Universidade do Vale do Paraíba
Laboratório de Espectroscopia Vibracional Biomédica
ANÁLISE DOS CONSTITUINTES DA PELE
HUMANA SOB EFEITOS DE FORMULAÇÕES
COSMÉTICAS POR ESPECTROSCOPIA RAMAN
Maira Gaspar Tosato
Rani de S. Alves, Leandro Raniero, Priscila F. C. Menezes*,
Carlos Eduardo de O. Praes*, Odivania Kruger*, Airton Abrahão
Martin.
Sumário
1. Introdução
2. Objetivos
3. Revisão Bibliográfica
4. Materiais e Métodos
5. Resultados e Discussões
6. Conclusões
7. Projetos Futuros
Introdução
9 Pele: importante função de proteção, sensorial e estética
9 De 1980 a 2000, o grupo de idosos aumentou 107% contra 14% de 0 a 14
anos.
9 Envelhecimento cutâneo – fatores extrínsecos e intrínsecos
Introdução
9 Uso de cosméticos – retardar envelhecimento extrínseco e prevenir intrínseco
9 Crescimento setor mundial de cosméticos - 5,4% a.a entre 2004 e 2008
9 Indústria brasileira – crescimento de 10,6% nos últimos 13 anos – 3% PIB,
2,9% indústria geral - 2º mercado consumidor de cosméticos
Introdução
9 Teorias do envelhecimento – ROS, encurtamento de telômeros, envelhecimento
mitocondrial e fotodanos.
•
Métodos invasivos
ex vivo – biópsia- alterações do tecido
9 Técnicas biofísicas
in vivo – escamometria- dificuldades de análises
•
Métodos não invasivos - Corneometer®, Tewameter®, Phmeter – perfil geral da pele ; OCT, fluorescência –
especificidade molecular limitada
9 Espectroscopia Raman – informações bioquímicas do tecido
Objetivos
1. Identificar os componentes bioquímicos da pele de mulheres entre 60 e 65 anos
através da análise dos modos vibracionais dos espectros Raman adquiridos in
vivo.
2. Identificar as regiões espectrais onde ocorreram as principais alterações
comparando com os diferentes tratamentos dos grupos de voluntárias.
3. Analisar as alterações das estruturas protéicas, lipídicas e quantidade de água
presentes na pele envelhecida na ausência e sob efeitos de formulações
cosméticas utilizando dois tipos de técnicas de espectroscopia Raman in vivo
sendo elas: dispersiva e com transformada de Fourier
Materiais e Métodos
¾
Comitê de ética nº H48/CEP/2008
¾
43 voluntárias selecionadas (60 to 75 anos)
¾
3 grupos: controle (CTR), placebo (RT2) e ativo (AF2)
¾
Estabilização 20ºC, 50% umidade durante 10 min.
¾
Região orbicular limpa com algodão embebido em 1,5 ml de álcool
etílico 70%
¾
Classificação da pele por fototipo: Fitzpatrick
Grupo
Tipo I
Tipo II
Tipo III
Tipo IV
Tipo V
CTR
0
2
RT2
1
AF2
3
Tipo VI
1
3
5
1
6
4
2
1
0
6
6
2
0
0
Materiais e Métodos
¾
•
FT-Raman
Espectrômetro RFS 100 (Bruker Optics, USA)- laser Nd:YAG
com λ = 1064 nm
•
Parâmetros: 2 pontos, 190 mW, 18 minutos, 4 cm-1
Materiais e Métodos
¾
•
Raman Dispersivo
Espectrometro SpectraPro- 2500i (Pi-Acton) e detector CCD
(Spec10, Princeton); laser λ = 785 nm, fibra óptica EMVISION
LLC
•
Parâmetros: 3 pontos, 78 mW, 70 segundos
Pré processamento
9Análise de Componentes Principais (PCA)
Classificação de tecidos com distintas características bioquímicas
Padrões nos dados → semelhanças e diferenças
9Análise Discriminante Linear
Contribuição das variáveis na separação dos grupos
Localização de indivíduos dentro dos grupos conhecidos
9Cálculo de 1º derivada
Pequenas variações → aumento da sensibilidade de análise
Resultados e Discussões
7
Número da
Intensidade (u.a.)
9
banda
1
Posição do pico
(cm
Estrutura
Atribuição
νC-C
α hélice-
-1)
937
colágeno
3
(prolina e
6
5
1
2
hidroxiprolina)
2
8
4
1080
1260
1440
1620
-1
Deslocamento Raman (cm )
“Impressão Digital”
νCC (Anel
Fenilalanina
aromático)s
10
900
1005
3
1063
1800
C-C=O
Lipídeos (ácidos
trans(acyl)
graxos)
4
1174
νC-C
Tirosina
5
1262
νC=O, νC-N
α hélice-Amida
III
6
1302
νC=O, angular
Amida III
CNH
7
1445
δ(CH3)a
Lipídeos e
proteínas
8
1344/ 1544
NH, νC-C
Triptofano, DNA,
melanina
9
1654
νC=O
α hélice - Amida
I
10
1747
νC=O
Triglicérides/
sebo (éster)
FT-Raman
91080 cm-1 lipídeos (trans) e 1121 cm-1 lipídeos (gauche)
9AF2- ↓ Lipídeos gauche ↑ Lipídeos trans- Produto homeostase lipídica
RT2- 1121 cm-1 ↑ lipídeos gauche
CTR- Deslocamento para lipídeos gauche
1 12 1 c m
Inte nsity (a.u.)
0.00
0,00
-0.01
(a)
1080
1100
112 0
(b)
1080
1140
1110
1140
-1
-1
Ram an S hif t (cm )
Raman shift (cm )
Intensity (a.u.)
Intensity (a.u.)
-1
RT2_T0
RT2_T30
RT2_T60
AF2_ T0
AF2_ T30
AF2_ T60
0 .0 1
CTRT0
CTRT30
CTRT60
0 .0 0
-0 .0 1
(c)
10 80
11 10
114 0
-1
Ra man shift (cm )
Figura 1: Deslocamento espectral da derivada
primeira de 1075 a 1155 cm-1 (1080 cm-1 conformação
trans de lipídeos e 1121 cm-1 - conformação gauche
de lipídeos). (a) grupo AF2, (b) grupo RT2 e (c) grupo
CTR
FT-Raman
91295 cm-1 a ácidos graxos (COOH) e 1303 cm-1 a amida III
9AF2- Desaparecimento de dublete em T609RT2- Deslocamento de 1296 cm-1 (ácidos graxos).
9CTR- Deslocamento em 1295 cm-1 , ↑T30 e T60
AF2 _T0
AF2 _T30
AF2 _T60
R T2_ T0
R T2_ T30
R T2_ T60
0 .01
Intensity (u.a.)
*
0,00
-0,02
12 80
0 .00
-0 .01
1 300
1 320
12 80
13 00
-1
Raman Shift (cm )
•o uso do
produto
desacelerou o
processo de
oxidação
lipídica.
CT R_ T0
CT R_ T3 0
CT R_ T6 0
0.0 1
Figura 2: Deslocamento espectral da derivada
primeira de 1280 a 1325 cm-1 (1295 cm-1
correspondem aos ácidos graxos δ (CH2) e 1303 cm-1
a amida III). (a) grupo AF2, (b) grupo RT2 e (c) grupo
CTR
0.0 0
-0.0 1
12 8 0
13 2 0
-1
Raman Shift (cm )
Intensity (a.u.)
Intensity (a.u.)
0,02
1 3 00
Raman Shift (cm -1 )
1 3 20
FT-Raman
•Radicais livres – oxidação de
DNA, lipídeos e proteínas.
1,0
AF260
CTR60
RT260
Intensidade (u.a.)
0,8
•Peroxidação de ácidos graxos –
radical lipidico livre – CTR e RT2
0,6
0,4
Ativos antivelhecimento- AF2
0,2
• Melanina- fotoenvelhecimento
0,0
1400
1500
1600
1700
1800
-1
Deslocamento Raman (cm )
•Grupos CTR e RT2fragmentação
e
oxidação do DNA
“ombro”
GRUPO /
T0
T30
T60
AF2
3,36
4,20
3,92
RT2
3,41
5,26
5,37
CTR
4,81
4,44
6,83
PERÍODO
FT-Raman
Resultados da Análise Discriminante Linear (%)
Grupo
T0
T30
T60
AF2
52,9
47,1
11,8
RT2
50,0
21,4
64,3
CTR
81,8
81,8
90,9
•Área relativa entre os picos
1445 cm-1 (lipídeos) e 1654 cm-1
(amida I)
•Umidade relativa 24,3%
Grupos RT2 e AF2
sutis variações
espectrais
FT-Raman- alta frequência
Pele
Água
Intensidade (u.a.)
Intensidade (u.a.)
2
4
1
2900
3000
3100
3200
3300
-1
Raman Shift (cm )
5
3
2900
3000
3100
3200
3300
-1
Deslocamento Raman (cm )
3400
3400
3500
FT-Raman- alta frequência
AF2_0
AF2_30
AF2_60
AF2(60)-AF2(0)
Intensidade (u.a.)
Intensidade (u.a.)
AF2(30)-AF2(0)
2900
3000
3100
3200
3300
-1
Deslocamento Raman (cm )
3400
AF2(0)
AF2(30) - AF2(0)
AF2(60) - AF2(0)
3500
2900
3000
3100
3200
3300
3400
-1
Deslocamento Raman (cm )
•Diferença entre T30 e T60- influência da umidade relativa do ar- perda de
água
•Cálculo da área:
• 3100 a 3490 cm-1
3500
FT-Raman
RT2(60)-RT2(0)
RT2_0
RT2_30
RT2_60
Intensidade (a.u.)
Intensidade (u.a.)
RT2(30)-RT2(0)
2900
3000
3100
3200
3300
3400
3500
RT2(0)
RT2(30)-RT2(0)
RT2(60)-RT2(0)
2900
3000
3100
3200
3300
3400
-1
Deslocamento Raman (cm )
-1
Deslocamento Raman (cm )
3500
FT-Raman
CTR_0
CTR_30
CTR_60
CTR(60)-CTR(0)
Intensidade (u.a.)
Intensidade (u.a.)
CTR(30)-CTR(0)
2900
3000
3100
3200
3300
3400
3500
CTR_0
CTR(30)-CTR(0)
CTR(60)-CTR(0)
2900
3000
3100
3200
3300
-1
Deslocamento Raman (cm )
-1
Deslocamento Raman (cm )
3400
3500
FT-Raman
• Intensidade relativa 3220 cm-1 e 2936 cm-1
Hidratação (u.a.)
25
CTR
AF2
RT2
20
0,02
15
10
0,00
5
0
10
20
30
40
50
Umidade relativa do ar** (%)
30
0,04
60
Tempo (dias)
**Estação meteorológica da UNIVAP (Urbanova)
Raman Dispersivo
Cálculo da 1º derivada
T0
T30
T60
•Amida III de prolina na molécula de
protocolágeno
Intensidade (u.a.)
0,02
0,00
•Alteração do colágeno- ação das MMP
-0,02
1280
1300
1320
-1
Deslocamento Raman (cm )
T0
T30
T60
1
Amida I - cadeia de colágeno tripla hélice –
grande número de ligações de hidrogênio
= alteração da geometria molecular e
formação de ponte de hidrogênio.
Intensidade (u.a.)
0,02
2
0,00
-0,02
1625
1650
1675
1700
-1
Deslocamento Raman (cm )
1725
Conclusões
•A espectroscopia Raman foi sensível para identificar as alterações bioquímicas
ocorridas na pele com e sem o uso de cosméticos.
•As mudanças ocorridas na região de DNA e melanina mostraram a ação dos
radicais livres e possíveis alterações no fotopigmentação da pele mostrando o
benefício de produtos com ativos antienvelhecimento.
•Pode-se comprovar as influências climáticas sobre a barreira de proteção da pele
gerando perda de água e possíveis alterações funcionais da pele.
Agradecimentos
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