JULIANA CRISTINA DOS SANTOS ALMEIDA
TRIAGEM FITOQUÍMICA BIOMONITORADA COM AVALIAÇÃO DA
POTENCIAL ATIVIDADE ANTIINFLAMATÓRIA E ANTINOCEPTIVA DO
EXTRATO ACETÔNICO DOS FRUTOS DE Capsicum baccatum L.
UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO
PÓS GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
OURO PRETO
2010
UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO
ESCOLA DE FARMÁCIA
PÓS GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
TRIAGEM FITOQUÍMICA BIOMONITORADA COM AVALIAÇÃO DA
POTENCIAL ATIVIDADE ANTIINFLAMATÓRIA E ANTINOCEPTIVA DO
EXTRATO ACETÔNICO DOS FRUTOS DE Capsicum baccatum L.
Autora: Juliana Cristina dos Santos Almeida
Orientador: Prof. Dr. Tanus Jorge Nagem
Co-orientadora: Profª. Dra. Tânia Toledo de Oliveira
Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação
em
Ciências
Farmacêuticas
–
CIPHARMA, como requisito parcial para a obtenção
do título de Mestre em Ciências Farmacêuticas. Área
de concentração: Fármacos e Medicamentos. Linha
de pesquisa: Plantas Medicinais
OURO PRETO
2010
A447t
Almeida, Juliana Cristina dos Santos.
Triagem fitoquímica biomonitorada com avaliação da potencial atividade
antiinflamatória e antinoceptiva do extrato acetônico dos frutos de Capsicum
baccatum L. [manuscrito] / Juliana Cristina dos Santos Almeida. – 2010.
xviii, 104 f.: il. color.; grafs.; tabs.
Orientador: Prof. Dr. Tanus Jorge Nagem.
Co-orientadora: Profa. Dra. Tânia Toledo de Oliveira.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Ouro Preto. Escola de
Farmácia. Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas.
Área de concentração: Fármacos e Medicamentos
1. Plantas medicinais - Teses. 2. Pimenta dedo-de-moça - Teses. 3. Atividade
antiinflamatória – Teses. I. Universidade Federal de Ouro Preto. II. Título.
CDU: 615.276:633.84
Catalogação: [email protected]
Juliana Cristina dos Santos Almeida
Triagem fitoquímica biomonitorada com avaliação da potencial atividade antiinflamatória e
antinoceptiva do extrato acetônico dos frutos de Capsicum baccatum L.
Dissertação aprovada no dia 19 de Novembro de 2010
Banca Examinadora:
Profa. Dra. Marisa Alves Nogueira Diaz
Departamento de Bioquímica – UFV
Profa.Dra. Carla Penido
Departamento de Farmácia – UFOP
Profa. Dra. Tânia Toledo de Oliveira
Departamento de Bioquímica - UFV
DEDICATÓRIA
Dedico esse trabalho aos meus pais e à minha tia Maria Eunice
por proporcionarem mais uma etapa de aprendizado e
realizações em minha vida. Serei eternamente grata!
iv
AGRADECIMENTOS
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus por ter me dado essa oportunidade de crescimento e
forças para conseguir vencer mais uma etapa da minha vida.
Aos meus pais pelo carinho, incentivo, pela compreensão e oportunidade de poder
realizar mais um sonho. Amo vocês!
À minha tia Maria Eunice, exemplo de força e luta, pelo incentivo eterno em tudo que
me proponho a fazer.
Aos meus amigos, em especial Érika Freitas, Marcelle Souza, Renata Batista, Sara
Elizabeth e Wallace Benjamin por compreenderem tantos momentos de ausência.
À Universidade Federal de Ouro Preto, por me receber nesta ilustre casa.
Ao Programa de Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas (CIPHARMA) pela
oportunidade e aprendizado.
Ao meu orientador Prof. Dr. Tanus Jorge Nagem pelo exemplo de luta, perseverança e
força. O senhor é realmente uma pessoa especial!
À minha co-orientadora Profª. Dra. Tânia Toledo de Oliveira pelos ensinamentos, pelo
incentivo, pela paciência e dedicação.
Aos amigos do Laboratório de Produtos Naturais (LAPPRONA) pela amizade, pelo
incentivo e apoio durante o desenvolvimento desse projeto, em especial à Ana Lia Mazzeti,
Jordana Mol, Katiúscia F. Rodrigues e Tamires de Souza Rodrigues.
Aos professores, que muito mais que professores, foram verdadeiros mestres e amigos,
Cláudia Martins, Sidney Augusto (Bibo), Gustavo Henrique Barbosa, Orlando David
Henrique, Carlos Eduardo e Rosângela Barbosa. Meus eternos agradecimentos!
Aos funcionários Adão, Délio Fernandes Lopes, José Maria Marcelino, Marcelo
Augusto Alves Costa pelo carinho e pela colaboração.
v
À amiga de tantos anos e de todas as horas Rosana Gonçalves Rodrigues-das-Dôres
pela amizade, pelo incentivo, pelos aprendizados, pelas risadas e oportunidades. Não tenho
palavras para te agradecer!
Ao Botânico prof. Doutor João Renato Sthemann da Universidade Federal de Minas
Gerais pela identificação da espécie.
À professora Ms. Fernanda Duval pelo auxílio na confecção da exsicata.
Ao professor Dr. Ricardo Tavares pelas análises estatísticas.
Aos alunos e funcionários do Laboratório Biofármacos da Universidade Federal de Viçosa
(UFV), em especial à Idelvânia dos Anjos, Luiz Eduardo, Carlos Eduardo, Marcos e Sílvia
Ribeiro. Seria muito mais difícil sem vocês!
À Lorena e suas amigas de república por tornar os meus dias em Viçosa mais agradáveis e
confortáveis.
Aos funcionários do Laboratório de Análises Clínicas do Departamento de Medicina
Veterinária da Universidade Federal de Viçosa (UFV), em especial ao farmacêutico Aécio.
À Eunice, Liliam e Ilza pelo apoio e pelas análises no HPLC.
Aos meus companheiros de turma no mestrado, em especial à Paola, Priscila, Patrícia
e Renata pelas risadas e pelos momentos de descontração.
À Alessandra Vidal e Nívea Cristina pela companhia durante o percurso pela estrada
Real. Essa amizade é eterna!
À Karina Zanotti e sua família pelos reconfortantes cafés de final de tarde após
atravessar o deslumbramento da Estrada Real embaladas ao som de Djavan.
Ao professor Gabriel e Sílvio da Universidade Viçosa (UNIVIÇOSA) pela confecção
das lâminas histológicas.
Ao Allysson Benjamin pelo incentivo e apoio durante esse período.
vi
Aos meus alunos do curso de Farmácia da Universidade Presidente Antônio Carlos –
UNIPAC – Barbacena por permitirem aprendizado e aprimoramento no dia-a-dia dentro e
fora das salas de aula. Serei eternamente grata!
A todos aqueles que direta ou indiretamente contribuíram para a execução desse
trabalho!
vii
“É melhor tentar e falhar, que preocupar-se e ver
a vida passar. É melhor tentar, ainda em vão, que
sentar-se fazendo nada até o final. Eu prefiro na
chuva caminhar que em dias tristes em casa
esconder. Prefiro ser feliz, embora louco, que em
conformidade viver...”
Martin Luther King
viii
RESUMO
RESUMO
ALMEIDA, J.C.S. Avaliação do potencial antiinflamatório de Capsicum baccatum.
Dissertação de Mestrado – Escola de Farmácia – Universidade Federal de Ouro Preto. Ouro
Preto, 2010.
Palavras-chave: Capsicum, pimenta dedo-de-moça, atividade antinoceptiva e antiinflamatória
As pimentas do gênero Capsicum apresentam várias atividades biológicas, tais como:
atividade antioxidante, antiinflamatória, analgésica, dentre outras. Com o objetivo de estudar
o potencial antiinflamatório e analgésico da espécie Capsicum baccatum L. foi preparado o
extrato acetônico dos frutos verdes da espécie e realizados os seguintes testes: edema de pata
induzido por carragenina, contorções abdominais induzidas por ácido acético e análise
histológica do músculo plantar dos ratos Wistar após 4h da indução do edema de pata. No
teste de edema de pata determinou-se a resposta antiedematogênica do extrato acetônico de
Capsicum baccatum L. nas concentrações de 100, 300, 600 e 1000mg/Kg de peso,
comparados à nimesulida (300mg/Kg de peso), adotando-se os tratamentos 1 hora antes da
indução do edema. No teste de contorções abdominais induzido por ácido acético (0,6%),
determinou-se o número de contorções entre 10 e 30 minutos após a administração do ácido,
utilizando as doses de 100, 300, 600 e 1000mg/Kg de peso, comparados à nimesulida
(300mg/Kg de peso), adotando-se os tratamentos 1h antes da administração do ácido. No
edema de pata induzido por carragenina, a melhor a dose foi a de 1000mg/Kg de peso,
promovendo um aumento de edema de apenas 9,6%. Em se tratando de contorções
abdominais, todas as doses mostraram-se efetivas, reduzindo o número de contorções em 65,
68, 68 e 65%, aproximadamente, nas doses de 100, 300, 600 e 1000mg/Kg de peso,
respectivamente; sendo os resultados dos extratos estatisticamente iguais entre si e ao
controle. A análise histológica do músculo plantar dos ratos confirmou a diminuição do
ix
edema no tratamento com 1000mg/Kg de peso. Baseado nos resultados obtidos pode-se
concluir que o extrato acetônico dos frutos verdes de Capsicum baccatum L. apresenta
atividade antinoceptiva nas doses de 100, 300, 600 e 1000mg/Kg de peso e atividade
antiinflamatória na dose de 1000mg/Kg de peso, nos modelos apresentados.
x
ABSTRACT
ABSTRACT
ALMEIDA, J.C.S. Avaliação do potencial antiinflamatório de Capsicum baccatum.
Dissertação de Mestrado – Escola de Farmácia – Universidade Federal de Ouro Preto. Ouro
Preto, 2010.
Keywords: Capsicum, chili finger-shaped girl, antinociceptive and antiinflammatory activity
The Capsicum peppers contain several biological activities such as antioxidant, antiinflammatory, analgesic, among others. Aiming to study the potential anti-inflammatory and
analgesic species Capsicum baccatum L. was prepared acetone extract of unripe fruits of the
species and performed the following tests: paw edema induced by carrageenan, writhing
induced by acetic acid and histologic analysis of the plantar muscle of rats after 4 h induction
of paw edema. In the test of paw edema was determined to answer antiedematogenic the
acetone extract of Capsicum baccatum L. concentrations of 100, 300, 600 and 1000mg/kg
body weight, compared to nimesulide (300 mg / kg body weight), adopting the treatments 1
hour before induction of edema. In the writhing test induced by acetic acid (0.6%), we
determined the number of contortions between 10 and 30 minutes after administration of acid,
using doses of 100, 300, 600 and 1000mg/kg body weight, compared to nimesulide (300 mg /
kg body weight), adopting the treatments 1 hour before the acid administration. In the paw
edema induced by carrageenin, the best dose of 1000mg/Kg was the weight, causing an
increase of swelling of only 9,6%. In the case of contortions, all doses have been proven
effective by reducing the number of contortions in 65, 68, 68 and 65%, approximately, at
doses of 100, 300, 600 and 1000mg/kg body weight, respectively, being the results of the
extracts statistically similar to each other and control. Histological analysis of the plantar
muscle of mice confirmed the reduction of edema in the treatment with 1000mg/kg of body
xi
weight. Based on these results we can conclude that the acetone extract of unripe fruits of
Capsicum baccatum L. shows antinociceptive activity at doses of 100, 300, 600 and
1000mg/kg body weight and anti-inflammatory activity in a dose of 1000mg/kg of body
weight
in
the
models
presented.
xii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1
Concentração média de massa fresca, massa seca, cinzas totais e perda de
água de frutos maduros de Capsicum baccatum L........................................ 50
Tabela 2
Rendimento dos extratos acetônicos dos frutos de Capsicum baccatum L.
em três diferentes estádios de maturação......................................................
Tabela 3
Valores de Rf de capsaicina em extratos em acetona de Capsicum
baccatum
em
três
diferentes
estádios
de
maturação......................................................................................................
Tabela 4
55
Valores de Rf de linalol em extratos acetônicos de Capsicum baccatum L.
em três diferentes estádios de maturação......................................................
Tabela 6
53
Valores de Rf de timol em extratos acetônicos de Capsicum baccatum L.
em três diferentes estádios de maturação......................................................
Tabela 5
52
55
Valores de Rf de saponina em extratos em acetona de Capsicum baccatum
L. em três diferentes estádios de maturação.................................................. 55
Tabela 7
Valores de Rf de quercetina em extratos em acetona de Capsicum
baccatum L. em três diferentes estádios de maturação.................................
Tabela 8
Concentração média de capsaicina em extratos acetônicos de Capsicum
baccatum L. em três diferentes estádios de maturação.................................
Tabela 9
56
59
Concentração média de compostos fenólicos em extratos acetônicos de
Capsicum baccatum L. em três diferentes estádios de maturação................
62
Tabela 10 Parâmetros físico-químicos do xarope contendo extrato acetônico de
Capsicum baccatum L. no estádio imaturo (verde)......................................
70
Tabela 11 Valores médios e porcentagem de inibição do número de contorções
abdominais (“Writhing) induzido por ácido acético 0,6% em ratos da
linhagem Wistar tratados com formulação contendo extrato acetônico dos
frutos imaturos de Capsicum baccatum L.....................................................
72
Tabela 12 Valores médios do tamanho do edema de pata induzido por carragenina a
1% em ratos da linhagem Wistar tratados com formulação contendo o
extrato acetônico dos frutos de Capsicum baccatum L.................................
77
xiii
Juliana Cristina dos Santos Almeida
LISTA DE FIGURAS
Figura 1
Estrutura química da piperina.................................................................................
03
Figura 2
Estrutura química da capsaicina..............................................................................
04
Figura 3
Frutos maduros da pimenta Capsicum frutescens L...............................................
06
Figura 4
Frutos maduros da pimenta Capsicum annuum L...................................................
06
Figura 5
Frutos maduros da pimenta Capsicum chinense Jacq.............................................
07
Figura 6
Frutos maduros da pimenta Capsicum pubescens...................................................
07
Figura 7
Flor de Capsicum baccatum...................................................................................
07
Figura 8
Frutos maduros da pimenta Capsicum baccatum L................................................
09
Figura 9
Etapas do processo inflamatório.............................................................................
14
Figura 10
Metabólitos do ácido araquidônico........................................................................
16
Figura 11
Frutos de Capsicum baccatum em diferentes estádios de maturação.....................
24
Figura 12
Rato Wistar macho adulto acondicionado em gaiola.............................................
34
Figura 13
Experimento de contorções abdominais.................................................................
35
Figura 14
Experimento de edema de pata induzido por carragenina.....................................
37
Figura 15
Espécie vegetal Capsicum baccatum L..................................................................
39
Figura 16
Exsicata de Capsicum baccatum L........................................................................
40
Figura 17
Frutos de Capsicum baccatum L...........................................................................
41
Figura 18
Corte longitudinal do fruto de Capsicum baccatum L...........................................
41
Figura 19
Corte transversal do fruto de Capsicum baccatum L. destacando camadas..........
42
Figura 20
Corte transversal do fruto de Capsicum baccatum L. evidenciando a cutina........
42
Figura 21
Corte transversal do fruto de Capsicum baccatum L. evidenciando cristais.........
43
Figura 22
Corte paramétrico da epiderme do fruto de Capsicum baccatum L......................
43
Figura 23
Corte transversal em frutos de Capsicum baccatum L. evidenciando reação
45
positiva com cloreto férrico....................................................................................
Figura 24
Corte transversal em frutos de Capsicum baccatum L. evidenciando reação
positiva com cloreto de alumínio............................................................................
Figura 25
Corte transversal em frutos de Capsicum baccatum L. evidenciando reação
positiva com ácido sulfúrico...................................................................................
Figura 26
46
47
Corte transversal em frutos de Capsicum baccatum L. evidenciando reação
positiva com vanilina sulfúrica...............................................................................
xiv
Juliana Cristina dos Santos Almeida
47
Figura 27
Corte transversal em frutos de Capsicum baccatum L. evidenciando reação
positiva com reagente de Dragendorf.....................................................................
Figura 28
Corte transversal em frutos de Capsicum baccatum L. evidenciando reação
positiva
com
ácido
tânico
5%
e
cloreto
férrico
3%...........................................................................................................................
Figura 29
48
49
Placa cromatográfica do extrato acetônico dos frutos maduros de Capsicum
baccatum L.............................................................................................................
53
Figura 30
Espectro de absorção na luz ultravioleta da capsaicina .........................................
58
Figura 31
Cromatograma do padrão de capsaicina.................................................................
58
Figura 32
Espectro de absorção na luz ultravioleta da capsaicina em diferentes
concentrações.........................................................................................................
59
Figura 33
Curva de calibração de compostos fenólicos.........................................................
62
Figura 34
Atividade antioxidante de extratos acetônicos de frutos de Capsicum baccatum
65
L. em três diferentes estádios de maturação...........................................................
Figura 35
Efeito analgésico do xarope contendo extrato dos frutos imaturos de Capsicum
75
baccatum L..............................................................................................................
Figura 36
Aumento da espessura da pata de ratos Wistar induzido por carragenina..............
78
Figura 37
Fotomicrografia das lâminas histológicas do grupo controle salina.......................
84
Figura 38
Fotomicrografia das lâminas histológicas do grupo controle carragenina a 1%....
85
Figura 39
Fotomicrografia das lâminas histológicas do grupo tratado com 1000mg/Kg de
86
extrato acetônico de Capsicum baccatum L...........................................................
Figura 40
Fotomicrografia das lâminas histológicas do grupo tratado com nimesulida
300mg/Kg................................................................................................................
xv
Juliana Cristina dos Santos Almeida
87
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
Ac
Absorbância do controle
At
Absorbância do teste
a.C.
Antes de Cristo
ADA
Adenosina deaminase
ADA1
Adenosina deaminase 1
ADA2
Adenosina deaminase 2
AINES
Antiinflamatórios não-esteroidais
ANOVA
Análise de variância
ASRL
Atividade sequestrante de radicais livres
ATCC
American Type Culture Collection
BHA
Butilhidroxianisol
CCD
Cromatografia em camada delgada
CEEA
Comissão de Ética na Experimentação Animal
CIS
Comissões Interinstitucionais de Saúde
CLAE
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
CLSI
Clinical and Laboratory Standards Institute
CL50
Concentração Letal Média
COBEA
COX
Colégio Brasileiro de Experimentação Animal
Ciclooxigenase
COX-1
Ciclooxigenase-1
COX-2
Ciclooxigenase-2
DL50
Dose letal Média
DMSO
Dimetilsulfóxido
DPPH
2,2-difenilpicrilidrazila
E%
Aumento do tamanho do edema
ERO
Espécies reativas de oxigênio
HE
HOCl
Hematoxilina-eosina
Ácido hipocloroso
IL-β
Interleucina β
IL-1
Interleucina 1
IL-6
Interleucina 6
xvi
Juliana Cristina dos Santos Almeida
IL-8
LAPPRONA
Interleucina 8
Laboratório de Produtos Naturais
LTB
Leucotrieno B
MPO
Mieloperoxidase
NO
Óxido nítrico
PDF
Produtos decorrentes da degradação de fibrina
PGD2
Prostaglandina D2
PGE2
Prostaglandina E2
PGF2α
Prostaglandina F2α
pH
Potencial hidrogeniônico
PGI2
Prostaglandina I2
PGs
Prostaglandinas
p/v
Peso por volume
Rf
Fator de retenção
Rfs
Fatores de retenção
SUS
Sistema Único de Saúde
TNF
Fator de necrose tumoral
TNF-α
Fator de necrose tumoral α
T0
Tamanho inicial da pata
Tt
Tamanho da pata após injeção de salina ou carragenina
UFOP
Universidade Federal de Ouro Preto
UFJF
Universidade Federal de Juiz de Fora
UFV
Universidade Federal de Viçosa
UV
Ultravioleta
xvii
Juliana Cristina dos Santos Almeida
SUMÁRIO
1. Introdução.........................................................................................................................
01
2. Revisão da Literatura.......................................................................................................
05
2.1. Família Solanaceae......................................................................................................
05
2.2. Gênero Capsicum........................................................................................................
06
2.3. Espécie estudada: Capsicum baccatum.......................................................................
08
2.4. Processo patológico estudado: inflamação..................................................................
10
2.5. Inflamação experimental.............................................................................................
17
2.6. Agentes antiinflamatórios...........................................................................................
18
3. Objetivos...........................................................................................................................
21
3.1. Objetivo geral.............................................................................................................
21
3.2. Objetivos específicos..................................................................................................
21
4. Materiais e métodos.........................................................................................................
23
4.1. Coleta do material vegetal...........................................................................................
23
4.2. Caracterização morfo-anatômica dos frutos................................................................
24
4.3. Caracterização histoquímica dos frutos.......................................................................
24
4.4. Determinação da massa seca, massa fresca, porcentagem de água e teor de cinzas
totais dos frutos de Capsicum baccatum L.............................................................................
25
4.5. Preparo dos extratos....................................................................................................
26
4.6. Estudo fitoquímico dos extratos..................................................................................
26
4.7. Quantificação dos constituintes fenólicos...................................................................
27
4.8. Atividade antioxidante................................................................................................
28
4.9. Quantificação da capsaicina nos extratos....................................................................
29
4.10. Teste antifúngico.......................................................................................................
29
4.11. Determinação da bioletalidade frente a Artemia salina............................................
31
4.12. Desenvolvimento da formulação farmacêutica.........................................................
31
xviii
Juliana Cristina dos Santos Almeida
4.13. Testes de atividade da formulação farmacêutica.......................................................
32
4.13.1. Animais usados no teste.............................................................................
32
4.13.2. Aprovação pelo Comitê de Ética dos experimentos com animais.............
33
4.13.3. Teste de contorções abdominais.................................................................
34
4.13.4. Teste de edema de pata induzido por carragenina.....................................
35
4.13.4.1. Histologia do edema de pata.....................................................
36
4.13.5. Protocolo de anestesia...............................................................................
37
4.14. Análises estatísticas................................................................................................
37
5. Resultados e Discussão....................................................................................................
38
5.1. Identificação do material botânico.............................................................................
38
5.2. Caracterização morfo-anatômica dos frutos...............................................................
39
5.3. Caracterização histoquímica dos frutos......................................................................
43
5.3.1. Reação de detecção de compostos fenólicos....................................................
43
5.3.2. Reação de detecção de flavonoides..................................................................
44
5.3.3. Reação de detecção de lactonas sesquiterpênicas............................................
45
5.3.4. Reação de detecção de taninos.........................................................................
46
5.3.5. Reação de detecção de alcalóides.....................................................................
47
5.3.6. Reação de detecção de mucilagens..................................................................
48
5.4. Determinação de massa fresca, massa seca, porcentagem de água e de cinzas
totais dos frutos de Capsicum baccatum L..........................................................................
49
5.5. Preparo dos extratos.................................................................................................
51
5.6. Screening fitoquímico dos extratos...........................................................................
52
5.7. Quantificação da capsaicina nos extratos..................................................................
57
5.8. Quantificação de compostos fenólicos......................................................................
60
5.9. Atividade antioxidante..............................................................................................
63
xix
Juliana Cristina dos Santos Almeida
5.10. Determinação da bioletalidade frente a Artemia salina Leach...............................
65
5.10. Teste antifúngico.....................................................................................................
66
5.11. Desenvolvimento da formulação farmacêutica.......................................................
69
5.12. Testes de atividade farmacológica...........................................................................
71
5.13.1. Teste de contorções abdominais..................................................................
71
5.13.2. Teste de edema de pata induzido por carragenina.......................................
76
5.13.3. Histologia do edema de pata.......................................................................
81
6. Conclusão..........................................................................................................................
87
7. Referências bibliográficas................................................................................................
89
xx
Juliana Cristina dos Santos Almeida
INTRODUÇÃO
1- INTRODUÇÃO
Diante da perspectiva de se obter novos fármacos para o tratamento das diversas
enfermidades que acometem a civilização humana, não pode ser negligenciado o grande
arsenal de produtos naturais disponíveis no país que apresenta uma grande diversidade
química e uma múltipla função biológica (SIMÕES et al., 2004).
A pesquisa farmacológica de produtos naturais, principalmente as plantas, tem
propiciado um avanço importante para a terapêutica de várias patologias, além de promover
ferramentas extremamente úteis para o estudo teórico da fisiologia e da farmacologia
(DOHADWALLA, 1985).
O uso de plantas medicinais é tão antigo quanto a civilização. O homem vem buscando
na natureza o suprimento para as suas necessidades básicas retirando dela alimentos, abrigo,
vestuário, meios de transporte, temperos, perfumes e remédios (NEWMAN et al., 2000).
No Brasil, diretrizes do Ministério da Saúde determinaram prioridades na investigação
das plantas medicinais e a implantação da Fitoterapia como prática oficial da medicina,
orientando as Comissões Interinstitucionais de Saúde (CIS) a buscarem sua inclusão no
Sistema Único de Saúde (SUS). Para que essa inclusão ocorra é essencial que os profissionais
da área de saúde conheçam as atividades farmacológicas e a toxicidade das plantas medicinais
de cada bioma brasileiro, de acordo com os costumes, tradições e condição sócio-econômica
da população (JÚNIOR et al., 2008).
Dentre as diversas patologias tratadas com plantas medicinais podem ser citadas:
doenças inflamatórias, diabetes, hipertensão, ansiedade, depressão, problemas circulatórios,
dentre outras (SIMÕES et al., 2004).
O termo inflamação é derivado do latim, eflamare, que tem como significado “atear
fogo”. A civilização egípcia, há cerca de 3.200 a.C., representou a inflamação com um
símbolo hieroglífico de um braseiro. A civilização grega há cerca de 2000 a.C. usou o termo
1
Juliana Cristina dos Santos Almeida
phlogosis para denominar o termo e a civilização romana utilizou a palavra inflammation,
todos com o mesmo propósito, descrever o processo atualmente conhecido como inflamação
(ROCHA, 2006).
Em se tratando de um processo complexo, e principalmente devido à sua importância
em Patologia, a inflamação tem sido intensamente investigada desde o início da era Cristã,
quando Celsus (30 a.C.- 36 d.C.) definiu os quatro sinais principais ou cardeais da
inflamação: rubor, calor, tumor e dor. A estes sinais, Galeno, médico da Antiguidade,
acrescentou um quinto sinal, a perda da função da parte afetada (BECHARA & SZABÓ,
1989).
Apesar do avanço do conhecimento da anatomia, fisiopatologia e farmacologia da dor e
da inflamação, os resultados do tratamento ainda não são satisfatórios. Isso porque o emprego
de diversas opções terapêuticas não é capaz de inibir o início e a manutenção do processo
inflamatório sem riscos, custo ou efeitos adversos.
Os agentes antiinflamatórios agem no processo de redução da atividade antiinflamatória
por inibirem a síntese e liberação de prostaglandinas, atuando em etapas pré-estabelecidas na
via do ácido araquidônico (FONSECA et al., 2002).
Atualmente existe um grande arsenal de medicamentos antiinflamatórios disponíveis no
mercado, dentre eles podem ser destacados os antiinflamatórios não-esteroidais (AINES),
glicocorticoides e os fitoterápicos.
Os
antiinflamatórios
não-esteroidais
constituem
uma
classe
de
fármacos
antiinflamatórios que atuam na redução do edema, eritema e dano tecidual resultante de
processos inflamatórios (FONSECA et al., 2002).
Os
glicocorticoides
constituem
fármacos
com
efeitos
antiinflamatório
e
imunossupressor, comumente utilizados para processos alérgicos e imunomediados, choques
séptico e cardiogênico, traumatismo do sistema nervoso central e da coluna (FONSECA et al.,
2002).
2
Juliana Cristina dos Santos Almeida
As estatísticas relativas ao mercado de fitoterápicos mostram que o consumo destes
produtos no Brasil e no exterior tem aumentado consideravelmente nos últimos tempos
(PEREIRA & LOPES, 2006). Muitos produtos padronizados em uso corrente já se mostraram
efetivos para o combate de processos inflamatórios, dentre eles podem ser destacados a
Cordia verbenaceae, Echinacea purpurea, Tanacetum vulgare, Arnica montana, Allium
sativum, Hamamelis virginiana, dentre outros (CZEPULA, 2006).
A pimenta é, hoje em dia, um dos condimentos mais consumidos no mundo; estima-se
que um quarto da população mundial consome pimenta diariamente, seja de forma direta ou
através da ingestão de alimentos processados que contenham essa iguaria (SZALASI &
BLUMBERG, 1999).
Muitos compostos presentes nos alimentos exercem sobre o organismo funções
adicionais a seus efeitos meramente nutritivos ou flavorizantes, e a pimenta não é uma
exceção. As pimentas são uma boa fonte dietética de antioxidantes como flavonoides,
compostos fenólicos, carotenoides, ácido ascórbico, vitamina A e os capsaicinoides
(SAVEGNAGO et al., 2006).
As pimentas são plantas utilizadas na alimentação e produzem a sensação picante e de
calor devido aos seus componentes químicos, capazes de estimular as papilas gustativas da
boca. Basicamente há dois gêneros de pimentas mais conhecidos, o Piper e o Capsicum
(BONTEMPO, 2007).
As mais antigas são do gênero Piper, que são sementes de plantas da família das
piperáceas. O princípio ativo mais importante desse gênero é a piperina (Figura 1)
(BONTEMPO, 2007).
Figura 1 – Estrutura química da piperina
3
Juliana Cristina dos Santos Almeida
O gênero Capsicum compreende cerca de 30 espécies conhecidas. As pimentas do
gênero Capsicum são importantes componentes da dieta humana e podem ser consumidas
frescas ou secas. Essas plantas sintetizam e acumulam capsaicinoides, um grupo de
compostos responsavéis pelo ardor das pimentas. A estrutura característica dos capsaicinoides
que determina a propriedade de pungência nas espécies do gênero Capsicum é a presença de
uma cadeia amino ligada a um anel vanilil e uma cadeia acila (BARBERO et al., 2008). A
concentração dessas substâncias depende do genótipo, maturidade do fruto e condições de
cultivo. Os capsaicinoides presentes nessas espécies são: nornorcapsaicina, norcapsaicina,
homocapsaicina, nornordihidrocapsaicina, capsaicina, hordihidrocapsaicina, dihidrocapsaicina
e homodihidrocapsaicina (MORÁN-BAÑUELOS et al., 2008). O princípio ativo mais
importante desse gênero é a capsaicina (Figura 2) (BONTEMPO, 2007).
Figura 2 – Estrutura química da capsaicina
Muitos estudos demonstram várias atividades farmacológicas atribuídas às espécies de
pimentas do gênero Capsicum, tais como: antioxidantes, anti-tumoral e anti-mutagênica,
propriedades antiinflamatórias, analgésico tópico na dor neuropática e estimulante do sistema
cardiovascular, respiratório (BARBERO et. al., 2008), mucolítica, termogênica, tratamento da
dor crônico facial, neuralgia do trigêmeo e dor pós herpética (GRÉGIO et al., 2008). Além
disso, estudos demonstraram atividade anticancerígena dos capsaicinoides ao inibir o
crescimento dependente de andrógenos nas células cancerígenas do cólon, adenocarcinoma
gástrico e de próstata. O potencial das pimentas como fonte de capsaicinoides na indústria
4
Juliana Cristina dos Santos Almeida
farmacêutica tem promovido o estudo fitoquímico dessas espécies (MORÁN-BAÑUELOS et
al., 2008).
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1. FAMÍLIA SOLANACEAE
A família Solanaceae é subcosmopolita, ocorrendo em quase todas as regiões do
planeta. Nesta família são encontradas cerca de 92 gêneros e mais de 2300 espécies, sendo a
maioria de ocorrência nas regiões montanhosas da América do Sul. Na região andina são
encontrados treze gêneros endêmicos (HUNZIKER & BARBOZA, 1990).
As espécies dessa família são caracterizadas por um conjunto de caracteres como folhas
simples, alternadas, podendo apresentar odor desagradável ao serem amassadas. As flores
normalmente são vistosas, bissexuadas, actinomorfa, diclamídeas, cálice pentâmero,
gamossépalo, geralmente plicada, reunidas em inflorescências em regra cimosas, corola com
5 pétalas unidas. Os estames geralmente são em número de 5 (4 ou 2 em alguns poucos
gêneros), ovário súpero, bicarpelar, bilocular, com muitos óvulos, estilete terminal, carpelos
orientados obliquamente EME relação ao eixo da flor, placentação axial, anteras rimosas ou
poricidas, disco nectarífero geralmente presente. O fruto pode apresentar formato baciforme
ou capsular. Várias espécies arbustivas ou arbóreas são pioneiras, habitando a borda ou
clareiras na mata (HUNZIKER & BARBOZA, 1990).
Dentre os gêneros pertencentes à família Solanaceae destaca-se o gênero Capsicum, que
possui grande importância econômica (HUNZIKER & BARBOZA, 1990).
5
Juliana Cristina dos Santos Almeida
2.2. GÊNERO CAPSICUM
O centro de origem das pimentas são as Américas, destacando-se as regiões tropicais
(LUZ, 2007).
A mais recente descrição taxonômica das pimentas, segundo BOSLAND & VOTAVA
(1999) é:
Reino: Plantae
Divisão: Magnoliophyta
Classe: Magnoliopsida
Ordem: Solanales
Família: Solanaceae
Gênero: Capsicum
Ainda não existe um consenso do número de espécies classificadas de acordo com o
nível de domesticação. Mas quando se relata o número de espécies domesticadas existe um
consenso de serem cinco: Capsicum frutescens L. (Figura 3), Capsicum annuum L. (Figura
4), Capsicum chinense Jacq. (Figura 5), Capsicum baccatum L. e Capsicum pubescens Ruiz
& Pav. (Figura 6) (REIFSCHNEIDER, 2000).
Figura 3 – Frutos maduros de Capsicum frutescens L.
Fonte: http://www.cnph.embrapa.br/capsicum/especies.htm
Figura 4 – Frutos maduros de Capsicum annuum L.
Fonte: http://www.cnph.embrapa.br/capsicum/especies.htm
6
Juliana Cristina dos Santos Almeida
Figura 5 – Frutos maduros de Capsicum chinense Jacq.
Figura 6 – Frutos maduros de Capsicum pubescens
Fonte: http://www.cnph.embrapa.br/capsicum/especies.htm Fonte: http://www.cnph.embrapa.br/capsicum/especies.htm
As diversas espécies e variedades de pimentas podem ser diferenciadas por
características morfológicas dos frutos e, principalmente das flores (MOREIRA et. al., 2006).
O gênero Capsicum tem sido segregado pela cor de suas corolas em dois grandes grupos:
branco e púrpura. A espécie Capsicum baccatum apresenta corola branca e anteras amarelas
(Figura 7), enquanto a espécie Capsicum pubescens possui corola púrpura e anteras púrpuras
ou violetas. Além dessas características, as principais espécies domesticadas do gênero podem
ser identificadas pela posição da flor e do pedicelo, presença ou ausência de manchas nos
lobos das pétalas e margem do cálice (CARVALHO et al., 2003). Com relação ao sistema
reprodutivo, as espécies domesticadas de Capsicum apresentam-se autógamas, de forma geral.
Figura 7 – Flor de Capsicum baccatum: corola com coloração branca
e anteras amarelas
Fonte: Arquivo pessoal do pesquisador
7
Juliana Cristina dos Santos Almeida
Uma característica exclusiva do gênero Capsicum, é a pungência atribuída à presença de
capsaicinoides. Tais compostos acumulam-se na superfície da placenta e são liberados quando
o fruto sofre qualquer dano físico (CARVALHO et al., 2003).
2.3. ESPÉCIE ESTUDADA: Capsicum baccatum L.
A pimenta dedo-de-moça pertence à espécie Capsicum baccatum e é cultivada
principalmente nos estados de São Paulo, Rio Grande do Sul e Goiás. Os frutos apresentam
suave pungência e são consumidos frescos, na forma de molhos, conservas e desidratados em
flocos com a semente (pimenta calabresa) (EMBRAPA, 2008).
O nome baccatum significa “em forma de baga”. Originária da Bolívia ou Peru e, de
acordo com evidências arqueológicas, foi provavelmente domesticada no Peru por volta de
2500 a.C. O tamanho do fruto aumentou e gradualmente tornaram-se perenes e ficavam nas
plantas até o seu total amadurecimento.
A espécie Capsicum baccatum é geralmente distinta das outras espécies pelas manchas
amarelas ou marrons na corola de suas flores e pelas anteras amarelas. Essa espécie é
cultivada na Argentina, Colômbia, Equador, Peru, Bolívia e Brasil. Na América do Norte seu
crescimento é limitado e na Califórnia é conhecida sob o nome de Mild-Italian e em Nevada
como Chileno.
Os frutos da pimenta dedo-de-moça (Figura 8) medem cerca de 7,5cm de comprimento
por 1,0 – 1,5 cm de largura. Existem algumas variações de tamanho: 'Dedo-de-Moça' miúda
(3,5-4,0 cm de comprimento por 0,8-1,0 cm de largura); frutos de maior tamanho e coloração
vermelha mais intensa, que recebem diferentes nomes em função da região em que são
cultivados como 'Chifre-de-Veado', 'Sertãozinho', 'Rabo-de-Gato'. Sementes de pimenta
'Dedo-de-Moça' são comercializadas pelas companhias de sementes Topseed e Islã
(EMBRAPA, 2008).
8
Juliana Cristina dos Santos Almeida
Figura 8 – Frutos maduros da pimenta Capsicum baccatum L.
Fonte: Arquivo pessoal do pesquisador
As plantas baccatums são altas, possuem caules múltiplos, eretos e tendem à expansão,
entretanto quando cultivadas em jardins tendem a ficar como pequenas árvores. Seu período
de crescimento é de 120 dias ou mais, e as plantas podem produzir mais de 40 frutos. As
folhas são largas e cor verde-escuras medindo cerca de 17 cm de comprimento por 10 cm de
largura. Os frutos são firmes, tipicamente compridos com sementes cor creme, medindo entre
8 a 15 cm de comprimento por 1,8 a 2,5 cm de largura. De forma geral iniciam eretos e
tornam-se pendentes quando maduros, de cor vermelho-alaranjado ou amarelo e marrom em
algumas variedades. Grande ardência entre 30.000 a 50.000 unidades Scoville. As flores são
solitárias a cada nodo, pedicelos eretos ou inclinados na floração, corola branco ou brancoesverdeado, com manchas amarelas difusas na base, lóbulos da corola normalmente revolutas,
anteras amarelas ou marrons. Cálice do fruto maduro sem constrição anular na junção com o
pedicelo (entretanto às vezes irregularmente enrugados), veias prolongadas em dentes
proeminentes.
9
Juliana Cristina dos Santos Almeida
2.4. PROCESSO PATOLÓGICO: INFLAMAÇÃO
A inflamação caracteriza-se por um fenômeno complexo, dinâmico e multimediado,
diferindo de espécie para espécie, na mesma espécie de um tecido para o outro e também no
mesmo tecido, de acordo com o tipo de trauma ou estímulo (FERREIRA & VANE, 2002).
Pode ser definida como a reação do tecido vivo vascularizado à injúria local. A injúria
representa um sem número de agressões de natureza diversa: química, fisiológica ou biológica
(BECHARA & SZABÓ, 1989).
O processo inflamatório desenvolvido por um organismo consiste na resposta a um
trauma, tendo como principal característica a de se manifestar de maneira esteriotipada,
independente da natureza do agente agressor. A inflamação apresenta alterações
morfofuncionais da microcirculação na área lesada envolvendo células, tecidos, vasos
sanguíneos e linfáticos. A intensidade ou a persistência da injúria, características do órgão ou
tecido atingido e a capacidade de reação do organismo vão desencadear as reações
características do processo inflamatório (PEGORARO, 1994).
A inflamação tem como finalidade localizar o agente agressor, diluir, neutralizar,
conforme a severidade, a duração e a natureza da agressão, desde seroso, catarral, purulento,
fibrinoso até hemorrágico (DAVID et al, 2001).
Os componentes básicos de um processo inflamatório consistem em eventos celulares e
humorais interdependentes que culminam com a reparação do tecido e a restauração da
função. Tais componentes podem ser apresentados da seguinte forma: 1) estímulo lesivo ou
trauma; 2) dano celular ou migração celular; 3) liberação e ativação de mediadores; 4)
resposta tecidual; 5) reparo (SILVA et al., 2002).
Dentre as células presentes no processo inflamatório, podem ser citadas células
fagocíticas como os neutrófilos (primeiras células a migrar para o local da lesão), monócitos
10
Juliana Cristina dos Santos Almeida
(leucócitos circulantes) e macrófagos (realizam a fagocitose e liberam de espécies reativas do
oxigênio) (MANTOVANI et al., 2007).
Os neutrófilos são granulócitos típicos da fase aguda da inflamação, com alto poder de
diapedese, rápida velocidade de migração e a capacidade de provocar necrose tecidual pela
liberação de suas enzimas lisossômicas. O rolamento de leucócitos é favorecido pela ação de
selectinas, enquanto a adesão firme ao endotélio é proporcionado por integrinas
(SCHWARTZ, 2007).
A resposta inflamatória envolve vários eventos celulares e a liberação de inúmeras
substâncias químicas como enzimas e mediadores químicos, destacando-se: o óxido nítrico
(SANCHAYITA; ABRAHAM, 2006; SCHMID-SCHÖBEIN, 2006; MARIOTTO et al.,
2004; TSUCHIYA et al., 2007), a mieloperoxidase (ARATANI, 2006; ARATANI et al.,
2006; KLEBANOFF, 2005; WINTERBOURN et al., 2006; HANSSON et al., 2006) e a
adenosina-deaminase
(ZAVIALO
&
ENGSTRÖM,
2005),
além
das
citocinas
(MANDERSCHEID et al., 2004; SCHMID-SCHÖBEIN, 2006) e quemocinas (SPEYER et
al., 2004; SCHMID-SCHÖBEIN, 2006).
A enzima mieloperoxidase (MPO) é sintetizada principalmente por neutrófilos e células
precursoras de monócitos e catalisa a produção de um metabólito com importante atividade
microbicida, o ácido hipocloroso (HOCl). Esta enzima está intimamente relacionada com a
proteção do hospedeiro (WINTERBOURN et al., 2006).
A adenosina–deaminase (ADA), outra enzima envolvida na inflamação, está envolvida
no processo de catalisação da reação de desaminação da adenosina e 2-desoxiadenosina em
inosina e desoxinosina, respectivamente. Estudos in vivo demonstraram a presença de pelo
menos duas isoenzimas (ADA1 e ADA2), liberadas principalmente por macrófagos e
monócitos circulantes (CONLON & LAW, 2004). Nos seres humanos, também já foram
identificadas ambas as isoenzimas (ZAVIALOV & ENGSTRÖM, 2005).
11
Juliana Cristina dos Santos Almeida
O óxido nítrico (NO) é outro mediador químico extremamente importante no processo
inflamatório. O óxido nítrico é um gás incolor e estável, moderadamente solúvel em água, sua
meia-vida é curta e é a molécula de secreção celular de mamíferos com menor peso
molecular. A L-arginina e a L-citrulina são moléculas utilizadas por inúmeras células para
produzir o óxido nítrico. O NO está envolvido com vários fenômenos como:
vasorrelaxamento dependente do endotélio, citotoxicidade mediada por macrófagos, inibição
da ativação, adesão e agregação plaquetária, relaxamento do corpo cavernoso peniano
humano, regulação da pressão sanguínea basal, depressão sináptica a longo prazo,
potencialização da transmissão sináptica a longo prazo, microcirculação medular e glomerular
e prevenção de piloroespasmo em estenose pilórica hipertrófica infantil (CERQUEIRA &
YOSHIDA, 2002).
Citocinas são substâncias pertencentes a uma família de peptídeos sintetizada por
monócitos e linfócitos, cujas principais são a interleucina 1 (IL-1), o fator de necrose tumoral
(TNF) (MONTENEGRO & FRANCO, 1996) e as quemocinas, como interleucina-8 (IL-8) em
humanos e quemocina para neutrófilos, em camundongos (MANDERSCHEID et al., 2004).
O fator de necrose tumoral α (TNF-α) liberado no local da inflamação promove a
liberação de outros mediadores químicos e a ativação celular ocasionando na expressão de
moléculas de adesão no endotélio e nos leucócitos (SEELY et al., 2003).
A interleucina β (IL-β), liberada por macrófagos, atua próximo à célula onde foi
liberada e possui atividade pró ou antiinflamatória. Promove sua ação através da ativação da
liberação de TNF-α pelos macrófagos, células endoteliais, linfócitos e fibroblastos e IL-6 por
macrófagos e células hepáticas (HIETBRINK et al., 2006).
As quemocinas ligam-se a receptores com sete domínios transmembranares (C-X-CR1 e
C-X-CR2) (DI CIOCCIO et al., 2004) e fazem a quimiotaxia de neutrófilos.
O processo inflamatório pode apresentar dois tipos de respostas: uma denominada
transitória ou aguda, predominando alterações vasculares exsudativas e outra denominada
12
Juliana Cristina dos Santos Almeida
crônica, quando o estímulo lesivo ou modificado permanece por períodos relativamente
longos, desencadeando grande proliferação celular, que não raramente levará a lesão
funcional do órgão afetado (GARCIA LEME, 1979).
A primeira fase da inflamação, conhecida como fase aguda, é caracterizada pela
presença de vários eventos celulares e vasculares: mudança de calibre e fluxo na
microcirculação levando à vasodilatação das arteríolas; aumento da permeabilidade vascular
das vênulas em consequência da abertura das junções entre as células levando à formação de
exsudato rico em proteínas desencadeando o edema local; migração de leucócitos do sangue
circulante para o local a inflamação (ALBERTINE et al., 2001) (Figura 9). Os eventos
celulares e vasculares são mediados por substâncias químicas conhecidas como mediadores
químicos, podendo atuar isoladamente, associadamente ou em sequência podendo ampliar a
resposta inflamatória (DREUX, 2005). São vários os locais onde podem ser sintetizados os
mediadores químicos: no plasma, células e tecidos agredidos. Dentre esses mediadores,
podem ser destacados a histamina, cininas plasmáticas, serotonina, prostaglandinas (PGs),
elementos formados durante a ativação do sistema complemento, proteases neutras, proteínas
catiônicas de origem lisossomal, produtos decorrentes da degradação de fibrina (PDF), fatores
reativos de linfócitos, citocinas, entre outras (DREUX, 2005).
13
Juliana Cristina dos Santos Almeida
Figura 9 – Etapas do processo inflamatório: estímulo, aumento da permeabilidade vascular,
formação do edema e recrutamento de leucócitos . Fonte: Castardo, 2007.
A histamina e a serotonina, aminas vasoativas, são liberadas dos mastócitos e das
plaquetas. A histamina é o primeiro mediador a atuar na inflamação aguda promovendo
aumento da permeabilidade vascular e uma contração do endotélio venular com alargamento
de junções celulares interendoteliais. A serotonina corresponde a um segundo mediador pré
formado que possui ações semelhantes as da histamina (COTRAN et al., 1996).
O ácido araquidônico é uma substância precursora para várias moléculas, dentre elas:
prostaglandinas, prostaciclinas, tromboxanos e leucotrienos. As prostaglandinas originadas
da conversão do ácido araquidônico agem como importantes substâncias vasodilatadoras. A
liberação do ácido araquidônico ocorre pela estimulação específica de receptores da superfície
celular promovendo a subseqüente ativação de fosfolipases A2 (CARVALHO et al., 1990)
(Figura 10).
Duas grandes rotas do ácido araquidônico em mamíferos possuem grande importância
no papel fisiológico da inflamação, a via da ciclooxigenase (COX) e a via de lipoxigenase.
14
Juliana Cristina dos Santos Almeida
Prostanois, dentre eles as prostaglandinas e tromboxano A2, são produzidos pela via da
ciclooxigenase e leucotrienos são produzidos pela via da 5-lipoxigenase, ambas iniciadas com
a ação da fosfolipase A2 (YOSHIKAI, 2001) (Figura 10).
Dois tipos de COX são relatados: ciclooxigenase-1 (COX-1) e ciclooxigenase-2 (COX2). A COX-1 é uma enzima constitucional presente em muitos tecidos e está envolvida na
homeostase tecidual. A COX-2 é induzida em células inflamatórias e é considerada como
sendo a enzima que produz os mediadores da inflamação da classe dos prostanois (FONSECA
et al., 2002).
As prostaglandinas constituem uma família complexa de derivados de ácidos graxos,
sintetizadas por quase todas as células de mamíferos. Possuem efeitos intracelulares
importantes em condições fisiológicas e patológicas (FONSECA et al., 2002). As
prostaglandinas produzidas pela via da ciclooxigenase incluem prostaglandina E2 (PGE2),
prostaglandina D2 (PGD2), prostaglandina F2α (PGF2α), prostaglandina I2 (PGI2) (COTRAN et
al., 1996) (Figura 10).
Na via da 5-lipoxigenase, dentre os leucotrienos mais importantes destaca-se o
leucotrieno B (LTB), que causa aderência dos neutrófilos ao endotélio das vênulas pós
capilares, sendo também um importante quimiotático para neutrófilos (CORREA, 2001).
15
Juliana Cristina dos Santos Almeida
Figura 10 – Geração dos metabólitos do ácido araquidônico e seus papéis na inflamação. Fonte:
Castardo, 2007.
A inflamação crônica é proveniente da ação de agentes infecciosos persistentes,
exposição prolongada a agentes lesivos ou como manifestação de doença auto-imune. Esse
tipo de inflamação manifesta-se de forma lenta, menos agressiva, de duração prolongada e
muitas vezes, assintomática.
Na inflamação crônica é característica a infiltração de células mononucleares
(linfócitos, plasmócitos e macrófagos) no tecido, destruição tecidual e fibrose.
As inflamações, tanto aguda como crônica, geram alterações teciduais e sistêmicas. As
alterações teciduais principais são: inflamação serosa, fibrinosa, purulenta e úlcera. Os efeitos
sistêmicos podem ser salientados como a produção de mediadores químicos, radicais livres de
oxigênio e constituintes lisossômicos.
Diversas enfermidades envolvendo processos inflamatórios afetam a população
mundial, como: artrite reumatoide, gota, asma, transtornos neurodegenerativos. Além dessas,
16
Juliana Cristina dos Santos Almeida
muitas outras doenças menores estimulam um processo inflamatório no organismo como
resposta a traumas físicos ou alergias (FRANCO et al., 2007).
2.5. INFLAMAÇÃO EXPERIMENTAL
O estudo da reação inflamatória e o desenvolvimento de novas terapias e drogas sempre
dependeram de modelos animais apropriados (DREUX, 2005).
Do ponto de vista laboratorial existem diversos métodos experimentais empregados na
investigação do processo inflamatório. Estes modelos são bastante variáveis e analisam alguns
aspectos do processo inflamatório, dentre os quais podemos citar (DREUX, 2005):
- os fenômenos vasculares precoces: dilatação, alterações de fluxo, dinâmica circulatória;
- as alterações da permeabilidade vascular;
- o desenvolvimento de edemas;
- a pesquisa de fatores quimiotáticos e seu mecanismo;
- os processos fagocitários;
- a análise química e farmacológica de exsudatos inflamatórios e perfusatos de áreas
inflamadas, para a detecção de substâncias ativas (mediadores e enzimas);
- as alterações no sistema linfático: composição e fluxo da linfa;
- os fenômenos dolorosos, sua produção e mecanismos;
- as alterações morfológicas globais, a natureza das células presentes, a extensão do infiltrado
celular, a lesão final;
- os processos cicatriciais.
Para a avaliação do mecanismo de ação antiinflamatória alguns dos modelos
laboratoriais já descritos são: a bolsa de ar, pleurisia, o edema de pata, a artrite e o implante de
esponjas embebidas em agentes irritantes (LIZ, 2007).
17
Juliana Cristina dos Santos Almeida
Neste trabalho, optou-se pelo modelo experimental de edema de pata induzido por
carragenina, uma vez que essa técnica é de fácil execução e é considerado um bom modelo
para avaliar o mecanismo de ação de plantas ou fármacos que possuem propriedades
antiinflamatórias.
2.6. AGENTES ANTIINFLAMATÓRIOS
Os agentes antiinflamatórios são fármacos que atuam no processo de redução da
inflamação inibindo a síntese e liberação de prostaglandinas (FONSECA et al., 2002). Várias
substâncias são utilizadas como drogas antiinflamatórias, podendo ser citados os
glicocorticoides, antiinflamatórios não-esteroidais (AINES) e fitoterápicos.
Os glicocorticoides têm sido considerados como agentes inibidores da produção de
prostaglandinas, pela ação inibitória que exercem sobre a fosfolipase A2, liberando
lipocortina-1 (mediador proteico antiinflamatório). O resultado final da ação desses
antiinflamatórios é a parcial ou total inibição da síntese e liberação dos mediadores próinflamatórios, através do sequestro do substrato fosfolipídico e/ou da inibição direta da
enzima (FONSECA et al., 2002).
Os AINES inibem a conversão do ácido araquidônico em endoperóxidos cíclicos
instáveis intermediários (prostaglandinas e prostaciclinas) envolvidos no processo
inflamatório e na sensibilização das vias dolorosas centrais e periféricas catalisadas pela
ciclooxigenase (FONSECA, 2007). Portanto, promovem sua ação antiinflamatória através da
inibição da enzima ciclooxigenase (FONSECA et al., 2002).
A utilização das plantas medicinais é uma das mais antigas armas empregadas para o
tratamento das enfermidades humanas e muito já se conhece a respeito de seu uso por parte da
sabedoria popular. Com os avanços científicos, esta prática milenar perdeu espaço para os
18
Juliana Cristina dos Santos Almeida
medicamentos sintéticos, entretanto, o alto custo destes fármacos e os efeitos adversos
apresentados contribuíram para o ressurgimento da fitoterapia.
Uma das primeiras substâncias utilizada como antiinflamatório, a salina, é um derivado
glicosídico desenvolvido a partir de várias espécies de Salix e Populus que deu origem a
vários derivados conhecidos como salicilatos. Desses salicilatos, o ácido salicílico merece
destaque porque através de sua acetilação consegue-se o ácido acetilsalicílico, popularmente
conhecido como aspirina. Este fármaco apresenta efeito inibidor não-seletivo das duas
isoformas da COX, de inibição irreversível (FURST & MUNSTER, 2003).
Várias espécies de plantas medicinais têm sido empregadas como agentes
antiinflamatórios, dentre elas: garra do diabo (Harpagophytum procumbens D.C.), agoniada
(Plumeria bancifolia), malva (Sida cordifolia), salgueiro branco (Salix alba L.) e a erva
baleeira (Cordia verbenacea).
Estudos mostram que as pimentas do gênero Capsicum apresentam uma série de efeitos
fisiológicos benéficos, mostrando-se excelente alimento nutracêutico, ou seja, é um alimento
ou parte de um alimento que proporciona benefícios médicos e de saúde, incluindo a
prevenção e/ou tratamento da doença. A pimenta apresenta intensa ação hipocolesterolêmica,
antiinflamatória e antioxidante, e que estes efeitos parecem estar relacionados com a presença
de capsaicinoides, vitaminas e polifenois (ALVES, 2006).
A pimenta está descrita como um alimento funcional (SURH, 1999) devido às
propriedades antioxidante, antiinflamatória, antimutagênica e quimiopreventivo do vaniloide
pungente (capsaicina) presente nas pimentas vermelhas (ANJO, 2004). Esta substância
mostrou ser potente como inibidora da peroxidação lipídica por radicais livres (SURH, 1999).
O gênero Capsicum é rico em compostos fenólicos, ácido ascórbico e capsaicinoides
que conferem alto poder oxidante dessas espécies (DEEPA et al. 2006).
O fruto é usado popularmente em diversas doenças, como nas inflamações na garganta,
diarreia, dilatador capilar, expectorante, para diminuir o broncoespasmo e na obstrução da
19
Juliana Cristina dos Santos Almeida
passagem de ar pulmonar induzido pela histamina. Adicionalmente, referências indicam que
compostos bioativos presentes nos frutos das espécies de Capsicum inibem o crescimento do
patógeno gástrico Helicobacter pylori, exercem atividade bactericida, promove ainda inibição
da agregação plaquetária, efeito estimulante neural e diurético, além de aumentar a atividade
adrenocortical e a produção do cortisol. Topicamente é usada para a alopecia, a neuralgia, a
pleurite e a artrite reumatoide. As folhas são usadas como curativo em locais feridos e
inflamados ocorrendo, porém, controvérsias na literatura quanto ao uso do fruto em
inflamações agudas (BARCELOUX, 2009, PIRES et al., 2004).
Dentre os capsaicinoides, a capsaicina (Figura 2) e a dihidrocapsaicina são as mais
abundantes e a primeira é largamente responsável pelas ações terapêuticas desses compostos,
tais como: neuropatia diabética, osteoartrite, psoríase, neuralgia pós-herpética, cicatrização de
feridas e câncer (WEI & ZHAO, 2008).
A capsaicina é um composto com fórmula molecular C18H27NO3 encontrado nas
sementes e nas membranas dos frutos do gênero Capsicum (GRÉGIO et al., 2008).
Os efeitos médicos da exposição à capsaicina resultam do período inicial de intensa
excitação de nervos sensoriais aferentes primários seguido por um período prolongado de
relativa resistência a estímulos nociceptivos químicos. Capsaicina reduz a transmissão dos
impulsos dolorosos da periferia para o sistema nervoso central por esgotar substância P das
fibras nervosas sensoriais de tipo C presentes no local (BUCK & BURKS, 1985). Sabe-se que
a substância P serve de intermediária na transmissão dos impulsos dolorosos dos nervos
periféricos para a medula espinhal. Assim, mesmo que a causa da dor continue presente, a
percepção da dor não chega ao encéfalo.
Fisiologicamente, a capsaicina reduz a vasodilatação, dor e calor limiares, levando a
uma diminiuição da sensibilidade à dor (WEINBERG, 1981). Repetidos contatos com
capsaicina causa dessensibilização do efeito estimulatório sobre nervos sensoriais
(CARPENTER
&
LYNN,
1981).
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OBJETIVOS
3. OBJETIVOS
3.1. Geral
Avaliar o efeito antiinflamatório de uma formulação que contenha o extrato da espécie
Capsicum baccatum L. no processo inflamatório agudo, utilizando o modelo de edema de pata
em ratos, induzido por carragenina.
3.2. Específicos
3.2.1. Identificação botânica do material e depósito de exsicata no Herbário Professor
José Badini da Universidade Federal de Ouro Preto;
3.2.2. Caracterização morfo-anatômica e histoquímica dos frutos de Capsicum baccatum;
3.2.3. Determinação de massa fresca, massa seca, porcentagem de água e teor de cinzas
dos frutos de Capsicum baccatum L.;
3.2.4. Obtenção do extrato bruto da espécie Capsicum baccatum L. utilizando solventes
orgânicos e seleção da fração desejada;
3.2.5. Realização de screening fitoquímico dos frutos de Capsicum baccatum L. a fim de
investigar a presença dos principais metabólitos secundários, evidenciando os principais
grupos;
3.2.6. Avaliar a concentração do metabólito capsaicina nos frutos de Capsicum baccatum
L. em três estádios de maturação;
3.2.7. Realizar o bioensaio de letalidade de Artemia salina Leach do extrato orgânico dos
frutos de Capsicum baccatum L. a fim de avaliar a toxicidade aguda do extrato orgânico;
3.2.8. Determinar a atividade antioxidante do extrato bruto de Capsicum baccatum L. e
sua relação com a concentração de compostos fenólicos;
3.2.9. Desenvolver formulação com extrato bruto;
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3.2.10. Avaliar a atividade antiinflamatória in vivo do produto desenvolvido em modelo de
edema de pata em ratos;
3.2.11. Avaliar a atividade analgésica in vivo do produto desenvolvido em modelo de
contorções abdominais em ratos;
3.2.12. Acompanhar o efeito dos tratamentos em análises histológicas de músculo das
patas de ratos Wistar.
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MATERIAIS E MÉTODOS
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1. Coleta do Material Vegetal
A espécie vegetal Capsicum baccatum foi coletada no distrito de Amarantina, município
de Ouro Preto, localizado a 23 Km da sede do município. A amostra foi coletada em agosto de
2008. A identificação foi realizada pelo botânico Professor Doutor João Renato Stehmann da
Universidade Federal de Minas Gerais e o material testemunho foi depositado no Herbário
Professor José Badini da Universidade Federal de Ouro Preto (UFOP).
Os frutos da pimenta dedo-de-moça foram coletados em três diferentes estádios de
maturação: estádio imaturo (verde), intermediário (alaranjado) e estádio maduro (vermelha)
(Figura 11).
A
B
Figura 11 – Frutos de Capsicum baccatum em diferentes estádios de maturação. A – frutos imaturos
(verdes) e maduros (vermelhos), B – frutos em estádio intermediário de maturação (alaranjados) e
maduros (vermelhos). Fonte: Arquivo pessoal dos pesquisadores.
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4.2. Caracterização morfo-anatômica dos frutos
Os frutos colhidos foram levados para o Laboratório de Produtos Naturais
(LAPPRONA) da Universidade Federal de Ouro Preto – MG, sendo selecionados e separados
daqueles que apresentavam deformações ou ataques de fungos e insetos.
A contagem de número de sementes por fruto foi realizada com uma amostra de 50
frutos.
Para a descrição da morfologia interna e externa foram utilizados 100 frutos, escolhidos
aleatoriamente. As observações, quando necessário, foram feitas com o auxílio de uma lupa.
Observou-se nos frutos o tipo, a coloração, textura e consistência do tegumento. As
características internas observadas foram o tipo de placentação, pericarpo e o número médio
de sementes. O diâmetro e a altura dos frutos foram medidos utilizando uma régua de 30
centímetros de comprimento.
4.3. Caracterização histoquímica dos frutos
A caracterização microscópica de Capsicum baccatum foi realizada utilizando a região
apical de frutos imaturos (verdes). A partir dos frutos totalmente expandidos, foram realizados
cortes transversais à mão livre com o auxílio de uma lâmina cortante. Os cortes mais finos
foram selecionados com a ajuda de um pincel nº2 e montados em água ou glicerina. Os
exemplares selecionados foram submetidos às reações de coloração para caracterização de
morfologia das células, da parede e da placentação com os reagentes azul de Alcian e fucsina.
Para a caracterização histoquímica foram utilizados os reagentes de cloreto de ferro III
(JOHANSEN, 1940) para a detecção de compostos fenólicos gerais, fluorocromos
(CHARRIÈRE-LADREIX, 1976) para flavonóides, Reagente de Dragendorff (SVENDSEN
& VERPOORTE, 1983) para alcaloides, ácido sulfúrico concentrado (GEISSMEN &
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GRIFFIN, 1971) para lactonas sesquiterpênicas, vanilina clorídrica (MACE & HOWELL,
1974) para taninos, ácido tânico associado a cloreto férrico (PIZZOLATO & LILLIE, 1973)
para mucilagens e azul brilhante de Comassie (FISCHER, 1968) para proteínas. As imagens
foram analisadas no Microscópio Leica DM5000B e capturadas em programa Leica
Application Suite.
4.4. Determinação de massa fresca, massa seca, porcentagem de água e teor de cinzas
totais dos frutos de Capsicum baccatum L.
As análises farmacognósticas foram realizadas segundo as especificações da
Farmacopéia Brasileira, IV edição (1988). Após a retirada das sementes e das membranas
internas dos frutos, os testes de determinação de água e cinzas totais foram realizados usandose quatro repetições para cada tratamento.
Para a realização do teste de determinação de água foi utilizada a metodologia de
Gravimetria, que consiste em pesar aproximadamente 5,0 gramas do material vegetal
fragmentado em pesa-filtro, previamente tarado e dessecado por cerca de 30 minutos a
temperatura de 105ºC. O material pesado foi acondicionado em estufa de ventilação forçada
da marca TECNAL (modelo TE-394/I), pré aquecida por 30 minutos em temperatura de
105ºC, durante 5 horas. Após o intervalo de 5 horas, o material foi retirado da estufa de
ventilação forçada, resfriado em dessecador por 1 hora à temperatura ambiente e pesado. O
processo foi repetido até que o material apresentasse peso constante.
Na determinação de cinzas totais, as amostras foram secas em estufa de ventilação
forçada da marca TECNAL (modelo TE-394/I) a 105ºC até que apresentassem peso constante
conforme a metodologia descrita anteriormente. Pesou-se cerca de 3,0g do material seco em
cadinhos previamente calcinados à temperatura de 450ºC, resfriados e tarados. Distribuiu-se
as amostras uniformemente nos cadinhos e incinerou-as em mufla, aumentando a temperatura
paulatinamente até 450°C, para que todo o material orgânico fosse eliminado. Os cadinhos
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contendo as cinzas foram resfriado em dessecador e pesados. Para os cálculos da
determinação de água e de cinzas totais, foi utilizado o programa SAEG for Windows 2009.
Os resultados foram submetidos à análise de variância (ANOVA – one way) e teste de média
(Tukey) com grau de significância p≤0,05, utilizando o programa SAEG for Windows 2009,
adaptado ao modelo estudado.
4.5. Preparo dos extratos
Os extratos orgânicos de Capsicum baccatum L. foram confeccionados de acordo com a
metodologia de Perucka et. al. (2000). Os frutos foram selecionados, higienizados,
particionados, as sementes retiradas e as placentas maceradas com o solvente orgânico
acetona.
Os frutos foram extraídos em três estádios diferentes de maturação: imaturo (verde),
intermediário (alaranjado) e maduro (vermelho).
A metodologia de extração utilizada foi a maceração exaustiva, por um período de 7
dias. Os extratos obtidos foram filtrados e concentrados em evaporador rotativo (BÜCHI R114) a 40ºC. Depois de concentrados os extratos foram secos e os solventes deixados evaporar
à temperatura ambiente.
4.6. Estudo Fitoquímico dos extratos
A pesquisa de alguns metabólitos secundários foi realizada através da metodologia de
cromatografia em camada delgada (CCD), dentre eles as classes: alcaloides, flavonoides,
terpenos e triterpenos, pela metodologia adaptada de Wagner (1984).
A detecção de alcaloides consistiu em eluir os extratos acetônicos em hexano: acetato
de etila (60:40) e utilizar como revelador o Reagente de Dragendorff. O padrão usado para a
pesquisa de alcaloides foi a capsaicina (SIGMA ALDRICH) aplicada na concentração de
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2mg/100µL. Todos os extratos foram eluídos com quatro repetições para cada estádio de
maturação.
A detecção de terpenos e triterpenos consistiu em eluir os extratos acetônicos em
clorofórmio:etanol:ácido acético (94:5:1) e utilizar como revelador vanilina sulfúrica. Os
padrões usados para a pesquisa de terpenos e triterpenos foram timol, saponina e linalol
(SIGMA ALDRICH) aplicados na concentração de 2mg/100µL. Todos os extratos foram
eluídos com quatro repetições para cada estádio de maturação.
A detecção de flavonoides foi realizada eluindo os extratos acetônicos em acetato de
etila:ácido fórmico:ácido acético:água (20:2:2:6) e as placas foram reveladas com vanilina
sulfúrica. O padrão usado para a pesquisa de flavonoides foi a quercetina aplicada na
concentração de 2mg/100µL. Todos os extratos foram eluídos com quatro repetições para
cada estádio de maturação.
4.7. Quantificação dos constituintes fenólicos totais
A concentração de compostos fenólicos totais, mensurada nos extratos orgânicos foi
adaptada da metodologia de Jahayaprakasha et al. (2002). A quantidade total de fenóis de
cada extrato foi quantificada por meio de uma curva padrão preparada com ácido gálico e
expressa como equivalentes de ácido gálico (mg de ácido gálico/mg da amostra). Os extratos
orgânicos (0,2 mg) foram misturados a 1 mL do reagente de Folin-Ciocalteu (1:10) e a 0,8 mL
da solução a 7,5% de carbonato de sódio. A mistura foi aquecida em banho-termostatizado
(TECNAL TE-2005) a 30ºC por 30 minutos. A absorbância foi medida a 765 nm usando o
espectrofotômetro FEMTO 800 XI. As amostras dos 3 estádios diferentes de maturação foram
submetidas a essa análise, realizadas em quatro repetições.
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4.8. Atividade antioxidante
A medida da atividade antioxidante foi realizada pelo método fotocolorimétrico in vitro
do radical livre estável 2,2-difenilpicrilidrazila (DPPH) adquirido da SIGMA ALDRICH (lote
S43654-357), segundo adaptação da metodologia de Vicentino et al. (2007). O método
consiste em utilizar 2,5 mL de soluções de amostras dos extratos nas concentrações de 5, 10,
25, 50, 125 e 250 µg/mL e adicionar 1 mL de uma solução de DPPH a 0,3 mM em etanol. A
solução de DPPH em etanol é utilizada como controle negativo, o etanol como branco e como
controle positivo o butilhidroxianisol (BHA) adquirido da SYNTH (lote: 105904), que possui
alta capacidade antioxidante. Após trinta minutos da adição do DPPH, leituras das amostras
foram feitas a 518 nm no espectrofotômetro FEMTO 800 XI. A atividade sequestrante de
radicais livres (ASRL) foi expressa em porcentagem em comparação ao controle,
butilhidroxianisol (BHA), nas mesmas diluições das amostras, segundo a equação:
%ASRL = Ac – At x 100
Ac
Onde, Ac: absorbância do controle e At: absorbância teste (amostra)
Para detectar a diferença entre as médias de atividade antioxidante das diferentes
concentrações dos extratos e avaliar essas diferenças, foram utilizadas análises de variância
(ANOVA – one way) e o teste de Tukey, com grau de significância para p≤ 0,05.
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4.9. Quantificação de capsaicina nos extratos orgânicos obtidos dos frutos de Capsicum
baccatum em três estádios diferentes de maturação
A capsaicina foi quantificada pela adaptação do método de Perucka et.al. (2000). O
método consiste em utilizar a Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) para a
determinação da quantidade de capsaicina presente em extratos orgânicos de Capsicum.
Primeiramente o método foi validado de acordo com as normas da Resolução nº 899
(29/05/2003), “Guia para a Validação de Métodos Analíticos e Bioanalíticos” da ANVISA
(BRASIL, 2003), que consiste em determinar a especificidade, linearidade, robustez, limite de
quantificação, precisão e exatidão de uma metodologia analítica. Após a validação do
procedimento, a capsaicina foi quantificada em extratos orgânicos (acetônicos) dos frutos de
Capsicum baccatum L. em três diferentes estádios de maturação, a fim de verificar em qual
estádio de desenvolvimento do fruto esse capsaicinoide encontra-se em maior concentração.
O cálculo da concentração desse capsaicinoide nos extratos foi realizado pela construção da
curva padrão com diferentes concentrações (10, 25, 50, 100, 200, 400 e 500 µg/mL) do
padrão de capsaicina (SIGMA ALDRICH, lote: 045K7031) Os ensaios foram realizados
utilizando-se quatro replicatas. Através da curva padrão foi calculada a reta da curva para os
cálculos de concentração. Os cálculos foram realizados através de regressão linear simples
empregando-se o programa Excel for Windows 2007.
4.10. Teste antifúngico
A metodologia empregada para a realização do teste antifúngico foi a proposta pela
organização americana Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A2.
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Juliana Cristina dos Santos Almeida
Os ensaios foram realizados com o extrato bruto acetônico imaturo (verde) dos frutos de
Capsicum baccatum em concentrações que variaram de 1µg/mL a 512µg/mL. Os antifúngicos
azólicos cetoconazol e fluconazol solubilizados em dimetilsulfóxido (DMSO) foram
utilizados como padrões positivos nas concentrações que variaram de 0,0625 µg/mL a 32
µg/mL e 0,125 µg/mL a 64 µg/mL, respectivamente. As quatro espécies de Candida usadas
para o teste foram cepas adquiridas da American Type Culture Collection (ATCC), sendo
determinadas como: Candida albicans (ATCC18804), Candida tropicalis (ATCC750),
Candida parapsilosis (ATCC22019) e Candida krusei (ATCC6258).
Para a obtenção do inócuo, as cepas foram repicadas em meio de cultura Ágar
Sabouraud dextrose e incubadas a 35ºC em estufa bacteriológica por 24h.
Para assegurar a reprodutibilidade dos ensaios, a quantidade de inócuo foi padronizada
pela comparação visual dos inócuos em salina e da escala 0,5 McFarland. Com uma agulha de
platina esterilizada, transferiram-se culturas de 24 h de leveduras para tubos contendo 2 mL
de solução de cloreto de sódio a 0,85%. Segundo os critérios do CLSI, foram efetuadas
diluições sucessivas em tubo no caldo RPMI 1640, obtendo-se uma quantidade final de
inóculo de 1,2 x 103 UFC/mL.
Com a utilização de uma agulha de platina esterilizada, foram transferidas culturas de
24 h das leveduras cultivadas em ágar Sabouraud dextrose para o meio de cultura líquido
RPMI 1640. Foram utilizadas microplacas com 96 orifícios e cada orifício recebeu o inóculo,
o meio de cultura e as soluções dos extratos diluídos, de tal forma que o volume final fosse de
100 µL. Para o controle da metodologia foram realizados os controles: esterilidade do caldo
RPMI 1640, inóculo, o qual apresentou crescimento total devido à ausência do controle
positivo, esterilidade dos extratos brutos, bem como dos padrões positivos e negativos.
Logo após a micropipetagem dos inóculos, do meio de cultura e dos controles, as
microplacas foram tampadas e incubadas a 28 ºC por 48 horas. A leitura dos resultados foi
realizada visualmente com o auxílio de suporte com espelho.
30
Juliana Cristina dos Santos Almeida
4.11. Determinação da bioletalidade frente a Artemia salina
O bioensaio com Artemia salina foi baseado na técnica descrita por Meyer et.al.(1982).
Neste ensaio biológico foram utilizadas larvas de Artemia salina Leach, obtidas a partir da
incubação de cerca de 20mg do extrato bruto de Capsicum baccatum L. de todas as amostras,
nas quais foram solubilizados em 2mL de solvente apropriado e dessa solução amostras de 5,
50 e 500 µL foram transferidas, em quatro repetições, para frascos de 5 mL. Após a remoção
total do solvente, uma solução salina (0,38g/L, 5mL) foi adicionada a cada um dos frascos
resultando em concentrações finais de 10, 100 e 1000 µg/mL, respectivamente. Os cistos de
A. salina (20mg) foram incubadas sob luz artificial por 48 horas para que as larvas
(metanáuplios) eclodissem. Sete grupos de 10 a 13 metanáuplios foram expostos a diferentes
concentrações (50µm/mL a 1000µg/mL) dos extratos em acetona de Capsicum baccatum L. O
primeiro grupo recebeu solução salina, três grupos receberam diferentes concentrações dos
extratos e um grupo recebeu o lapachol, que funcionou como controle positivo. As amostras
foram submetidas à luz artificial durante 24 horas, sendo contabilizadas após esse período as
larvas vivas e as larvas mortas. Cada ensaio foi realizado quatro vezes. Os dados foram
analisados através do método de Probit (FINNEY, 1962).
4.12. Desenvolvimento da formulação fitoterápica
A formulação foi desenvolvida sob a forma de xarope. Nessa forma farmacêutica base,
o extrato acetônico de Capsicum foi incorporado manualmente sob agitação constante. Todos
os parâmetros físico-químicos para a forma farmacêutica xarope especificadas na
Farmacopeia Brasileira, IV edição (1988) foram determinados, tais como: densidade relativa,
viscosidade, características organolépticas e concentração de capsaicina na formulação.
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Juliana Cristina dos Santos Almeida
A extração de capsaicina do xarope, para sua quantificação na formulação, foi realizada
de acordo com a metodologia adaptada da Farmacopeia Japonesa – 14ª edição (2001) e
consistiu em acrescentar a 0,5mL de xarope contendo o extrato de Capsicum baccatum, 30mL
de metanol e agitar durante 15 minutos.
Centrifugar durante 30 minutos e separar o
sobrenadante. Acrescentar ao resíduo 10mL de metanol, agitar durante 5 minutos e
centrifugar por 15 minutos. Repetir esse processo até que o líquido sobrenadante complete
50mL, sendo essa solução usada para teste.
Para a determinação da capsaicina no xarope foi utilizada a metodologia de Perucka
et.al. (2000) adaptada, conforme citado na página 30.
4.13. Testes de atividade farmacológica da formulação farmacêutica
Para avaliar as atividades analgésica e antiinflamatória do xarope de Capsicum
baccatum foram realizados dois testes farmacológicos: teste de contorções abdominais com
ácido acético e teste de edema de pata induzido por carragenina.
4.13.1. Animais utilizados nos testes
Foram utilizados ratos machos da linhagem Wistar, adultos, pesando entre 150 e 250g,
acondicionados em gaiolas individuais de polietileno convencionais (Figura 12), em
condições de temperatura controlada (22ºC a 28ºC), ciclo de luz controlado (período de luz de
6:00h às 18:00h) e receberam água e ração ad libitum. As gaiolas ficaram acondicionadas na
área experimental do Laboratório de Biofármacos na Universidade Federal de Viçosa (UFV).
Os animais foram distribuídos aleatoriamente em 7 grupos experimentais, sendo que
cada grupo continha 6 animais: grupo 1 (controle não tratado), grupo 2 (controle tratado com
a base do xarope), grupo 3 (tratado com formulação na concentração de 100mg/Kg de peso),
32
Juliana Cristina dos Santos Almeida
grupo 4 (tratado com formulação na concentração 300mg/Kg de peso), grupo 5 (tratado com
formulação na concentração 600mg/Kg de peso), grupo 6 (tratado com formulação na
concentração de 1000mg/Kg de peso) e grupo 7 (controle tratado com medicamento
referência – Nimesulida 300mg/Kg de peso).
Figura 12 – Rato Wistar macho adulto acondicionado em gaiola individual de polietileno.
Fonte: Arquivo pessoal do pesquisador
4.13.2. Aprovação pelo Comitê de Ética
Os trabalhos foram realizados dentro dos princípios éticos da experimentação animal de
acordo com o Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA), tendo sido aprovados
pela Comissão de Ética na Experimentação Animal (CEEA) da Universidade Federal de Juiz
de Fora – UFJF com registro de protocolo nº01/2010 – CEEA, no dia 02/02/2010.
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Juliana Cristina dos Santos Almeida
4.13.3. Teste de contorções abdominais
O teste de contorções abdominais foi realizado de acordo com a metodologia de Kosper
et.al., 1959. O xarope de Capsicum baccatum foi administrado por gavagem, uma hora antes
da aplicação intraperitonal da solução de ácido acético 0,6% em salina (Figura 13). As doses
administradas foram de 100mg/Kg, 300mg/Kg, 600mg/Kg e 1000 mg/Kg de peso do rato
(n=6). Uma hora após o tratamento foram administrados 10mL/Kg de peso do rato de ácido
acético 0,6% em salina por via intraperitoneal em cada rato, e o número de contorções
contado entre 10 e 30 minutos após este procedimento. O grupo não tratado recebeu 0,5mL de
salina, o grupo controle recebeu 0,5mL de base do xarope. A nimesulida (fármaco referência)
foi solubilizada em propilenoglicol, sendo administrado por gavagem na concentração de
300mg/Kg de peso do rato. Cinco minutos depois da administração da solução de ácido
acético (0,6% em salina), a contagem do número de “Writhings” (contorções abdominais) foi
determinada para cada grupo, permitindo calcular a porcentagem de inibição para cada dose
(SOARES, 2006).
A
B
Figura 13 – Experimento de contorções abdominais. A- Administração por gavagem do xarope de
Capsicum baccatum. B- Administração intraperitonial de solução de ácido acético 0,6% em salina.
Fonte: Arquivo pessoal dos pesquisadores.
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Juliana Cristina dos Santos Almeida
4.13.4. Teste de edema de pata induzido por carragenina
O edema de pata foi induzido pela administração subplantar de 0.1 mL de uma solução
a 1% de carragenina (p/v) diluída em solução salina 0.9% na pata direita traseira de cada rato.
Foi feita a administração de salina (cloreto de sódio 0,9%) na pata esquerda traseira de cada
animal para ser utilizada como controle (Figura 14). Uma hora antes da injeção da
carragenina, o primeiro grupo recebeu nimesulida na dosagem de (300mg/Kg de peso) por via
oral, droga antiinflamatória não esteroidal, utilizada como padrão do teste. Os grupos
experimentais, também uma hora antes da administração da carragenina, receberam o xarope
de Capsicum baccatum L. nas concentrações de 100, 300, 600 e 1000 mg/Kg de peso (Figura
14). A espessura da inflamação foi mensurada imediatamente e em intervalos de 1, 2, 3 e 4 h
após a administração da carragenina com o auxílio de um paquímetro digital 150mm
Profissional Western (Dai et al., 2002; Kweifio-Okai, 1991; Nkeh et al., 2003; Inverno et al.,
1962; Jovem et al., 2005). O edema produzido nas patas de cada animal foi determinado pela
diferença entre as medidas das patas direita e esquerda (MOREIRA, 2008).
O aumento percentual das patas foi calculado através da expressão:
E(%) = Tf – To x 100
To
Onde: E(%) = aumento percentual do tamanho da pata
To = tamanho inicial da pata
Tt = tamanho da pata após injeção de salina ou carragenina
O resultado final foi obtido subtraindo-se os valores controle (patas injetadas com
salina) dos valores testes (patas injetadas com carragenina) (CANABRAVA, 2008).
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Juliana Cristina dos Santos Almeida
A
B
C
Figura 14 – Experimento de edema de pata induzido por carragenina. A- Administração por
gavagem do xarope de Capsicum baccatum L. B- Administração subplantar de carragenina.
C – Medição do edema de pata com auxílio de paquímetro.
Fonte: Arquivo pessoal dos pesquisadores.
4.13.4.1. Histologia do edema de pata
A análise histológica foi realizada para confirmar o efeito antiinflamatório da
formulação-teste desenvolvida com o extrato dos frutos verdes de Capsicum baccatum L.
Para o estudo histológico do edema de pata foram realizadas biópsias das patas dos
animais dos grupos controle e dos grupos tratados. Ao término da 4ª hora do experimento de
edema de pata induzido por carragenina, os animais foram sacrificados, o músculo plantar foi
retirado para análise histológica e os fragmentos dos tecidos foram fixados, durante 48 horas,
em solução de formol neutro tamponado (pH 7,2) a 10%. Após fixação, os fragmentos foram
desidratados em soluções alcoólicas crescentes (70%, 80%, 90% e 100%). Posteriormente,
foram diafanizados em xilol e incluídos em parafina. Cortes histológicos seriados de 4µm de
espessura foram realizados em micrótomo de rotação e corados em hematoxilina-eosina (HE).
36
Juliana Cristina dos Santos Almeida
As lâminas foram analisadas com auxílio de luz binocular (Leica DM5000B). As
leituras das lâminas foram realizadas em três animais diferentes para cada grupo analisado e
as lesões microscópicas foram descritas de forma qualitativa, de acordo com a sua
manifestação. As imagens foram capturadas com auxílio do programa Leica Application
Suite.
4.13.5. Protocolo de anestesia
Para a realização da coleta das patas traseiras dos animais, os mesmos foram
anestesiados com 0,05 mL de cloridrato de Xilazina mais 0,05 mL de Ketamina (10mg/Kg)
injetados intraperitonialmente para a dissecação muscular e exposição do tórax. Após a coleta
de sangue e a retirada das patas posteriores, os animais, ainda anestesiados, foram
eutanaziados por exsanguinação ou por injeção intracardíaca de cloreto de potássio, quando
necessário.
4.14. Análises estatísticas
Os dados foram analisados estatisticamente pelo teste de variância a 5% de probabilidade
(ANOVA – one way) seguido pelo teste de Tukey e Dunnet, quando necessários, com grau de
significância p≤0,10.
37
Juliana Cristina dos Santos Almeida
RESULTADOS E DISCUSSÃO
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1. Identificação do material botânico
As plantas medicinais tem sido uma rica fonte para a obtenção de moléculas obtidas com
ação terapêutica. Para a obtenção dessas moléculas, vários passos são requeridos, começando
com a identificação correta e sistemática do material vegetal utilizado (identificação
botânica).
Para o desenvolvimento desse trabalho, a espécie utilizada foi Capsicum baccatum L.
(Figura 15) e o material testemunho foi depositado no Herbário Professor José Badini da
Universidade Federal de Ouro Preto sob a denominação: OUPR 23178 (figura 16).
A
B
C
Figura 15 – Capsicum baccatum L. A – folhas e frutos. B – flor. C – fruto maduro.
Fonte: Arquivo pessoal do pesquisador.
38
Juliana Cristina dos Santos Almeida
Figura 16 – Exsicata de Capsicum baccatum L. depositada no Herbário Professor José Badini –
UFOP sob registro OUPR23178. Fonte: Arquivo pessoal do pesquisador.
5.2. Caracterização morfo-anatômica dos frutos de Capsicum baccatum L.
A
caracterização
morfo-anatômica
tem
importância
particular
para
melhor
conhecimento de uma espécie. Portanto, após a identificação botânica de Capsicum baccatum
L., a caracterização morfológica e anatômica dos frutos foi realizada para melhor
conhecimento da parte utilizada para a preparação da formulação farmacêutica a ser testada.
Os frutos de Capsicum baccatum L. apresentaram-se do tipo baga, alongados, medindo
de 7 a 9 centímetros de comprimento e 4 a 5 cm de largura. O epicarpo é fino, liso e carnoso,
apresentando coloração vermelha no estádio final de maturação (Figura 17).
39
Juliana Cristina dos Santos Almeida
A
B
Figura 17 – Capsicum baccatum L. (Solanaceae). A – Frutos maduros, B – Comprimento médio do
fruto. Fonte: Arquivo pessoal do pesquisador.
As sementes foram encontradas num número médio de 72,25 ± 4,35 unidades por fruto,
numerosas e pequenas, arredondadas ou ligeiramente reniformes, angulosas com bordas
marginadas, de coloração creme e inseridas à placenta em um único ponto (Figura 18).
O pericarpo apresentou-se carnoso, de pouca espessura e com placenta pouco
aumentada, aderida no ápice e na porção basal do fruto com espaços inter-paredes (Figura
18).
Inserção da placenta
↘
Figura 18 – Corte longitudinal de fruto de Capsicum baccatum L.
Fonte: Arquivo pessoal do pesquisador.
Na análise microscópica o corte transversal da epiderme demonstrou camada
epidérmica de forma multisseriada, composta de até cinco camadas de células poliédricas
40
Juliana Cristina dos Santos Almeida
(Figura 19), destacando-se a presença de cutina sobre essas células (Figura 20). Presença de
tecido de expansão celular com 3 a 15 camadas, parênquima de preenchimento com mais de
10 camadas de células (Figura 19).
A
↘
C
↘
B
A
↘
↘
1
2
Figura 19 – Corte transversal do fruto de Capsicum baccatum L. (Solanaceae). 1 – Epiderme
multisseriada (A), tecido de expansão celular (B) e parênquima (C). Aumento de 10x. 2Epiderme multisseriada em detalhe. Aumento de 20x. Coloração com Azul de Alcian e Fucsina.
Fonte: Arquivo pessoal do pesquisador.
Cutina
↘
Figura 20 – Corte transversal do fruto de Capsicum baccatum L. Presença de cutina sobre as
células da epiderme. Aumento de 40x. Fonte: Arquivo pessoal do pesquisador.
A presença da cutina nas paredes celulares serve para reduzir a transpiração da espécie
vegetal, evitando a perda excessiva de água. Nas espécies de Capsicum baccatum, a camada
de cutina encontra-se presente nos frutos tendo como função preservar a alta concentração de
água encontrada nessa parte da planta.
41
Juliana Cristina dos Santos Almeida
As espécies do gênero Capsicum sintetizam e acumulam substâncias denominadas
capsaicinoides, um grupo de metabólitos responsáveis pela pungência característica das
pimentas. Esses capsaicinoides são metabolizados principalmente no tecido da placenta,
adjacente às sementes (MORÁN-BAÑUELOS, 2008).
O corte transversal do fruto de
Capsicum baccatum L. na presença de luz fluorescente azul e verde demonstrou a presença de
ráfides ou cristais aciculares no tecido de inserção da placenta, caracterizando a presença de
capsaicinoides nessa espécie (Figura 21).
Capsaicinóides
↘
Figura 21 – Corte transversal do fruto de Capsicum baccatum L. Cristais aciculares. Luz
fluorescente verde. Aumento de 10x. Em detalhe os cristais de capsaicinoides. Luz fluorescente
azul. Aumento de 40x. Fonte: Arquivo pessoal do pesquisador.
No corte paramétrico observa-se epiderme com células justapostas, a presença de
plastídeo (cromoplasto), poros escuros, entre células (Figura 22). Não foi observada a
presença de estômatos ou tricomas.
42
Juliana Cristina dos Santos Almeida
Poros entre células
↘
Figura 22 – Corte paramétrico da epiderme do fruto de Capsicum baccatum L. Células da
epiderme. Diafanização com solução de Cândida (hipoclorito de sódio a 20%). Aumento de 20x.
Fonte: Arquivo pessoal do pesquisador.
5.3. Caracterização histoquímica dos frutos de Capsicum baccatum L.
Os metabólitos secundários são produtos do metabolismo de espécies vegetais
responsáveis por grande parte das funções farmacológicas descritas na literatura. De acordo
com o British Herbal Compendium (2006), as espécies do gênero Capsicum apresentam uma
grande variedade de metabólitos secundários: capsaicinoides, carotenoides, flavonoides,
ácidos fenólicos, alcoóis, ácido ascórbico e uma fração volátil complexa. A caracterização
histoquímica dos frutos de Capsicum baccatum L. foi realizada a fim de verificar os principais
metabólitos secundários presentes nessa espécie.
5.3.1. Reação para caracterização de compostos fenólicos
Compostos fenólicos são substâncias antioxidantes primárias que agem como
sequestradores de radicais livres e bloqueadores de reações em cadeia (MOREIRA &
MANCINI-FILHO, 2004).
Os compostos fenólicos encontrados em plantas podem ser enquadrados em diversas
categorias: fenóis simples, ácidos fenólicos, cumarinas, flavonoides, estilbenos, taninos
condensáveis e hidrolisáveis, lignanas e ligninas (NACKZ & SHAHIDIFI, 2004).
43
Juliana Cristina dos Santos Almeida
A reação para compostos fenólicos gerais foi realizada na amostra de Capsicum
baccatum L. a fim de verificar a presença desses compostos nos frutos dessa espécie, para
posterior utilização como matéria-prima na fabricação da formulação.
Em cortes transversais de frutos verdes de Capsicum baccatum L. a reação simples para
a detecção de compostos fenólicos foi positiva, sendo os tecidos da placenta visualizados
enegrecidos, assim como inúmeros pontos nos tecidos parenquimáticos (Figura 23).
A
B
↘
↘
Figura 23 – Corte transversal de fruto de Capsicum baccatum L. A – controle em glicerina. B –
reação positiva com cloreto férrico. Aumento de 10x. Fonte: Arquivo pessoal do pesquisador.
A presença de compostos fenólicos em plantas tem sido muito estudada por
apresentarem atividades farmacológicas, por inibirem a proliferação de fungos e a oxidação
lipídica (SOARES, 2002).
5.3.2. Reação de caracterização para flavonoides
Os flavonoides pertencem à classe de polifenois incluindo as antocianidinas, flavonois,
flavanois, flavanonas e flavonas. Diversos efeitos biológicos estão associados à presença
desses metabólitos como: atividade antitumoral, antiulcerogênica, antiinflamatória e muitas
outras (COUTINHO et al., 2009).
44
Juliana Cristina dos Santos Almeida
Após o tratamento com o fluorocromo cloreto de alumínio, os cortes transversais dos
frutos verdes de Capsicum baccatum L. apresentaram fluorescência secundária, muito intensa,
de cor esverdeada na região da epiderme e em vários pontos dispersos do tecido
parenquimático indicando a presença dessa classe de metabólito secundário (Figura 24).
↘
↘
A
B
Figura 24 – Corte transversal de fruto de Capsicum baccatum. A – controle. B – reação positiva com
cloreto de alumínio. Aumento de 5x. Lâmpada GFP de fluorescência verde.
Fonte: Arquivo pessoal do pesquisador.
5.3.3. Reação para caracterização de lactonas sesquiterpênicas
Lactonas sesquiterpênicas são substâncias de grande ocorrência na natureza que
possuem amplo espectro de atividade biológica, dentre elas: atividade citotóxica, antitumoral,
antibacteriana, antiinflamatória, esquistossomicida, antimalárica e antifúngica (ARANTES,
2007).
Os cortes transversais dos frutos verdes da pimenta dedo-de-moça, após o tratamento
com ácido sulfúrico concentrado, evidenciaram o aparecimento de regiões com coloração
45
Juliana Cristina dos Santos Almeida
castanho-avermelhado caracterizando a presença de lactonas sesquiterpênicas nessa espécie
no estádio imaturo de desenvolvimento (Figura 25).
↘
A
B
Figura 25 – Corte transversal de fruto verde de Capsicum baccatum. A – controle em água. B - reação
positiva com ácido sulfúrico. Aumento de 20x. Fonte: Arquivo pessoal do pesquisador.
5.3.4. Reação para caracterização de taninos
Plantas ricas em taninos são empregadas na medicina tradicional no tratamento de
diversas moléstias, tais como: diarreia, hipertensão arterial, reumatismo, hemorragias, feridas,
queimaduras, problemas estomacais e problemas inflamatórios em geral (SIMÕES et al.,
2004).
Os cortes transversais confeccionados com os frutos verdes de Capsicum baccatum L.,
após o tratamento com vanilina clorídrica, desenvolveram coloração castanho avermelhada
caracterizando a reação positiva para essa classe (Figura 26).
46
Juliana Cristina dos Santos Almeida
↘
A
B
Figura 26 – Corte transversal de fruto verde de Capsicum baccatum L. A – controle em ácido clorídrico
9%. B - reação positiva com vanilina sulfúrica. Aumento de 20x. Fonte: Arquivo pessoal do pesquisador.
5.3.5. Reação para caracterização de alcalóides
Capsaicinoides é a denominação dada a um grupo de compostos presentes em
representantes do gênero Capsicum responsáveis pela maior parte das atividades biológicas
atribuídas a essas espécies (PERUCKA, 2000). Dentre as atividades biológicas apresentadas
pela capsaicina podem ser citadas a proteção contra processos carcinogênicos e mutagênicos
(SURH, 1997), atividade nematicida (NEVES, 2008), tratamento tópico da dor neuropática
(DOG, 2006), dentre outros.
Para a pesquisa de alcaloides foram realizados cortes transversais dos frutos verdes de
Capsicum baccatum L., posteriormente tratados com reagente de Dragendorff. O
desenvolvimento de coloração castanho-avermelhada caracterizou reação positiva para essa
classe (Figura 27).
47
Juliana Cristina dos Santos Almeida
↘
A
B
Figura 27 – Corte transversal de fruto verde de Capsicum baccatum L. A – controle em água. B - reação
positiva com reagente de Dragendorff. Aumento de 20x. Fonte: Arquivo pessoal do pesquisador.
5.3.6. Reação para caracterização de mucilagem
Mucilagens são constituintes naturais do vegetal que possuem como função reter água.
Essa atividade explica o uso dessas substâncias como laxativas e antidiarreica (SIMÕES et
al., 2004).
Os cortes transversais dos frutos verdes de Capsicum baccatum L. foram tratados com
ácido tânico 5% e cloreto férrico 3% desenvolvendo coloração enegrecida nos locais onde
havia a presença de mucilagens (Figura 28).
48
Juliana Cristina dos Santos Almeida
↘
A
B
Figura 28 – Corte transversal de fruto verde de Capsicum baccatum L. A – controle em cloreto férrico. B reação positiva para ácido tânico 5% e cloreto férrico 3% . Aumento de 20x. Fonte: Arquivo pessoal do
pesquisador.
Após a análise histoquímica dos frutos verdes de Capsicum baccatum L. pôde-se
observar a presença de diversos metabólitos secundários: compostos fenólicos, flavonoides,
taninos, alcaloides, mucilagens e lactonas sesquiterpênicas, responsáveis por diversas
atividades biológicas associadas às plantas. Portanto, essa espécie é uma fonte potencial de
estudo para o desenvolvimento de novos medicamentos.
5.4. Determinação de massa fresca, massa seca, porcentagem de água e de cinzas totais
dos frutos de Capsicum baccatum L.
As plantas medicinais são a matéria-prima para a produção de medicamentos
fitoterápicos. Para que a qualidade de uma formulação fitoterápica possa ser assegurada, é
imprescindível que o material a ser utilizado em sua fabricação esteja em condições
adequadas de qualidade. A fim de assegurar a qualidade do material a ser utilizado para o
desenvolvimento da formulação-teste foram realizados os testes de perda de água e cinzas
totais.
49
Juliana Cristina dos Santos Almeida
Os resultados obtidos para a determinação de água e de cinzas totais estão expressos na
tabela a seguir (Tabelas 1):
Tabela 1 – Concentração média de massa fresca, massa seca, perda de água e cinzas totais
de frutos imaturos (verdes) de Capsicum baccatum L.
Tratamento
Média (g)
Porcentagem
Massa fresca
5,03
-
Massa seca
0,56
-
Perda de água
4,47
88,89
Cinzas Totais
0,58
19,27
A secagem dos frutos de Capsicum baccatum L., em estufa de circulação de ar, com
temperaturas do ar de 40ºC ± 5ºC, apresentaram, em média, 4,47 ± 0,04g perda de água que
corresponde a 88,89 ± 0,82% do peso inicial. Esses valores demonstram a grande quantidade
de água presente nesses frutos sem, entretanto, ultrapassar os limites especificados pela
Farmacopéia Japonesa – 14ª edição (2001), demonstrando também a efetividade do processo
utilizado para a secagem do material vegetal.
O teor de cinzas totais dos frutos de Capsicum baccatum L. apresentou valores de 0,58
± 0,03g que corresponde a 19,27 ± 1,20%, demonstrando que a quantidade de substância
residual não-volátil (cinzas fisiológicas de tecido vegetal e material estranho; cinzas nãofisiológicas como areia e terra) estão dentro dos limites especificados pela Farmacopeia
Japonesa – 14ª edição (2001). Esses valores indicam que o material vegetal utilizado
apresenta baixa porcentagem de substâncias inorgânicas (areia, terra) e interferentes de outros
materiais vegetais.
Os resultados acima representados indicam que os frutos analisados estão em
conformidade com os testes de determinação de água e de cinzas totais determinados para a
espécie Capsicum baccatum L. Isso demonstra que o material vegetal coletado apresenta boa
50
Juliana Cristina dos Santos Almeida
qualidade para ser utilizado como matéria-prima na fabricação de uma formulação
fitoterápica.
5.5. Preparo dos extratos
O processo de extração consiste num passo crucial para a fabricação de um extrato. O
método utilizado para a fabricação do extrato acetônico dos frutos de Capsicum baccatum L.
foi a maceração exaustiva por ser um método simples e efetivo.
A acetona foi escolhida como líquido extrator por ser um solvente de caráter apolar,
assim como a principal substância de interesse, a capsaicina.
O rendimento dos extratos acetônicos nos três estádios de maturação dos frutos de
Capsicum baccatum L. foram mensurados através do método de Gravimetria (Farmacopeia
Brasileira – 4ª edição, 1988), tomando como base 10g de frutos para cada estádio de
maturação (Tabela 2).
Tabela 2 – Rendimento dos extratos acetônicos produzidos a partir de 10g dos frutos de
Capsicum baccatum L. em três estádios de maturação
Estádios de maturação
Rendimento extrato
acetônico
Imaturo
0,19g
Intermediário
0,99g
Maduro
0,38g
O solvente orgânico acetona mostrou ser eficaz para realizar a extração de substâncias
dos frutos de Capsicum baccatum L. Dos três estádios de maturação analisados, o estádio
intermediário foi o que promoveu o maior rendimento (0,99g) de material extraído com
acetona. O estádio imaturo foi o que proporcionou o menor rendimento (0,19g) de material
extraído em acetona. Portanto, a extração com acetona no estádio intermediário de maturação
51
Juliana Cristina dos Santos Almeida
mostrou ser o processo mais efetivo para a extração de substâncias nos frutos de Capsicum
baccatum L.
5.6. Screening fitoquímico
A screening fitoquímico de plantas medicinais consiste numa estratégia alternativa para
a procura de agentes terapêuticos. Com o intuito de verificar a presença dos principais grupos
de metabólitos responsáveis pelas ações biológicas do extrato acetônico dos frutos verdes de
Capsicum baccatum L. foram realizados testes de triagem fitoquímica. Os grupos de
metabólitos analisados foram alcaloides, flavonoides, terpenos e triterpenos.
O padrão escolhido para o desenvolvimento da cromatografia em camada delgada foi a
capsaicina, por ser uma das moléculas responsáveis pela ação biológica de espécies do gênero
Capsicum. Os valores dos fatores de retenção (Rfs) para a capsaicina e as amostras estão
demonstrados na tabela abaixo (Tabela 3).
Tabela 3 – Valores do fator de retenção (Rf) de capsaicina em extratos acetônicos de
Capsicum baccatum L. em três diferentes estádios de maturação
Estádios de maturação
Rf
Rf
padrão capsaicina
extrato acetônico
Imaturo
0,328
0,325
Intermediário
0,317
-
Maduro
0,318
-
52
Juliana Cristina dos Santos Almeida
↘
↘
capsaicina
↘
↘
Figura 29 – Placa cromatográfica do extrato acetônico de frutos maduros de Capsicum baccatum L. após a
revelação com Reagente de Dragendorff. Em destaque o padrão de capsaicina e a presença dessa
substância nos extratos. Fonte: Arquivo pessoal dos pesquisadores.
Em dois estádios de maturação (intermediário e maduro) não foram observadas bandas
na cromatografia em camada delgada realizada dos extratos acetônicos que correspondessem
à capsaicina (Figura 29). Esse fato pode ter ocorrido pela quantidade insuficiente de extrato
utilizada durante a cromatografia, pela inexistência ou menor concentração dessa substância
nos estádios de maturação especificados.
No estádio imaturo de maturação, foram detectadas bandas cromatográficas com valores
de Rf semelhantes ao padrão aplicado (diferença menor que 0,05) em três das quatro
repetições realizadas dos extratos acetônicos, caracterizando a presença desse capsaicinoide
nesse estádio.
Segundo TOPUZ & OZDEMIR (2007) a concentração de metabólitos secundários
encontrados em espécies de Capsicum sofre influência do genótipo e do grau de maturação
dos frutos.
Os componentes responsáveis pelo sabor e pela pungência das pimentas do gênero
Capsicum são sintetizados pela via do ácido cinâmico e eles são degradados, conforme a
maturação, por ação das enzimas peroxidases. A concentração de capsaicina nos frutos das
53
Juliana Cristina dos Santos Almeida
espécies do gênero Capsicum, dentre elas a espécie Capsicum baccatum L. aumenta com a
maturidade dos frutos, sofrendo um rápido decréscimo no estádio maduro. Isso ocorre devido
à presença da enzima peroxidase na placenta dos frutos (CONTRERAS-PADILLA, 1998).
Portanto, a presença da capsaicina na placa cromatográfica do extrato acetônico de
pimenta dedo-de-moça no estádio imaturo e a ausência nos demais estádios, colabora para
reforçar os dados encontrados na literatura.
Os terpenos são metabólitos secundários de plantas cuja origem biossintética seja
derivada de unidades do isopreno (PASSOS et al., 2009).
Muitos derivados monoterpênicos, dentre eles o linalol, limoneno e citronelol possuem
ação anticonvulsivante e antinoceptiva (PASSOS et al., 2009).
O timol é um composto fenólico derivado do fenilpropano que apresenta propriedades
carminativas,
anti-espasmódica,
antisséptica,
expectorante
e
antiinflamatória
(BRECKENFIELD et al., 2005).
Saponinas são glicosídeos de esteróides ou de terpenos policíclicos. Este tipo de
estrutura determina a propriedade de redução da tensão superficial da água e sua ação
detergente e emulsificante (LÓPEZ, 2010).
Tabela 4 – Valores de Rf do timol em extratos em acetona de Capsicum baccatum L. em
três diferentes estádios de maturação
Estádios de maturação
Rf
Rf
padrão timol
extrato acetônico
Imaturo
0,502
0,502
Intermediário
0,502
0,500
Maduro
0,573
0,568
54
Juliana Cristina dos Santos Almeida
Tabela 5 – Valores de Rf do linalol em extratos em acetona de Capsicum baccatum L. em
três diferentes estádios de maturação
Estádios de maturação
Rf
Rf
padrão linalol
extrato acetônico
Imaturo
0,325
0,354
Intermediário
0,390
0,390
Maduro
0,450
0,446
Tabela 6 – Valores de Rf do saponina em extratos em acetona de Capsicum baccatum L.
em três diferentes estádios de maturação
Estádios de maturação
Rf
Rf
padrão saponina
extrato acetônico
Imaturo
0,753
0,753
Intermediário
0,760
0,763
Maduro
0,768
0,770
As placas cromatográficas contendo os extratos nos três estádios de maturação
apresentaram bandas alinhadas com os três padrões utilizados, indicando a presença de
compostos nos extratos com cadeia fechada, anel aromático e com cadeia lateral ramificada,
correspondentes às bandas das saponinas, do timol e linalol, respectivamente. Logo, há
presença de terpenos e triterpenos nessa amostra de pimenta dedo-de-moça nos estádios
imaturo, intermediário e maduro. No entanto, não se pode afirmar que os terpenos
encontrados no extrato acetônico dos frutos verdes de Capsicum baccatum L. são o timol e o
linalol por serem produtos altamente voláteis e degradados a altas temperaturas, como a usada
para o processo de concentração do extrato.
Os flavonoides são compostos fenólicos biossintetizados a partir da via dos
fenilpropanoides, presentes entre os metabólitos secundários dos vegetais.
55
Juliana Cristina dos Santos Almeida
A quercetina é um flavonoide abundante na natureza, podendo ser encontrado em
muitas plantas, tais como: cebola, brócolis e pimentas (MARTINEZ, 2008). Portanto, esse
flavonoide foi o escolhido como padrão para o desenvolvimento da cromatografia em camada
delgada dos extratos de Capsicum baccatum L. nos três estádios de maturação (Tabela 7).
Tabela 7 – Valores de Rf da quercetina em extratos acetônicos de Capsicum baccatum L.
em três diferentes estádios de maturação
Estádios de maturação
Rf
Rf
padrão quercetina
extrato acetônico
Imaturo
0,41
0,37
Intermediário
0,46
0,45
Maduro
0,41
0,39
A detecção de bandas amareladas reveladas com vanilina sulfúrica indica a presença de
compostos da subclasse dos flavonois, que são flavonoides oxigenados, substituídos com
hidroxilas e/ou metoxilas, nos extratos acetônicos de Capsicum baccatum L. nos três estádios
de maturação. Dentre os flavonois, podem ser citados a quercetina, miracetina e kaempferol
(BEHLING et al., 2004).
Vários estudos demonstram a presença de flavonoides em espécies de pimenta do
gênero Capsicum, sendo os mais citados quercetina e miricetina (KAPPEL, 2007).
Portanto, a presença da quercetina na placa cromatográfica do extrato acetônico de
pimenta dedo-de-moça nos três estádios de maturação, colabora para reforçar os dados
encontrados na literatura.
56
Juliana Cristina dos Santos Almeida
5.7. Quantificação de capsaicina nos extratos orgânicos obtidos dos frutos de Capsicum
baccatum L. em três estádios diferentes de maturação
As espécies do gênero Capsicum são caracterizadas pela presença de um grupo de
substâncias conhecidas como capsaicinoides. Os capsaicinoides são substâncias derivadas de
compostos fenilpropanoides que apresentam diversidade química e estrutural. Dos
capsaicinoides
conhecidos,
podem
ser
citados
a
capsaicina,
dihidrocapsaicina
e
nordihidrocapsaicina. Desses, a capsaicina é responsável por 90% da pungência e das
atividades biológicas apresentadas pelo gênero (PERUCKA, 2000). Por esse motivo, a
capsaicina foi quantificada nos três estádios de maturação dos frutos de Capsicum baccatum
L. a fim de determinar em qual estádio de maturação ela encontra-se em maior quantidade.
Para que a capsaicina fosse quantificada com efetividade e segurança, tornou-se
necessário validar a metodologia utilizada. A validação do método de quantificação da
capsaicina por CLAE consistiu nas etapas: detecção no ultravioleta (UV), linearidade, limite
de quantificação, precisão, exatidão e robustez. Para isso, o sistema cromatográfico utilizado
foi Waters Alliance 2695, detector Waters UV-visível 2996, coluna C18 Waters Symmetry
(150mmx4,6mmx5um), comprimento de onda 281nm, temperatura 30ºC, fluxo 1mL/min.,
volume de injeção 50µL e concentração da capsaicina padrão 16µg/mL.
Os resultados encontrados indicaram que a capsaicina absorve luz ultravioleta no
comprimento de onda de 280,4nm (Figura 30) e que a fase móvel mais eficaz para sua
eluição, que apresente um pequeno tempo de retenção e uma boa resolução foi
acetonitrila:água (60:40) (Figura 31).
57
Juliana Cristina dos Santos Almeida
Intensidade ultravioleta (AU)
Absorbância (nm)
Figura 30 – Espectro de absorção da capsaicina na luz ultravioleta visível. Padrão de capsaicina. Fase
móvel acetonitrila: água (60:40) e detector UV-visível Waters 2996. Fonte: Arquivo pessoal do
pesquisador.
0,18
capsaicina
Absorbância (281 nm)
0,16
0,14
0,12
0,10
0,08
0,06
0,04
0,02
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
3,50
4,00
4,50
5,00
5,50
6,00
6,50
7,00
Tempo (minutos)
Figura 31 – Cromatograma do padrão de capsaicina. Fase móvel acetonitrila: água (60:40) e detector
UV-visível Waters 2996. Fonte: Arquivo pessoal do pesquisador.
Para a construção da linearidade, o padrão de capsaicina foi eluído nas concentrações de
10, 25, 50, 100, 200, 400 e 500µg/mL (Figura 32), obtendo a equação da reta y = 27,652x +
16,313 e o coeficiente de determinação de r2 foi de 0,9996.
58
Juliana Cristina dos Santos Almeida
0,90
0,80
Absorbância (281nm)
0,70
0,60
0,50
0,40
0,30
0,20
0,10
0,00
3,00
3,20
3,40
3,60
3,80
4,00
4,20
4,40
4,60
4,80
5,00
5,20
5,40
5,60
5,80
6,00
Tempo (minutos)
Figura 32 – Espectro de absorção da capsaicina na luz ultravioleta visível. Padrão de capsaicina nas
concentrações de 10, 25, 50, 100, 200, 400 e 500µg/mL. Fase móvel acetonitrila: água (60:40) e detector
UV-visível Waters 2996. Fonte: Arquivo pessoal do pesquisador.
O método desenvolvido foi considerado linear por apresentar valor de r2= 0,9996 e
apresentou valores de exatidão de 92,09% a 103,39% e de precisão de 0,46% a 10,10%.
Depois da validação da metodologia empregada, a concentração de capsaicina nos três
estádios de maturação da pimenta dedo-de-moça foi quantificada (Tabela 8).
Tabela 8 – Concentrações médias de capsaicina nos extratos acetônicos de Capsicum
baccatum L. em três diferentes estádios de maturação
Estádios de maturação
Imaturo
Intermediário
Maduro
Concentração de capsaicina (µg/mL)
60,51*
60,80*
55,53
Os resultados foram submetidos à análise de variância (ANOVA – one way) com grau
de significância p≤0,05, considerando estatisticamente iguais as concentrações de capsaicina
59
Juliana Cristina dos Santos Almeida
nos estádios imaturo e intermediário de maturação, sendo a concentração deste metabólito
inferior no estádio maduro.
A concentração de capsaicina nos frutos das espécies do gênero Capsicum, dentre elas a
espécie Capsicum baccatum L. aumenta com a maturidade dos frutos, sofrendo um rápido
decréscimo no estádio maduro. Isso ocorre devido à presença da enzima peroxidase na
placenta dos frutos (CONTRERAS-PADILLA, 1998).
Portanto, a menor concentração de capsaicina no estádio maduro dos frutos de
Capsicum baccatum L. é encontrada devido à degradação desse metabólito durante a
maturação dos frutos.
A concentração de capsaicina encontrada no extrato acetônico dos frutos imaturos de
Capsicum baccatum L. são superiores àquele encontrado no estádio maduro, confirmando os
dados encontrados na literatura.
5.8. Quantificação dos constituintes fenólicos totais
Compostos fenólicos são substâncias altamente reativas quimicamente, responsáveis por
uma grande variedade de ações biológicas em plantas utilizadas com fins medicinais. Além de
contribuírem no sabor, odor e na coloração de diversos vegetais, possuem atividade
antioxidante pronunciada, atividade antibacteriana e antiviral, inibição da 5-lipoxigenase
(SIMÕES et al., 2004). Portanto, são compostos que se destacam por produzir atividade
farmacológica em um grande número de espécies vegetais.
Determinar os níveis de compostos fenólicos em tecidos vegetais constitui a etapa
inicial de qualquer pesquisa de atividade fisiológica, visando a prevenção e tratamento de
doenças. A capacidade redutora desses compostos pode ser utilizada para direcionar a
quantificação inicial (FURLONG et al., 2003).
60
Juliana Cristina dos Santos Almeida
Para determinação dos compostos fenólicos nos três estádios de maturação (imaturo,
intermediário e maduro) dos frutos de Capsicum baccatum L. foi construída a curva de
calibração.
A curva de calibração de compostos fenólicos foi construída com o ácido tânico em
concentrações de 20, 30, 40, 50 e 60µg/mL. Para cada ponto foram realizadas quatro
replicatas (Figura 33).
Curva de Calibração de compostos fenólicos
Absorvância 265nm
0.5
r2= 0,991
y = 0,007x - 0,003
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
0
20
40
60
80
Concentração ácido tânico (µ
µ g)
Figura 33 – Curva de calibração de compostos fenólicos. Padrão ácido tânico.
Fonte: Arquivo pessoal do pesquisador.
O método apresentou-se linear caracterizado por equação da reta y = 0,007x – 0,003 e
coeficiente de determinação r2= 0,991.
Os valores encontrados para a concentração de compostos fenólicos em extratos
acetônicos dos frutos de Capsicum baccatum L. em diferentes estádios de maturação foram
submetidos à análise de variância (ANOVA – one way) com grau de significância para p≤0,05
e estão representados na tabela abaixo (Tabela 9).
61
Juliana Cristina dos Santos Almeida
Tabela 9 – Valores médios da concentração de compostos fenólicos em extratos em
acetona de Capsicum baccatum L. em três diferentes estádios de maturação
Estádios de maturação
Peso
Absorbância
Concentração Compostos
(g)
(765nm)
Fenólicos (µg/mg de amostra)
Verde
0,0023
0,304
39,83*
Intermediário
0,0021
0,175
21,67
Maduro
0,0021
0,239
31,67
* Diferença significativa com relação aos outros grupos após análise de variância (ANOVA)
O extrato acetônico dos frutos de Capsicum baccatum L. no estádio imaturo, obtido
pelo método de maceração exaustiva, foi o que apresentou a maior concentração de
compostos fenólicos (39,83µg/mg de amostra), sendo estatisticamente superior e diferente da
concentração encontrada nos estádios intermediário e maduro.
As pimentas do gênero Capsicum apresentam uma diversidade de compostos químicos
conhecidos como compostos fenólicos, dos quais podem ser destacados os flavonoides,
capsaicinoides, ácidos fenólicos, dentre outros (KAPPEL, 2007).
A maior concentração de compostos fenólicos no extrato acetônico produzido a partir
dos frutos imaturos de Capsicum baccatum L. é justificada pela maior concentração de
capsaicina nesse estádio de maturação e a presença do flavonoide quercetina. Esses dados
confirmam o resultado de vários estudos que encontraram mudança na composição química
influenciada pelo processo de maturação em espécies do gênero Capsicum (DEEPA et al.,
2006, KAPPEL, 2007, MÓRAN-BAÑUELOS, 2008).
62
Juliana Cristina dos Santos Almeida
5.9. Atividade antioxidante
A oxidação nos sistemas biológicos ocorre devido à ação dos radicais livres ou espécies
reativas de oxigênio (ERO) no organismo. Elas podem ser geradas por fontes endógenas e
exógenas. Por fontes endógenas, originam-se de processos biológicos normalmente do
organismo, tais como: redução da flavinas e tióis; resultado da atividade de oxidases,
ciclooxigenases, lipoxigenases, desidrogenases e peroxidases, presença de metais de transição
no interior da célula e de sistemas de transporte de elétrons (SOARES, 2002).
Muitas doenças e processos degenerativos podem ser associados ao aumento na
produção das ERO no organismo, podendo ser incluídos: inflamação, isquemia cerebral,
mutagênese, câncer, demência e processos relacionados à idade fisiológica (SAVEGNAGO,
2006).
Antioxidantes fenólicos funcionam como seqüestradores de radicais livres e algumas
vezes como quelantes de metais, agindo tanto na etapa de iniciação como na propagação do
processo oxidativo (SOARES, 2002).
A atividade antioxidante dos extratos acetônicos nos estádios imaturo, intermediário e
maduro apresentou valor médio de 72,90 ±1,52%. O padrão butilhidroxianisol (BHA) nas
concentrações de 5, 10, 25, 50 e 75µg/mL, demonstrou valores de atividade antioxidante
estatisticamente igual à atividade antioxidante dos extratos acetônicos de Capsicum baccatum
L. no estádio imaturo nas concentrações de 5, 10, 25, 50 e 75µg/mL. Os demais extratos
acetônicos nos estádios intermediários e maduro apresentaram valores inferiores ao padrão e
ao extrato acetônico imaturo (Figura 34).
63
Juliana Cristina dos Santos Almeida
ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DOS EXTRATOS ACETÔNICOS DA PIMENTA
DEDO-DE-MOÇA EM TRÊS ESTÁDIOS DE MATURAÇÃO
Atividade antioxidante (% inibição)
100
90
BHA
IMATURO
80
INTERMEDIÁRIO
MADURO
*
*
*
*
*
70
60
0
20
40
60
80
Concentração dos extratos de pimenta dedo-de-moça (µ
µ g/mL)
Figura 34 – Atividade antioxidante de extratos acetônicos dos frutos de Capsicum baccatum L. em três
estádios diferentes de maturação (imaturo, intermediário e maduro). * Significativo após análise de
variância (ANOVA) seguida do Teste de Tukey a 5% de significância (p<0,05)
A quercetina apresenta um potente efeito antioxidante, combinando-se com espécies de
radicais livres para formar radicais fenoxi menos reativos (MARTINEZ, 2008).
Os capsaicinoides, dentre eles a capsaicina, possui atividade antioxidante (TOPUZ et
al., 2007, MORÁN-BAÑUELOS et al., 2008) e antibacteriana contra um grupo de bactérias
(TOPUZ et al., 2007).
A miricetina é um composto polifenólico com propriedades antioxidantes. Miricetina
tem sido reportada por ter diversas aplicações terapêuticas como anticâncer, antivírus,
antimicrobiano, antiagregante plaquetário e citoproteção (TIWARI et al., 2009).
Uma correlação positiva entre a maior concentração de capsaicina, a presença de
flavonóides (quercetina) e a alta concentração de compostos fenólicos no extrato acetônico
produzido a partir dos frutos imaturos de Capsicum baccatum L. e a atividade antioxidante in
vitro foi verificada. Esta correlação demonstrada foi semelhante à encontrada em outros
extratos ricos em polifenois, sugerindo que os compostos fenólicos poderiam ser os
responsáveis pela atividade antioxidante destes extratos (KAPPEL, 2007). No entanto, cabe
64
Juliana Cristina dos Santos Almeida
ressaltar que por se tratar de um extrato bruto as propriedades encontradas podem ser devido
ao sinergismo dos diversos compostos presentes no extrato.
5.10. Determinação da bioletalidade frente a Artemia salina Leach
A utilização de bioensaios para o monitoramento da bioatividade de extratos, frações e
substâncias isoladas de plantas tem sido frequentemente incorporada à pesquisa fitoquímica.
Dentre estes ensaios biológicos destaca-se o ensaio de bioletalidade frente a Artemia salina
Leach (NOLDIN et al., 2003).
Artemia salina Leach é um crustáceo da classe Anostracea, que vive em águas salinas
e salobras de todo o mundo. Possui 4 estágios de desenvolvimento (ovo, náuplio, metanáuplio
e adulto) e alguns mecanismos de adaptação que as tornam cosmopolitas, como a
osmorregulação, a presença de pigmentos respiratórios como a hemoglobina e a
disponibilidade de alternativas reprodutivas que facilitam a dispersão e a perpetuação dessa
espécie. Essa espécie é amplamente conhecida como indicador de toxicidade de substâncias
químicas, pesticidas, poluentes em um bioensaio (Brine Shrimp Test), utilizando-se a
Concentração Letal Média (CL50) como parâmetro de avaliação da atividade biológica
(LOPES, 2007).
O extrato acetônico dos frutos imaturos de Capsicum baccatum L. não causaram
letalidade em larvas de Artemia salina L. nas concentrações de 10 e 100µg/mL. Na
concentração de 1000 µg/mL do extrato acetônico dos frutos imaturos de Capsicum baccatum
L. houve uma letalidade de 20%.
Os resultados obtidos no ensaio de Artemia salina L. indicam uma baixa toxicidade do
extrato testado nesta espécie, uma vez que o extrato acetônico mostrou toxicidade na
concentração de 1000µg/mL.
65
Juliana Cristina dos Santos Almeida
A toxicidade com Artemia salina mostra boa correlação com atividades antitumoral,
inseticida e anti-Trypanosoma cruzi para substâncias com Concentração letal média menores
do que 1000 µg/mL (RUIZ et al., 2005). Por outro lado, uma baixa toxicidade pode ser
interessante para a utilização de extratos vegetais no desenvolvimento de novas formulações
terapêuticas, não deixando de levar em consideração a necessidade de maiores estudos para
avaliar a toxicidade em humanos.
5.11. Teste antifúngico
As leveduras do gênero Candida têm grande importância pela alta frequência com que
colonizam e infectam o hospedeiro humano. Espécies de Candida são encontradas no tubo
gastrintestinal em 20% a 80% da população adulta saudável. Esses microorganismos
comensais tornam-se patogênicos caso ocorram alterações nos mecanismos de defesa do
hospedeiro ou o comprometimento de barreiras anatômicas secundariamente a queimaduras
ou procedimentos médicos invasivos (COLOMBO & GUIMARÃES, 2003).
As espécies de Candida são as leveduras mais usualmente envolvidas na etiologia de
infecções micóticas. A candidíase caracteriza-se como a infecção fúngica mais comum sendo
Candida albicans seu agente etiológico mais freqüente. Outras espécies, tais como: Candida
tropicallis, Candida krusei, Candida parapsilosis também podem estar relacionadas à
incidência de candidíase (LIMA, 2006). Atualmente são conhecidas cerca de dezessete
espécies de Candida causadoras de micoses superficiais ou invasivas em seres humanos
(COLOMBO & GUIMARÃES, 2003).
Os quadros clínicos mais rotineiramente reportados à candidíase são a do tipo cutâneomucosa, sistêmica/visceral e alérgica (LIMA et al., 2006).
A infecção por Candida sp produz um quadro diverso de processos infecciosos e
inflamatórios, podendo ser citados: glossite rombóide, lesões bucais (SPOLIDORIO, 2003),
66
Juliana Cristina dos Santos Almeida
inflamações vaginais (RIBEIRO, 2007), infecções de pele e mucosa (COLOMBO &
GUIMARÃES, 2003). Portanto, é de grande interesse terapêutico uma formulação que possua
atividade antiinflamatória e antifúngica frente a microorganismos do gênero Candida.
Os pacientes imunocomprometidos apresentam maior probabilidade de serem
acometidos por infecções fúngicas, como os indivíduos portadores de leucemia, linfoma,
diabetes mellitus e síndrome da imunodeficiência adquirida (LIMA et al., 2006). Trabalhos
demonstram que a presença de Candida sp aumenta a severidade de displasias bucais
(SPOLIDORIO et al., 2003).
Nos últimos anos, vem aumentando o número de infecções invasivas causadas por
espécies de Candida não albicans (COLOMBO & GUIMARÃES, 2003).
Atualmente, no mercado farmacêutico existe uma vasta gama de medicamentos para o
tratamento de infecções micóticas, dentre eles podem ser citados os antisépticos (tintura de
iodo, violeta genciana, ácido salicílico e benzóico, quinonas, compostos azóis (cetoconazol,
fluconazol, miconazol) e os compostos de selênio e anfotericina B. Entretanto, as infecções
fúngicas são de difícil tratamento devido à resistência adquirida pelos microorganismos frente
aos agentes antimicóticos (LIMA, 2006). Portanto, torna-se interessante o estudo de uma
substância que possa auxiliar ou efetivamente tratar quadros de infecções fúngicas,
principalmente aqueles causados por espécies do gênero Candida.
A avaliação quantitativa da atividade antifúngica (determinação da Concentração
Inibitória Mínima – CIM) demonstrou que o extrato bruto em acetona dos frutos de pimentade-moça (Capsicum baccatum L.) verde tem atividade contra C. albicans, C. tropicalis na
concentração média de 128µg/mL, não sendo efetivo para C. parapsilosis e C. krusei nas
concentrações analisadas.
Os resultados obtidos in vitro mostraram que o extrato bruto acetônico de pimenta dedode-moça verde (Capsicum baccatum L.) demonstrou capacidade moderada de inibir o
67
Juliana Cristina dos Santos Almeida
crescimento de espécies Candida, podendo auxiliar ou promover o tratamento da candidíase
provocada por Candida albicans e Candida tropicalis.
Candida albicans é espécie mais associada a diversos quadros patológicos relacionados
a infecções superficiais e invasivas em diferentes sítios anatômicos. Esta espécie é
naturalmente a sensível a uma gama grande de antifúngicos, entretanto casos de resistência
têm sido associados ao uso prolongado de azólicos (COLOMBO & GUIMARÃES, 2003).
Candida tropicalis constitui um agente oportunista em casos de neoplasias, sendo sua
freqüência maior em leucemias e menor em tumores sólidos. Em países da América Latina,
principalmente o Brasil, está espécie é extremamente freqüente. Candidíase sistêmica com
lesões de pele são principalmente devido à presença de Candida tropicalis (COLOMBO &
GUIMARÃES, 2003).
Vários compostos químicos presentes em plantas medicinais são responsáveis pela
atividade antimicrobiana das espécies com essas propriedades, tais como: saponinas (LÓPEZ,
2010), flavonoides, taninos, terpenos, sesquiterpenos (TAJKARIMI et al., 2010) e alcaloides
(DOG, 2006).
O mecanismo de ação sugerido para a atividade antifúngica das saponinas é sua
interação com os esteróis da membrana fúngica (LÓPEZ, 2010).
Segundo Kappel (2007) os capsaicinoides, compostos encontrados nas pimentas do
gênero Capsicum, além de serem responsáveis pela pungência dessas espécies, apresentam
atividades antimicrobiana, antioxidante, anticâncer e analgésica.
Portanto, a resposta biológica apresentada pelo extrato acetônico dos frutos imaturos de
Capsicum baccatum L., provavelmente está associada à presença em sua composição química
de um complexo de metabólitos secundários, tais como: taninos, flavonoides, capsaicinoides
(capsaicina), saponinas e terpenos. Essas substâncias, presentes em associação no extrato
estudado, apresentam um sinergismo de ação antifúngica frente às espécies de Candida
68
Juliana Cristina dos Santos Almeida
albicans e Candida tropicalis podendo abrir perspectivas no sentido de desenvolver um
fitoterápico eficaz e de baixo custo.
5.12. Desenvolvimento da formulação farmacêutica
Para o desenvolvimento da formulação-teste foram levados em consideração todos os
parâmetros avaliados para os três estádios de maturação dos frutos de Capsicum baccatum L.
que influenciam nas atividades biológicas. Portanto, o extrato acetônico dos frutos no estádio
imaturo de desenvolvimento foi o escolhido por apresentar baixa toxicidade frente à Artemia
salina L. (20% na concentração de 1000µg/mL do extrato), alta atividade antioxidante (71,6%
de atividade sequestrante), alta concentração de compostos fenólicos (39,8 µg/mg de
amostra); demonstrar a presença de metabólitos importantes nos efeitos terapêuticos
desejados (capsaicina, flavonoides, terpenos e triterpenos), concentração de capsaicina maior
do que nos demais estádios de maturação (60,51 µg/mL) e por ainda apresentar atividade
antifúngica na concentração de 128 µg/mL frente aos microrganismos Candida parapsilosis e
Candida krusei, que são microrganismos associados a vários quadros inflamatórios.
A formulação farmacêutica foi desenvolvida sob a forma de xarope. Xarope é uma
solução aquosa concentrada de açúcar ou de outra substância que o substitua, com ou sem
acréscimo de flavorizantes e princípios ativos, que possui dentre outras vantagens, a
propriedade de mascarar substâncias com sabor desagradável (ANSEL, 2000).
A capsaicina presente no extrato acetônico de Capsicum baccatum L., possui como uma
de suas características a pungência. Portanto, uma formulação contendo essa substância
possui ardor muito intenso, que deve ser minimizado pela presença de componentes utilizados
na forma farmacêutica. Uma dessas alternativas é a utilização de mel em formulações de
xarope.
69
Juliana Cristina dos Santos Almeida
A base do xarope foi formulada com as seguintes substâncias: açúcar, água e mel. A
formulação-base do xarope foi fabricada pela dissolução com aquecimento (ANSEL, 2000),
sendo o extrato acetônico de Capsicum baccatum L. em estádio imaturo acrescentado à
temperatura ambiente sob agitação manual vigorosa.
A viscosidade da formulação foi determinada no viscosímetro Viscotester 6
L
(Thermo
Rhaake) numa rotação de 30 rotações/minuto (RPM) com fuso L1 a 60,7%.
Para a determinação do pH do xarope foi utilizado o aparelho à temperatura de 25ºC.
A densidade foi determinada pelo método do picnômetro, segundo a Farmacopéia
Brasileira – 4ª edição (1988), a uma temperatura de 25ºC.
A determinação da concentração de capsaicina na formulação foi realizada através da
metodologia validada para Cromatografia Líquida de Alta Eficiência descrita na página 30.
Os parâmetros físico-químicos estabelecidos para a formulação estão representados na
tabela abaixo (Tabela 10).
Tabela 10 – Parâmetros físico-químicos do xarope contendo extrato em acetona de
Capsicum baccatum L. no estádio imaturo (verde)
Parâmetros físicos-químicos
Valores
Concentração de capsaicina
59,92 µg/mL
Densidade
1,36 mg/mL
pHmetro
6,5
Viscosidade
121mPas
Portanto, a formulação final apresentou aspecto fluido, com pH ácido, densidade de
1,36mg/mL e concentração de capsaicina de 59,92µg/mL.
70
Juliana Cristina dos Santos Almeida
5.13. Testes de atividade farmacológica
Os testes de atividade farmacológica são de suma importância para avaliar a atividade
de substâncias com potencial de utilização terapêutica em seres vivos. Para realizar a
avaliação da atividade antiinflamatória e antinoceptiva do extrato acetônico dos frutos
imaturos de Capsicum baccatum L. foram realizados os testes de contorções abdominais
induzido por ácido acético (0,6%) e o teste de edema de pata induzido por carragenina (1%),
em ratos machos da linhagem Wistar, respectivamente.
5.13.1. Teste de contorções abdominais
O método de contorções abdominais baseia-se na atuação indireta do ácido acético no
fluido peritonial, provocando a liberação de mediadores endógenos. Desta forma, ocorre a
sensibilização inicial e posterior estimulação das terminações neuronais dessa região.
Recentemente, Ribeiro et al (2000) mostraram que a nocicepção induzida pelo ácido acético
depende da liberação de citocinas, como a interleucina-1β (IL-1 β), TNF-α e a interleucina-8
(IL-8), a partir de macrófagos e basófilos residentes na cavidade abdominal e que, em
conjunto com outros mediadores podem induzir a nocicepção característica observada nesse
modelo.
Substâncias químicas injetadas por via intraperitoneal induzem contorções abdominais
devido à sensibilização de nociceptores por prostaglandinas. O teste de contorções
abdominais é útil para avaliar a analgesia moderada produzida por compostos
antiinflamatórios (PIRES et al., 2004).
O modelo de nocicepção empregado envolve diferentes mecanismos da dor, tais como
ativação do sistema simpático com liberação de aminas bioativas, os metabólitos do ácido
araquidônico e o sistema opioide. O ácido acético age induzindo a liberação de mediadores
71
Juliana Cristina dos Santos Almeida
endógenos que estimulam os nociceptores que são sensíveis aos antiinflamatórios nãoesteroides e/ou opioides (DUTRA et al., 2006).
A tabela 11 mostra os resultados obtidos no teste de contorções abdominais analisadas
estatisticamente por ANOVA (one-way) seguidos dos testes de Tukey e Dunnet, com
significância para p≤0,10.
72
Juliana Cristina dos Santos Almeida
19±2,12
20±12,01
20±1,41
19±13,44
21±4,95
3 - Extrato acetônico pimenta verde 100mg/Kg de peso
4 - Extrato acetônico pimenta verde 300mg/Kg de peso
5 - Extrato acetônico pimenta verde 600mg/Kg de peso
6 - Extrato acetônico pimenta verde 1000mg/Kg de peso
7 - Nimesulida 300mg/Kg de peso
Juliana Cristina dos Santos Almeida
*p≤0,10 comparado ao grupo controle.
29±2,12
2 – Base xarope
a
72,41*a
65,52*a
68,97*a
68,97*a
65,52*a
-
-
% DE INIBIÇÃO
73
p≤0,10 grupos comparados entre si. (ANOVA – one way - seguido dos testes de Tukey e Dunnet).
1 – Água
NÚMERO
CONTORÇÕES
29±8,49
GRUPOS TESTADOS
induzidas por ácido acético (0,6%) em ratos da linhagem Wistar (média ± EPM)
Tabela 11 – Valores médios do número de contorções (“Writhing”) e porcentagem de inibição obtidos no teste de contorções abdominais
Teste de contorção abdominal induzida pelo ácido acético
Número de contorções
40
30
20
*
*
*
*
*
3
4
5
6
10
0
1
2
7
Produtos testados (mg/Kg de peso)
Figura 35 – Efeito analgésico da formulação na forma de xarope contendo o extrato acetônico dos frutos
imaturos de Capsicum baccatum L. sobre o número de contorções abdominais induzidas por ácido acético
(0,6% em salina) em ratos da linhagem Wistar (n=6). * Significativo em comparação ao grupo controle, após
análise de variância (ANOVA), seguida dos testes de Tukey e Dunnet a 10% de significância (p < 0,10)
O resultado da análise de variância (ANOVA) seguida pelos testes de Tukey e Dunnet,
para p≤0,10 demonstrou que os extratos acetônicos dos frutos de Capsicum baccatum L. nas
concentrações de 100, 300, 600 e 1000mg/Kg, incorporados em base de xarope, apresentaram
diferença estatisticamente significativa quando comparados com o controle (Figura 35).
Esses resultados indicaram que nas concentrações testadas, o extrato acetônico de Capsicum
baccatum L. é um potencial analgésico, não sendo observada melhora significativa na
inibição de contorções abdominais nas doses de 300, 600 e 1000mg/Kg de peso quando
comparado à concentração de 100mg/Kg de peso. Além disso, a ação nociceptiva avaliada
com o teste de contorções abdominais apresentou resultados para os extratos semelhantes à
droga padrão (nimesulida) na concentração de 300mg/Kg de peso.
74
Juliana Cristina dos Santos Almeida
O fármaco utilizado como padrão foi a nimesulida por ser um analgésico e
antiinflamatório não-esteroidal que inibe seletivamente a enzima ciclooxigenase-2 (COX-2),
reduzindo a síntese de prostaglandinas relacionadas à inflamação e ao mecanismo da dor.
Recentes estudos indicam que espécies reativas de oxigênio (ERO) podem provocar
danos funcionais e estruturais nas células, além de estarem envolvidos em episódios de dor
persistente. Em condições fisiológicas normais, a produção de espécies reativas de oxigênio é
controlada por mecanismos celulares antioxidantes (LEE, 2007). A alta concentração de
compostos fenólicos no extrato acetônico dos frutos imaturos de Capsicum baccatum L.
(39,83µg/mg de ácido tânico) funciona como mecanismo auxiliar no controle da concentração
de espécies reativas de oxigênio presente nas células, auxiliando a diminuição do estímulo da
dor.
Diversos estudos demonstram que a capsaicina inativa neurônios sensoriais dos
glânglios da raiz dorsal da medula espinhal e dos glânglios do trigêmeo, encarregados de
transmitir a dor (SALAZAR-OLIVO et al., 2004).
A presença dos flavonoides luteolina, quercetina e apigenina, associada às classes de
substâncias capasaicinoides, carotenoides, ácidos fenólicos e uma complexa fração volátil, em
espécies do gênero Capsicum confere a essas espécies várias atividades terapêuticas:
rubefaciente, carminativo, analgésico, antiinflamatório, dor neuropática, dentre outras (British
Herbal Medicine Association – volume 2, 2006).
Diversos estudos demonstram o efeito antinociceptivo da quercetina e sugerem que o
mesmo pode ser mediado por sistemas serotoninérgico, taquicinérgico, glutamatérgico,
adrenérgico, glicocorticoide e dopaminérgico, não sofrendo a influência dos sistemas opioide,
oxidonitrérgico e colinérgico (FILHO, 2010).
75
Juliana Cristina dos Santos Almeida
Portanto, a ação sinérgica das classes de substâncias capsaicinoides, compostos
fenólicos (flavonoides), terpenos e triterpenos são responsáveis pela ação analgésica com o
extrato acetônico dos frutos verdes de Capsicum baccatum L.
5.13.2. Teste de edema de pata induzido por carragenina
A inflamação constitui um mecanismo de defesa local exclusivo dos tecidos
mesenquimais lesados, caracteriza-se por alterações do sistema vascular e dos componentes
líquidos e celulares. O edema constitui o acúmulo de líquido no tecido intersticial, nos
espaços ou nas cavidades do corpo. Ocorre devido ao aumento da pressão hidrostática e da
permeabilidade venular. A carragenina, entre outras aplicações, atua como um agente
inflamatório obtido através da extração com água ou com solução aquosa alcalina de alguns
membros da classe Rhodophyceae (algas vermelhas). O pico do edema produzido pela
carragenina ocorre entre a 3ª e 4ª hora. O efeito se mantém até a 6ª hora e nas horas seguintes
em seguida ele torna-se degenerativo (BACELLI, 2001).
A administração da carragenina (0,1mL a 1%) no interior das patas dos animais de
experimentação levou a um aumento progressivo do tamanho sendo das patas, ao longo das 4
horas de observação após a administração (Figura 36).
76
Juliana Cristina dos Santos Almeida
MÉDIA DA ESPESSURA DA PATA DO GRUPO CONTROLE
Espessura da pata (mm)
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
0
1
2
3
4
5
Tempo (h)
Figura 36 – Aumento da espessura da pata (mm) em ratos Wistar induzido por carragenina a 1% e
tratados com salina (n=6)
A variação percentual da espessura da pata de ratos Wistar estão expressos na tabela 12.
77
Juliana Cristina dos Santos Almeida
100
300
600
1000
300
Controle (água)
Base do xarope (sem extrato)
Xarope com extrato de Capsicum baccatum L.
Xarope com extrato de Capsicum baccatum L.
Xarope com extrato de Capsicum baccatum L.
Xarope com extrato de Capsicum baccatum L.
Padrão (nimesulida)
Juliana Cristina dos Santos Almeida
*p≤0,10 comparado ao grupo controle (ANOVA seguido dos testes de Tukey e Dunnet. n±EPM)
DOSE (mg/Kg)
GRUPOS
6,7
11,1
24,7
26,1
40,6
13,7
14,1
1h
22,9
22,1
26,7
11,2
47,9
45,2
16,4
2h
31,6
27,8
28,1
32,7
52,7
63,4
55,3
3h
TAMANHO DA PATA (%)
9,6*
22,3*
44,1
47,4
42,1
62,0
65,6
4h
AUMENTO PERCENTUAL DO
Tabela 12 – Variação percentual da espessura da pata de ratos Wistar, mensurada com paquímetro
78
A resposta edematogênica é um dos sinais da resposta inflamatória decorrente do
aumento da permeabilidade vascular, que ocorre na microcirculação, devido à ação dos
mediadores liberados (MOREIRA, 2008).
O edema produzido pela carragenina é um modelo bifásico, que conta com a
participação de vários mediadores que atuam em sequência para produzir a resposta
inflamatória (SILVA, 2005). Na fase inicial (0-1h) ocorre a liberação de histamina, serotonina
e bradicinina (BATISTA-LIMA, 2001). A fase posterior (1-6h) está relacionada com a
elevação da produção de prostaglandinas, ativação da COX-2 e a liberação de NO na resposta
inflamatória (SALVEMINI, 1996). De acordo com os dados acima apresentados (Tabela 12),
a inibição do edema nos animais que receberam tratamento com xarope do extrato acetônico
dos frutos imaturos de Capsicum baccatum L. na dosagem de 1000 mg/Kg de peso (1h antes
da aplicação do estímulo edematogênico - carragenina), ocorreu na 4ª hora, sendo similar à do
grupo tratado com nimesulida, o que sugere um mecanismo de ação baseado no envolvimento
de metabólitos do ácido araquidônico (MOREIRA, 2008).
A presença de flavonoides em extratos vegetais proporciona várias atividades
biológicas, dentre as quais podemos destacar a atividade antioxidante, anti-carcinogênica,
antiinflamatório, protetor dos sistemas cardiovascular, renal e hepático. Uma das ações dos
flavonoides está relacionada com a formação de ácidos graxos pela ação da fosfolipase A2,
responsável pela hidrólise de fosfolipídios presentes nas membranas celulares, com a
liberação do ácido araquidônico. Vários estudos indicam a inibição da enzima fosfolipase A2
pela quercetina. Além disso, estudos demonstram a ação de alguns flavonoides que inibem a
ação das enzimas ciclooxigenase e lipoxigenase, impedindo a formação das prostaglandinas e
leucotrienos, inibindo dessa forma os processos inflamatórios (BEHLING et al., 2004,
SILVA et al., 2002).
79
Juliana Cristina dos Santos Almeida
Os frutos secos da pimenta podem ser usados localmente para o tratamento da irritação
causada pelo reumatismo, como gargarejo para inflamação de garganta, em gastrites
alcoólicas e em certos casos de diarreia (CHUKWU, 2006).
Estudos apontam que a capsaicina exibe propriedade antiinflamatória e pode ser útil na
melhora de doenças inflamatórias e como agente preventivo (ALVES, 2006).
A capsaicina, um dos metabólitos secundários encontrados na espécie Capsicum
baccatum L., possui atividade inibitória sobre a enzima COX-2 e sobre a expressão da enzima
óxido-nítrico sintetase induzível (ALVES et al., 2006).
Em diversos estudos a quercetina demonstrou ter propriedades antiinflamatórias em
vários sistemas in vitro e in vivo, na cirrose hepática e na infecção pulmonar promovida pelo
vírus Influenza (MARTINEZ et al., 2008).
As saponinas presentes em muitas espécies vegetais aumentam a absorção e a atividade
de outras substâncias (LÓPEZ, 2010).
Os metabólitos secundários estão presentes nas plantas em complexas misturas
constituídas por vários tipos estruturais. Mesmo que a interação individual de um metabólito
secundário particular possa ser inespecífica e fraca, a soma de todas as interações leva a um
efeito substancial (LÓPEZ, 2002).
Diante de todas estas observações, pode-se supor que o sinergismo dos compostos
secundários presentes na formulação testada é responsável pela atividade antiinflamatória
observada no teste realizado. Como um dos mecanismos de ação sistêmica da formulaçãoteste pode-se propor a atuação na fase final da resposta inflamatória induzida por carragenina,
já que o efeito foi melhor observado na 4ª hora após a administração do agente flogístico.
80
Juliana Cristina dos Santos Almeida
5.13.3. Histologia do edema de pata
As leituras histológicas foram realizadas observando os campos compreendidos entre as
camadas da epiderme, tecido subcutâneo até atingir o tecido muscular.
Pode-se observar que todos os grupos que receberam carragenina apresentaram
infiltrado inflamatório com a presença de células polimorfonucleadas com predomínio de
neutrófilos, poucos eosinófilos e degeneração hidrópica do tecido epitelial. O infiltrado
inflamatório apresenta-se distribuído pelo tecido subcutâneo estendendo-se ao redor das fibras
musculares.
As lâminas histológicas foram qualificadas conforme o grau de inflamação. Para essa
qualificação foi criada uma escala de inflamação baseada no número de células
polimorfonucleares presentes no tecido analisado e a presença ou não de edema tecidual. A
análise das lâminas está esquematizada na tabela abaixo (Tabela 13).
Os resultados obtidos da análise histológica das lâminas de patas de ratos da linhagem
Wistar submetidos injeção subplantar de salina (Figura 37), carragenina como agente
inflamatório (Figura 38) e os tratamentos realizados com formulação contendo extrato
acetônico dos frutos verdes de Capsicum baccatum L. na concentração de 1000mg/Kg de
peso (Figura 39) e nimesulida (Figura 40) demonstraram que o modelo proposto para o teste
farmacológico da ação antiinflamatória desenvolveu-se de forma satisfatória. Nos tratamentos
realizados com nimesulida e extrato acetônico dos frutos imaturos de Capsicum baccatum L.
na concentração de 1000mg/Kg de peso, houve remissão do edema e diminuição de células
inflamatórias, confirmando os resultados observados no modelo de edema de pata induzido
por carragenina. Portanto, o extrato acetônico dos frutos verdes de Capsicum baccatum L., na
concentração de 1000mg/Kg de peso, demonstrou ser efetivo para o tratamento da inflamação
aguda em ratos da linhagem Wistar, no modelo de edema de pata induzido por carragenina.
81
Juliana Cristina dos Santos Almeida
de
inflamação:
0
–
Ausência
Juliana Cristina dos Santos Almeida
Escala
de
Inflamação
moderada;
2
7
–
2
6
2
3
5
discreta;
3
4
Inflamação
3
3
–
3
2
1
3
1
inflamação;
INTENSIDADE DA INFLAMAÇÃO
GRUPOS
extrato acetônico dos frutos imaturos de Capsicum baccatum L. em relação ao grupo controle
3
–
Inflamação
82
intensa
Tabela 13 – Valores médios da avaliação qualitativa da intensidade da inflamação nos grupos tratados com formulação contendo o
A figura 37 demonstra as lâminas histológicas da região plantar das patas traseiras
de ratos Wistar, 4h após a injeção com solução de salina. Observa-se a ausência de
células inflamatórias e edema tecidual.
A
B
Figura 37 – Fotomicrografias das lâminas histológicas do grupo controle salina. Coloração
Hematoxilina/Eosina. A: Aumento de 100x. B: Aumento de 400x.
83
Juliana Cristina dos Santos Almeida
A figura 38 demonstra as lâminas histológicas da região plantar das patas traseiras
de ratos Wistar, 4h após a injeção com solução de carragenina a 1%. Pode-se observar
edema tecidual, com espaçamento entre as fibras musculares em resposta transitória
aguda e infiltrados celulares precoces com grande número de neutrófilos e outras células
inflamatórias acumuladas em área de inflamação aguda.
A
Células inflamatórias
↘
B
Figura 38 – Fotomicrografias das lâminas histológicas do grupo controle carragenina a 1%.
Coloração Hematoxilina/Eosina. A: Aumento de 100x. B: Aumento de 400x.
84
Juliana Cristina dos Santos Almeida
A figura 39 demonstra as lâminas histológicas da região plantar das patas traseiras
de ratos Wistar, 4h após a injeção com solução de carragenina a 1% e tratados com
xarope contendo 1000mg/Kg de peso do extrato acetônico dos frutos imaturos de
Capsicum baccatum L. Pode-se observar uma diminuição significativa da infiltração
leucocitária e redução do edema.
A
B
Figura 39 – Fotomicrografias das lâminas histológicas do grupo tratado com 1000mg/Kg de extrato
acetônico de Capsicum baccatum L. Coloração Hematoxilina/Eosina. A: Aumento de 100x. B:
Aumento de 400x.
85
Juliana Cristina dos Santos Almeida
A figura 40 demonstra as lâminas histológicas da região plantar das patas traseiras
de ratos Wistar, 4h após a injeção com solução de carragenina 1% e tratados com
nimesulida 300mg/Kg de peso. Observa-se a redução do edema tecidual e do infiltrado
inflamatório (influxo leucocitário).
A
B
Figura 40 – Fotomicrografias das lâminas histológicas do grupo tratado com Nimesulida
300mg/Kg. Coloração Hematoxilina/Eosina. A: Aumento de 100x. B: Aumento de 400x.
86
Juliana Cristina dos Santos Almeida
CONCLUSÃO
6. CONCLUSÃO
O estudo morfo-anatômico dos frutos de Capsicum baccatum L. demonstraram frutos
do tipo baga, alongados, medindo de 7 a 9 centímetros de comprimento e 4 a 5 cm de largura.
O epicarpo é fino, liso e carnoso, apresentando coloração vermelha no estádio final de
maturação. O pericarpo é carnoso e de pouca espessura.
Na análise microscópica o corte transversal da epiderme demonstrou camada
epidérmica de forma multisseriada, composta de até cinco camadas de células poliédricas,
destacando-se a presença de cutina sobre essas células. Presença de tecido de expansão celular
com 3 a 15 camadas, parênquima de preenchimento com mais de 10 camadas de células.
O estudo histoquímico realizado nos frutos no estádio imaturo (verde) de Capsicum
baccatum L. demonstraram a presença de compostos fenólicos, flavonóides, lactonas
sesquiterpênicas, taninos e mucilagem.
A determinação de massa fresca, massa seca, porcentagem de água e cinzas totais
demonstrou frutos de boa qualidade e com as determinações dentro das especificações da
legislação vigente.
Os extratos acetônicos produzidos a partir dos frutos de Capsicum baccatum L.
apresentaram rendimentos diferentes, sendo o rendimento dos frutos no estádio intermediário
o de maior valor.
O screening fitoquímico dos extratos acetônicos demonstraram a presença das
substâncias capsaicina, terpenos, saponinas e flavonoides.
O principal composto identificado e quantificado nos frutos imaturos de Capsicum
baccatum L. foi a capsaicina.
O extrato acetônico dos frutos no estádio imaturo foi o que apresentou a maior
concentração de compostos fenólicos.
87
O extrato acetônico dos frutos verdes da espécie Capsicum baccatum L. apresentaram
atividade antioxidante pronunciada em todas as concentrações testadas.
Os resultados obtidos no ensaio de Artemia salina L. indicam uma baixa toxicidade do
extrato acetônico dos frutos imaturos de Capsicum baccatum L. testado nesta espécie.
Os resultados obtidos in vitro mostraram que o extrato bruto acetônico de pimenta dedode-moça verde (Capsicum baccatum L.) demonstrou capacidade moderada de inibir o
crescimento de espécies Candida, podendo auxiliar ou promover o tratamento da candidíase
provocada por Candida albicans e Candida tropicalis.
A administração oral do extrato acetônico dos frutos imaturos de Capsicum baccatum L.
na concentração de 1000mg/Kg de peso, em ratos Wistar, apresenta efeito inibitório no
modelo experimental de inflamação aguda de edema de pata induzido por carragenina.
A administração oral do extrato acetônico dos frutos imaturos de Capsicum baccatum L.
nas concentrações de 100, 300, 600 e 1000mg/Kg de peso, em ratos Wistar, apresenta efeito
inibitório no modelo experimental de contorções abdominais induzido por ácido acético.
A análise histológica confirma a remissão do processo inflamatório em edema de pata
induzido por carragenina no tratamento realizado 30 minutos antes da indução do edema com
a dose de 1000µg/Kg de peso.
Esses dados fornecem parâmetros para avaliar o potencial antiinflamatório e nociceptivo
da formulação desenvolvida, sugerindo a continuidade da pesquisa com estudos específicos
de atividade farmacológica visando possíveis novas ações terapêuticas e complementação das
ações aquí testadas.
88
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7- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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