Ensaio de Migração Celular – por Damiana Aparecida dos Santos1
A migração celular é um processo essencial para o desenvolvimento e que
também pode contribuir para patologias importantes (HORWITZ; WEBB; ZHANG,
2004).
A migração da uma célula ou grupo de células, de uma área para outra,
geralmente em resposta a um sinal químico, é fundamental para algumas funções tais
como: reparação de feridas, diferenciação celular, o desenvolvimento embrionário e
metástase tumoral (HORWITZ; WEBB; ZHANG, 2004).
A migração celular desempenha um papel importante em uma ampla variedade
de fenômenos biológicos. Em embriogênese, as migrações celulares são importantes em
processos morfogênicos que vão desde a gastrulação para o desenvolvimento do sistema
nervoso. As células utilizam o processo de migração no organismo adulto tanto na sua
fisiologia normal, bem como aquanto em situações patológicas. Na resposta
inflamatória, por exemplo, os leucócitos migram para áreas de injúria, onde realizam
funções fagocíticas. A migração de fibroblastos e células endoteliais vasculares é
essencial para a cicatrização de feridas. No processo metastático as células tumorais
migram do tumor primário para o sistema circulatório e em seguida migram para um
novo local (LAUFFENBURGER; HORWITZ, 1996).
O interesse na compreensão da migração celular é de grande importância para o
LABEN, que poderá contribuir para a descoberta de novas substâncias naturais que
sejam benéficas para a não migração de células tumorais e também com grandes
avanços na área da pesquisa e para a produção de conhecimentos.
Protocolo
Adicionar meio de cultura pré-aquecido nos poços de uma placa de 24 poços (a
quantidade de poços de uma placa de cultura deve estar de acordo com o utilizado para
o trabalho). Assepticamente, abrir o pacote com os insertos, removê-los com pinças
esterilizadas, e gentilmente colocá-los dentro dos poços. Evitar retenção de ar sob a
inserção pela inclinação do inserto enquanto leva-o para dentro do poço. Para o
equilíbrio de pH é recomendável armazenar o meio de cultura celular na incubadora
1
Damiana Aparecida dos Santos é aluna do curso de Gerontologia da UFSCar e
desenvolve Iniciação Científica no LABEN, com bolsa FAPESP.
durante 20 minutos. Adicionar meio de cultura e células de acordo com o volume
recomendado para a placa de 24 poços. Dentro dos insertos de 0,2 a 0,35 mL e fora dos
insertos de 0,7 a 0,9 mL.
Cultive as células em suas condições de rotina. Para remover as células aderidas
a garrafa, siga o seu padrão de tripsinização ou procedimento de raspagem.
Reagentes
1. DMEM sem soro
2. DMEM com soro
3. PBS
4. Tripsina
5. Metanol
6. Azul de Toluidina (diluída em 1g de bórax e 100 mL de água destilada)
7. Água destilada
8. Óleo de imersão
Procedimento
1. Hidratar os insertos com MSS (800µl fora dos insertos e 200µl dentro);
2. Tripsinizar a garrafa de células e fazer as diluições (em MSS);
3. Realizar a contagem e garantir que cada poço contenha 0,5x105 de células;
4. Descartar o meio dos insertos e acrescentar as diluições;

C-: único que utiliza MSS (750µl fora do inserto e 350µl dentro do inserto);

C+: utiliza 350µl de MSS dentro do inserto e 750µl de MCS fora do inserto;

Testes: dentro do inserto diluições com células e fora do inserto MCS.
5. Revelação 22h: em outra placa de 24 poços colocar 1 mL de metanol em 4 poços
e em outros 4 poços colocar 1 mL de azul de toluidina.
6. Retirar cada inserto com a pinça, descartar o meio e limpá-los vigorosamente
com o cotonete.
7. Deixar cada inserto por 5 minutos no metanol e depois por mais 5 minutos no
azul de toluidina para fixação. Em seguida lavá-los com água destilada para
remover o excesso de corante.
8. Após a secagem dos insertos: retirar a membrana com ajuda de um bisturi.
9. Aderir a membrana em uma lâmina sob o óleo de imersão (10µl), cobri-la com
mais 10µl de óleo e sobrepor a lamínula.
10. Fotos e contagem. Tirar de 4 a 5 fotos com a câmera no microscópio, em
campos aleatórios, e em seguida realizar a contagem do número de células
migratórias.
Bibliografia:
ALBERTS, B., JOHNSON, A., LEWIS, J., RAFF, M., ROBERTS, K., WALTER, P.
Biologia Molecular da Célula. 4.ed. Porto Alegre: Artmed, 2004. p. 235-331.
HORWITZ, A.F., WEBB, D.J., ZHANG, H. Cell Migration: an overview. Methods in
Molecular Biology, v. 294, p. 3-11, 2004.
LAUFFENBURGER, D.A.; HORWITZ, A.F. Cell Migration: A Physically Integrated
Molecular Process. Cell Press, vol. 84, p. 359–69, 1996.