Universidade do Estado do Rio de Janeiro
Centro Biomédico
Faculdade de Ciências Médicas
Érica Peres de Barros
Efeitos benéficos da rosuvastatina na estrutura renal de ratos
espontaneamente hipertensos (SHR)
Rio de Janeiro
2011
Érica Peres de Barros
Efeitos benéficos da rosuvastatina na estrutura renal de ratos espontaneamente hipertensos
(SHR)
Dissertação apresentada, como requisito parcial
para obtenção do título de Mestre, ao Programa
de Pós-graduação em Fisiopatologia Clínica e
Experimental, da Universidade do Estado do Rio
de Janeiro.
Orientador: Prof. Dr. Jorge José de Carvalho
Rio de Janeiro
2011
Érica Peres de Barros
Efeitos benéficos da rosuvastatina na estrutura renal de ratos espontaneamente hipertensos
(SHR)
Dissertação apresentada, como requisito parcial
para obtenção do título de Mestre, ao Programa
de Pós-graduação em Fisiopatologia Clínica e
Experimental da Universidade do Estado do Rio
de Janeiro.
Aprovada em 26 de abril de 2011.
Orientador Prof. Dr. Jorge José de Carvalho
Banca Examinadora:
_____________________________________________
Profª. Dra. Ana Carolina Stumbo Machado
Instituto de Biologia Roberto Alcântara Gomes – UERJ
_____________________________________________
Profª. Dra. Erica Patricia Garcia de Souza
Instituto de Biologia Roberto Alcântara Gomes - UERJ
_____________________________________________
Prof. Drª. Suzana Corte Real Faria
Fundação Oswaldo Cruz
Rio de Janeiro
2011
Dedico este trabalho a Angélica Beatriz Garcia Pinto, por me ensinar o real
significado da palavra amizade.
AGRADECIMENTOS
Obrigado a Deus por ter me concedido esta oportunidade de conhecimento e fortalecimento
pessoal.
A minha família por darem todo o suporte necessário a minha educação e formação
profissional.
Ao professor Jorge Jose de Carvalho por toda sua ajuda profissional: a pessoa certa, no
momento certo.
A amiga Angélica por todo seu apoio nos bons momentos e nos momentos difíceis, por
participar de todo este processo de crescimento pessoal e profissional.
A todos os meus colegas do Laboratório de Ultraestrutura e Biologia Tecidual por sua
colaboração no desenvolvimento deste trabalho e pela amizade.
A todos que direta ou indiretamente possibilitaram a realização deste projeto de vida,
principalmente aqueles que sempre duvidaram do meu esforço e competência.
.
A certeza do amanhã surge, quando no presente, consigo inclinar minha alma ao
aprendizado do ontem e do hoje, na expectativa das minhas próprias descobertas.
Silvia Nobre Lopes
RESUMO
BARROS, Érica Peres de. Rosuvastatina altera beneficamente destruturas glomerulares dos
rins de ratos espontaneamemnte hipertensos (SHR). 2011. 43 f. Dissertação (Mestrado em
Fisiopatologia Clínica e Experimental) – Faculdade de Ciências Médicas, Universidade do
Estado do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2011.
A incidência de doenças renais crônicas está aumentando no mundo, e há uma grande
necessidade de identificar as terapias capazes de deter ou reduzir a progressão da doença. Há
crescente evidência clínica e experimental de que as estatinas poderiam desempenhar um
papel terapêutico. Recentes estudos clínicos e experimentais têm mostrado que as estatinas
têm "efeitos pleiotrópicos", além da modulação lipídica. Estudos têm avaliado os efeitos das
estatinas sobre a progressão da doença renal crônica, mas os resultados são controversos.
Estudos ultra-estruturais em humanos e em ratos demonstraram a presença de junções GAP
dentro de todas as células do glomérulo e os podocitos demonstraram conter principalmente
conexina-43 (Cx-43). O presente estudo tem como objetivo observar os efeitos da
rosuvastatina na estrutura e ultra-estrutura renal e a expressão glomerular de Cx-43 em ratos
normotensos (WKY) e em ratos espontaneamente hipertensos (SHR). O foco do estudo foi
avaliar os efeitos pleiotrópicos da rosuvastatina em rins de animais hipertensos
normocolesterolêmicos. Os ratos foram divididos aleatoriamente em quatro grupos: WKY-C:
animais normotensos que não receberam rosuvastatina; WKY-ROS: animais normotensos que
receberam rosuvastatina 20mg/kg/dia por gavagem orogástrica; SHR-C: animais hipertensos
que não receberam rosuvastatina; SHR-ROS: animais hipertensos que receberam
rosuvastatina, como descrito no grupo WKY-ROS. Os animais dos grupos SHR-C e SHRROS apresentaram níveis de pressão arterial maiores que os animais dos grupos WKY-C e
WKY-Ros. A massa corporal dos grupos de animais não diferiram significativamente durante
o experimento. Não houve diferença nos níveis sanguíneos de uréia, creatinina, ácido úrico e
creatinafosfoquinase entre os animas dos grupos estudados. No entanto, houve um aumento
da excreção de proteína de 24 horas nos animais do grupo SHR-C. Houve um aumento na
área capsular nos animais do grupo SHR-C. Por microscopia eletrônica de transmissão
observou-se que nos animais SHR-C a barreira de filtração glomerular, o diafragma de fenda
e os podócitos estão alterados exibindo os vacúolos nos podócitos e pedicelos mais curtos e
mais espessos. Por microscopia eletrônica de varredura, os animais SHR-C exibiram
pedicelos mais afilados, curtos e tortuosos. Um aumento da imunofluorescência para Cx-43
foi observada em células epiteliais viscerais dos glomérulos dos animais do grupo WKY-ROS
e nas células parietais e viscerais dos glomérulos dos animais do grupo SHR-ROS, se
comparado com os grupos WKY-C e SHR-C. Em conclusão, podemos supor que o efeito
pleiotrópico renal da rosuvastatina pode ser uma ferramenta terapêutica para melhorar a
estrutura e conseqüentemente a função renal em indivíduos hipertensos.
Palavras-chave: Hipertensão. Rim. Morfometria. Estrutura e ultraestrutura glomerular.
Conexina-43.
ABSTRACT
The incidence of chronic renal diseases is increasing worldwide, and there is a great
need to identify therapies capable of arresting or reducing disease progression. There is
growing clinical and experimental evidence that statins could play a therapeutic role. Recent
clinical and experimental studies have shown that statins have “pleiotropic effects”, besides
modulating lipid. Studies have evaluated the effects of statins on the progression of chronic
kidney disease but the results are controversial. Ultrastructural studies in both humans and
rats have shown the presence of gap junctions within all the cells of the glomerulus and
podocytes have been found to contain primarily connexin-43 (Cx-43). The present study aims
to observe the effects of rosuvastatin on structural and ultrastructural renal morphology and
on glomerular Cx-43 expression in normotensive rats and SHR. The focus of the study was to
evaluate the pleiotropic action of rosuvastatin upon kidney in hypertensive
normocholesterolemic animals. Rats were randomly allocated into four groups (n=8 each):
WKY-C: normotensive animals no receiving rosuvastatin; WKY-ROS: normotensive animals
receiving rosuvastatin 20mg/kg/day by orogastric gavage; SHR-C: hypertensive animals no
receiving rosuvastatin; SHR-ROS: hypertensive animals receiving rosuvastatin, as described
for WKY-ROS group. The SHR-C and SHR-ROS had increased blood pressure levels. The
body mass of the animal groups did not differ significantly throughout the experiment. There
were no differences in blood urea, creatinine, uric acid and CPK levels between the groups.
However, there was an increasing of 24 hour protein excretion in SHR-C. There was an
increasing in capsular area in SHR-C. By transmission electron microscopy it was observed
that in SHR-C animals the glomerular filtration barrier, the slit diaphragm and the podocyte
foot processes are altered exhibiting the vacuoles in the podocytes and the pedicels are shorter
and thicker. By scanning electron microscopy the SHR-C animals shows the thinner, shorter
and more tortuous pedicels. Increased Cx-43 immunofluorescence was observed at visceral
epithelial cells of the glomeruli of WKY-ROS and at parietal and visceral epithelial cells of
the glomeruli SHR-ROS groups if compared with WKY-C and SHR-C groups. In conclusion,
we hypothesize that renal pleiotropic effect of rosuvastatin can be a therapeutic tool for
improving kidney ultrastructure and, consequently, renal function in hypertensive individuals
Keywords: Hypertension. Kidney. Morphometry. Glomerular structure and ultrastructure.
Connexin-43.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1
Esquema da inibição da síntese de colesterol no fígado.............................. 14
Figura 2
Junções GAP................................................................................................ 18
Figura 3
Pressão arterial antes e durante as cinco semanas de tratamento................
25
Figura 4
Massa corporal antes e durante as cinco semanas de tratamento.................
26
Figura 5
Proteína urinária excretada...........................................................................
28
Figura 6 a
Morfometria das estruturas glomerulares.....................................................
29
Figura 6 b
Morfometria das estruturas glomerulares.....................................................
30
Figura 7
Microscopia eletrônica de transmissão........................................................ 31
Figura 8
Microscopia eletrônica de varredura...........................................................
32
Figura 9
Imunofluorescência para Connexina-43 nos glomérulos............................
34
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
%
Percentual
µm
Micrômetro
µm2
Micrômetro ao quadrado
ANOVA
Análise de variância
C
Controle
CO2
Gás carbônico
CPK
Creatinafosfoquinase
Cx
Conexina
dl
Decilitro
EUA
Estados Unidos da América
GAP
Junção comunicante
HDL
Lipoproteína de alta densidade
HMG CoA
3-hidroxi-3-methyl-glutaril-Coensima A
kg
Quilograma
kV
Quilovoltz
L
Litro
LDL
Lipoproteína de baixa densidade
m
Metro
MC
Massa corporal
MET
Microscópio Eletrônico de Trânmissão
MEV
Microscópio Eletrônico de Varredura
mg
Miligrama
ml
Mililitro
mol
Molécula
NADPH
Nicotinamida adenina dinucleotídeo-P
nm
Nanômetro
P
Nível descritivo
PA
Pressão Arterial
pH
Potencial de hidrogênio
ROS
Rosuvastatina
SHR
Rato espontaneamente hipertenso
U
Unidade
UV
Ultravioleta
WKY
Wistar Kyoto
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO.........................................................................................................
12
REVISÃO DA LITERATURA................................................................................
13
1.1 Origem e mecanismo de ação das estatinas............................................................
13
1.2 Efeitos pleiotrópicos das estatinas...........................................................................
15
1.3 Estatinas e seus efeitos renais..................................................................................
16
1.4 Junções GAP..............................................................................................................
16
2
19
1
OBJETIVOS..............................................................................................................
2.1 Objetivo geral............................................................................................................. 19
2.2 Objetivos específicos.................................................................................................. 19
MATERIAIS E MÉTODOS....................................................................................
20
3.1 Animais e tratamento................................................................................................
20
3.2 Excreção urinária, análise bioquímica do sangue e sacrifício dos animais.........
21
3.3 Morfometria..............................................................................................................
21
3.4 Microscopia eletrônica de transmissão...................................................................
22
3.5 Microscopia eletrônica de varredura......................................................................
22
3.6 Imunofluorescência..................................................................................................
22
3.7 Análise dos dados ...................................................................................................
23
4
RESULTADOS.........................................................................................................
24
4.1 Pressão arterial sanguínea e massa corporal.........................................................
24
4.2 Excreção urinária e análise bioquímica de sangue...............................................
26
4.3 Morfometria..............................................................................................................
28
4.4 Microscopia eletrônica de transmissão..................................................................
30
4.5 Microscopia eletrônica de varredura.....................................................................
32
4.6 Imunofluorescência..................................................................................................
33
5
DISCUSSÃO.............................................................................................................
35
6
CONCLUSÕES........................................................................................................
39
7
RECONHECIMENTOS..........................................................................................
40
REFERÊNCIAS.......................................................................................................
41
3
12
INTRODUÇÃO
Os inibidores da 3-hidroxi-3-metil coenzima A (HMG CoA) redutase, ou estatinas, são
alguns dos medicamentos amplamente prescritos nos Estados Unidos (Pfefferkorn, 2011).
Seus benefícios são provenientes tanto da redução nos níveis das lipoproteínas aterogênicas
(LDL) quanto do aumento das lipoproteínas antiaterogênicas (HDL) (Nicholls et al., 2007).
Além disso, as estatinas apresentam efeitos independentemente de sua capacidade
hipolipemiante, podendo ter importante função no controle da pressão arterial devido aos seus
efeitos pleiotrópicos (Wang et al., 2008; Suh et al., 2010).
A incidência de doenças renais crônicas está aumentando em todo o mundo, e há
uma grande necessidade de identificação de terapias capazes de impedir ou reduzir a
progressão da doença. Evidências clínicas e experimentais que levam a crer que as estatinas
poderiam exercer algum efeito terapêutico (Gianella et al., 2007). Além disso, existem
evidências de que o efeito renoprotetor das estatinas seria devido às propriedades
pleiotrópicas da droga (Gianella et al., 2007; Cormack-Aboud et al., 2009).
Estudos mostraram a presença de junções GAP em todas as células do glomérulo,
onde, os podócitos têm mostrado conter principalmente conexina-43 (Hanner et al., 2010).
O presente trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos benéficos do rosuvastatina
sobre a expressão de conexina-43, estrutura e ultraestrutura glomerular em animais
espontaneamente hipertensos.
13
1 REVISÃO DA LITERATURA
1.1 Origem e mecanismo de ação das estatinas
A descoberta de inibidores da biossíntese do colesterol, capazes de reduzirem os
níveis de colesterol para prevenir ou atenuar doenças cardiovasculares, levou à descrição da
compactina, inibidora da HMG CoA redutase (3-hidroxi-3-methyl-glutaril-CoensimaA
redutase), isolada de culturas de Penicillium citrinum e que serviu de base para a produção
das estatinas (Brown et al., 1978; Kornbrust et al., 1989). Após a descoberta da campactina
um análogo relacionado a sua estrutura, que difere somente na presença de um gupo metil, a
lovastatina (inicialmente chamada de mevinolina) foi isolada de culturas de Aspergillus
terreus. Após intenso estudo em diferentes animais esta droga foi aprovada para uso nos
Estados Unidos pela “Food and Drug Administration” em 1978 (Brown et al., 1978).
As estatinas são substâncias que têm capacidade de regular a síntese do colesterol no
fígado e em outros tecidos, por competição com a enzima HMG CoA redutase, impedindo a
formação do ácido mevalônico. Deste modo, as estatinas impedem a síntese de importantes
isoprenóides, tais como farnesilpirofosfato e geranilgeranilpirofosfato, que são precursores da
síntese do colesterol (Figura 1) (McGown & Brookes, 2007; Wang et al., 2008).
14
Figura 1. Esquema da inibição da síntese de colesterol no fígado: a estatina interage
com o sítio de ligação da HMG Coa redutase atuando como inibidor competitivo, inibindo a
síntese do colesterol (McGown & Brookes, 2007).
Mais do que competir com os sítios desta enzima, estas drogas alteram sua
conformação quando se ligam ao seu sitio ativo, fazendo com que as mesmas aumentem sua
eficácia e especificidade (Stancu & Sima, 2001).
A inibição da HMG CoA redutase, além de reduzir o colesterol intracelular, induz a
ativação de uma protease que libera proteínas reguladoras do retículo endoplasmático. A
conseqüente redução do colesterol LDL (lipoproteína de baixa densidade) nos hepatócitos
desencadeia um aumento na expressão dos receptores hepáticos de LDL, reduzindo a
quantidade de LDL circulantes (Brown & Goldstein, 1986; Álvarez et al., 1999) e seus
precursores (Maron et al., 2000; Vaughan et al., 2000).
15
1.2 Efeitos pleiotrópicos das estatinas
As estatinas compreendem alguns dos medicamentos mais amplamente prescritos nos
Estados Unidos para tratamento de dislipidemia (Pfefferkorn, 2011). Os benefícios das
estatinas, como dito anteriormente são provenientes da redução do nível das lipoproteínas
aterogênicas (LDL) e do aumento do nível das lipoproteínas anti-aterogênicas (HDL lipoproteína de alta densidade) (Nicholls et al., 2007). No entanto estas drogas podem exercer
efeitos independentes de sua capacidade hipolipemiante, conhecidos como efeitos
pleiotrópicos, tais como os efeitos antiinflamatório, anti-proliferativo, anti-trombótico,
atenuação de NADPH (Nicotinamida adenina dinucleotídeo-P) oxidase mediada pela geração
de espécies reativas de oxigênio e melhoria da função vasomotora endotelial, reduzindo a
mortalidade e morbidade das doenças coronarianas (Wang et al., 2008; Suh et al., 2010).
Neto-Ferreira et al. (2010) descreveram que a administração de rosuvastatina é capaz de
atenuar o remodelamento da ultra-estrutura aórtica em animais com hipertensão por
deficiência da síntese de óxido nítrico. Além destes efeitos no sistema cardiovascular, as
estatinas têm exibido efeitos no tecido muscular (Hedenmalm et al., 2010), ósseo (Chen et al.,
2010) e renal (Renke et al., 2010).
Embora as estatinas compartilhem o efeito hipolipemiante em comum, há diferenças
dentro desta classe de drogas como a eficácia na redução dos níveis de LDL, as propriedades
farmacocinéticas, interações com alimentos, e custo que podem variar amplamente,
influenciando a seleção de uma estatina particular como opção de tratamento. A consciência
destas diferenças bem como o conhecimento dos efeitos pleiotrópicos pode ajudar na seleção
ou substituição de uma estatina para um paciente em particular (Chong et al., 2001).
16
1.3 Estatinas e seus efeitos renais
Doenças cardiovasculares representam aproximadamente 50% das causas de morte
em países desenvolvidos e 25% de mortes em países em desenvolvimento. Doenças
cardiovasculares compreendem uma variedade de desordens que incluem doença coronária
cardíaca e suas conseqüências (infarto do miocárdio, angina e insuficiência coronária) como
também acidente vascular encefálico, insuficiência cardíaca congestiva, doença vascular
periférica e hipertensão sistêmica (Pfefferkorn, 2011).
A doença renal pode ser a causa ou a conseqüência da hipertensão essencial. A
hipertensão conduz ao dano de órgãos alvo como, o coração, vasos sanguíneos, cérebro, olhos
e rins, com desenvolvimento eventual de doenças cardiovasculares e renais, sendo um
conhecido fator de risco para uma progressão mais rápida de falência renal (Barri, 2008;
Krzesinski & Cohen, 2007)
A incidência de doenças renais crônicas está aumentando em todo o mundo, e há
uma grande necessidade de identificação de terapias capazes de impedir ou reduzir a
progressão da doença. O tratamento atual de nefropatia crônica está limitada ao uso de
inibidores de enzima conversora de angiotensina, entretanto, existe um número crescente de
evidências clínicas e experimentais que levam a crer que as estatinas poderiam exercer algum
efeito terapêutico (Gianella et al., 2007).
Tem sido relatado que a administração de várias estatinas exibiu efeitos benéficos em
vários modelos experimentais de doenças renais crônicas sugerindo que lipídios podem
representar alvos terapêuticos importantes na diminuição ou até mesmo na cura de danos
renais (Strippoli et al., 2008). Estudos avaliaram os efeitos das estatinas na progressão da
doença renal crônica, porém os resultados são controversos (Gianella et al., 2007; Strippoli et
al., 2008; Verhulst et al., 2008).
17
Embora seja difícil distinguir quais dos efeitos são dependentes ou independentes da
ação hipolipemiante em testes clínicos, existem evidências de que o efeito renoprotetor das
estatinas seria devido às propriedades pleiotrópicas da droga (Gianella et al., 2007; CormackAboud et al., 2009).
1.4 Junções GAP
Junções GAP representam um modo no qual as células de seres vertebrados se
comunicam, compartilhando íons, mensageiros secundários, pequenos metabolitos, e outras
moléculas sinalizadoras. Este tipo de comunicação intercelular permite uma coordenação da
atividade celular, incluindo a secreção e permitindo que células revisem o estado funcional de
outras células vizinhas, uma característica crítica para a homeostase de sistemas
multicelulares. Junções GAP resultam da associação de 2 hemi-canais, nomeados conexons,
os quais contribuem para a sinalização de duas células adjacentes (Figura 2). Cada conexon é
um conjunto de 6 proteínas de membrana, nomeadas conexinas (Cx) as quais são codificadas
por uma família de pelo menos 20 membros. Uma série de estudos mostraram expressão de
mRNA pertencentes a nove conexinas diferentes no rim, nomeadas Cx26, Cx30.3, Cx31,
Cx32, Cx37, Cx40, Cx43, Cx45, e Cx46 (Hanner et al., 2010).
18
Figura 2: Junções GAP resultam da associação de 2 hemi-canais, nomeados
conexons. Cada conexon é um conjunto de 6 proteínas de membrana, nomeadas conexinas
(Cx). (Bear et al., 2002)
Estudos ultra-estruturais em humanos e ratos mostraram a presença de junções GAP
no citoplasma de todas as células do glomérulo. Em particular são encontradas muitas junções
GAP entre as células mesangiais intraglomerulares (Taugner et al., 1978). Os podócitos e as
células endoteliais também mostraram a presença de junções GAP em estudos de criofratura
(Kuhn & Reale, 1975; Kuhn et al., 1975; Taugner et al., 1984). As células glomerulares e os
podócitos têm mostrado conter principalmente Cx-43 (Sawai et al., 2006). Não há relato de
junções GAP unindo diferentes tipos celulares, como por exemplo, células mesangiais e
endoteliais (Hanner et al., 2010)
19
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Avaliar a ação pleiotrópica da rosuvastatina em rins de animais hipertensos não
colesterolêmicos.
2.2 Objetivos específicos
Verificar o efeito da rosuvastatina na pressão arterial sanguínea e na massa corporal de
animais normotensos e hipertensos.
Verificar o efeito da rosuvastatina na excreção urinária e em parâmetros bioquímicos
do sangue de animais normotensos e hipertensos.
Analisar o efeito da rosuvastatina na morfometria glomerular de animais normotensos
e hipertensos.
Verificar o efeito da rosuvastatina na ultra-estrutura glomerular dos rins de animais
normotensos e hipertensos.
Verificar o efeito da rosuvastatina na expressão de Cx-43 nas células glomerulares dos
rins de animais normotensos e hipertensos.
20
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Animais e tratamento
Este estudo foi executado conforme as diretrizes do "Cuidado e Uso de Animais de
Laboratório” (United States National Institutes of Health, revisado em 1996). O manuseio e
os protocolos de experimentação foram aprovados pelo Comitê de Éticas para o uso e
Cuidado de Animais Experimentais da Universidade do Estado do Rio de Janeiro (Protocolo
número CEA/038/2009).
Ratos Wistar-Kyoto (WKY) e ratos espontaneamente hipertensos (SHR) foram
mantidos sob condições padrão (12h ciclo claro/escuro, 21±2°C, umidade de 60±10%) e
receberam água e ração padrão (Nuvilab, Paraná, Brasil) ad libitum. Os animais foram
comprados com dois meses de idade no Centro de Modelos Experimentais para Medicina e
Biologia da Universidade Federal de São Paulo (www.unifesp.br/centros/cedeme) e o período
experimental começou quando os animais estavam com cinco meses de idade. Os animais
foram divididos em quatro grupos (n=8 cada): WKY-C (controle) - animais normotensos os
quais não receberem rosuvastatina; WKY-ROS - animais normotensos os quais receberam
rosuvastatina (Crestor, AstraZeneca, Brasil) 20mg/kg/dia através de gavagem orogastrica;
SHR-C (controle hipertenso) - animais hipertensos os quais não receberam rosuvastatina;
SHR-ROS - animais hipertensos os quais receberam rosuvastatina, como descrito para o
grupo anterior. O período experimental durou cinco semanas.
A pressão arterial sanguínea (PA) e a massa corporal (MC) foram mensuradas
semanalmente. A PA foi mensurada com os ratos conscientes pelo método não invasivo de
pletismografia caudal (Letica LE 5100, Panlab, Espanha).
21
3.2 Excreção urinária, análise bioquímica do sangue e sacrifício dos animais
Na 6ª semana de experimentação a urina de 24 horas de cada animal foi coletada em
gaiola metabólica e a excreção de proteína urinária foi determinada com o Kit Uréia UV
(Kovalent, São Gonçalo, Brasil). Os animais foram anestesiados com pentobarbital de sódio
(150 mg/kg) e sacrificados através de excesso anestésico. O sangue dos animais foi retirado
através de punção cardíaca utilizando seringa heparinizada (0,2ml). Imediatamente a uréia,
creatinina, ácido úrico e creatina fosfoquinase (CPK) foram quantificados e posteriormente
utilizados como biomarcadores de função renal. Depois destes procedimentos, o abdômen dos
animais foi aberto, e os rins foram retirados.
3.3 Morfometria
Foram analisados cinco cortes histológicos por rim, sendo utilizado o rim direito de
cada um destes animais. Em cada um destes cortes foram visualizados cinco campos e em
cada campo cinco glomérulos. Cada corpúsculo renal foi delineado com o objetivo de se
mensurar a área capsular e conseqüentemente através de tonalidade de coloração o espaço
urinário dos respectivos corpúsculos. As áreas delineadas foram mensuradas em µm2 com o
programa analisador de imagem Image Pro Plus 4.5. Foram considerados como glomérulos
corticais aqueles localizados até 250µm da cápsula (Ossani et al., 2009). Um total de 4.000
glomérulos foi mensurado.
22
3.4 Microscopia eletrônica de transmissão (MET)
Fragmentos dos rins esquerdos foram imediatamente fixados em glutaraldeido a
2,5% (Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH, Seelze, Alemanha) em solução de tampão
cacodilato a 0,1M (pH 7,2) e ácido de tânico a 0,25% (Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha),
pós-fixado em tetroxido de ósmio a 1% (Sigma-Aldrich, Saint Louis, E.U.A.), e então
incluidos em Epon (Embe-812, EMS, Hatfield, PA, E.U.A.). Cortes ultrafinos (60 a 70 nm)
foram obtidos de áreas selecionadas com ultramicrótomo (Leica ULTRA-CUT; Leica
Aktiengesellschaft, Viena, Áustria), contrastados com acetato de uranila e citrato de chumbo,
e então observados em microscópio eletrônico de transmissão (MET) Zeiss EM 906 (Carl
Zeiss EM 906, Oberköchen, Alemanha) a 80 kV.
3.5 Microscopia eletrônica de varredura (MEV)
Outros fragmentos dos rins esquerdos foram fixados em 2,5% de glutaraldeido
(Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH, Seelze, Alemanha) em solução Tampão cacodilato
a 0,1M (pH 7,2) e pós-fixado em 1% de tetroxido de ósmio durante 30 minutos e
posteriormente desidratado em acetona. Amostras foram então secas com CO2 em pontocrítico, cobertas com ouro, e observadas em um microscópio eletrônico de varredura (MEV;
Carl Zeiss LEO 1450 VP, Oberköchen, Alemanha) a 15 kV.
3.6 Imunofluorescência
Secções dos rins esquerdos foram fixadas em uma solução de formaldeído 1,27 mol/l
em 0,1M de Tampão fosfato; pH7,2, lavadas e incubadas overnight com anticorpo primário
23
monoclonal anti-conexina-43 (anti-Cx-43) (1:20, MAB3067, Chemicon), seguido de
incubação com o anticorpo secundário Fluor ®-488 (A21202, Invitrogen) e corado com Evans
blue 1:5000 por 15 minutos. As secções foram montadas e observadas sob microscópio
confocal de varredura a laser Zeiss LSM 510 META.
3.7 Análise dos dados
Os dados foram exibidos em média±erro padrão da média. Os dados foram testados
para normalidade e homogeneidade de variância, e então as diferenças entre grupos foram
analisadas por análise de variância one-way ANOVA, sendo utilizado o pós-teste de Tukey. O
resultado foi considerado estatisticamente significativo quando P≤0,05. (Graph-Pad Prism
version 5.03, San Diego, E.U.A.).
24
4 RESULTADOS
4.1 Pressão arterial sanguínea e massa corporal
A PA dos
animais dos
grupos
WKY-C
e WKY-ROS
não diferiram
significativamente (P>0,05) ao longo do período experimental (Figura 3). Os animais dos
grupos SHR-C e SHR-ROS apresentaram um nível de PA mais elevado (de 163±15 a 202±9 e
de 155±12 a 207±7 respectivamente) (P<0,05) depois das cinco semanas de experimento se
comparado com o período inicial de experimentação (considerado como semana 0). Estas
alterações se tornaram significativas a partir da 2ª semana de experimento.
25
Figura 3: Pressão arterial antes e durante as cinco semanas de tratamento. Abreviação:
C, controle; SHR, ratos espontaneamente hipertensos; ROS, rosuvastatina 20mg/kg/dia
administrado via orogástrica; WKY, ratros Wistar-Kyoto. One way ANOVA pós-teste de
Tukey; P<0.001, quando: (a) vs. WKY-C, (b) vs. WKY-ROS.
A MC dos animais dos grupos WKY-C e WKY-ROS não diferiram
significativamente (P>0,05) ao longo do período experimental, assim como a massa dos
animais dos grupos SHR-C e SHR-ROS também não diferiram (Figura 4). Porém, houve
diferença entre os animais das linhagens WKY e SHR no período inicial dos experimentos
(semana 0), e esta diferença permaneceu depois de cinco semanas de tratamento com
rosuvastatin (P<0,01).
26
Figura 4: Massa corporal antes e durante as cinco semanas de tratamento. Abreviação: C,
controle; SHR, ratos espontaneamente hipertensos; ROS, rosuvastatina 20mg/kg/dia
administrado via orogástrica; WKY, ratros Wistar-Kyoto. One way ANOVA pós-teste de
Tukey; P<0.001, quando: (a) vs. WKY-C, (b) vs. WKY-ROS.
4.2 Excreção urinária e análise bioquímica de sangue
Não houve diferença significativa dos níveis séricos de uréia, creatinina, ácido úrico
e CPK entre os animais dos grupos estudados (P>0,05) (Tabela 1).
27
Tabela 1
Efeitos da rosuvastatina nos níveis séricos de uréia, creatinina, ácido úrico e creatina
fosfoquinase (CPK) dos animais dos grupos estudados
Grupos
Uréia
Creatinina
Ácido Urico
CPK
(n=8)
(mg/dl)
(mg/dl)
(mg/dl)
(U/I)
WKY-C
45,1±1,17
0,5±0,01
1,3±0,06
876,7±131,62
WKY-ROS
44,5±0,89
0,5±0,01
1,1±0,02
662,7±73,27
SHR-C
48,3±1,10
0,5±0,01
1,3±0,09
866,8±65,72
SHR-ROS
50,8±1,39
0,4±0,01
1,3±0,11
603,0±48,70
Tabela: O sangue foi retirado por punção cardíaca de ratos e imediatamente usado
para determinar os efeitos da rosuvastatina nos níveis séricos de uréia, creatina, ácido úrico e
creatina fosfoquinase (CPK) utilizados como biomarcadores da função renal. Nenhuma
diferença estatística foi encontrada entre os animais dos grupos estudados (P>0,05).
Abreviação: C, controle; SHR, ratos espontaneamente hipertensos; ROS, rosuvastatina
20mg/kg/dia administrado via orogástrica; WKY, ratros Wistar-Kyoto.
Houve um aumento significativo da excreção de proteína de 24 horas nos animais
dos grupos SHR-C se comparado com os animais dos grupos WKY-C e WKY-ROS (P
<0,01). Apesar dos animais do grupo SHR-ROS terem exibido uma diminuição na excreção
de proteína, este resultado não foi significativo quando comparado com qualquer animal dos
outros grupos (P>0,05) (Figura 5).
28
Figura 5: Proteína urinária excretada. Houve um aumentando significativo da
excreção de proteína de 24 horas nos animais dos grupos SHR-C (a,b) se comparado com os
animais dos grupos WKY-C e WKY-ROS. Apesar dos animais do grupo SHR-ROS terem
exibido uma diminuição na excreção de proteína, este resultado não foi significativo quando
comparado com qualquer animal dos outros grupos. Abreviação: C, controle; SHR, ratos
espontaneamente hipertensos; ROS, rosuvastatina 20mg/kg/dia administrado via orogástrica;
WKY, ratros Wistar-Kyoto. P<0,01 quando comparado a (a) e (b).
4.3 Morfometria
Não houve diferença significativa (P>0,05) na área do Espaço Urinário entre os
glomérulos dos animais de nenhum dos grupos estudados (Figura 6 a).
29
Espaço Urinário
25000
Área (µ m2)
20000
15000
10000
5000
S
O
SH
R
-R
SH
R
-C
S
K
YR
O
W
W
K
YC
0
Figura 6 a: Morfometria das estruturas glomerulares. Não houve diferença
significativa na área do espaço urinário entre os glomérulos dos animais de nenhum dos
grupos estudados (Figura 4 a). Abreviação: C, controle; SHR, ratos espontaneamente
hipertensos; ROS, rosuvastatina 20mg/kg/dia administrado via orogástrica; WKY, ratros
Wistar-Kyoto.
Houve um aumento significativo (P<0,05) da área capsular dos glomérulos dos
animais do grupo SHR-C se comparado com os animais dos grupos WKY-C e WKY-ROS.
Apesar dos animais do grupo SHR-ROS exibirem uma diminuição na área capsular dos seus
glomérulos, este resultado não foi significativo quando comparado com qualquer animal dos
outros grupos (P>0,05) (Figura 6 b).
30
Figura 6 b: Morfometria das estruturas glomerulares. Houve um aumento
significativo da área capsular dos glomérulos dos animais do grupo SHR-C se comparado
com os animais dos grupos WKY-C e WKY-ROS. Apesar dos animais do grupo SHR-ROS
exibirem uma diminuição na área capsular dos seus glomérulos, este resultado não foi
significativo quando comparado com qualquer animal dos outros grupos (Figura 4 b).
Abreviação: C, controle; SHR, ratos espontaneamente hipertensos; ROS, rosuvastatina
20mg/kg/dia administrado via orogástrica; WKY, ratros Wistar-Kyoto. P<0,05 quando
comparado a (a) e (b).
4.4 Microscopia eletrônica de transmissão
O diafragma da fenda de filtração e os pedicelos se apresentam preservados na
barreira de filtração glomerular nos rins dos animais dos grupos WKY-C (Figura 7 a), WKYROS (Figura 7 b) e SHR-ROS (Figura 7 d). Nos rins dos animais do grupo SHR-C (Figura 7
c) o diafragma da fenda de filtração está ausente, os podócitos se apresentaram vacuolizados e
os pedicelos alterados, apresentando-se mais curtos e mais espessos.
31
Figura 7: Microscopia eletrônica de transmissão. O diafragma da fenda de filtração
(setas) e os pedicelos (α) se apresentam preservados na barreira de filtração glomerular nos
rins dos animais dos grupos WKY-C (a), WKY-ROS (b) e SHR-ROS (d). Nos rins dos
animais do grupo SHR-C (c) o diafragma da fenda de filtração está ausente, os podócitos se
apresentaram vacuolizados e os pedicelos alterados, apresentando-se mais curtos e mais
espessos. (a) WKY-C, (b) WKY-ROS, (c) SHR-C, (d) SHR-ROS. Abreviação: C, controle;
SHR, ratos espontaneamente hipertensos; ROS, rosuvastatina 20mg/kg/dia administrado via
orogástrica; WKY, ratros Wistar-Kyoto.
32
4.5 Microscopia eletrônica de varredura
Os pedicelos dos glomérulos renais dos rins dos animais dos grupos WKY-C (Figura
8 a), WKY-ROS (Figura 8 b) e SHR-ROS (Figura 8 d) se apresentaram preservados. Nos
animais do grupo SHR-C (Figura 8 c) os pedicelos se apresentam mais delgados, curtos e
tortuosos.
Figure 8: Microscopia eletrônica de varredura. Os pedicelos (setas) dos glomérulos
renais dos rins dos animais dos grupos WKY-C (a), WKY-ROS (b) e SHR-ROS (d) se
apresentaram preservados. Nos animais do grupo SHR-C (c) os pedicelos se apresentam mais
afilados, curtos e tortuosos. (a) WKY-C, (b) WKY-ROS, (c) SHR-C, (d) SHR-ROS.
Abreviação: C, controle; SHR, ratos espontaneamente hipertensos; ROS, rosuvastatina
20mg/kg/dia administrado via orogástrica; WKY, ratros Wistar-Kyoto.
33
4.6 Imunofluorescência
Houve imunofluorescência para Cx-43 nas células epiteliais viscerais dos glomérulos
dos animais do grupo WKY-ROS (Figura 9 b) e em células epiteliais parietais e viscerais dos
glomérulos dos animais do grupo SHR-ROS (Figura 9 d) se comparados aos animais dos
grupos WKY-C (Figura 9 a) e SHR-C (Figura 9 c).
34
Figura 9: Imunofluorescência para conexina-43 nos glomérulos. Houve
imunofluorescência para Cx-43 (setas) nas células epiteliais viscerais dos glomérulos dos
animais do grupo WKY-ROS (b) e em células epiteliais parietais e viscerais dos glomérulos
dos animais do grupo SHR-ROS (d) se comparados aos animais dos grupos WKY-C (a) e
SHR-C (c).
(a) WKY-C, (b) WKY-ROS, (c) SHR-C, (d) SHR-ROS. Abreviação: C,
controle; SHR, ratos espontaneamente hipertensos; ROS, rosuvastatina 20mg/kg/dia
administrado via orogástrica; WKY, ratros Wistar-Kyoto.
35
5 DISCUSSÃO
O objetivo do presente estudo foi prover nova informação sobre o desenvolvimento
do dano renal nos rins de animais hipertensos e como os efeitos pleiotrópicos da rosuvastatina
são benéficos a estes animais.
Em rins com lesão, o reflexo miogênico está falho, a auto-regulação renal está
prejudicada, e a habilidade de prevenir a transmissão da pressão arterial sistêmica na
circulação glomerular é parcialmente ou totalmente perdida. Por conseguinte, a pressão
intraglomerular começa a mudar em proporção direta às mudanças na pressão arterial
sistêmica (Palmer & Fenves, 2010). Remodelamentos em vasos sanguíneos expostos a níveis
pressóricos aumentados levam ao desenvolvimento de nefrosclerose benigna com o passar do
tempo. Porém, quando a PA excede o limiar de auto-regulação, há um aumento do risco para
injuria vascular, resultando em nefrosclerose maligna aguda, e a habilidade autoregulatoria da
vasculatura pré-glomerular de preservar os vasos capilares glomerulares se apresenta falha
(Bidani et al., 2009). Nos animais SHR as arteríolas aferentes menos calibrosas são uma
possível causa para a resistência vascular renal aumentada. A resistência vascular renal está
aumentada nos animais SHR, possivelmente como resultado destas arteríolas menos
calibrosas e, após o início da hipertensão, provavelmente também como conseqüência da
auto-regulação fisiológica (Ren et al., 2010; Ofstad & Iversen, 2005). Foram observados
através do MET que o diafragma da fenda de filtração e os pedicelos se apresentam
preservados na barreira de filtração glomerular nos rins dos animais dos grupos WKY-C,
WKY-ROS e SHR-ROS. Nos rins dos animais do grupo SHR-C os podócitos se apresentaram
vacuolizados e os pedicelos alterados, apresentando-se mais curtos e mais espessos. A pressão
intraglomerular aumentada poderia ser uma possível explicação de como a hipertensão afeta a
ultra-estrutura glomerular dos rins dos animais do grupo SHR-C.
36
Para um melhor entendimento das alterações encontradas nos pedicelos, esta
estrutura foi examinada utilizando MEV. Nossos experimentos mostraram que os pedicelos
dos glomérulos renais dos rins dos animais dos grupos WKY-C, WKY-ROS e SHR-ROS se
apresentaram preservados. Nos animais do grupo SHR-C os pedicelos se apresentam mais
delgados, curtos e tortuosos. Estas observações estão de acordo com o fato de que a
rosuvastatina significativamente reduz apoptose induzida em podócito, sugerindo que
estatinas podem ter um efeito generalizado na sobrevida dos podócitos agindo de maneira
p21-dependente. P21 citoplasmático tem sido descrito ligado à procaspase3 e assim
prevenindo sua ativação, interferindo com a apoptose mediada por Fas (Cormack-Aboud et
al., 2009).
Alterações da barreira de filtração glomerular podem causar proteinuria (Tryggvason
et al., 2006). Esta barreira possui três camadas: o endotélio fenestrado, a membrana de
filtração glomerular, e os podócitos. Acredita-se que a barreira de filtração seja uma barreira
seletiva, selecionando as particulas por tamanho e carga. O diafragma da fenda de filtração
tem um papel importante e direto na filtração glomerular. Alguns de seus componentes
protéicos estão envolvidos nos mecanismos de proteinuria (Putaala et al., 2001; Donoviel et
al., 2001; Ciani et al., 2003; Roselli et al., 2004). Em nossos experimentos, observamos que
componentes da barreira de filtração glomerular, como o diafragma da fenda de filtração e os
pedicelos estão alterados em animais do grupo SHR-C.
A proteinuria é um útil marcador de dano renal associado à hipertensão, sendo um
fator de risco para a progressão da doença renal (Atkins et al., 2005; Flack et al., 2010).
Houve um aumento significativo da excreção de proteína de 24 horas nos animais dos grupos
SHR-C se comparado com os animais dos grupos WKY-C e WKY-ROS. Apesar dos animais
do grupo SHR-ROS terem exibido uma diminuição na excreção de proteína, este resultado
não foi significativo quando comparado com qualquer animal dos outros grupos. Levando em
37
conta que não houve diferença significativa dos níveis séricos de uréia, creatinina, ácido úrico
e CPK entre os animais dos grupos estudados, uma possível explicação, é que as alterações
estruturais começariam antes dos distúrbios bioquímicos. Portanto, os efeitos benéficos
observados neste estudo são pelo menos em parte atribuíveis ao fato da rosuvastatina ter
ocasionado a diminuição da proteinúria como causa da preservação da integridade dos
podócitos, como mostrada por nossos resultados ultra-estruturais.
A taxa de filtração de glomerular total depende da integridade estrutural e da área
dos glomérulos. A mensuração da área ou volume glomerular tem sido amplamente
empregada em biologia humana e experimental (Ossani et al., 2009). Em nossos experimentos
observamos que não houve diferença significativa na área do espaço urinário entre os
glomérulos dos animais de nenhum dos grupos estudados.
Porém, houve um aumento
significativo da área capsular dos glomérulos dos animais do grupo SHR-C se comparado
com os animais dos grupos WKY-C e WKY-ROS. Apesar dos animais do grupo SHR-ROS
exibirem uma diminuição na área capsular dos seus glomérulos, este resultado não foi
significativo quando comparado com qualquer animal dos outros grupos.
As junções intracelulares do tipo GAP são o resultado da associação de 2 hemicanais nomeados conexons. Cada conexon é um conjunto de 6 proteínas de membrana
chamadas conexinas. Estudos ultra-estruturais realizados em humanos e ratos têm mostrado a
presença de junções GAP em todas as células glomerulares e os podócitos têm mostrado
conter principalmente Cx-43 (Hanner et al., 2010). Dlugosova et al. (2009) demonstraram que
a hipertensão altera a expressão de Cx-43 em aorta de animais SHR. Houve um aumento da
imunofluorescência para Cx-43 nas células epiteliais viscerais dos glomérulos dos animais do
grupo WKY-ROS e em células epiteliais parietais e viscerais dos glomérulos dos animais do
grupo SHR-ROS se comparados aos animais dos grupos WKY-C e SHR-C. O aumento da
imunofluorescência para Cx-43 em WKY-ROS e SHR-ROS provavelmente indica que a
38
rosuvastatina exerceu algum efeito sobre a expressão de Cx-43 em animais hipertensos e
normotensos no período estudado. Yaiota et al. (2002) descreveram um aumento precoce da
expressão de Cx-43 em resposta ao dano de podócitos e concluiu que a Cx-43 é expressa nos
podócitos injuriados como um epitélio integrado do glomérulo em vez de individualmente
como uma célula separada. Em oposição, nossos resultados indicam que a expressão da Cx43 está presente em células de glomérulos renais que sofreram ação benéfica da rosuvastatina.
Portanto, podemos então sugerir que provavelmente há uma melhora na qualidade de resposta
glomerular nos animais tratados com rosuvastatina.
Os resultados obtidos demonstraram que a hipertensão provoca alterações
ultraestruturais glomerulares da barreira de filtração. Estas alterações relacionadas com a
estrutura dos pedicelos e da membrana da fenda de filtração que podem comprometer a
filtração glomerular foram preservadas com a utilização da rosuvastatina. Além da
preservação destas estruturas, a rosuvastatina também proporcionou a manutenção do
diâmetro normal dos glomérulos e dos espaços urinários.
39
6 CONCLUSÕES
A análise dos resultados obtidos neste trabalho permite concluir que a rosuvastatina:
- não altera a pressão arterial sanguínea ou a massa corporal de animais normotensos e
hipertensos;
- altera a excreção urinária de proteínas em animais hipertensos;
- não altera parâmetros bioquímicos do sangue de animais normotensos e hipertensos;
- altera a morfometria glomerular de animais hipertensos;
- altera a ultra-estrutura glomerular dos rins de animais hipertensos;
- altera a expressão de Cx-43 nas células glomerulares dos rins de animais
normotensos e hipertensos.
40
7 RECONHECIMENTOS
Este estudo foi apoiado pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico (CNPq), Fundação Carlos Chagas Filho que Amparo à Pesquisa do Estado do
Rio de Janeiro (FAPERJ), de da Coordenação de Aperfeiçoamento Pessoal de Nível Superior
(Capes) e da Universidade do Estado do Rio de Janeiro (UERJ).
41
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