, o HTLV-2
estão associados a efeitos patológicos da infecção. Até o momento, os vírus HTLV-3 e
HTLV-4 não são considerados agentes etiológicos de doença, assim como é desconhecida sua
forma de transmissão aos humanos.
Várias são as manifestações clínicas associadas à infecção pelo HTLV-1, embora
a maioria dos indivíduos infectados permaneça assintomática ao longo da vida. A
Leucemia/Linfoma de Células T do Adulto (LLcTA) e a Paraparesia Espástica
Tropical/Mielopatia Associada ao HTLV (PET/MAH) são duas doenças claramente
relacionadas com este tipo do retrovírus. Dos indivíduos infectados, somente cerca de 2% a
3% desenvolvem LLcTA e 0,25% a 3,8% a doença neuroinflamatória crônica PET/MAH. É
possível que atividades transativadoras específicas de proteínas virais associadas a eventos
genéticos secundários específicos, em diferentes tipos de células, determinem se a infecção
pelo HTLV-1 se manifestará como leucemia, doença neurológica ou permanecerá
assintomática (Sousa, 2010). Diferenças no sistema imunológico relacionadas à eficiência da
resposta dos linfócitos T citotóxicos dos indivíduos infectados, quando associadas às
diferenças no provírus (partícula viral não envelopada), estariam relacionadas ao risco de
desenvolvimento de doenças inflamatórias como a PET/MAH (Bangham & Osame, 2005).
Em relação ao HTLV-2, que apresenta grande homologia com o HTLV-1, já existe um
conjunto de evidências e estudos que afirmam seu poder patogênico pela ocorrência de
distúrbios hematológicos e neurológicos em indivíduos infectados. Sendo assim, há de se
considerar seu papel como agente etiológico de doenças neurológicas semelhantes a
PET/MAH, além de outras patologias hematológicas (Peters et al., 1999; Silva et al., 2002 e
Macêdo et al., 2004). Contudo, mais estudos são necessários para elucidar essa questão.
12
1.3 PARAPARESIA ESPÁSTICA TROPICAL/MIELOPATIA ASSOCIADA AO HTLV
(PET/MAH).
Trabalhos realizados por Gessain et al. (1985) constataram a soropositividade do
HTLV-1 em 68% dos pacientes acometidos por Paraparesia Espástica Tropical (PET) na
Martinica, no qual associaram o retrovírus como seu agente causal. No ano seguinte, estudos
realizados por Osame et al. (1986) relataram uma doença semelhante no Japão, onde fora
denominada Mielopatia Associada ao HTLV-1 (MAH). Porém, somente em 1988, Román e
Osame concluíram que ambas tratavam-se da mesma doença, que desde então passou a ser
denominada como PET/MAH.
A PET/MAH é uma doença inflamatória crônica progressiva do sistema nervoso
central de baixa letalidade, caracterizada clinicamente por uma paraparesia espástica com
sinais piramidais, comprometimento da função esfincteriana e distúrbios sensitivos, podendo
se desenvolver de forma rápida ou lentamente, sem possibilidades de remissão (Araújo &
Silva, 2006; Malta, 2009). A mielopatia leva a um processo inflamatório de desmielinização
(Coral et al., 1998). A inflamação envolve a medula espinhal, provocando comprometimentos
motores como a fraqueza e espasticidade em membros inferiores; comprometimentos
sensitivos como parestesias e dores neuropáticas; distúrbios esfincterianos vesicais e
intestinais, disfunção erétil no homem, assim como outros sinais e sintomas que culminam
com o declínio da qualidade de vida do paciente (Ribas & Melo, 2002; Oliveira, 2010).
Do ponto de vista patológico, o paciente acometido por PET/MAH possui um
comprometimento da medula espinhal a um nível torácico inferior, com espessamento
leptomeningeo e atrofia medular em diferentes graus. Os achados histopatológicos incluem
infiltração linfocitária perivascular, desmielinização, degeneração axonial e das células gliais.
A intensidade da reação inflamatória está relacionada com a duração da doença, ou seja, na
fase inicial, ocorre um processo meningo-mielítico com proliferação capilar e infiltrado
linfomonocitário acometido, predominantemente na região torácica da medula espinhal.
Progressivamente, ocorre uma degeneração da substância branca, particularmente, do trato
córtico-espinhal lateral, com pouco envolvimento da substância cinzenta (Montanheiro,
2007). De acordo com os trabalhos realizados por Yoshioka et al. (1993) e Iwasaki et al.
(1993), constatou-se que os casos mais avançados da patogênese ocorreram em indivíduos já
acometidos por um longo período pela PET/MAH, além de observarem que o processo de
13
degeneração acaba predominando sobre a inflamação, embora relatos definem que há
persistência de atividade inflamatória após longos períodos de doença.
Segundo Cravois et al. (2000) e Champs et al. (2010), o retrovírus atravessa a
barreira hemato-encefálica através da migração de linfócitos infectados, e, semelhante ao que
ocorre na circulação periférica, a proliferação das células infectadas no interior do liquor é
confrontada por uma intensa resposta imunológica celular anti-HTLV. O predomínio de
anormalidades na coluna lombar da medula torácica pode ser explicado pelo processo
hemodinâmico desta região. No encéfalo de pacientes com PET/MAH, observam-se áreas de
inflamação perivascular na substância branca central e com menor frequência no cérebro e no
tronco encefálico (Montanheiro, 2007).
Embora o mecanismo pelo qual o HTLV induza o desenvolvimento da PET/MAH
seja desconhecido, existem três hipóteses principais que tendem a explicar a patogênese desta
doença (Araujo & Silva, 2006; Malta, 2009):
a) Hipótese da citotoxidade direta, onde o HTLV infectaria as células gliais, as
quais passam a expressar antígenos virais em sua superfície. Os linfócitos T CD8+ citotóxicos
(CTLs) HTLV-específicos, por sua vez, atravessariam a barreira hemato-encefálica, e ao
reconhecerem principalmente a proteína Tax, destruiriam as células infectadas através da
atividade citotóxica direta ou por liberação de citocinas (Ijichi & Osame, 1995; Ijichi et al.,
1996; Nakamura, 2000; Furukawa et al., 2003; Figura 6a). Além disso, de acordo com
estudos realizados por Hamasaki et al. (2001), linfócitos CD4+ infectados pelo HTLV-1
parecem resistir a apoptose, o que contribui para a cronicidade do processo inflamatório.
Numa variante da teoria citotóxica, a resposta inflamatória seria dirigida contra células
nervosas infectadas pelo HTLV-1, em que existiria uma linhagem neurotrópica do vírus
(Watanabe et al., 2004; Malta, 2009).
14
Figura 6a – Esquema demonstrando as células gliais infectadas pelo HTLV de acordo com a
hipótese da citotoxidade direta (Fonte: Taylor, 1998).
b) Hipótese da autoimunidade, onde as células da glia possuem em sua superfície
antígenos self semelhantes aos epítopos virais. Desta maneira, linfócitos T CD4+
reconheceriam células gliais normais, assim como as células infectadas pelo HTLV,
acarretando em uma resposta auto-imune, o que resultaria na morte de células nervosas e
consequente lesão neural (Figura 6b). Em estudo realizado por Krees et al. (2005) foi
identificada a proteína neuronal hnRNP-A1 que apresenta reação cruzada com a proteína viral
Tax, configurando um processo de mimetismo molecular. Outro estudo realizado por Banki et
al. (1994) observaram um processo semelhante de mimetismo molecular entre a proteína viral
Gag e a enzima transaldolase presente em oligodendrócitos. Outro mecanismo capaz de
induzir reatividade cruzada seria a perda da tolerância periférica de linfócitos T auto-reativos
através de um processo autoimune, ocasionado durante a seleção negativa de linfócitos T
imaturos no timo. Esta teoria pode justificar a associação de manifestações autoimunes
sistêmicas nos pacientes com PET/MAH (Rodgers-Johnson et al., 1990; Gessain & Gout,
1992; Furuya et al., 1998; Lee et al., 2005; Montanheiro, 2007; Malta, 2009; Cabral, 2010).
15
Figura 6b – Representação esquematizada da hipótese da autoimunidade na patogênese da
PET/MAH (Fonte: Malta, 2009).
c) Hipótese do dano colateral ou circundante, onde os linfócitos T CD4+
infectados pelo HTLV se infiltrariam no interior do sistema nervoso central através da
barreira hemato-encefálica., Sendo assim, as células T CD8+ citotóxicas (CTLs) específicas
anti-Tax desencadeariam uma resposta inflamatória contra as células infectadas, promovendo
a liberação de citocinas, quimiocinas e metaloproteinases que acabariam por lesar o tecido
nervoso (Hollsberg & Hafler, 1995; Nagai & Osame, 2003; Montanheiro, 2007; Malta, 2009;
Figura 6c).
Figura 6c – Representação esquemática da hipótese do dano colateral na patogênese da
PET/MAH (adaptado de Araujo & Silva, 2006; Malta, 2009).
16
1.4 RESPOSTA IMUNOLÓGICA CONTRA O HTLV-1 NA PET/MAH
O sistema imunológico desempenha um importante papel frente à infecção pelo
HTLV, especialmente durante o desenvolvimento da PET/MAH, devido à natureza
inflamatória desta doença. É provável que a eficiência da resposta imunológica seja um
determinante da carga proviral, e consequentemente do risco apresentado pelo portador em
desenvolver mielopatia (Bangham, 2000). No entanto, sabe-se que para o desenvolvimento
das manifestações clínicas específicas da PET/MAH, os pacientes acometidos pela doença
apresentam uma série de parâmetros imunológicos alterados quando comparados aos
indivíduos infectados assintomáticos. Dentre os mais relevantes, destacam-se o aumento da
capacidade migratória dos leucócitos circulantes; o aumento percentual de linfócitos T CD8+
ativados específicos para o HTLV; a expressão do gene viral de forma intensificada; um
aumento na produção de citocinas pro-inflamatórias nas regiões afetadas da medula espinal,
tais como: INF-γ, TNF-α, IL-1 e IL-6; e finalmente, altos títulos de anticorpos específicos
contra o HTLV, que são encontrados tanto no soro quanto no líquido cefalorraquidiano (LCR)
(Nagai et al., 2001; Araújo et al., 2009; Best et al., 2009; Castro-Costa et al., 2009; Romanelli
et al., 2010).
Conforme elucidado anteriormente, os linfócitos T CD4+ são as células
preferencialmente infectadas pelo HTLV-1 e, portanto, constituem o principal reservatório do
retrovírus in vivo. A infecção pelo HTLV promove a ativação e proliferação precoce destas
células, que exercem a função de direcionar as respostas dos linfócitos B e linfócitos T CD8+
citotóxicos (CTLs) contra o vírus, embora também sejam responsáveis pela liberação de
citocinas que possivelmente contribuem para as lesões inflamatórias no SNC, associadas a
PET/MAH (Grant et al. 2002). No entanto, são as células CTLs que parecem desempenhar
um papel fundamental no curso da infecção e desenvolvimento desta patologia. Estas células
HTLV-específicas encontram-se na forma ativadas e são abundantes durante a infecção;
quando reconhecem principalmente a proteína viral Tax, ocorre a liberação dos grânulos
citotóxicos e lise de células infectadas, além da supressão da replicação viral pela produção de
citocinas pró-inflamatórias. Portanto, a resposta imunológica específica em indivíduos
paraparéticos é característica do tipo Th1, apresentando-se com uma produção aumentada de
citocinas inflamatórias como INF-γ e TNF-α pelos linfócitos presentes no sangue periférico, o
que para alguns autores, leva a uma maior circulação destas células entre o sangue periférico e
17
o sistema nervoso central, propiciando a inflamação e lesão tecidual local. Em estudo
realizado por Matsuura et al. (2010) foi observado que em indivíduos acometidos por
PET/MAH, há um predomínio de citocinas cujo perfil é de resposta Th1 e uma diminuição
nas citocinas do perfil Th2, como a IL-4 que apresenta baixo nível de expressão. (Ahuja et al.,
2007; Matsuura et al., 2010; Toulza et al., 2008; Yamano et al., 2009). De acordo com
Bangham (2000) e Malta (2009), na infecção pelo HTLV-1, as células CTLs HTLVespecíficas desempenham uma importante função em limitar a replicação viral estabelecendo
um equilíbrio na concentração de partículas virais. Deste modo a eficiência com que as
células T CD8+ citotóxicas eliminam as células infectadas pelo retrovírus está relacionada
com a carga viral do indivíduo e consequentemente com o risco de desenvolvimento de
PET/MAH.
No decorrer dos últimos anos, tem-se estudado bastante o papel das células T
reguladoras (Tregs) na infecção pelo HTLV, células estas que foram descritas com os
marcadores CD4+CD25+ e identificadas pela expressão intracelular de Foxp3+. As Tregs são
subpopulações de células T CD4+ responsáveis por suprimir a atividade de células T durante a
resposta inflamatória. Estudos têm mostrado que a infecção pelo HTLV pode modificar os
níveis de expressão de Foxp3 no hospedeiro. Segundo alguns autores, em pacientes
acometidos por PET/MAH relata-se a diminuição da expressão de Foxp3 assim como a
diminuição na produção das citocinas anti-inflamatórias, IL-10 e TGF-β responsáveis pela
função supressora da resposta imunológica, o que determina um desequilíbrio no processo
inflamatório mantido durante a doença. Em estudo realizado por Yamano et al. (2009),
observaram que, a ativação persistente da resposta imunológica induzida por TAX, estaria
associada a uma diminuição da expressão de células T CD4+ supressoras e a um acúmulo da
população de células T CD4+CD25+Foxp3-, ou seja, em pacientes acometidos por PET/MAH
ocorreu
um
aumento
na
subpopulação
de
células
T
com
o
fenótipo
de
CD4+CD25+CCR4+Foxp3- produtoras de IFN-γ, o que se correlaciona com a severidade nos
quadros inflamatórios da PET/MAH. Para Toulza et al. (2008), indivíduos paraparéticos
possuem níveis de TGF-β consideravelmente baixos quando comparados a indivíduos sadios,
além de observarem uma forte correlação negativa entre a frequência de células T
CD4+foxp3+Tax- na circulação e a taxa de lise mediada pelos CTLs de células infectadas pelo
HTLV, o qual concluíram que a frequência das células T CD4+foxp3+Tax- é um importante
determinante da eficiência da resposta imunológica mediada pelas CTLs contra o HTLV e
consequentemente no desenvolvimento da PET/MAH (Heraud et al., 2007; Toulza et al.,
18
2008; Michaëlson et al., 2008; Yamano et al., 2009; Bewick et al., 2009; Montes et al, 2009;
Saito, 2010).
Não há, até o presente momento, um tratamento específico comprovadamente
eficaz para PET/MAH. As medidas terapêuticas utilizadas visam o alívio sintomático das
dores e o combate de infecções associadas à doença (Malta, 2009).
1.5 O TIMO HUMANO
O timo é um órgão linfóide primário, essencial para ontogenia de células T, pois
fornece um ambiente exclusivo para a o desenvolvimento destas células, através de um
processo conhecido como timopoiese (Ye et al., 2004). A população de células T no sangue
periférico é mantida em homeostase no decorrer da vida humana. Tanto a produção de células
recém-emigradas do timo (RTEs) quanto a proliferação de células T já presentes na periferia
contribuem para o pool total de linfócitos T no individuo. Estima-se que geralmente em
crianças, as células T periféricas são mantidas predominantemente através das células recémemigradas do timo, enquanto que em adultos o número de linfócitos T é predominantemente
complementado através da expansão destas células já existentes na periferia (Haynes, 1999).
Além das diferenças quantitativas entre essas duas fontes de células T recémgeradas, existem ainda as diferenças qualitativas (Mackall et al., 1997). Linfócitos T recémgerados no timo sofrem rearranjos no receptor de células T (TCR), proporcionando uma
diversidade no repertório de células T periféricas, o que é necessário para a resposta a
numerosos neoantígenos em potencial. As novas células T geradas através da proliferação de
células T já existentes na periferia preservam o fenótipo de seus progenitores e respondem a
um número limitado de antígenos encontrados. Consequentemente, timócitos recémexportados são críticos para a manutenção da funcionalidade e tamanho do pool de células T
periféricas.
Até o final do primeiro ano de vida, o timo atinge o seu tamanho máximo e
continua a fornecer células T com diversidade de TCR à periferia, estabelecendo assim, o
pool de células T periféricas (Haynes et al., 1998). A timectomia no primeiro mês de vida
pode resultar em algum grau de imunodeficiência, como evidenciado pelo número
significativamente menor de células T e suas subpopulações, além da diminuição na resposta
19
imunológica mediada por estas células. Durante o envelhecimento, a região do espaço
epitelial tímico, onde ocorre a timopoiese, revela uma involução contínua, a partir do 1º ano
até o final da vida, de modo que a região do espaço perivascular tímico, região esta de tecido
não funcional do timo, expande o seu tamanho (Ye & Kirschner, 2002). Embora o tamanho
do timo humano permaneça inalterado, o número absoluto de timócitos diminui drasticamente
com a redução da região do espaço epitelial tímico. As evidências que apóiam a involução do
timo em adultos vem dos estudos em crianças e adultos após tratamento de câncer e trasplante
de células-tronco. As crianças tendem a ter uma reconstituição de células T muita mais rápido
do que os adultos, sugerindo um timo mais ativo (Mackall et al., 1995; Douek et al., 2000).
No entanto, atualmente, alguns estudos demostram que o timo adulto permanece ativo ao
passar dos anos gerando células T funcionais para o repertório linfoide periférico, embora em
quantidades menos intensa com o passar dos anos (Jamieson et al., 1999; Paolin et al., 1999).
A involução tímica durante o envelhecimento humano afeta a timopoiese de
forma quantitativa e não qualitativamente. As distribuições das subpopulações de timócitos
nos adultos são similares às observadas no feto, e timócitos adultos continuam a sofrer o
rearranjo de TCR em níveis semelhantes aos do timo fetal. Além disso, células do estroma
tímico continuam ativas, fornecendo sinais para a sobrevivência dos timócitos e maturação
destes ao longo da vida. Em contrapartida, a timopoiese murina é menos eficiente durante o
envelhecimento, como evidenciado pelo declínio das concentrações de círculos de excisão do
rearranjo de receptores de células T (TREC) em timócitos de animais idosos (Sempowski et
al., 2002).
Recentemente, situações onde as células T estão comprometidas, como na
infecção pelo HIV e/ou pelo HTLV, assim como na síndrome de DiGeorge, têm mostrado que
a medida da função tímica pode ser comparável com a produção de novas células T recém
emigradas do timo (RTEs) (Zhang et al., 1999; Yasunaga et al., 2001; Fomin, 2009). Na
população de células T de interesse, estas células podem ser estimadas a partir da frequência
de particulas TREC (Fugimoto & Yamagashi, 1987; Hazenberg et al., 2001; Ye & Kirschner,
2002). Atualmente a quantificação de TREC tem sido amplamente utilizada para representar
os níveis de RTEs na saúde e na doença, ao explorarem uma característica intrínseca do
processo de rearranjo do TCR no timo. Para gerar a diversidade no repertório de TCR, os
linfócitos T precursores sofrem um processo de rearranjo gênico, fase esta em que ocorrem
excisões de segmentos de DNA, dando origem a pequenos círculos de DNA epissomal, que
são exportados a partir do timo no interior de células recém-emigradas (Ribeiro & Perelson,
20
2007). Estas particulas de DNA epissomal (TREC) são estáveis e não são duplicadas durante
a mitose; portanto, suas concentrações encontram-se diluídas a cada divisão celular. Desta
forma, as concentrações de TREC podem refletir o número de células RTE presentes no
sangue periférico.
A geração de novos linfócitos T no timo é especialmente importante em condições
de imunodeficiência, como a infecção pelo HIV-1, transplante de células tronco
hematopoiéticas, quimioterapia e, de acordo com alguns autores, pacientes infectados pelo
HTLV-1 e acometidos por LLcTA, que possuem indícios de um estado de imunodeficiência
semelhante à encontrada em pacientes com AIDS. Desta forma, nestes indivíduos, a geração
de linfócitos no timo é vista de forma crítica pelos estudiosos, uma vez que permite a
recuperação da imunidade mediada por células T, melhor do que se a recuperação for através
apenas da expansão destas células pré-existentes na periferia (Yasunaga et al., 2001; Ye &
Kirschner, 2002).
De acordo com estudos realizados por Yasunaga et al. (2001), a baixa
porcentagem de linfócitos T naive em portadores infectados pelo HTLV-1 com idade de 50
anos, sugere que a função tímica é prejudicada. Muito se tem utilizado a quantificação de
TRECs como um indicador para medição da produção tímica em indivíduos infectados pelo
HIV. Portanto, pode-se inferir a partir da análise de TRECs se a geração de células T naives é
reduzida ou não em portadores da infecção pelo HTLV e acometidos por PET/MAH. Nos
trabalhos de Yasunaga et al. (2001), foi observado que em indivíduos infectados pelo HTLV1 a concentração de TRECs diminuiu conforme a idade, o que é consistente com o achado de
diminuição relativa à idade dos linfócitos T naive. Os resultados deste estudo indicam que a
baixa contagem de linfócitos T naive pode estar ocorrendo em decorrência de uma linfopoiese
T prejudicada.
Na literatura existem poucos estudos quantificando as partículas TREC em
indivíduos HTLV positivo e, até o momento não há nenhum estudo publicado de pacientes
acometidos por PET/MAH na população brasileira.
21
2. OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar a função tímica de pacientes portadores da infecção pelo vírus HTLV-1
através da quantificação do número de TREC em células mononucleares do sangue periférico.
2.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS
Quantificar o número de partículas de TREC em células mononucleares de sangue
periférico de pacientes infectados por HTLV- 1 que desenvolveram PET/MAH;
Quantificar o número de partículas de TREC em células mononucleares de sangue
periférico de pacientes infectados por HTLV- 1 que não desenvolveram PET/MAH;
Correlacionar os resultados obtidos nos dois grupos de pacientes infectados por
HTLV-1.
22
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 CASUÍSTICA
Pacientes
Foram selecionados 23 pacientes com idade entre 30 e 78 anos atendidos no
Ambulatório do Núcleo de Medicina Tropical (NMT) da Universidade Federal do Pará
(UFPA). Deste total foram estabelecidos dois grupos de pacientes: grupo PA composto por
sete pacientes infectados por HTLV-1 e acometidos por PET/MAH e, grupo NPA
compreendido por 16 pacientes infectados por HTLV-1 que não desenvolveram PET/MAH ou
LLcTA.
Critérios de inclusão
Foram incluídos neste estudo pacientes de ambos os gêneros residentes no estado
do Pará que recebessem acompanhamento médico no ambulatório do NMT-UFPA, cujo
diagnóstico através de teste de triagem por ensaio imunoenzimático (EIE) fosse positivo e
confirmado pelo teste da reação em cadeia da polimerase (PCR) para o HTLV-1;
acompanhados das características de espasticidade no momento da avaliação clínica (apenas
para o grupo PA); pacientes que não apresentassem clínica para espasticidade embora
apresentassem outros sintomas como: fibromialgia, artrite, artrose, entre outros (para inclusão
no grupo NPA).
Critérios de exclusão
Foram excluídos deste estudo pacientes que não fossem atendidos pelo
ambulatório do NMT-UFPA e que não se tenha detectado a presença de anticorpos
específicos para o HTLV-1 por teste triagem por EIE e negativo por PCR; da mesma forma
foram excluídos pacientes que, mesmo que tenham apresentado os critérios de inclusão acima
descritos, fossem soropositivo para a infecção pelo HIV ou outro agente infeccioso que
ocasione imunossupressão; e aqueles que não concordaram em participar deste estudo.
23
Aspectos éticos
O presente trabalho foi submetido à comissão de ética em pesquisa (Anexo A) do
Núcleo de Medicina Tropical (NMT) da UFPA e por ela aprovado tendo seguido as diretrizes
e as normas regulamentadoras de pesquisa envolvendo seres humanos (Resolução 196 do
Conselho Nacional de Saúde). As amostras de sangue só foram colhidas mediante
concordância dos pacientes consultados em participar do projeto. Tal concordância foi
oficialmente documentado em Termo de Consentimento Livre e Esclarecido devidamente
assinado por cada paciente (Anexo B). Toda e quaisquer informação de identificação pessoal
do paciente envolvido no estudo foram consideradas confidenciais e, portanto, mantidas sob
sigilo, do modo que somente os membros do grupo de pesquisa têm acesso a elas.
Avaliação clínica
Tais pacientes foram submetidos à avaliação clínica no ambulatório do NMTUFPA com médico reumatologista e infectologista, ocasião esta em que se procedia à
anamnese e ao exame físico. Desses pacientes, foram selecionados sete acometidos por
PET/MAH (grupo PA) e 16 sem o diagnóstico para a doença neuroinflamatória (grupo NPA).
Os dados clínicos utilizados neste estudo foram obtidos a partir de informações
contidas nas fichas de avaliação clínica decorrente das consultas realizadas no ambulatório,
onde constavam informações como idade, sexo, sintomas e contagem da população de
linfócitos T CD4+ e CD8+ (Anexo C).
3.2 MÉTODOS LABORATORIAIS
Separação das células linfomononucleares
Para cada paciente selecionado foram coletados 5 mL de sangue em tubo
cilindrico
contendo
anticoagulante
ácido
etilenodiamino
tetra
acético
(EDTA),
homogeneizando-se a mistura manualmente por inversão, imediatamente após a coleta. O
sangue então era diluído em 1:2 com solução tampão fosfato salina (PBS) 1x em tubo cônico
Falcon® de 50 mL. Em outro tubo de 50 mL foi adicionado 5 mL de Ficoll-Hypaque e em
seguida a amostra diluida foi adicionada lentamente para que se formasse duas interfaces. Em
24
seguida, o tubo cônico foi centrifugado a 2000 RPM por 30 minutos, utilizando a centrífuga
Heltich Zentrifugen Universal 320 R. Após a centrifuação, na região interfásica ocorria a
formação de camada de células linfomononucleares, a qual era recolhida por pipetagem e
trasnferida para outro tubo de 50 mL. Para finalizar, as células foram lavadas por mais uma
vez com PBS 1x, sendo centrifugadas a 4000 RPM por 20 minutos a 15ºC. O sobrenadante
foi desprezado, e o pellet de células foi ressuspendico em 1 mL de PBS 1x e armazenadas em
microtubo de 1,5 mL a -80°C para posterior extração de DNA.
Extração do ácido nucléico
Para
obtenção
do
ácido
desoxirribonucleico
(DNA)
das
células
®
linfomononucleares foi utilizado o kit QIAamp DNA Mini and Blood Mini Kit (Qiagen®),
segundo instruções do fabricante.
Para a execução da técnica, em microtubo estéril de 1,5 mL foram adicionados 20
µL de Proteinase K/Protease ER, 200 µL de Buffer AL e 200 µL do espécime. A mistura foi
suavemente homogeneizada com auxílio da própria pipeta e incubada em banho Maria à
temperatura de 56 °C por 10 minutos. Ao final do tempo de incubação, foram adicionados
200 µL de ethanol absoluto (Merck®) e agitou-se vigorosamente por 15 segundos. Em seguida
transferiu-se o produto para o microtubo-filtro (coluna) para dar início ao procedimento de
lavagem. Após centrifugar a 8000 RPM por um minuto, foram adicionados ao microtubofiltro 500 µL de solução Buffer AW1 e centrifugou-se novamente a 8000 RPM por um
minuto. Adicionou-se 500 µL de solução Buffer AW2 e procedeu-se uma nova centrifugação
a 13000 RPM durante três minutos. Finalmente, para eluir o DNA na coluna utilizou-se 100
µL de água MiliQ previamente aquecida à 37 °C e centrifugou-se a 8000 por um minuto. A
solução resultante desta centrifugação contém o DNA extraído da amostra.
Clonagem de TREC
O DNA amplificado de TREC foi clonado utilizando TOPO TA Cloning Kit
®
(Invitrogen ). Resumidamente, foi realizada uma PCR comum, utilizando os óligos
iniciadores para o fragmento cjTREC. Em seguida, em um microtubo de 1,5 mL foi
adicionado 1 µL da PCR, 3 µL de água MilliQ, 1uL de solução de sal e 1 µL de vetor, e foi
25
incubado a 5 °C de um dia para o outro. O próximo passo foi transformar as bactérias
competentes com os vetores contendo o inserto. Em um tubo de One Shot® competent cells
(Invitrogen®), foi adicionado 2 µl do vetor e a transformação foi realizada por eletroporação.
As bactérias transformadas foram incubadas em placas de Petri contendo meio LB com 50
µg/mL kanamicina e X-Gal. Colônias que cresceram de cor branca foram selecionadas e
crescidas em meio S.O.C. a temperatura de 37°C.
Purificação do DNA plasmidal de Escherichia coli contendo TREC
O DNA plasmidal correspondente ao vetor contendo o amplicon foi purificado
com o Kit Pure Yeld™ Plasmid Miniprep System (Promega®), conforme recomendações do
fabricante e descrito a seguir:
Em microtubo estéril de 1,5 mL foram adicionados 600 µL do inóculo de cultura
bacteriana, 100 µL de solução Cell Lysis Buffer e homogeneizado seis vezes por inversão.
Adicionou-se 350 µL de Neutralization Buffer previamente refrigerado, homogeneizou-se seis
vezes por inversão e procedeu-se a centrifugação a 13000 RPM por três minutos. O
sobrenadante foi então transferido para o microtubo filtro (coluna) cuidadosamente sem
misturar ao pellet formado. Após o microtubo-filtro ser centrifugado a 13000 RPM por 15
segundos, o material eluido foi descartado e acrescentou-se ao tubo 200 µL de solução
Endotoxin Removal Wash (ERB) e centrifugado novamente a 13000 RPM por 15 segundos.
Descartado o material eluído, foram adicionados 400 µL de Column Wash Solution (CWC) e
procedeu-se a centrifugação a 13000 RPM por 30 segundos. Finalmente, para a eluir o DNA
plasmidal utilizou-se 30 µL de solução Elution Buffer e procedeu-se centrifugação a 13000
RPM por 15 segundos. O material resultante desta centrifugação contém o DNA plasmidal
extraído da cultura de E. coli contendo o amplicon de TREC.
Para verificar se o plasmídeo continha o inserto, outro procedimento de PCR foi
realizado com óligos iniciadores M13 Forward e Reverse. A banda esperada em gel de
agarose 1% em TBE era de aproximadamente 600 pb. Com a presença da banda, este produto
foi submetido a seqüenciamento para verificar se o inserto possuía a sequência de cjTREC.
26
Quantificação do DNA
A avaliação qualitativa e quantitativa de DNA foi realizada para verificar a
concentração e grau de pureza do DNA extraído das amostras de sangue coletada dos
pacientes e do padrão cjTREC plasmidal. Este procedimento foi realizado utilizando o Kit
Quanti-iT™ dsDNA BR Assay *2-1000 ng* para o equipamento Invitrogen Qubit®
Fluorometer e procedeu-se à leitura das amostras seguindo as instruções do fabricante.
Detecção e quantificação de partículas TREC
Para a curva padrão absoluta, foi realizada a quantificação e cálculo do número de
partículas TREC a partir do produto clonado. Para isso, foi realizado um calculo que levou em
consideração a massa molecular do plasmídeo acrescido da massa molecular do inserto.
Foram, então, realizadas diluições seriadas com fator 10, variando de 101 a 107 para o desenho
da curva padrão.
A quantificação da concentração de partículas TREC foi determinada pelo método
de reação em cadeia da polimerase quantitativo em tempo real (q-PCR), utilizando o
equipamento StepOnePlus™ (Applied Biosystems®).
A PCR em tempo real foi realizada utilizando-se, para um volume de 20 µL: 40
ng de DNA de cada amostra; 0,5 µL de cada óligo (sentido e reverso) a 100 µmol e 12,5 µL
de reagente QuantiFast® SYBR® Green PCR (Qiagen®). Os primers de cjTREC utilizados
para a reação de PCR foram: Sentido 5’-CCT GTT TGT TAA GGC ACA TTA GAA TCT
CTC ACT G-3’, Reverso 5’-CTA ATA ATA AGA TCC TCA AGG GTC GAG ACT GTC3’. O tamanho do produto gerado foi de 360 pb.
As condições de ciclagem da PCR foram: 10 minutos a 95 °C, seguidos de 20
segundos a 95 °C, um minuto e 20 segundos a 63,5 °C por 40 ciclos consecutivos. Os ensaios
foram realizados em duplicata incluindo a série de diluições do padrão cjTREC plasmidal em
concentrações de 101 a 107 números de partículas.
27
Análise estatística
Os dados obtidos foram armazenados em banco de dados elaborado no Programa
Excel (Windows, Microsoft®) para posterior realização da análise estatística. Para análise
estatística, foram utilizados os softwares BioEstat 5.0 e Prism 5. Os testes utilizado para a
comparação entre grupos foram o teste de Mann-Whitney e teste T, e para a análise de
correlação foi utilizado o teste de correlação de Pearson. Foi adotado valor de p ≤ 0,05 como
nível de significância.
28
4. RESULTADOS
4.1 CARACTERIZAÇÃO CLÍNICA DOS PACIENTES
Para a realização deste trabalho foram utilizadas células mononucleares de 23
pacientes (n = 23) infectados por HTLV-1. Os pacientes foram divididos em dois grupos, de
acordo com as manifestações clínicas. Um dos grupos foi formado por 7 pacientes que
desenvolveram PET/MAH (PA) e, o outro com 16 pacientes que não desenvolveram
PET/MAH (NPA).
Dos indivíduos que compuseram o grupo NPA, 15 (93,75%) eram do sexo
feminino e apenas um (6,25%) do sexo masculino. No que se refere a idade, o grupo NPA
variou de 16 a 78 anos (média de 50 anos). No grupo PA, 5 (71,43%) pacientes pertenciam ao
sexo feminino e 2 (28,57%) o sexo masculino, ambos variando a idade entre 35 e 61 anos
(média de 48,4 anos) (Tabela 1).
Tabela 1 - Resumo dos dados referentes aos indivíduos incluídos nos grupos NPA e PA.
Grupo
N° de Indivíduos
Idade média
Sexo (%)
F
M
NPA
16
50
93,7
6,3
PA
7
48,4
71,4
28,6
4.2 CONTAGEM DE LINFÓCITOS T CD4+ E CD8+
A contagem de CD4+ e CD8+ obtidas dos prontuários dos pacientes foram
comparadas entre os dois grupos (Tabela 2).
A análise de CD4+ mostrou para o grupo PA a média de 1638,6 linfócitos CD4+/
mm3, variando de 1245 a 3024 células/mm3, e para o grupo NPA, a média de 1353,2
linfócitos T/mm3, variando de 603 a 2301 células/mm3.
29
A contagem de células CD8+ mostrou para o grupo PA a média de 828,8 linfócitos
CD8+/mm3, variando de 442 a 1167 células/mm3, e para o grupo NPA, a média de 612,5
linfócitos T CD8+/mm3, variando de 395 a 907 células/mm3.
Tabela 2 - Contagem fenotípica de Linfócitos T em indivíduos dos grupos NPA e PA.
Grupos
Grupo PA
Grupo
NPA
ID
Contagem absoluta
CD4+
Contagem absoluta
CD8+
Razão
CD4+/CD8+
PA-01
PA-02
PA-03
PA-04
PA-05
PA-06
PA-07
MÉDIA
SD
1245
SD
3024
1292
1330
1302
1638,6
SD
1167
SD
817
442
595
1123
828,8
SD
1,07
SD
3,70
2,92
2,24
1,16
2,22
NPA-01
NPA-02
NPA-03
NPA-04
NPA-05
NPA-06
NPA-07
NPA-08
NPA-09
NPA-10
NPA-11
NPA-12
NPA-13
NPA-14
NPA-15
NPA-16
MÉDIA
1610
1666
1451
1450
1133
1036
SD
776
603
907
2288
2301
1303
1067
SD
SD
1353,2
532
669
493
649
653
499
SD
395
401
639
852
907
567
706
SD
SD
612,5
3,03
2,49
2,94
2,23
1,74
2,08
SD
1,96
1,50
1,42
2,69
2,54
2,30
1,51
SD
SD
2,19
ID: Identificação; SD: Sem dados.
30
Em relação aos linfócitos T CD4+, não foi observada diferença em sua
quantificação conforme mostra a figura 7a (p = 0,6221, pelo teste T). A análise do número
dos linfócitos T CD8+ mostrou ligeiro aumento para o grupo PA, porém não foi
estatisticamente significante, com valor de p = 0,2369 (Figura 7b).
a
b
p = 0,6221
p = 0,2369
1500
Linfócitos T CD8 +
3000
2000
1000
1000
500
PA
PA
A
NP
A
0
0
NP
Linfócitos T CD4 +
4000
Figura 7 – Comparação entre a contagem de linfócitos T CD4+ (a) e CD8+ (b) entre os
grupos NPA e PA.
4.3 RAZÃO CD4+/CD8+
O significado clínico da quantidade de sub-populações de linfócitos T circulantes
no sangue periférico pode ser um indicativo da integridade da resposta imunológica do
hospedeiro. Assim, quando a razão entre CD4+/CD8+ está abaixo de 1,2 a resposta adaptativa
do indivíduo pode estar comprometida (Malta, 2009). Para o grupo PA a razão ocilou entre
1,07 e 3,70 com média de 2,22. O grupo NPA apresentou razão entre 1,42 e 3,03 com média
de 2,1 (Tabela 2).
A comparação dos valores de razão entre os dois grupos estudados não mostrou
diferença (p = 0,9215) (Figura 8).
31
p = 0,9215
Razão CD4+/CD8+
4
3
2
1
N
P
A
P
A
0
Figura 8 – Comparação da razão CD4+/CD8+ entre os grupos PA e NPA.
4.4 QUANTIFICAÇÃO DE PARTÍCULAS TREC
A quantificação de partículas TREC foi determinada por meio de PCR em tempo
real quantitativa (q-PCR), utilizando a técnica de quantificação absoluta por meio de curva
absoluta, como descrita em Materiais e Métodos.
Para os pacientes do grupo NPA, a quantificação de partículas apresentou média
de 321,48 partículas TREC/40ng DNA, variando de 15,91 a 811,46 partículas. Para os
pacientes PA, a média foi 212,07 partículas TREC/40ng DNA, variando de 29,51 a 623,18
partículas (Tabela 3).
Tabela 3 – Dados referentes a quantificação de TREC em indivíduos dos grupos PA e NPA.
Grupos
Grupo PA
ID
N° de partículas
TREC/40ng DNA
PA-01
PA-02
PA-03
PA-04
PA-05
PA-06
PA-07
MÉDIA
83,35
81,94
23,18
326,15
221,39
29,51
119,00
212,07
32
NPA-01
NPA-02
NPA-03
NPA-04
NPA-05
NPA-06
NPA-07
NPA-08
NPA-09
NPA-10
NPA-11
NPA-12
NPA-13
NPA-14
NPA-15
NPA-16
MÉDIA
Grupo NPA
93,03
550,67
672,85
463,82
73,68
182,25
187,40
263,80
230,45
354,87
461,22
811,46
528,30
15,91
76,94
176,98
321,48
Embora estes resultados não tenham demonstrado diferença significante entre os
grupos (p = 0,3326) pode-se notar pela figura 9 que, o grupo PA tende a apresentar menor
número de particulas TREC que os pacientes do grupo NPA.
p = 0,3326
TREC/40 ng DNA
1000
800
600
400
200
P
A
N
PA
0
Figura 9 – Comparação do número de TREC entre os grupos NPA e PA.
33
4.5 CORRELAÇÃO DE PEARSON ENTRE CD4+, CD8+ E TREC COM A IDADE
Linfócitos T CD4+ e idade
O próximo passo na análise de dados foi a análise de correlação entre as
quantificações realizadas para os pacientes.
Inicialmente, correlacionou-se o número de linfócitos T CD4+ com a idade e
observou-se que, para os dois grupos NPA e PA, não houve correlação, mostrando que com a
idade, o número de células CD4+ se mantém constante. Para o grupo NPA o r foi de 0,04 (p =
0,8501) e para o grupo PA r = 0,04 (p = 0,9321) conforme demonstrado na figura 10.
a
b
Grupo NPA
4000
r = 0,04
p = 0,8501
2000
Linfócitos T CD4+
Linfócitos T CD4+
2500
Grupo PA
1500
1000
500
0
0
20
40
Idade
60
80
r = 0,04
p = 0,9321
3000
2000
1000
0
30
40
50
60
70
Idade
Figura 10 – Correlação de linfócitos T CD4+ com a idade nos grupos NPA (a) e PA (b).
Linfócito T CD8+ e idade
Quando correlacionado a quantidade de linfócitos T CD8+ com a idade, notou-se
que houve uma fraca correlação positiva em ambos os grupos. Para o grupo NPA os
resultados demonstraram um r = 0,20 (p = 0,3603) e para o grupo PA r = 0,18 (p = 0,9268)
(Figura 11).
34
a
b
Grupo NPA
Grupo PA
2500
r = 0,20
p = 0,3603
Linfócitos T CD8+
Linfócitos T CD8+
1500
1000
500
0
30
40
50
60
70
2000
r = 0,18
p = 0,9268
1500
1000
500
0
30
80
40
Idade
50
60
70
Idade
Figura 11 - Correlação de linfócitos T CD8+ com a idade nos grupos NPA (a) e PA (b).
Partículas TREC e idade
A correlação entre a quantidade de partículas TREC e a idade demostrou que há
uma fraca correlação negativa em ambos os grupos. Porém, o grupo PA (r = -0,37)
apresentrou um valor de r menor que o grupo NPA (r = -0,19), como mostra a figura 12. Com
isso, verfica-se que o grupo PA tende a ter maior queda de particulas TREC com a idade.
a
b
Grupo NPA
800
r = - 0,19
p = 0,4881
800
TREC/40ng DNA
TREC/40ng DNA
1000
Grupo PA
600
400
200
0
40
60
Idade
80
100
r = - 0,37
p = 0,4119
600
400
200
0
30
40
50
60
70
Idade
Figura 12 - Correlação de partículas TREC com a idade nos grupos NPA (a) e PA (b).
35
5. DISCUSSÃO
O HTLV-1 infecta preferencialmente células T, em particular CD4+. As células T
que são desenvolvidas no timo são um importante braço do sistema imunológico. Sabe-se que
a involução tímica ocorre com o passar da idade, porém, estudos mostram que há presença de
tecido tímico em adultos com idade superior a 107 anos (Steinman, 1985). A importância da
função tímica tomou novos rumos com o aparecimento de doenças como a infecção por HIV,
após tratamento com antiretrovirais, e em câncer, após quimioterapia. Para avaliar a atividade
tímica, como a obtenção de amostras teciduais de timo é difícil, técnicas de avaliação indireta
tem sido utilizadas. A quantificação de TREC em sangue periférico é uma das técnicas mais
utilizadas. A avaliação da função tímica em infecções virais que acometem células T, como
na infecção pelo HIV e HTLV, é de grande importância para que se possa compreender
melhor a patogenia dessas doenças.
Neste estudo, a análise comparativa da quantificação de partículas TREC entre o
grupo PA e NPA mostrou que os pacientes PA apresentavam menor número de partículas em
relação aos pacientes NPA, apesar de não ser estatisticamente significante, isto pode ser
demonstrativo de que a geração de linfócitos T naives tende a estar prejudicada nestes
pacientes. Estes achados são correlatos aos encontrados por Yasunaga et al. (2001). Porém
estes autores mostraram a diminuição de partículas TREC em portadores de HTLV em
relação a indivíduos não infectados. Embora neste estudo não se tenha analizado a carga
proviral de ambos os grupos de indivíduos estudados, outros trabalhos demonstraram que a
extensão da diminuição de células T naives em infectados pelo HTLV-1, não está
correlacionada com o aumento da carga proviral, porém foi associada à infecção pelo
retrovírus (Yasunaga, 2001).
Sabe-se que com a idade existe o decaimento da produção de células T naives
pelo timo, porém isso não afetaria a resposta imunológica. Com isso, também se
correlacionou o número de TREC com a idade dos pacientes. A correlação de número de
partículas TREC com a idade, mostra declínio destas partículas com a idade em ambos os
grupos, PA e NPA, porém foi mais acentuado para o grupo PA. Isso corroborando com os
achados de Yasunaga et al. Apesar de apresentar menor número de TREC, ou seja, menor
número de células naives sendo produzidas, ao correlacionar o número de células CD4+ e
CD8+ e a idades, não foi verificado correlação. Isso provavelmente ocorreu pela expansão de
36
células de memória nos pacientes PA, o que já foi relatado em outros estudos (Worner, 1990;
Yasunaga, 2001).
Em relação às contagens de células T CD4+ e CD8+ e a razão CD4+/CD8+, foi
encontrado que não há diferenças entre os pacientes PA e NPA na contagem de células T
CD4+ e na razão CD4+/CD8+. Apenas verificou-se que os pacientes PA apresentam maior
número de células CD8+ em relação aos pacientes NPA. Este dado reforça ainda mais a
indicação de proliferação de células de memória. Estudos mostraram que o número de células
de memória CD8+ específicas contra TAX, correlaciona positivamente com a carga viral de
HTLV. Apesar deste dado de carga viral não ter sido avaliado, sabe-se que pacientes com
PET/MAH apresentam alta carga viral, o que explicaria a expanssão clonal de células T,
principalemente de CD8+ (Nagai, 1998; Nagai, 2001).
37
6. CONCLUSÕES
- Há diminuição não significante do número de partículas TREC em pacientes
acometidos por PET/MAH em relação a pacientes que não desenvolveram a doença, isto é
sugestivo de que possa haver provável diminuição da função tímica em pacientes acometidos
por PET/MAH.
- Os dados indicam provável expansão de células de memória nos pacientes que
desenvolveram PET/MAH.
- Não houve diferenças entre as contagens de células T CD4+, CD8+, nem mesmo
no cálculo de Razão CD4+/CD8+ entre os grupos de pacientes.
38
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47
ANEXOS
48
ANEXO A: PARECER DE APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA
DO NMT
49
ANEXO B: TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
NÚCLEO DE MEDICINA TROPICAL
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL
Correlação entre a avaliação clínica, padrão de resposta periférica e a função tímica de
pacientes acometidos por paraparesia espástica tropical/mielopatia associada ao HTLV.
As pessoas que são infectadas pelo HTLV-1 podem desenvolver várias doenças,
dentre elas, uma lesão na coluna que leva a dificuldade de caminhar, a paraparesia espástica.
No entanto, a maioria dos indivíduos infectados não adoece. Para adoecer, o vírus causa
mudanças na defesa do corpo. Para entender e tratar melhor as doenças causadas pelo HTLV,
este trabalho se propõe a estudar as defesas do corpo juntamente com as alterações dos
pacientes infectados com HTLV. Para isso, coletaremos amostras de sangue e realizaremos
avaliação clínica, sem qualquer outra intervenção.
Se você tiver qualquer dúvida sobre este estudo, você pode entrar em contato com
George Alberto da Silva Dias, aluno do curso de Mestrado em Doenças Tropicais pela UFPA
pelo telefone (91)8108-9582. Se você tiver dúvidas sobre seus direitos ou com relação aos
aspectos éticos do trabalho, você pode entrar em contado com o Comitê de Ética em Pesquisa
Envolvendo Seres Humanos (CEP) do Núcleo de Medicina Tropical - UFPA – Av.
Generalíssimo Deodoro, 92, Umarizal, Belém – PA; Telefone 3241-0032.
É garantida a liberdade de retirar o consentimento a qualquer momento e deixar de
participar do estudo sem qualquer prejuízo à continuidade de tratamento na instituição. As
informações serão analisadas em conjunto a outros pacientes, não divulgadas as suas
identificações. Não há nenhuma despesa pessoal adicional ao participante do estudo e
nenhuma compensação financeira relacionada à sua participação. Os dados obtidos por sua
participação serão apenas utilizados para este estudo.
Acredito ter sido suficientemente informado a respeito das informações que li ou que
foram lidas para mim, descrevendo o estudo “Correlação entre a Avaliação Clínica, Padrão de
Resposta Periférica e a Função Tímica de Pacientes Acometidos por Paraparesia Espástica
Tropical/Mielopatia Associada ao HTLV”.
Eu discuti com o George Alberto da Silva Dias sobre a minha decisão em participar
nesse estudo. Ficaram claros para mim, quais são os propósitos, os procedimentos a serem
realizados, seus desconfortos e riscos, as garantias de confidencialidade e de esclarecimentos
permanentes. Ficou claro também que minha participação é isenta de despesas e que tenho
garantia do acesso a tratamento hospitalar quando necessário. Concordo voluntariamente em
participar deste estudo e poderei retirar o meu consentimento a qualquer momento, antes ou
durante o mesmo, sem penalidades ou prejuízo ou perda de qualquer benefício que eu possa
ter adquirido, ou no meu atendimento neste Serviço.
______________________________
Belém __/__/20__
Participante
______________________________
Belém __/__/20__
Testemunha
Declaro que obtive de forma apropriada e voluntária o Consentimento Livre e Esclarecido
deste paciente para a participação neste estudo.
___________________________
Pesquisador
Belém __/__/20__
50
ANEXO C: FICHA DE AVALIAÇÃO MÉDICA
FICHA DE AVALIAÇÃO CLÍNICA
Origem:
Número ____ RG-NMT __________ RG-HUJBB __________
[1] NMT
Iniciais_____________
[2] URE-Reduto
Sexo [1] Masc [2] Fem
Idade_____ anos
Etnia [1] Branco [2] Pardo [3] Amarelo [4] Índio [5] Negro
HTLV
[0]Negativo [1]HTLV 1 [2]HTLV 2
Método [1]ELISA [2]Western Blot [3]PCR
Modo de infecção: [1]Vertical [2]Transfusão sangüínea [3]Agulha contaminada [4]Contato sexual [5]
Desconhecido
Tempo provável de infecção _____ [ ] anos / [ ] meses / [ ] Desconhecido
Comorbidades:___________________________________Medicações:__________________
Investigação reumatológica
⊗ Artralgia [1] Tempo _____ [
] anos / [ ] meses / [ ]
dias
Artrite [2] Tempo ______ [ ] anos / [ ] meses / [ ]
dias Pedir RX
[1] Monoarticular [2] Oligoarticular (2-4) [3]
Poliarticular (≥5)
Rigidez Matinal [0] Não [1] < 1h [2] ≥ 1h
RX___ [1] ____ [2] ____ [3] ___ [4] ___ [5] _____
RX___ [1] ____ [2] ____ [3] ___ [4] ___ [5] _____
RX___ [1] ____ [2] ____ [3] ___ [4] ___ [5] _____
[1] Redução do espaço articular
[2] Osteófitos
[3] Esclerose subcondral
[4] Osteopenia justa-articular
[5] Erosão
51
Outras manifestações reumatológicas:
[1] Bursite_____________________
[2] Tendinite___________________
[3] Epicondilite_________________
[4] Outras______________________
Síndrome sicca Xerostomia [0] Não [1] Sim Tempo _____ [ ] anos / [ ] meses / [ ] dias
Xeroftalmia [0] Não [1] Sim Tempo _____ [ ] anos / [ ] meses / [ ] dias
Se algum achado positivo:
* Oftalmologia:
- T. Schirmer [0] > 5mm [1] ≤ 5mm
- Rosa Bengala [0] NL [1] ≥ 4 (Sistema de van Bijsterveld)
* Serviço de Patologia Bucal e Medicina Nuclear:
- Bx gl salivar_______________________________________________________________
- Cintilo de gls salivares [0] NL [1] Deficit de função
[1] Nenhuma anormalidade ao exame
Avaliação muscular
[2] Nenhuma anormalidade ao exame, fatigabilidade fácil ou diminuição da tolerância
Mialgia [0] Não [1] Sim
ao exercício
Fraqueza Proximal [0] Não [1] Sim
[3] Grau discreto de atrofia de um ou mais grupos musculares
- Graduação [1] [2] [3] [4] [5] [6]
- Mingazzini
[4] Marcha alterada; incapacidade para correr, mas hábil p/ subir escadas s/ suporte
para as mãos
MMSS [1] ≥ 2’ [2] < 2’ __ segs
[5] Marcha muito alterada; lordose acentuada, incapacidade p/ subir escadas ou se
MMII [1] ≥ 2’ [2] < 2’ __segs
- Biópsia muscular
___________________________________________________________________________
- ENMG ___________________________________________________________________________
52
Outras manifestações
Cutâneas ___________________________________________________________________________
Biópsia _________________________________________________________________
Linfonodomegalias
___________________________________________________________________________
Biópsia ___________________________________________________________________________
Oculares:
[ ]Uveíte
[1]Dor [2]Hiperemia [3]Fotofobia [4]Turvação [5]Redução da acuidade
[1] Unilateral [2] Bilateral
Encaminhar para OFTALMO
[ ] Confirmado [1] Anterior [2] Posterior [3] Intermediária [4] Panuveíte
[ ] Afastado
Diagnóstico__________________________________________
[ ] Outras __________________________________________________________
Neurológicas [ ] PET / MAH
[ ] Outras _______________________________________________________
Outros órgãos e sistemas [ ] LTA
___________________________________________________________________________
53
Laboratório
Hemograma
Hb
Ht
Leuco
Seg
Linfo
PAIs
VHS
PCR
EFP
Alfa1
Plaqt
Alfa2
Beta
Albumina
Gama
Anti-DNA
Anti-Sm
Anti-P
Anti-Ro
Anti-La
Anti-RNP
Anti-Jo-1
Látex
WR
Anti-CCP
Anti-HCV
HbsAg
Anti-HBc
Anti-HIV
[0]
Indetectável
[1] Detectável
cópias
-610Fas
IVS3nt169FasL
IVS2nt-124FasL
Outros
TSH
T4L
ALT
Creat
Outros
CD4
Perfil
Autoanticorpos
Sorologias
Carga Proviral
Polimorfismos
CPK
AST
CD8
Critérios de Exclusão
[SIm]
[Não]
Sorologia positiva para Hepatite B
[SIm]
[Não]
Sorologia positiva para Hepatite C
[SIm]
[Não]
Sorologia positiva para HIV
[SIm]
[Não]
Tireoidopatia
[SIm]
[Não]
Hepatopatia (AST e/ou ALT > 2x o limite superior da normalidade)
[SIm]
[Não]
Nefropatia (Creatinina > 1,5mg/dl)
[SIm]
[Não]
Uso de glicocorticóides sistêmicos, atual ou nos últimos 6 meses
[SIm]
[Não]
Uso de imunossupressores, atual ou nos últimos 6 meses
[SIm]
[Não]
Uso de antiretrovirais, atual ou nos últimos 6 meses
[SIm]
[Não]
Manifestações/doenças reumatológicas com sorologia para HTLV 1 / 2 (+) e PCR
negativa
[SIm]
[Não]
Não assinar o termo de consentimento
54
Critérios para classificação da Artrite Reumatóide – ACR
[1]
Rigidez Matinal ≥ 1h*
[2]
Artrite em 3 ou + áreas articulares observada pelo médico*
[3]
Artrite de mãos*
[4]
Artrite simétrica*
[5]
Nódulos reumatóides
[6]
Fator reumatóide positivo
[7]
Alterações radiológicas
Artrite Reumatóide [0] Não (<4critérios) [1] Sim (≥4 critérios)
Critérios de Classificação Internacional Revisados para Síndrome de Sjögren
Você tem olho seco, diariamente, persistentemente, há mais de 3 meses?
[1] Sintomas oculares
Você tem sensação recorrente de areia nos olhos?
Você necessita usar lágrima artificial mais de 3 vezes ao dia?
Você tem sensação de boca seca, diariamente, há mais de 3 meses?
[2] Sintomas orais
Você tem inchaço das glândulas salivares, recorrente ou persistente,
enquanto adulto?
Você frequentemente ingere líquidos para facilitar a deglutição,
principalmente de alimentos sólidos?
Teste de Schirmer (≤5mm em 5 minutos)
[3] Sinais oculares
Escore de Rosa Bengala ou outro corante (≥4 no Sistema de van Bijsterveld)
[4] Histopatologia
Sialadenite linfocítica focal em glândula salivar menor
Fluxo salivar não-estimulado (≤1,5mL em 15 minutos)
[5] Envolvimento de
glândula salivar
Sialografia de parótida com sialectasias sem evidência de obstrução
Cintilografia de glândula salivar com déficit de função
55
[6] Auto-anticorpos
Anti-Ro e/ou Anti-La
[ ] Síndrome de Sjögren primária
4 dos 6 itens, sendo positivo o item 4
ou 6
3 dos 4 critérios objetivos (3,4,5,6)
[ ] Síndrome de Sjögren secundária
[ ]Critérios de exclusão
Qual doença?
História de radioterapia em cabeça e pescoço, HCV, Linfoma preexistente,
SIDA, sarcoidose, Doença enxerto versus hospedeiro, uso de anticolinérgicos
Critérios diagnósticos para Miopatias Inflamatórias Idiopáticas – Bohan e Peter
[1]
Fraqueza muscular proximal e simétrica
[2]
Evidência de miosite ao exame histopatológico
[3]
Elevação de enzimas musculares
[4]
ENMG com padrão miopático
[5]
Lesões cutâneas típicas da dermatomiosite
[ ] Polimiosite
[ ] Dermatomiosite
[ ] Definitiva
Todos de 1-4
[ ] Provável
3 de 1-4
[ ] Possível
2 de 1-4
[ ] Definitiva
5 + 3 de 1-4
[ ] Provável
5 + 2 de 1-4
[ ] Possível
5 + 1 de 1-4
Critérios para Classificação da Fibromialgia – ACR
[1]
Dor difusa pelo corpo, definida como dor acima, abaixo ou em ambos os lados da cintura, com
pelo menos 3 meses de duração e comprometimento de pelo menos um segmento da coluna
[2]
11 dos 18 Tender points positivos
56
Critérios para osteoartrite de mãos, joelhos e quadris – ACR
[ ] Mãos – Clínico
[1]
Dor ou rigidez nas mãos pela maioria dos dias do mês
[2]
Alargamento rígido de 2 ou + articulações das mãos, dentre 10
(2/3 IFP e IFD; 1 carpoMTC)
[3]
Edema de até 2 MTC
[4]
Alargamento duro de de 2 ou + IFD
[5]
Deformidade de 1 ou + articulações, dentre 10
1,2,3,4 ou 1,2,3,5
[ ] Quadril – Clínico e Radiológico
[1]
Dor no quadril pela maioria dos dias do mês
[2]
VHS ≤ 20mm/h
[3]
RX com osteófitos femorais e/ou acetabulares
[4]
RX com redução do espaço articular
1,2,3 ou 1,2,4 ou 1,3,4
[ ] Joelhos – Clínico
[1]
Dor no joelho pela maioria dos dias do mês
[2]
Crepitação à movimentação
[3]
Rigidez Matinal ≤ 30 minutos
[4]
Idade ≥ 38 anos
[5]
Alargamento ósseo ao exame
1,2,34 ou 1,2,5 ou 1,4,5
[ ] Joelhos – Clínico e Radiológico
[1]
Dor no joelho pela maioria dos dias do mês
1,2 ou 1,3,5,6 ou 1,4,5,6