UNIVERSIDADE DE TRÁS-OS-MONTES E ALTO DOURO
EFEITO DE ÓLEOS ESSENCIAIS DE PLANTAS
AROMÁTICAS NO COMPORTAMENTO DE
SALMONELLA SPP. EM SALSICHAS FRESCAS
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO EM SEGURANÇA ALIMENTAR
INÊS PEREIRA DA FONSECA
Vila Real, 2012
UNIVERSIDADE DE TRÁS-OS-MONTES E ALTO DOURO
EFEITO DE ÓLEOS ESSENCIAIS DE PLANTAS
AROMÁTICAS NO COMPORTAMENTO DE
SALMONELLA SPP. EM SALSICHAS FRESCAS
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO EM SEGURANÇA ALIMENTAR
INÊS PEREIRA DA FONSECA
Orientador: Professor Doutor Luís Avelino da Silva Coutinho Patarata
Vila Real, 2012
Agradecimentos
O espaço limitado desta secção de agradecimentos, seguramente, não me permite
agradecer, como devia, a todas as pessoas que, ao longo do meu Mestrado em
Segurança Alimentar me ajudaram, direta ou indiretamente, a cumprir os meus
objetivos e a realizar mais esta etapa da minha formação académica. Desta forma, deixo
apenas algumas palavras, de um sentido e profundo agradecimento.
Ao meu orientador Professor Doutor Luís Patarata, pela orientação deste trabalho e pela
sua dedicação, ajuda, paciência, confiança, persistência, disponibilidade e conhecimento
transmitido e acima de tudo, pela sua amizade. Muito obrigada!
Ao Sr. Felisberto Borges, Sra. Ana Leite e Sra. Fátima Silva pelo apoio prestado no
laboratório durante todo trabalho prático, pelo conhecimento transmitido, pela
motivação, boa disposição e pelos bons momentos passados.
À Regina Esteves um agradecimento muito especial pela ajuda na execução deste
trabalho, pela amizade, carinho, diversão e bons momentos passados, pela força e por
estar comigo nos bons e maus momentos. Ah, e pelos momentos de descompensação!
Muito obrigada!
Ao Fábio António, à Olívia Machado, à Vânia Barros e à Sara Gabriel pela ajuda no
laboratório, por todo o carinho e amizade e também por estarem comigo em todos os
momentos.
À Marisa João por estar sempre de braços abertos para me receber na sua casa, por toda
a amizade e carinho, pela força e pelas ótimas conversas na sua varanda.
À Mónica Lopes e à Maria João Carvalho, pela amizade, companheirismo,
cumplicidade, pelo apoio e incentivo, por terem sempre uma palavra e um ombro amigo
e sobretudo por estarem sempre presentes nesta minha caminhada.
A todos os meus amigos, que não refiro especificamente, mas que sempre fizeram parte
da minha vida e me apoiaram, incentivaram e estiveram comigo em toda esta
caminhada.
Á Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, pelas facilidades concedidas.
A todos aqueles que, mesmo não os tendo referido especificamente, contribuíram direta
ou indiretamente para a realização deste trabalho.
Por fim, à minha família, em especial aos meus pais e aos meus irmãos, um enorme
obrigada por acreditarem sempre em mim e naquilo que faço e por todos os
ensinamentos de vida. Espero que esta etapa, que agora termino, possa, de alguma
forma, retribuir e compensar todo o carinho, apoio e dedicação que, constantemente, me
oferecem. A eles, dedico todo este trabalho.
“ Por vezes sentimos que aquilo que fazemos não é senão uma gota de água no
mar. Mas o mar seria menor se lhe faltasse uma gota. “
Madre Teresa de Calcutá
Índice
Resumo
i
Abstract
ii
Índice de quadros
iii
Índice de figuras
iv
1. INTRODUÇÃO
1
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
4
2.1 Salsicha fresca
4
2.1.1 Matérias-primas
6
2.1.1.1 Carne
6
2.1.1.2 Tripa
6
2.1.1.3 Água
7
2.1.1.4 Sal
7
2.1.1.5 Aditivos
7
2.1.1.6 Condimentos e especiarias
9
2.2 Plantas aromáticas e óleos essenciais
10
2.2.1 Alho (Allium sativum L.)
11
2.2.2 Orégão (Origanum vulgare)
12
2.3 Microrganismos responsáveis por toxi-infeções alimentares
14
3. MATERIAL E MÉTODOS
17
3.1 Estrutura do trabalho
17
3.2 Determinações em salsichas frescas comerciais
19
3.2.1 Determinação da composição química bruta
19
3.2.2 Pesquisa de Salmonella spp.
19
3.3 Efeito da adição de óleos essenciais de plantas na resistência de Salmonella spp. ao
calor
20
3.3.1 Obtenção dos óleos essenciais
20
3.3.2 Microrganismos e condições de crescimento
20
3.3.3 Avaliação da atividade inibitória dos óleos essenciais de alho e de orégão
21
3.3.4 Preparação da massa de salsicha
22
3.3.5 Determinação dos parâmetros de resistência térmica de Salmonella spp.
21
3.3.6 Avaliação sensorial de massa de salsicha fresca com óleos essenciais de alho e
orégão
23
3.4 Tratamento de dados
24
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
25
4.1. Determinações realizadas em salsichas frescas de proveniência comercial
25
4.1.1. Composição química bruta
25
4.1.2. Pesquisa de Salmonella spp.
27
4.2. Sensibilidade de Salmonella spp. ao óleo essencial de alho e de orégão
28
4.3 Resistência de Salmonella spp. ao calor em massa de salsicha fresca com óleo
essencial de alho ou de orégão
31
4.3.1. Cálculo do valor D
35
4.3.2. Modelo preditivo para estimativa do tempo de morte térmica
37
4.4. Avaliação sensorial de massa de salsicha fresca
48
5. CONCLUSÃO
50
6. BIBLIOGRAFIA
51
Resumo
Salsicha fresca é um enchido cru constituído por carne e gordura frescas de porco,
adicionadas de condimentos e aditivos Por ser um produto cuja segurança biológica só
consegue ser assegurada pelo tratamento térmico efetuado pelo consumidor final quando faz
a preparação culinária da salsicha, é importante garantir que a contaminação com agentes
patogénicos é tão reduzida quanto possível, e desenvolver estratégias para melhorar a
eficácia do tratamento térmico culinário. Os óleos essenciais de plantas, para além da
potencial vantagem sensorial que podem conferir ao produto, permite dispensar a utilização
direta da planta, ou seu extrato, como condimento, que pode ser um potencial veículo de
microrganismos. Adicionalmente, estes óleos essenciais têm demonstrado uma elevada
eficácia na inibição de alguns microrganismos patogénicos em alimento, de entre os quais
Salmonella spp., que se configura como um dos perigos biológicos mais preocupantes no
fabrico de salsichas frescas. O objetivo do presente trabalho foi o de avaliar o efeito da
utilização de óleos essenciais de alho e orégãos e nos parâmetros de resistência ao calor
Salmonella spp.em massa de salsicha fresca. A introdução de óleo de alho e de orégão
em massa de salsicha fresca nos níveis estudados no presente trabalho teve um efeito
importante na redução da microflora quando a massa da salsicha foi aquecida. Os
parâmetros de morte térmica -valores D e z- não puderam ser calculados pois a cinética
de morte microbiana apresentou-se não linear. Aplicou-se um modelo preditivo baseado
na função exponencial que se mostrou bem adequado aos dados. Com esse modelo foi
possível estimar o tempo necessário para produzir uma redução na microflora prédeterminada. Na estimativa de tempo para produzir uma redução de 7D o efeito da
adição dos óleos essenciais mostrou-se significativo. O óleo de orégão permitiu reduzir
para cerca de metade a duração de alguns tratamentos térmicos e não apresentou
consequências negativas nas características sensoriais, sendo que o nível de adição de
0,05% foi muito apreciado. O óleo essencial de alho conferiu um aroma demasiado forte
e uma coloração esverdeada o que contribuiu para a sua fraca aceitação.
Palavras-chave: salsicha fresca, Salmonella, óleo essencial, alho, orégão, resistência
térmica
i
Abstract
Fresh sausage is made from fresh pork and fat, with added spices and additives. Its
biological safety can only be ensured by heat treatment performed by the end user when
doing the culinary preparation of sausage. Thus, it is important to ensure that
contamination with pathogens is reduced as much as possible, and to develop strategies
for improve the effectiveness of the culinary heat treatment. The essential oils of plants,
in addition to its sensory advantage, avoiding the use of pant parts as spices, which may
be a potential vehicle for microorganisms, have demonstrated high efficacy in the
inhibition of pathogenic microorganisms in food, including Salmonella spp. which is the
biological hazards of most concern in the manufacture of fresh sausages. The aim of this
study was to evaluate the effect of essential oils of garlic and oregano and heat
resistance parameters Salmonella spp. in fresh sausage. The introduction of garlic and
oregano oil in fresh sausage had an important effect in reducing microflora when the
sausage was heated. The thermal death parameters -D and z-values could not be
calculated because the kinetics of microbial death was nonlinear. It was applied a
predictive model based on the exponential, that was adequate for the data. With this
model it was possible to estimate the time required to produce a reduction in microflora
predetermined. The estimated time to produce a reduction of 7D was strongly
influenced by the use of essential oils. Oregano oil was responsible for a reduction of
about half the time of some heat treatment and showed no adverse effects on the sensory
characteristics.. The essential oil of garlic was responsible for a very strong odour and a
greenish colour, which contributed to its poor acceptance.
Keywords: fresh sausage, Salmonella, essential oil, garlic, oregano, thermal resistance
ii
Índice de quadros
Quadro 2.1. Aditivos da salsicha fresca admitidos na NP723 (2006) e respetivo Valores
Máximos Admitidos (VMA)
Quadro 2.2. Atividade antimicrobiana de óleo essencial de orégão (Origanum vulgare)
Quadro 2.3. Atividade antimicrobiana de alguns componentes do óleo essencial de
orégão (Origanum vulgare)
Quadro 2.4. Principais características de Salmonella spp.
Quadro 3.1. Formulação da massa de salsicha fresca para determinação dos parâmetros
de morte térmica de Salmonella spp.
Quadro 3.2. Tempos de exposição a cada temperatura estudada
Quadro 4.1. Composição química bruta (%) de salsichas frescas de 15 proveniências
comerciais (médias de duas repetições)
Quadro 4.2. Sensibilidade de Salmonella spp. ao óleo de alho e óleo de orégão; - não
apresentou crescimento, + apresentou crescimento; observações feitas às 24 e 48h
Quadro 4.3 Redução percentual do número de Salmonella spp. após aquecimento a
55ºC, 60ºc e 65ºC (média ± desvio padrão)
Quadro 4.4. Equações das retas e parâmetros associados obtidos por regressão da
totalidade dos tempos de aquecimento (a), utilizando o segmento reto excluindo o
tempo zero (b) e utilizando o segmento reto definido pelo tempo zero e 5 minutos (c).
Resultados relativos a uma repetição do ensaio a 55ºC, amostras controlo (sem adição
de óleo essencial)
Quadro 4.5. Parâmetros do modelo de estimativa não linear baseado na função de
crescimento exponencial para cada temperatura testada (55ºC, 60ºC e 65ºC) nas
diferentes condições de ensaio e para cada repetição individualmente
Quadro 4.6, Comparação do tempo necessário (minutos) estimado para produzir uma
redução de 7D, 5D e 3D na população de Salmonella spp., em massa de salsicha fresca
para cada temperatura testada (55ºC, 60ºC e 65ºC) nas diferentes condições de ensaio
iii
Ìndice de figuras
Figura 2.1: Diagrama de fabrico da salsicha fresca
Figura 2.2. Estrutura química da alicina
Figura 2.3. Estruturas químicas do carvacrol, p-cimeno e timol respectivamente
Figura 3.1. Esquema geral do trabalho experimental
Figura 4.1. Valores de pH de salsichas frescas de 15 proveniências comerciais (médias
de duas repetições)
Figura 4.2. Número de sobreviventes (log ufc/g) após aquecimento a 55ºC ao longo de
35 minutos
Figura 4.3. Número de sobreviventes (log ufc/g) após aquecimento a 60ºC ao longo de
14 minutos
Figura 4.4. Número de sobreviventes (log ufc/g) após aquecimento a 65ºC ao longo de
14 minutos
Figura 4.5. Retas obtidas por regressão da totalidade dos tempos de aquecimento (a),
utilizando o segmento reto excluindo o tempo zero (b) e utilizando o segmento reto
definido pelo tempo zero e 5 minutos (c). Resultados relativos a uma repetição do
ensaio a 55ºC, amostras controlo (sem adição de óleo essencial)
Figura 4.6. Curvas de inativação térmica a 55ºC nas diferentes condições de ensaio
obtidas com o modelo de crescimento exponencial
Figura 4.7. Curvas de inativação térmica a 60ºC nas diferentes condições de ensaio
obtidas com o modelo de crescimento exponencial
Figura 4.8. Curvas de inativação térmica a 65ºC nas diferentes condições de ensaio
obtidas com o modelo de crescimento exponencial
Figura 4.9. Características sensoriais de massa de salsicha grelhada preparada de com
dois níveis de óleo de alho ou de orégão e controlo, A pontuação foi efetuada numa
escala de intensidade de 7 pontos
iv
1. INTRODUÇÃO
É um direito das pessoas terem a expectativa de que os alimentos que consomem
sejam seguros e adequados para consumo. As doenças e os danos provocados por
alimentos são, na melhor das hipóteses, desagradáveis, e, na pior das hipóteses, fatais.
Nas duas últimas décadas, os hábitos alimentares têm passado por mudanças em
muitos países, acarretando o desenvolvimento de novas técnicas de produção,
preparação e distribuição de alimentos. Portanto, um controle eficaz de higiene tornouse imprescindível para se evitar consequências prejudiciais decorrentes de doenças e
danos provocados pelos alimentos à saúde humana e à economia. Todos – agricultores e
cultivadores, fabricantes e processadores, manipuladores de alimentos e consumidores –
têm a responsabilidade de garantir que o alimento seja seguro e adequado para
consumo. Embora estejam a ser feitos grandes esforços, por parte das entidades
governamentais de todo o mundo, no sentido de promover a melhoria da segurança ao
longo da cadeia alimentar, a ocorrência de doenças de origem alimentar continua a ser
um problema significativo de saúde pública, quer nos países desenvolvidos quer nos
países em desenvolvimento (Codex Alimentarius, 2006).
Anualmente são documentados na Europa, pela European Food Safety Agency
(EFSA), graves surtos de gastroenterites, sendo a salmonelose a segunda doença mais
frequentemente relatada. Na União Europeia, as carnes picadas e preparados de carne
são os produtos mais implicados na salmonelose e considerados não conformes
relativamente à presença de Salmonella (EFSA, 2012). Há ainda portanto uma
necessidade de novos métodos de redução ou eliminação de microrganismos
patogénicos, possivelmente em combinação com métodos já existentes (Burt, 2004).
Embora existam na indústria alimentar uma série de conservantes, esta experiencia a
falta de agentes de conservação potentes o suficiente, que possam assegurar a segurança
dos alimentos ou dos produtos alimentares (Bajpai et al., 2012).
Ao mesmo tempo, a sociedade ocidental parece experimentar uma tendência de
consumismo “verde” (Burt, 2004), desejando menos aditivos alimentares sintéticos e
produtos com um menor impacto no ambiente. Para além disso, a Organização Mundial
de Saúde apelou recentemente a um menor consumo de sal a nível mundial, no sentido
de reduzir a propensão a doenças cardiovasculares (OMS, 2002). Daqui se depreende
que se o nível de sal em alimentos processados é reduzido, é possível que sejam
1
necessários outros aditivos para manter a segurança alimentar. Existe, por conseguinte,
oportunidade para novos métodos de tornar os alimentos seguros e que tenham uma
imagem natural ou “verde”. Uma dessas possibilidades é o uso de óleos essenciais como
aditivos antibacterianos (Burt, 2004).
Durante milhares de anos os óleos e extratos de plantas foram usados para diversas
finalidades (Hammer et al.,1999). A história dos óleos essenciais está intimamente
ligada à das plantas aromáticas.
Óleos essenciais, também chamados de óleos voláteis ou etéreos, são líquidos
aromáticos obtidos a partir de material vegetal (raízes, rizomas, sementes, frutos, flores,
folhas, bolbos e partes lenhosas) (Burt, 2004). Existem cerca de três mil óleos essenciais
com eficácia biológica, são comercializados e destinados sobretudo ao uso na indústria
de sabores e fragrâncias (Bajpai et al., 2012). Os componentes individuais dos óleos
essenciais são igualmente utilizados como aromatizantes dos alimentos, quer os extratos
da planta quer os sintéticos. Para além disso, os óleos essenciais e os seus componentes
possuem propriedades antibacterianas que são aproveitadas em diversos produtos como
antissépticos (Burt, 2004).
Os óleos essenciais constituem-se em complexas misturas de substâncias voláteis,
geralmente lipofílicas (Santurio et al., 2007.), cujos componentes incluem
hidrocarbonetos terpénicos, álcoois simples, aldeídos, cetonas, fenóis, ésteres, ácidos
orgânicos, entre outros, em diferentes concentrações, nos quais, um composto
farmacologicamente ativo é majoritário. Dos óleos essenciais com maior interesse na
indústria de produtos cárneos, destaca-se a utilidade do alho e do orégão. O primeiro
pela sua utilização corrente como tempero desses produtos, e o segundo pela
possibilidade sensorial da sua utilização, e pela forte atividade antimicrobiana que tem
sobre microrganismos patogénicos. No alho (Allium sativum L.) o principal componente
ativo contra microrganismos é a alicina (dialil-tiosulfinato ou 2-propenil-propeno
tiosulfinato) (Corzo-Martínez et al., 2007). Esta é conhecida como o principal
ingrediente do alho que tem atividade antimicrobiana sobre bactérias Gram positivas e
negativas (Rahman et al., 2007). Os orégãos (Origanum vulgare L.) são uma especiaria
tradicional do Mediterrâneo. O óleo essencial de orégãos contém mais de 30 compostos
entre os quais compostos fenólicos com forte poder antioxidante e atividade
antimicrobiana tais como o carvacrol e timol (Figiel et al., 2010; Zhang et al., 2010).
2
O objetivo do presente trabalho foi o de avaliar o efeito da utilização de óleos essenciais
de alho e orégãos e nos parâmetros de resistência do calor Salmonella spp. em massa de
salsicha fresca.
3
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Salsicha fresca
A NP723 de 2006 define a salsicha fresca como um enchido cru, de massa
granulosa, constituído por carne e gordura de suíno fresca, adicionadas de condimentos
(sal refinado e especiarias) e aditivos, nomeadamente antioxidantes, aromatizantes,
emulsionantes, estabilizadores do equilíbrio físico, reguladores de acidez, intensificador
de sabor, conservantes, água potável e corantes. O formato da salsicha fresca é
cilíndrico com diâmetro e comprimento variável, sendo apresentado em cadeia, por
simples torção de tripa natural de ovino com diâmetro e comprimento variáveis,
segundo prática da região ou do fabricante. Organolepticamente a salsicha fresca
apresenta-se de cor rosada, brilhante e de aspeto marmoreado.
Em termos de características físico-químicas, a no passado a NP723 (1988)
estabelecia que o produto devia conter no mínimo, 11% de proteína total, 30% de
gordura livre máxima e a humidade do produto desengordurado não devia ser superior a
84%. Podia ainda conter proteínas não cárneas, no máximo de 5% relativamente ao total
de ingredientes. Porém, essas limitações quantitativas foram suprimidas da norma na
sua revisão de 2006 (NP 723, 2006).
Na figura 2.1 está representado um fluxograma geral de fabrico de salsicha fresca.
4
Figura 2.1: Diagrama de fabrico da salsicha fresca (Fonte: Carnes VALINHO citado
em Conceição, 2012)
5
2.1.1. Matérias-primas
2.1.1.1 Carne
A carne, essencialmente de porco, constitui a matéria-prima principal da maioria dos
produtos cárneos transformados. A sua composição química varia conforme a espécie
animal, idade e zona muscular em causa, em termos gerais, contém 75% de água, 18%
de proteínas, 3,5% de substâncias não proteicas solúveis e 3% de gordura (Prandl et al.,
1994).
A carne define-se como a parte comestível da carcaça, sendo usualmente identificada
com o tecido muscular estriado esquelético. No entanto, na sua composição entram
outros tecidos, nomeadamente o conjuntivo (adiposo) e nervoso, contribuindo de modo
apreciável para a sua qualidade (Correia e Correia, 1985). Os diferentes aspetos de
qualidade da carne podem-se dividir em: sensoriais, nutritivos, tecnológicos e higiénicotoxicológicos. Existem quatro características determinantes da qualidade sensorial da
carne e que influenciam o consumidor: cor, sabor, suculência e tenrura (Feiner, 2006).
Os produtos preparados de carne frescos são considerados como muito perecíveis,
apresentando uma reduzida vida útil comercial. Este facto reflete as características
intrínsecas da carne, nomeadamente em termos de valores de aw superiores a 0,98 e de
pH compreendidos entre 5,5 e 5,6 (Prandal et al., 1994). A durabilidade dos preparados
de carne também é, igualmente, influenciada pela qualidade das matérias-primas e pelas
operações unitárias de corte e mistura, necessárias para a elaboração do produto. Para a
salsicha fresca, pode-se considerar que a origem da sua microflora está principalmente
relacionada com a contaminação da carne (Davies, 1998).
2.1.1.2 Tripa
Segundo a Norma Portuguesa723 (2006), a tripa utilizada na salsicha fresca é
uma tripa natural de ovino. A sua função é muito importante visto ser ela que vai servir
de invólucro à massa, definindo o formato.
A tripa natural devido à sua estrutura, apresenta características técnicas de elasticidade,
permeabilidade ao vapor e aos gases, retratilidade, resistência à tração e pressão e ainda
6
de digestibilidade que são difíceis de reproduzir pela tripa artificial. A tripa é
geralmente preservada por salga, cura e/ou secagem (Rufino, 2004). A qualidade
microbiológica da tripa natural depende da higiene dos procedimentos, manipulação
pós-processamento e temperatura de armazenamento (Trigo e Fraqueza, 1998).
2.1.1.3 Água
A água é utilizada na formulação de salsicha fresca, constituindo 20-40% do
total, favorecendo a ligação da carne. É habitual adicionar até 40% de água total, da
formulação do produto, sob a forma de gelo para reduzir o aumento de temperatura e o
crescimento microbiano durante a preparação do produto. (Rego, 2008)
2.1.1.4 Sal
É o ingrediente mais comum e essencial para a formulação destes produtos.
Desempenha funções gustativas, antimicrobianas e promove alterações físico-químicas
no músculo ou tecido adiposo, como a redução da aw (Toldrá, 2002). O crescimento de
algumas bactérias é inibido em concentrações salinas baixas, como 2% de sal no entanto
outros microrganismos, halotolerantes, são capazes de crescer em concentrações mais
elevadas (Wirth, 1993; Toldrá, 2002).
2.1.1.5 Aditivos
Em termos de aditivos permitidos, poderão ser encontrados na salsicha fresca os
constantes do Quadro 1. A parte B do anexo III do Decreto-Lei n.º363/98 de 19 de
Novembro e o Decreto-Lei n.º 33/2008 de 25 de Fevereiro estabelecem o Valor Máximo
Admitido (VMA) para cada aditivo. Os corantes passíveis de ser utilizados são
regulados pelo anexo III do Decreto-lei 120/2011 de 28 de Dezembro (Conceição,
2012).
7
Quadro 2.1. Aditivos da salsicha fresca admitidos na NP723 (2006) e respetivo Valores
Máximos Admitidos (VMA).
Aditivo
VMA (mg/Kg)1
Corantes
E100 – Curcumina
E120 – Cochonilha, carminas, ácido
carmínico
E160c – Extrato de pimentão
E162 – Vermelho de beterraba, betamina
20 mg/Kg
100 mg/Kg
10 mg/Kg
Quantum satis
Conservantes
E221 -Sulfito de sódio
E223 - Metabissulfito de sódio
E224 - Metabissulfito de potássio
450 mg/kg expresso em SO2
(Valor máximo admitido de todas as
origens)
Antioxidantes e sinérgicos
E300 – Ácido L-ascórbico
E301 – L-ascorbato de sódio
E302 – L-ascorbato de cálcio
E330 – Ácido cítrico
E331 – Citratos de sódio
E332 – Citratos de potássio
E333 – Citratos de cálcio
Quantum satis
Aromatizantes
Substâncias naturais ou idênticas às naturais - Sem restrição
Emulsionantes, estabilizadores do equilíbrio físico e reguladores de acidez
E339 – Fosfatos de sódio
E340 – Fosfatos de potássio
E341 – Fosfatos de cálcio
E450 – Difosfatos
E451 – Trifosfatos
E452 – Polifosfatos
Máximo 5 g/kg
Intensificador de sabor
E621 – Glutamato monossódico
Sem restrição
1
VMA estabelecidos pelo Decreto-Lei nº363/98 de 19 de Novembro e Decreto-Lei 33/2008 de 25 de
Fevereiro. Os corantes são regulados pelo Decreto-Lei nº 120/2011 de 28 de Dezembro.
8
2.1.1.6 Condimentos e especiarias
As especiarias e os seus derivados têm sido usados na preparação dos alimentos
há milhares de anos, conferindo-lhes sabor e aroma diferenciados. Determinadas
especiarias, no antigo Egipto, foram empregues em processos de embalsamento, em
muitos países são usadas para fins medicinais e em locais de clima quente onde falta
refrigeração, têm sido utilizadas para melhorar os aspetos organoléticos de carnes
durante o seu armazenamento (Trajano et al., 2009).
Segundo o decreto-lei nº 28/84, entende-se por condimento todo o género
alimentício, com ou sem valor nutritivo, utilizado como ingrediente para conferir ou
aumentar a apetibilidade a outro e inócuo na dose aplicada.
Os condimentos tradicionalmente mais utilizados são o alho, o sal, a massa de
pimentão e o colorau. Estas substâncias são de extrema importância, uma vez que
conferem características organoléticas desejáveis e apreciáveis, contribuindo para a
tipicidade dos produtos. Tem sido demonstrado um papel importante destes
condimentos na inibição da atividade dos microrganismos de degradação e patogénicos
(Silva et al., 2003).
Os condimentos utilizados devem ser puros pois em caso contrário podem
originar produtos cujo sabor e aroma não são característicos (Rufino, 2003).
As especiarias definem-se como substâncias aromáticas de origem vegetal,
utilizadas com a função de fornecer sabores e aromas, não contribuindo para o valor
nutricional dos produtos (Silva et al., 2003). São constituídas de partes de espécies
vegetais, como raízes, rizomas, bolbos, cascas, folhas, flores, frutos, sementes e outras
partes das plantas. A sua concentração nos alimentos é determinada pela preferência de
sabores, normalmente encontrando-se entre 0,5 a 1% no produto final (Bedin et al.,
1999). Muitas ervas e especiarias exercem um efeito antioxidante útil para prevenir a
oxidação de gorduras e possuem propriedades antimicrobianas, prevenindo o
crescimento de bactérias indesejáveis tanto patogénicas como responsáveis pela
deterioração (Chi e Wu, 2007).
Na salsicha fresca, os ingredientes normalmente utilizados são o sal e o alho (e.g.:
pó, granulado, massa). Podem ainda ser adicionadas diversas especiarias e outros
aditivos (Quadro 2.1) normalmente na forma de pré-misturas contendo antioxidantes,
conservantes, corantes por forma a facilitar a sua quantificação e dispersão.
9
2.2. Plantas aromáticas e óleos essenciais
Desde cedo que as qualidades odoríferas de certas plantas foram notadas e
aproveitadas pelo Homem. Muito antes de surgir a escrita, já se utilizavam plantas
aromáticas, aproveitando as propriedades nutritivas, os sabores, os odores e as suas
propriedades curativas (Rego, 2008). Pode-se dividir a história do uso dos condimentos
vegetais (plantas aromáticas) pelo homem em quatro períodos: o da Antiguidade; outro
das civilizações clássicas dos gregos e romanos; um terceiro da Idade média, que inclui
as grandes explorações e o colonialismo; e o dos tempos modernos. (Giacometti, 1989
citado por Ourives, 1997).
As plantas aromáticas podem ser utilizadas sob diversas formas: em fresco, secas,
através do óleo essencial ou do extrato. A sua aplicação em várias indústrias tem longa
tradição, nomeadamente na alimentar, perfumaria, cosmética, farmacêutica e do tabaco,
representando assim um papel de grande importância nas atividades económicas. As
plantas aromáticas são utilizadas como aromatizantes e/ou antioxidantes na indústria
alimentar (Vigil et al., 2005)
O óleo essencial é uma mistura complexa de compostos orgânicos voláteis,
contendo até centenas de constituintes distintos, extraída por processos específicos a
partir de plantas sob a forma de um líquido viscoso. Em algumas plantas, ele forma-se
unicamente como um resultado da reação enzimática natural ocorrida quando o tecido
da planta é macerado. Os óleos essenciais, cujas técnicas de obtenção forma
desenvolvidas fundamentalmente pela indústria de perfumaria, podem ser obtidos por
diversos métodos, nomeadamente extração por pressão, enfleurage ou hidrodestilação.
Este último é o mais comummente usado para a produção comercial dos óleos
essenciais (Burt, 2004).
Os óleos essenciais são conhecidos pela sua ação como potenciais agentes
antimicrobianos, tendo a capacidade de controlar bactérias patogénicas (Oussalah, et al.,
2007). São vários os fatores responsáveis pela eficácia biológica dos óleos essenciais
em alimentos, nomeadamente a temperatura, o pH, a carga microbiana e outros fatores
ambientais (Bajpai et al., 2012).
Os compostos químicos presentes nos óleos essenciais podem ser classificados em
(Vigil et al., 2005):
- hidrocarbonetos de fórmula geral (C5H8)n – terpenos;
10
- derivados oxigenados dos hidrocarbonetos;
- compostos aromáticos possuindo estrutura benzénica;
- compostos contendo azoto (N) ou enxofre (S).
2.2.1. Alho (Allium sativum L.)
O alho (Allium sativum) é um vegetal da família Liliaceae que vem sendo utilizado
na culinária e como medicamento há centenas de anos em todo o mundo. Seu bolbo,
vulgarmente conhecido como cabeça e constituído por vários dentes, é o verdadeiro
responsável por toda esta fama. No Egipto antigo, por exemplo, o alho já era usado para
remediar a diarreia e na Grécia antiga era empregue no tratamento de patologias
pulmonares e intestinais (Kumar e Berwal, 1998).
O alho apresenta consideráveis níveis de alicina (di-propenyl tiosulfinato). A alicina
é a substância responsável por grande parte das suas propriedades farmacológicas, além
de atribuir ao alho o odor que conhecemos. Ela é a chave da atividade antimicrobiana
desta planta, devido à sua atividade inibitória sobre enzimas contendo grupos sulfidrilo.
(Shobana et al., 2009).
Figura 2.2. Estrutura química da alicina
O alho possui cerca de 0,1% a 0,25% de óleo essencial, formado enzimaticamente
quando os dentes são esmagados, cortados, ou reidratados. Relativamente ao aroma e
sabor, o OE de alho (sem diluição) tem 200 vezes mais poder que o alho desidratado e
900 vezes a mais que o alho fresco (Raghavan, 2007).
O efeito inibitório do alho tem sido documentado por vários investigadores (Vaughn
1969; Kumar e Berwal, 1998), particularmente o efeito do seu óleo essencial ou de
alguns dos seus compostos químicos (Ankri e Mirelman 1999; Miron et al., 2000).
Kumar e Berwal (1998) e Shobana et al., (2009), demonstraram que extratos aquosos de
alho ou dentes de alho esmagados tinham atividade inibitória sobre vários
11
microrganismos patogénicos com importância em alimentos, nomeadamente Salmonella
spp., Staphylococcus aureus e Listeria monocytogenes. Linares et al., (2013)
observaram atividade inibitória de sumo de alho e de alho seco em Salmonella spp. e
Listeria monocytogenes.
2.2.2. Orégão (Origanum vulgare)
O orégão pertence à família Lamiaceae (Labiatae) da qual também fazem parte o
manjericão (Ocimum basilicul L.), o alecrim (Rosmarinus officinalis L.) e a sálvia
(Salvia officinalis L.). O género Origanum possui mais de 38 espécies destacando-se
Origanum majorana e Origanum vulgare entre as mais importantes (Prelapantano,
2011; Haberbeck, 2011).
A alta atividade antimicrobiana do óleo essencial de orégão é devida à sua grande
concentração de monoterpenos e compostos oxigenados, como carvacrol, timol, ρcimeno e γ-terpineno (Liolios et al., 2009).
O carvacrol e timol, os dois principais fenóis que constituem cerca de 78-85% do
óleo essencial de
orégãos,
são
principalmente
responsáveis
pela atividade
antimicrobiana do óleo. Além disso, outros constituintes menores, tais como terpineno e
p-cimeno também contribuem para a atividade antimicrobiana do óleo (figura 2.3)
(Burt, 2004).
O carvacrol é um composto fenólico que tem sido utilizado por muitas gerações
como conservante de alimentos. A sua atividade tem sido demonstrada sobre bactérias e
leveduras demonstrando um elevado potencial para prolongar a vida útil e melhorar a
segurança de alimentos perecíveis.
O timol é um isómero do carvacrol. Estes compostos são hidrofóbicos e tendem a se
dissolver na membrana citoplasmática de células bacterianas (Guarda et al., 2011).
12
Figura 2.3. Estruturas químicas do carvacrol, p-cimeno e timol respectivamente (Burt
2004)
A atividade antimicrobiana do óleo de orégão, ou dos seus componentes com
maior atividade antimicrobiana tem sido estudada por vários autores (quadros 2.2 e 2.3).
O seu efeito inibitório sobre Salmonella spp., Listeria monocytogenes e S.
aureus, de entre outros microrganismos patogénicos torna muito promissora a sua
utilização em alimentos de origem animal em que esta microflora representa perigo.
Fernandes (2011) observou um efeito inibidor do óleo essencial de orégão em E. coli
O157:H7, Salmonella spp. e Listeria monocytogenes no fabrico de salpicão e
particularmente interessante na redução daqueles três microrganismos patogénicos em
tripa de porco.
Quadro 2.2. Atividade antimicrobiana de óleo essencial de orégão (Origanum vulgare).
Adaptado de Burt, (2004) e de Bajpai et al., (2012).
Microflora estudada
E. coli
S. Typhimurium
MIC, intervalo
aproximado
(µl ml -1)
0,5 – 1,2
0,12 – 3,12
66,7 – 160
S. Enteritidis
S. aureus
MIC, intervalo
aproximado
(µg ml -1)
0,5 – 1,2
13
Quadro 2.3. Atividade antimicrobiana de alguns componentes do óleo essencial de
orégão (Origanum vulgare). Adaptado de Burt, (2004) .
Principais
componentes
do óleo
essencial
Carvacrol
Thymol
Microflora estudada
MIC, intervalo aproximado
(µl ml -1)
E. coli
0,225 – 5
S. Typhimurium
0,225 – 0,25
S. aureus
0,175 – 0,450
L. monocytogenes
0,375 - 5
E. coli
S. typhimurium
S. aureus
L. monocytogenes
B. cereus
0,225 – 0,45
0,056
0,140 – 0,225
0,450
0,450
2.3. Microrganismos responsáveis por toxi-infeções alimentares
Uma toxi-infeção é uma doença, geralmente de natureza infeciosa ou tóxica,
provocada por agentes que entram no corpo através da ingestão de alimentos ou de
água. Estima-se que, por ano, cerca de 30% da população dos países industrializados
sofra deste tipo de doença (Rocourt et al., 2003).
A contaminação dos alimentos pode ocorrer em qualquer fase do seu
processamento, desde a produção até à distribuição e consumo, por isso é importante
manter medidas higiénicas e técnicas adequadas em cada uma dessas etapas, prevenindo
os perigos associados a cada uma delas. Esses perigos são qualquer facto que, quando
presente num produto, pode produzir dano na saúde do consumidor, podendo ser de
natureza física, química ou biológica. Os agentes patogénicos responsáveis por doenças
alimentares são múltiplos (bactérias, vírus, fungos e parasitas) e representam o maior
risco para a saúde dos consumidores, quer pelo número elevado de pessoas que podem
afetar, quer pela forma grave ou mesmo fatal de alguns quadros clínicos. Os
microrganismos são responsáveis por doenças de origem alimentar de forma direta ou
indireta, e, embora o termo “Toxi-infeção alimentar” seja geralmente aplicado a
qualquer doença produzida por alimentos, o nome mais apropriado seria doença de
origem alimentar (Forsythe e Hayes, 2002).
14
Essas doenças caracterizam-se por um conjunto de perturbações gástricas,
envolvendo geralmente vómitos, diarreia, febre e dores abdominais, que podem ocorrer
individualmente ou em combinação. Na maioria dos casos, os sintomas são agudos e de
curta duração, raramente provocando a morte, podendo contudo, tornar-se grave
especialmente em crianças, idosos e pessoas imunodeprimidas (Prescott et al., 1999).
De acordo com Lindsay (1997), 2 a 3% dos casos agudos desenvolvem
secundariamente sequelas crónicas, que podem afetar o sistema muscular, nervoso,
renal e cardíaco. Por exemplo, a artrite reumatoide pode ser subsequente a infeções por
Salmonella spp., Campylobacter spp., E. coli ou Yersinia enterocolitica, as infeções por
Campylobacter spp. podem ser responsáveis por 20 a 40% dos casos da Síndrome de
Guillan-Barré (SGB) - maior causa de paralisia não relacionada com traumatismo – e,
cerca de 1,5% dos doentes infetados com E. coli O157 desenvolvem uma síndrome
multi-sistémica grave denominada de Síndrome Hemolítico Urémico (SHU).
Nos países industrializados é estimado que anualmente, mais de 30% das
pessoas possam vir a sofrer destas doenças. O problema é ainda mais grave nos países
em desenvolvimento, onde centenas de milhões de pessoas sofrem de diarreia, o
sintoma mais comum destas situações (Novais, 2003). Segundo dados da OMS,
aproximadamente 1,8 milhões de crianças morreram em 1998 devido a agentes
microbiológicos veiculados nos alimentos, dados estes apenas referentes a países
desenvolvidos. Apenas no ano 2000, verificou-se nos EUA, que por cada 100 mil
crianças com idade inferior a 2 anos, 1121 tinham sido alvo de toxi-infeções
alimentares, representando deste modo o maior grupo de risco (Threlfall et al., 2003).
De acordo com especialistas em epidemiologia da OMS (2002) as doenças de
origem alimentar afetam cerca de 5 a 10 % da população dos países industrializados.
Kaferstein (2003) indica uma perspetiva ainda mais pessimista, situada em taxas da
ordem dos 10 a 15%, estimada a partir dos dados revelados pelas agências de vigilância
epidemiológica. Para ilustrar a dimensão do problema, estima-se que nos EUA essas
doenças sejam responsáveis anualmente por 76 milhões de casos de doença, 323 000
hospitalizações e cerca de 5000 mortes (Quadro 1). Para além do velho problema que o
mundo tem com Salmonella spp., que continua a ser o principal agente etiológico
envolvido em TIAs, surgiram nas últimas décadas situações com microrganismos ditos
emergentes, como E. coli O157:H7, Campylobacter spp., Listeria monocytogenes, de
entre outros (Foster, 1997; Kvenberg e Archer, 1987).
15
Salmonella spp. é uma das principais causas de TIA, o que levanta uma preocupação a
nível de segurança para a saúde pública. (Bajpai et al., 2012). As salmoneloses são de
longe as TIAs mais frequentemente registadas nos países industrializados. Os produtos
alimentares de origem animal são os principais veículos desta doença.(Lacasse e Seixas
1995). No quadro 2.4 sintetizam-se os sinais clínicos, ecologia e algumas medidas de
controlo para Salmonella spp.
Quadro 2.4. Principais características de Salmonella spp. de Prescott et al., (1999) e
Forsythe e Hayes, (2002)
Sinais clínicos
- Diarreia
- Dor abdominal
- Febre moderada
- Vómito
- Cefaleias
- Desidratação
- Anorexia
Ecologia
- Reside no intestino do
Homem e animais, existindo
portadores assintomáticos
- Alimentos mais comuns:
Carne de suíno e aves, ovos,
leite não pasteurizado, água e
moluscos
Medidas de controlo
- Separação dos produtos animais
dos vegetais
- Separação dos alimentos crus dos
já cozinhados
- Prevenir a contaminação fecal
- Respeitar a cadeia de frio e
temperaturas de conservação
- Higiene dos manipuladores
(lavagem das mãos sempre que
muda de funções)
- Limpeza e desinfeção eficaz e
controlada de utensílios, materiais e
instalações
- Tratamento pelo calor adequado
16
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Estrutura do trabalho
O presente trabalho experimental desenvolveu-se em duas vertentes principais
(figura 3.1). Numa primeira fase procedeu-se à análises físico-químicas de salsichas
frescas comerciais, no sentido de conhecer a composição média das salsichas presentes
atualmente no mercado português, para posteriormente preparar massa de salsicha
fresca similar à comercial, para determinação de parâmetros de resistência térmica.
Nessas mesmas salsichas procedeu-se à pesquisa de Salmonella spp., tendo
como objetivo o isolamento de estirpes desse ecossistema para utilizar posteriormente
nos ensaios de resistência térmica. Isso não aconteceu, pois em nenhuma das amostras
testadas ocorreu Salmonella spp., pelo que esses ensaios foram realizados com
microrganismos previamente isolados de uma indústria de produtos cárneos que entre
outros itens prepara salsicha fresca.
O objetivo original do trabalho consistia em testar o efeito combinado do calor e
de óleos essenciais de plantas de produção biológica. Esse processo ainda foi iniciado,
tendo-se obtido óleo de alecrim (folhas e flores separadamente) e óleo de malva através
de hidrodestilação com aparelho de Clevenger. Não foi possível dar continuidade a este
trabalho por problemas técnicos com o aparelho e a não disponibilização em tempo útil
de um substituto por parte do fabricante. Assim, o ensaio prosseguiu obedecendo aos
objetivos gerais, porém, substituindo os óleos isolados no presente trabalho por óleos
essenciais comercias de alho e de orégão. A eficácia desses óleos essenciais na inibição
foi testada em meio de cultura, utilizando-se o método de microdiluição em placa de 96
poços.
Num segundo momento experimental preparou-se massa de salsicha fresca com
dois níveis de cada um dos óleos essenciais (0,05% e 0,5%), que se tinham revelado
interessantes nos ensaios prévios em meio de cultura. Uma parte dessa massa de
salsicha foi reservada para realizar análise sensorial, e outra parte foi utilizada em
ensaios de resistência térmica a 55ºC, 60ºC e a 65ºC. Os resultados desses ensaios foram
utilizados no cálculo de modelos preditivos do tempo de letalidade para reduções de 7D,
5D e 3D.
17
Ervas aromáticas de
produção biológica
Salsichas frescas de 15
proveniências
Determinação da composição
química bruta
Definição da composição para
utilizar nos ensaios de resistência
térmica
Pesquisa e isolamento de
Salmonella spp.
Isolados para utilizar nos
ensaios de resistência
térmica
Extração de óleos essenciais
por hidrodestilação
Problemas técnicos impediram a
concretização desta tarefa
não detetados
Preparação de massa de
salsicha para ensaios
Determinação das
concentrações
inibitórias em meio
de cultura
Salmonella spp. de
indústria de enchidos
previamente isoladas
Óleo essencial de alho e
de orégão comercial
Análise sensorial
Resistência térmica
Determinação do parâmetros D e z
não possível pela não linearidade
das curvas de morte térmica
Modelos preditivos do tempo
para letalidade pré-definida
Figura 3.1. Esquema geral do trabalho experimental. Indicações a tracejado indicam
tarefas previstas que não puderam ser realizadas, tendo sido substituídas
como indicado.
18
3.2 Determinações em salsichas frescas comerciais
As amostras de salsichas frescas utilizadas para as análises foram obtidas de 15
proveniências diferentes em superfícies comerciais e talhos do Concelho de Vila Real,
Maia e Covilhã. As amostras foram mantidas em refrigeração até análise, que nunca
ultrapassou as 24h.
3.2.1
Determinação da composição química bruta.
O teor em humidade foi determinado, por perda de peso por dessecação em estufa
a 105°C, de uma amostra de 10 g, até peso constante, segundo o método da NP 1614
(1979). O teor proteico (N x 6,25) das amostras foi obtido, por determinação do azoto
total pelo método de Kjeldhal, segundo a NP 1612 (1979). A determinação da gordura
livre total realizou-se pelo método de Soxhlet sobre o resíduo seco, utilizando como
solvente éter de petróleo (NP 1224, 1982). O teor em cloretos, expresso em cloreto de
sódio, foi determinado, titulando o excesso de nitrato de prata, que não se combinou
com os cloretos existentes na amostra, com tiocianato de potássio, utilizando como
indicador, o sulfato duplo de ferro e amónio (AOAC, 1990). O pH foi determinado com
um medidor de pH Crison modelo micropH 2002, numa pasta homogénea de amostra.
3.2.2
Pesquisa de Salmonella spp.
O procedimento foi feito basicamente de acordo com a norma ISO 6579:2002. A
pesquisa foi feita em 4 fases partindo-se do pré-enriquecimento em APT (de 8 a 20h a
37ºC). O enriquecimento seletivo foi efetuado em Rappaport-Vassiliadis Enrichement
Broth (CM669, Oxoid) e em MKT - Muller-Kauffmann Tetrathionate-novobiocine
broth (base) MKTTn (BK169HA+ BS056, Biokar). Seguiu-se o isolamento de colónias
suspeitas MRSV agar (BK191HA, Biokar) e em XLD - Xylose Lysine Deocholate agar
(BK168HA, Biokar). As colónias suspeitas seriam para confirmar por PCR especifica
de espécie, pelo método descrito em Talon et al., (2007).
19
3.3 Efeito da adição de óleos essenciais de plantas na resistência de Salmonella
spp. ao calor
3.3.1
Obtenção dos óleos essenciais2
Os ensaios de resistência de Salmonella spp. ao calor em massa de salsicha fresca
com óleos essencias foi realizado com óleo essencial de alho e orégãos (F70130L e
F70900L, Ravetllat, Barcelona).
3.3.2
Microrganismos e condições de crescimento
Na realização deste trabalho utilizaram-se 4 estirpes diferentes de Salmonella spp.,
uma estirpe de uma coleção de culturas (ATCC 49214) e três estirpes (MPI-B-07, MPIE-92, MPI-B-12) isoladas por Martins (2010) de matérias-primas e do ambiente de
fabrico de produtos cárneos de uma fábrica que também produz salsicha fresca.
Os
microrganismos
estavam
conservados
em
congelação
(-18ºC).
Após
descongelação foram repicadas 3 vezes em BHI (Oxoid CM225) e incubadas (37ºC,
24h) Seguiu-se a centrifugação (1000 x g, 15 min), a lavagem do sedimento com NaCl
0,85%, a combinação das quatro estirpes e a aferição da concentração celular por
comparação de diluições com o padrão MacFarland 2 (Biomerieux 70900). Prepararamse as diluições necessárias em NaCl 0,85%, de forma a obter um nível de inoculação de
cerca de 8 log ufc/g amostra.
2
No presente trabalho, num primeiro momento pretendeu-se utilizar óleos essencias obtidos a partir de
plantas aromáticas de produção biológica. Foram extraídos óleos essenciais de alecrim fresco (folhas e
flores) e malva. Os óleos essenciais foram extraídos seguindo o procedimento descrito por Mohamed et
al. (2005), extraído num aparelho do tipo Clevenger por hidrodestilação de 200 g de material vegetal
moído e suspenso em 2 l de água durante cerca de 3 horas. Os óleos essenciais foram recolhidos, secos
com sulfato de sódio anidro e armazenado a 4 º C. Por problemas técnicos com o aparelho de Clevenger
não resolúveis no tempo previsto para a realização da dissertação, e dado que a quantidade dos óleos já
extraídos era insuficiente para os ensaios previstos, procedeu-se à utilização de óleos essenciais comercias
20
3.3.3. Avaliação da atividade inibitória dos óleos essenciais de alho e de
orégão
A ação inibitória foi determinada utilizando microplacas de 96 poços. Diluíramse os óleos essenciais e extratos em BHI em diferentes concentrações e adicionaram-se
100 µl da mistura aos poços por ordem decrescente de concentração. De seguida
contaminaram-se 2ml de BHI com 100 µl de cada estirpe isoladamente e distribuiu-se
20µl pelos poços, cada poço ficou com 120 µl de meio. Fez-se um controlo positivo
somente com meio de cultura inoculado e no controlo negativo o microrganismo estava
ausente.
As microplacas foram incubadas durante 24 a 48 horas a 37ºC. A ação inibitória
foi determinada pela observação da falta de crescimento nos poços.
3.3.4
Preparação da massa de salsicha
A massa de salsicha fresca foi preparada a partir de carne da barriga de porco. As
peças foram preparadas separando o courato e o osso, e foram picadas numa picadora de
discos (Ø 6 mm). Os ingredientes foram adicionados de acordo com o indicado no
quadro 3.1. A mistura foi realizada numa misturadora Kenwood. Uma parte da massa
foi reservada em congelação para realização de análise sensorial. Porções de 200 g
foram novamente submetidas a redução de tamanho numa picadora doméstica do tipo 12-3, para conseguir uma pasta suficientemente fina para o dispositivo utilizado na
determinação da cinética de morte térmica.
21
Quadro 3.1. Formulação da massa de salsicha fresca para determinação dos parâmetros
de morte térmica de Salmonella spp.
Variáveis em estudo
Ingrediente
Carne e gordura de porco
alho
0,5%
90%
Água
20%
Sal(1)
1,5%
Sulfito de sódio E221(1)
0,45%
Controlo
alho
0,05%
orégão
0,05%
orégão
0,5%
Óleo essencial de alho(1)
0
0,05%
0,5%
0
0
Óleo essencial de orégão(1)
0
0
0
0,05%
0,5%
(1)
Quantidades expressas em relação ao peso da mistura carne e gordura e água
3.3.5 Determinação dos parâmetros de resistência térmica de Salmonella spp.
A massa de salsicha fresca preparada como indicado em 3.3.3 foi distribuída por
sacos de polietileno à razão de 3g por saco. A cada saco foi adicionada mistura de
Salmonella spp. (0,1 ml/g), no sentido de obter uma concentração final de
aproximadamente 8 log ufc/g. Os controlos negativos foram inoculados com 0,1 ml de
NaCl 0,85%. Os sacos foram então termossoldados e homogeneizados manualmente, no
sentido de assegurar uma boa distribuição dos microrganismos na massa da salsicha.
Finda a homogeneização, a massa foi esticada dentro do saco, recorrendo a uma pipeta,
no sentido de obter uma fina camada (1-2 mm de espessura) de produto contaminado,
tal como descrito por Juneja (1999, 2001).
Os sacos com as amostras a testar estavam à temperatura ambiente antes do
tratamento térmico. O período que decorreu entre a contaminação e o tempo térmico
não ultrapassou os 30 minutos. Os sacos foram colocados entre duas grelhas plásticas
(com uma estrutura quadrangular de 3x2 cm) e foram submersas num banho de água
termostatizado estabilizado a 55, 60 e 65ºC. A temperatura foi continuamente
monitorizada usando dois termopares introduzidos em dois sacos não inoculados, no
sentido de determinar a temperatura interna. Os tempos de aquecimento (subida de
temperatura até à temperatura de processo, onde o tempo começou a ser contado) foram
negligenciáveis.
22
Ao fim de cada intervalo de tempo designado (quadro 3.2) foram retirados 3 sacos
para análise. Imediatamente após a sua remoção do banho termostatizado, os sacos
foram arrefecidos em banho de água/gelo e analisados nos 30 minutos subsequentes.
Quadro 3.2. Tempos de exposição a cada temperatura estudada
Temperatura ºC
Tempo de exposição ao calor (minutos)
55
5
10
15
20
25
30
35
60
2
4
6
8
10
12
14
65
1
2
3
4
5
6
7
Após o tratamento térmico, foi adicionado a cada saco com um seringa 3 ml de
NaCl 0,85%. A mistura foi homogeneizada em stomacher durante 1,5 minutos e foram
preparadas diluições decimais sucessivas na mesma solução. Inoculou-se em superfície
0,1 ml de cada diluição em meio de cultura XLD Agar (Biokar BK058; BS 033). Nas
amostras com um tratamento térmico mais acentuado, inoculou-se 0,5 ml distribuído
por um par de caixas de Petri, no sentido de reduzir o limite de deteção. Após 24 horas
de incubação procedeu-se à contagem de colónias e, tendo em consideração o fator de
diluição e a quantidade inoculada, expressou-se a contagem à grama de massa de
salsicha fresca.
3.3.6 Avaliação sensorial de massa de salsicha fresca com óleos essenciais de
alho e orégão
As cinco formulações utilizadas para avaliar a resistência térmica de Salmonella
spp, foram analisadas (aspeto e cheiro) por um grupo de cinco provadores selecionados
e treinados. As amostras de massa de salsicha foram analisadas cruas. Foram avaliadas
as características: cor vermelha, cor anormal (verde ou castanha), intensidade do cheiro
a alho ou orégão e apreciação global. As características avaliadas foram pontuadas
numa escala de intensidade de 7 pontos.
23
3.4 Tratamento de dados
Os valores D, definidos como o tempo - expresso em minutos – necessário para
produzir uma redução de 90% da microflora viável do produto, foram calculados a
partir da reta que representa a relação entre o número de sobreviventes e a temperatura
utilizada. A relação entre essas variáveis foi determinada por análise de repressão, e
calculada a equação da reta de regressão (y = a+bx) onde b representa o declive da
melhor interpolação dos pontos. Esse declive foi empregue na determinação do valor D,
através da expressão: D = 1/|b| (Cerf et al., 1996, Murphy et al, 2004).
Como para efeitos de cálculo do valor D se devem considerar somente retas de
sobrevivência com, pelo menos 5 pontos, coeficientes de regressão superiores a 0,90 e
traduzirem reduções na microflora de pelo menos 5 unidades logarítmicas, a sua
aplicação não foi possível no presente trabalho. Procedeu-se então ao cálculo de um
modelo preditivo para estimar o tempo necessário para produzir uma redução prédefinida de 7D, 5D e 3D na população de Salmonella spp. em massa de salsicha fresca.
Para o efeito, recorreu-se a um modelo de estimativa não linear baseado na função
de crescimento exponencial (equação 1), que foi aquela que melhor se adaptou à
tipologia dos resultados.
(1)
Nesse modelo, utiliza-se não o logaritmo do número de microrganismos
sobreviventes, como acontece no cálculo do valor D, mas o logaritmo do número de
inativados (log I) para estimar o tempo necessário para produzir uma redução
predefinida, pelo que a equação 1 pode ser descrita pela equação 2.
(1)
A construção do modelo foi feita com o programa Statistica 7.0® (StatSoft, Inc.). As
comparações efetuadas entre amostras com diferentes tratamentos (dois óleos essenciais
com dois níveis de adição) foram realizadas por análise de variância simples. A
comparação entre médias foi realizada com o teste Tukey HSD.
24
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1. Determinações realizadas em salsichas frescas de proveniência comercial
4.1.1. Composição química bruta
O conhecimento da composição química das salsichas é importante para, numa
fase posterior, determinar o comportamento de Salmonella spp. face ao aquecimento,
dado que esses parâmetros podem ser influenciados pela composição do meio de
aquecimento, particularmente pelo teor em gordura.
No sentido de conhecer a composição química bruta das salsichas
comercializadas em Portugal, determinou-se o teor em humidade, gordura e proteína
bruta e cloreto de sódio em salsichas de 15 proveniências comerciais diferentes. Os
resultados são apresentados no quadro 4.1. As salsichas apresentaram um valor médio
de humidade de 68,06±3,94%. O coeficiente de variação do teor em humidade foi dos
mais reduzidos observados, indicando que nesse parâmetro as salsichas de diferentes
proveniências são bastante homogéneas. Pelo contrário, ao nível do teor em gordura, o
coeficiente de variação ascendeu a cerca de 26% (máximo de 22,16% e mínimo de
7,96%), indicando a grande heterogeneidade de gordura que os industriais incluem neste
produto cárneo. Por inerência à grande variabilidade no teor em gordura, o teor em
proteína apresentou também alguma variabilidade (10.38%). Os teores em cloreto de
sódio variaram entre 1,58% e 2,92%.
Os valores de pH das salsichas são apresentados na figura 4.1. Esses variaram
entre 5,49 e 6,25. Essa variabilidade nos valores de pH é determinada pelo pH da carne
utlizada, mas também por aditivos reguladores de acidez utilizados no fabrico deste
produto.
25
Quadro 4.1. Composição química bruta (%) de salsichas frescas de 15 proveniências
comerciais (médias de duas repetições).
Origem
Humidade
Gordura
Proteína
NaCl
A
68,02
12,30
16,33
2,53
B
65,79
14,54
13,80
2,22
C
71,04
10,29
13,89
2,57
D
73,65
7,96
14,24
1,58
E
57,71
22,16
15,86
2,13
F
63,73
18,04
12,74
2,03
G
66,22
14,98
14,23
2,57
H
73,22
10,97
12,74
2,54
I
70,90
11,97
14,24
2,43
K
67,21
13,77
13,58
2,12
L
69,94
10,22
14,88
1,95
M
69,57
13,62
14,19
2,92
N
67,08
17,77
10,02
2,02
O
68,69
13,68
14,27
2,54
P
68,08
14,46
13,58
2,77
Média
68,06
13,78
13,91
2,33
Desvio padrão
3,94
3,57
1,44
0,36
Coeficiente de variação
5,79
25,93
10,38
15,31
Máximo
73,65
22,16
16,33
2,92
Mínimo
57,71
7,96
10,02
1,58
26
6,4
6,2
pH
6
5,8
5,6
5,4
5,2
5
A
B
C
D
E F G H I K L
proveniência das salsichas
M
N
O
P
Figura 4.1. Valores de pH de salsichas frescas de 15 proveniências comerciais (médias
de duas repetições).
4.1.2. Pesquisa de Salmonella spp.
No sentido de recolher do ecossistema microbiano da salsicha fresca isolados de
Salmonella spp. para vir a utilizar no teste de resistência térmica, procedeu-se à sua
pesquisa em salsichas de 15 proveniências comerciais diferentes. Em nenhuma das
salsichas analisadas foi detetado o microrganismo pesquisado.
Como não se isolaram Salmonellas de salsicha fresca, realizaram-se os ensaios
de resistência térmica com isolados de um ambiente fabril de enchidos crus onde é
produzida também salsicha fresca (Martins, 2010).
27
4.2. Sensibilidade de Salmonella spp. ao óleo essencial de alho e de orégão
No quadro 4.2 apresentam-se os resultados da determinação da sensibilidade de
Salmonella spp. (ATCC 49214 e três isolados de indústria de enchidos) a várias
concentrações de óleo de alho e óleo de orégão. A estirpe ATCC 49214 mostrou-se a
mais resistente ao óleo de alho, tendo logo à 24 h evidenciado crescimento em
concentrações de 1,2% ou menores. As estirpes selvagens mostraram-se mais sensíveis,
ainda que após 48 h de incubação tenha sido observado crescimento da cultura em
concentrações de 1,2% (isolado MPI-B-07) ou 0,8% (isolados MPI-E-92 e MPI-B-12).
A concentração mais baixa de óleo de alho utilizada mostrou-se completamente
ineficaz na inibição de Salmonella spp.
O óleo de orégão mostrou-se mais eficaz na inibição de Salmonella spp. que o
óleo de alho. Para dois dos microrganismos testados 0,4% foi suficiente para inibir o
crescimento. Ao contrário do observado com o óleo de alho, com o óleo de orégão, a
inibição foi mais definitiva, pois não houve recuperação da cultura às 48h de incubação.
Concentrações de 0,2% ou menores mostraram-se ineficazes para inibir a
multiplicação de qualquer um dos isolados testados.
Os resultados observados no presente trabalho vão de encontro aos apresentados
por Friedman et al., (2002) e Nevas et al., (2004) citados por Oussalah et al., (2007) que
mostraram que o óleo essencial de orégão tem uma importante atividade antimicrobiana
sobre várias estirpes de Salmonella spp. O carvacrol, composto encontrado em maior
quantidade no óleo essencial de orégãos quando testado de forma isolada demonstrou
ter forte atividade antimicrobiana. A exposição de bactérias ao carvacrol resulta num
aumento da membrana, fluidez e saída de protões e iões de potássio, levando a uma
diminuição no gradiente de pH através da membrana citoplasmática, um colapso do
potencial de membrana, inibição da síntese de ATP e finalmente a morte da célula
(Ultee et al, 2000; Carneiro de Barros et al, 2009).
O efeito do alho em microrganismos patogénicos está bem documentado
(Johnson e Vaughn, 1969; Kumar e Berwal, 1998), particularmente no que se refere à
utilização do seu óleo essencial (Ross et al., 2001) ou de compostos isolados de alho
(Ankri e Mirelman 1999; Miron et al., 2000). É geralmente aceite que o efeito inibitório
do alho ou do seu óleo essencial é principalmente atribuído à alicina (tiosulfonato de
28
dialilo), um composto que pode inibir enzimas com grupos sulfurados (Corzo-Martínez
et al., 2007).
A fase de crescimento em que as bactérias se encontram também influencia a
ação dos óleos essenciais. É geralmente reconhecido que células na fase exponencial
são mais sensíveis a fatores de stress externo, enquanto as células na fase estacionária
são mais resistentes (Phillips e Duggan, 2002; Song et al., 2010). Este fenómeno pode
ser devido às mudanças estruturais da parede celular, que sendo uma estrutura dinâmica
se adapta a mudanças fisiológicas (Lv, et al, 2011). Essa maior sensibilidade das células
quando na fase exponencial podem explicar os resultados observados, em que às 24 h
alguns isolados de Salmonella spp. testados estavam inibidos, mas foi detetado
crescimento às 48h de incubação.
29
Quadro 4.2. Sensibilidade de Salmonella spp. ao óleo de alho e óleo de orégão; - não
apresentou crescimento, + apresentou crescimento; observações feitas às
24 e 48h (24h/48h).
ATCC 49214
MPI-B-07
MPI-E-92
MPI-B-12
2,4
-
-
-
-
2
-
-
-
-
1,6
-/+
-
-
-
1,2
+
-/+
-
-
0,8
+
-/+
-/+
-/+
0,4
+
-/+
-/+
-/+
0,2
+
-/+
-/+
-/+
0,08
+
-/+
-/+
-/+
0,04
+
-/+
-/+
-/+
0,0016
+
+
+
+
2,4
-
-
-
-
2
-
-
-
-
1,6
-
-
-
-
1,2
-
-
-
-
0,8
+
-
-
+
0,4
+
-
-
+
0,2
+
+
+
+
0,08
+
+
+
+
0,04
+
+
+
+
0,0016
+
+
+
+
Óleo de alho (%)
Óleo de orégão (%)
30
4.3. Resistência de Salmonella spp. ao calor em massa de salsicha fresca com óleo
essencial de alho ou de orégão
A resistência de Salmonella spp. ao calor em amostras suplementadas com óleo de
alho (0,05% ou 0,5%) ou com óleo de orégão (0,05% ou 0,5%) foi determinada a 55ºC,
60ºC e 65ºC (figuras 4.2, 4.3 e 4.4, respetivamente e quadro 4.3). O número de
sobreviventes em cada condição de ensaio, para cada tempo de exposição ao calor
serviu de base à construção dos gráficos ilustrados nas figuras 2, 3 e 4. Como se pode
observar, a curva de sobrevivência não pode ser traduzida por uma equação de 1º grau,
do tipo y = ax + b prevista para a determinação convencional do valor D. O
comportamento da população sobrevivente foi do tipo exponencial com ß<1, indicando
que a população sobrevivente ao aquecimento inicial é mais resistente que a eliminada
no início do processo. Este comportamento tem sido observado por vários autores,
conforme revisto por Juneja et al., (2001), Boekel (2002) e Gaze (2005). O motivo
apontado por esses autores para este comportamento é a existência de subpopulações
mais resistentes dentro da população inoculada nas amostras. Essas subpopulações
podem ser constituídas simplesmente por microrganismos que estão em diferentes fases
de crescimento, pois ainda que se padronizem as condições de preparação das culturas a
inocular há sempre uma coexistência de microrganismos que estão em momentos
diferentes da sua curva de crescimento. Adicionalmente, a utilização de uma mistura de
estirpes do mesmo microrganismo, comumente utilizada em ensaios desta natureza,
pode também contribuir para a perda de linearidade da curva de morte térmica, pois a
resistência ao calor é uma característica muito determinada por fatores genéticos.
O nível de inoculação inicial das amostras foi com aproximadamente 8 log ufc/g,
apresentando pequenas variações entre ensaios. Para comparar o efeito dos óleos
essenciais na mortalidade da microflora, transformou-se o logaritmo do número de
sobreviventes, em taxa de redução, expressa em percentagem da contagem inicial,
eliminando-se assim a variação existente na contaminação inicial. Esses resultados são
apresentados no quadro 4.3. Quando se compara a taxa de redução para cada intervalo
de tempo estudado a cada temperatura entre as amostras controlo e as tratadas com os
dois níveis de óleo de alho e de orégão, observa-se que em todas as situações estudadas,
as amostras não tratadas com óleos essenciais apresentam taxas de redução mais
reduzidas, indicando que a microflora é mais resistente ao calor nessas amostras.
31
Sumariamente, foram as amostras com 0,5% de óleo de orégão aquelas que
apresentaram taxas de redução de Salmonella spp. mais elevadas. O efeito dos óleos
essenciais é discutido numa secção posterior do presente trabalho onde são apresentados
os resultados dos modelos preditivos para produzir reduções da microflora pré-
Log UFC/g
definidos.
9,0
8,0
7,0
6,0
5,0
4,0
3,0
2,0
1,0
0,0
55ºC
Control
alho 0,05%
alho 0,5%
oregão 0,05%
oregão 0,5%
0
5
10
15
20
25
Tempo (min)
30
35
Figura 4.2. Número de sobreviventes (log ufc/g) após aquecimento a 55ºC ao longo de
35 minutos
9,0
8,0
60ºC
Log UFC/g
7,0
6,0
Control
5,0
alho 0,05%
4,0
alho 0,5%
3,0
oregão 0,05%
2,0
oregão 0,5%
1,0
0,0
0
2
4
6
8
10
Tempo (min)
12
14
Figura 4.3. Número de sobreviventes (log ufc/g) após aquecimento a 60ºC ao longo de
14 minutos.
32
Log UFC/g
9,0
8,0
7,0
6,0
5,0
4,0
3,0
2,0
1,0
0,0
65ºC
Control
alho 0,05%
alho 0,5%
oregão 0,05%
oregão 0,5%
0
1
2
3
4
5
Tempo (min)
6
7
Figura 4.4. Número de sobreviventes (log ufc/g) após aquecimento a 65ºC ao longo de
7 minutos.
33
Quadro 4.3 Redução percentual do número de Salmonella spp. após aquecimento a
55ºC, 60ºC e 65ºC (média ± desvio padrão).
Controlo
alho 0,05%
alho 0,5%
oregão 0,05%
oregão 0,5%
p
55ºC
5
56,3 ± 1,9ab
58,5 ± 3,6ab
53,9 ± 1,1a
67,2 ± 0,9c
64,7 ± 5,5bc
0,002
10
63,8 ± 2,2b
70,7 ± 0,7a
75,3 ± 1,8a
71,4 ± 1,3c
69,7 ± 0,1a
<0,001
15
67,5 ± 0,3c
72,0 ± 0,6b
76,2 ± 1,3c
72,0 ± 0,7b
75,5 ± 0,4c
<0,001
20
71,5 ± 0,7a
72,2 ± 3,6a
77,9 ± 0,8bc
73,9 ± 0,6ab
78,8 ± 0,9c
0,001
25
71,9 ± 0,4a
73,3 ± 1,0ab
78,6 ± 0,9c
75,2 ± 1,4b
83,8 ± 0,9d
<0,001
30
71,5 ± 2,8a
77,5 ± 1,1b
81,1 ± 2,3b
79,3 ± 0,7b
90,2 ± 2,0c
<0,001
35
77,9 ± 0,1a
81,1 ± 0,2ab
89,5 ± 2,1cd
85,5 ± 1,3bc
95,0 ± 4,3c
<0,001
2
47,0 ± 1,7c
51,2 ± 3,5ac
59,0 ± 4,0ab
58,7 ± 3,6ab
62,9 ± 3,4b
0,001
4
55,1 ± 0,7a
56,9 ± 2,1a
59,9 ± 2,1a
59,9 ± 2,5a
65,1 ± 0,9b
<0,001
6
56,3 ± 5,4a
60,9 ± 2,5ab
63,1 ± 3,7ab
68,5 ± 0,6b
68,1 ± 1,7b
0,005
8
57,0 ± 1,0c
63,5 ± 2,1a
65,1 ± 0,8a
69,6 ± 0,7b
69,7 ± 0,3b
<0,001
10
58,9 ± 0,7c
68,5 ± 1,6b
71,6 ± 2,0ab
73,1 ± 1,2a
72,2 ± 1,0a
<0,001
12
59,0 ± 3,9d
68,3 ± 1,9a
71,8 ± 2,3ab
76,0 ± 0,9bc
81,7 ± 3,9c
<0,001
14
69,1 ± 0,4b
76,2 ± 0,8a
77,1 ± 0,6a
81,5 ± 1,0c
86,3 ± 1,9d
<0,001
1
74,0 ± 1,7ab
74,1 ± 1,2ab
69,8 ± 0,2a
80,4 ± 0,6b
92,3 ± 7,5c
<0,001
2
85,3 ± 0,7a
92,7 ± 7,0ab
86,8 ± 1,9a
93,6 ± 5,8ab
100,0 ± 0,0b
0,010
60ºC
65ºC
3 100,0 ± 0,0
100,0 ± 0,0
100,0 ± 0,0
100,0 ± 0,0
100,0 ± 0,0
-
a, b, c – médias seguintes de letras diferentes na mesma linha apresentam diferenças significativas
(p<0,05)
34
4.3.1. Cálculo do valor D
O cálculo do valor D, tal como definido em Stumbo (1973) assume que a
inativação do microrganismo testado é uma função de primeira ordem. Assim, o
logaritmo do número de microrganismos sobreviventes à temperatura testada durante
períodos de tempo crescentes, pode ser representada por uma reta com declive negativo.
O cálculo do valor D é então assumido como o inverso do valor absoluto do
declive da reta. Esta assunção de que a inativação do microrganismo obedece a uma
cinética de primeira ordem, baseia-se no pressuposto de que a morte do microrganismo
é determinada pela inativação de enzimas vitais para a sobrevivência. Como é
geralmente aceite que a inativação de enzimas pelo calor obedece a uma cinética de
primeira ordem, esse princípio tem sido extrapolado para justificar o comportamento
linear da morte de microrganismos quando expostos ao calor (Boekel, 2002). Não
obstante esse princípio ser utilizado regularmente no cálculo dos parâmetros de morte
térmica de microrganismos, e a sua aplicação seja bem-sucedida, têm sido observadas
experimentalmente várias exceções àquela regra, observando-se comportamentos de
morte térmica não lineares (Valdramis et al., 2005). Os afastamentos da linearidade
observados experimentalmente podem apresentar diferente tipologia - curvas com dois
períodos retos, curvas concavas e curvas convexas - conforme revisto por Juneja et al.,
(2001).
No presente trabalho pretendia-se determinar os parâmetros de morte térmica
(valores D e z) para Salmonella spp. em massa de salsicha fresca com diferentes níveis
de adição de óleo essencial de alho e de orégão. Observou-se porém que o
comportamento das estirpes testadas foi não linear, sendo a representação gráfica do
logaritmo do número de microrganismos sobreviventes à temperatura testada durante
períodos de tempo crescentes uma curva convexa. Nestes casos, alguns autores (Juneja
et al., 2001) sugerem que se estime o valor D a partir da porção da curva que tem um
perfil reto – linha assintótica – determinando-se assim o designado valor D assintótico.
Nesse sentido, no presente trabalho estimou-se o valor D assintótico, conforme
ilustrado na figura 4.5, complementado pelo quadro 4.4. O exemplo apresentado é
relativo a uma das três repetição das amostras controlo (sem adição de óleo essencial) à
temperatura de 55ºC.
35
Sobreviventes (log ufc/g)
9.0
8.0
7.0
c
6.0
5.0
a
4.0
3.0
b
2.0
1.0
0.0
0
10
20
Tempo (min)
30
40
Figura 4.5. Retas obtidas por regressão da totalidade dos tempos de aquecimento (a),
utilizando o segmento reto excluindo o tempo zero (b) e utilizando o
segmento reto definido pelo tempo zero e 5 minutos (c). Resultados
relativos a uma repetição do ensaio a 55ºC, amostras controlo (sem adição
de óleo essencial).
Quadro 4.4. Equações das retas e parâmetros associados obtidos por regressão da
totalidade dos tempos de aquecimento (a), utilizando o segmento reto
excluindo o tempo zero (b) e utilizando o segmento reto definido pelo
tempo zero e 5 minutos (c). Resultados relativos a uma repetição do ensaio a
55ºC, amostras controlo (sem adição de óleo essencial).
Linha
Equação da reta
r
b
D
Número
de pontos
utilizados
Redução
abrangida
pelos pontos
selecionados
a
y = -0,1295x + 5,5341
0,76
-0,1295
7,7
8
6,4
b
y = -0,0524x + 3,6067
0,96
-0,0524
19,1
7
1,8
c
y = -4,6326x + 12,865
1
-4,6326
0,2
2
4,6
36
Como se pode observar na figura 4.5 e quadro 4.4, a reta de regressão para a
totalidade dos pontos (reta a, ilustrada com linha contínua) é pouco representativa dos
dados, como se depreende da observação gráfica e do reduzido coeficiente de correlação
(r = 0.76). Esta reta viola alguns princípios a que deve obedecer a utilização de retas
para cálculo do valor D, nomeadamente o reduzido coeficiente de correlação, que é
menor que os 0.90 recomendados (Juneja et al., 2001). Quando se ignora o primeiro
ponto da curva, correspondente às amostras não aquecidas (tempo zero), observa-se que
a reta (reta b, ilustrada com linha tracejada) tem parâmetros mais compatíveis com a
determinação do valor D (r > 0.90 e mais do que cinco pontos), porém, a reta só traduz
uma redução do número de sobreviventes de 1.8 log ufc/g o que é manifestamente
inferior à redução de cinco unidades logarítmicas recomendada para retas usadas no
cálculo de parâmetros de morte térmica. A reta c (ilustrada com linha-ponto), é ainda
mais inadequada, pois só inclui 2 pontos do ensaio. Ainda que nenhuma das três retas
identificadas obedeça aos parâmetros recomendados para a determinação do valor D, do
ponto de vista estritamente teórico apresenta-se o valor D obtido com cada uma delas.
Como se podia esperar pela observação do gráfico, as discrepâncias entre os
valores obtidos com a 3 retas são enormes, desde cerca de 19 minutos usando a reta b, a
menos de 0,2 minutos quando se utiliza a reta c, sendo que provavelmente nenhuma das
retas descreve corretamente o comportamento da morte pelo calor do microrganismos
em estudo. Esta discrepância vai de encontro à preocupação revelada por Juneja et al.,
(2001 IJFM) sobre a clareza do procedimento de identificar a porção linear da curva,
levando muitas vezes à ocorrência de vieses associados à seleção dos pontos a utilizar
na reta feita pelo investigador.
4.3.2. Modelo preditivo para estimativa do tempo de morte térmica
A estratégia de utilização de modelos não lineares para estimar o tempo
necessário para produzir uma redução pré-determinada na população microbiana em
estudo tem sido aplicada por vários autores (Boekel, 2002, Juneja et al, 2003, Valdramis
et al, 2005). Genericamente, o conceito rígido de valor D – tempo necessário para
reduzir dez vezes a população microbiana sujeita ao aquecimento – tem vindo a ser
substituído por um conceito mais aplicado, o do tempo necessário para produzir uma
redução pré-definida na referida população microbiana. Do ponto de vista prático, o
37
objetivo do valor D é sempre o de estimar o tempo total de aquecimento necessário para
produzir uma redução pré-definida. Por exemplo, de acordo com o Departamento de
Inspeção e Segurança Alimentar Norte Americano (USDA-FSIS, 2001) a validação de
um processo de fabrico de um enchido pasteurizado deve assegurar uma redução de 7D
em Salmonella spp., ou seja, o que se pretende é saber o tempo total que é necessário
manter o alimento sob a temperatura testada. A substituição da utilização do valor D por
modelos preditivos do tempo necessário para produzir uma redução pré-definida tem
assim vindo a ser aplicada em alimentos em que a microflora tem uma cinética de morte
térmica não linear.
Uma vez que o microrganismo em estudo no presente trabalho apresentou uma
cinética de morte não linear, e dada a inadequação dos resultados para utilizar numa
aproximação linear por seleção do segmento reto da curva de morte térmica, procedeuse ao estudo da cinética de morte térmica recorrendo a um modelo de estimativa não
linear baseado na função de crescimento exponencial (equação 1), que foi aquela que
melhor se adaptou à tipologia dos resultados.
(1)
Nesse modelo, utiliza-se não o logaritmo do número de microrganismos
sobreviventes, como acontece no cálculo do valor D, mas o logaritmo do número de
inativados para estimar o tempo necessário para produzir uma redução predefinida, pelo
que a equação 1 pode ser descrita pela equação 2.
(1)
As figuras 4.6, 4.7 e 4.8 ilustram as curvas de morte térmica a 55ºC, 60ºC e 65ºC
nas diferentes condições de ensaio. O modelo foi definido como tempo (minutos) em
função do logaritmo do número de microrganismos inativados (log I). As figuras
ilustram a curva calculada usando simultaneamente as 3 repetições de cada condição de
ensaio. Para efeitos de comparação do efeito da adição de óleos essenciais no tempo
necessário para produzir uma redução pré-definida, o modelo foi calculado
individualmente para cada repetição. Os parâmetros do modelo são apresentados no
quadro 4.5. Observou-se que os modelos calculados para estimar o tempo de morte
térmica são, na generalidade adequados para descrever os dados, apresentando
coeficientes de correlação superiores a 0,90 em 43 dos 45 casos. Só numa das repetições
do ensaio a 60ºC nas amostras controlo e numa do ensaio a 65ºC nas amostras com o
38
nível mais alto de óleo de orégão é que a curva tem uma mais fraca representação dos
dados, com coeficientes de correlação de 0,84 e 0,87, respetivamente. Os resultados
obtidos a 65ºC devem ser vistos com reservas, pois o número de pontos do modelo é
menor que o utilizado nas outras temperaturas, pois a redução da microflora foi muito
extensa logo nos primeiros tempos de exposição ao calor testados. Ao fim de três
minutos de exposição ao calor a contagem foi inferior ao limite de deteção (0,6 log
ufc/g) do método usado.
Os parâmetros utilizados no quadro 4.5 foram utilizados para estimar o tempo
necessário para produzir uma redução pré-definida na população de Salmonella spp. em
massa de salsicha com os dois níveis de óleo de alho e de orégão testados. Para efeito
dessa estimativa, utilizou-se no presente trabalho três reduções pré-definidas: 7D, 5D e
3D. A redução de 7D em Salmonella spp, é preconizada pelo USDA-FSIS (2001) para
validar processos de fabrico de produtos cárneos processados pelo calor. Esta exigência
daquela agência Norte-Americana é mais prudente que a redução de 5D que é apontada
por alguns autores (Nottermans et al., 1993) para validação de processos de fabrico
onde há uma probabilidade razoável de Salmonella estar presente. As reduções de 7D e
5D são apontadas para validação de processos de fabrico industriais, em que o principio
de precaução, tal como recomendado no regulamento comunitário nº 178 de 2002, é
aplicado. Esta redução pode ser equacionada para processos de pasteurização industrial
de salsichas, desviando-as do tipo de produto fresco para um similar tratado pelo calor
com uma prazo de validade mais longo e garantindo a segurança sanitária ao nível do
fabricante, e não ao nível do consumidor como acontece com as salsichas frescas. Essa
transferência do controlo do risco para o tratamento térmico culinário efetuada pelo
consumidor, deve ser comunicada pelo industrial ao consumidor, respondendo assim à
obrigatoriedade de comunicar o risco ao elo seguinte da cadeia alimentar prevista
também no regulamento comunitário suprarreferido. Esta comunicação de risco é feita
habitualmente através de menções no rótulo à necessidade do produto ser bem
cozinhado.
39
60
50
time (min)
40
30
20
10
0
-10
-1
0
1
2
3
4
5
6
7
log I
60
50
50
40
40
tempo (min)
Tempo (min)
55ºC - control
60
30
20
30
20
10
10
0
0
-10
-10
-1
0
1
2
3
4
5
6
7
-1
8
0
1
2
3
log I
5
6
7
8
6
7
8
55ºC - 0,5% óleo de alho
55ºC - 0,05% óleo de alho
60
60
50
50
40
40
tempo (min)
tempo (min)
4
log I
30
20
30
20
10
10
0
0
-10
-10
-1
0
1
2
3
4
5
6
log I
55ºC - 0,05% óleo de orégão
7
8
-1
0
1
2
3
4
5
log I
55ºC - 0,5% óleo de orégão
Figura 4.6. Curvas de inativação térmica a 55ºC nas diferentes condições de ensaio
obtidas com o modelo de crescimento exponencial (equações 1 e 2).
40
20
tempo (min)
15
10
5
0
-5
-1
0
1
2
3
4
5
6
7
8
log I
20
15
15
time (min)
tempo (min)
60ºC - control
20
10
5
10
5
0
0
-5
-5
-1
0
1
2
3
4
5
6
7
-1
8
0
1
2
3
log I
5
6
7
8
6
7
8
60ºC - 0,5% óleo de alho
60ºC - 0,05% óleo de alho
20
20
15
15
time (min)
time (min)
4
log I
10
5
10
5
0
0
-5
-5
-1
0
1
2
3
4
5
6
log I
60ºC - 0,05% óleo de orégão
7
8
-1
0
1
2
3
4
5
log I
60ºC - 0,5% óleo de orégão
Figura 4.7. Curvas de inativação térmica a 60ºC nas diferentes condições de ensaio
obtidas com o modelo de crescimento exponencial (equações 1 e 2).
41
7
6
time (min)
5
4
3
2
1
0
-1
-1
0
1
2
3
4
5
6
7
8
log I
7
6
6
5
5
4
4
time (min)
time (min)
65ºC - control
7
3
2
3
2
1
1
0
0
-1
-1
-1
0
1
2
3
4
5
6
7
-1
8
0
1
2
3
log I
5
6
7
8
6
7
8
65ºC - 0,5% óleo de alho
65ºC - 0,05% óleo de alho
7
7
6
6
5
5
4
4
time (min)
tempo (min)
4
log I
3
2
3
2
1
1
0
0
-1
-1
-1
0
1
2
3
4
5
6
log I
65ºC - 0,05% óleo de orégão
7
8
-1
0
1
2
3
4
5
log I
65ºC - 0,5% óleo de orégão
Figura 4.8. Curvas de inativação térmica a 65ºC nas diferentes condições de ensaio
obtidas com o modelo de crescimento exponencial (equações 1 e 2).
42
Quadro 4.5. Parâmetros do modelo de estimativa não linear baseado na função de
crescimento exponencial para cada temperatura testada (55ºC, 60ºC e
65ºC) nas diferentes condições de ensaio e para cada repetição
individualmente.
Temp.
55ºC
Formulação
rep
controlo
r
c
b0
b1
1
2
3
0,99
0,97
0,99
-0,78
-1,12
-0,88
-2,23
-2,96
-2,47
0,89
1,07
0,94
55ºC
0,05% óleo de alho
1
2
3
0,93
0,97
0,96
-0,60
-0,70
-0,74
-1,87
-4,10
-2,67
0,81
1,14
0,93
55ºC
0,5% óleo de alho
1
2
3
0,92
0,92
0,93
-2,24
-0,39
-0,62
0,12
-1,75
-1,48
0,51
0,78
0,75
55ºC
0,05% óleo de orégão
1
2
3
0,93
0,93
0,93
-2,01
-1,46
-1,84
-1,22
-2,11
-1,66
0,69
0,83
0,76
55ºC
0,5% óleo de orégão
1
2
3
0,96
0,99
0,99
-2,59
-1,74
-1,45
0,17
-0,60
-0,87
0,45
0,57
0,61
60ºC
controlo
1
2
3
0,95
0,84
0,93
-0,78
-0,88
-1,02
-1,30
-0,75
-1,06
0,75
0,67
0,72
60ºC
0,05% óleo de alho
1
2
3
0,98
0,96
0,99
-0,72
-0,79
-0,68
-1,46
-1,17
-1,60
0,69
0,70
0,74
60ºC
0,5% óleo de alho
1
2
3
0,93
0,97
0,98
-0,59
-0,36
-0,60
-2,86
-2,01
-1,96
0,91
0,76
0,80
60ºC
0,05% óleo de orégão
1
2
3
0,97
0,98
0,98
-0,57
-0,74
-0,63
-2,69
-1,32
-1,89
0,91
0,67
0,77
60ºC
0,5% óleo de orégão
1
2
3
0,93
0,93
0,95
-1,26
-0,60
-0,89
-0,55
-1,30
-1,13
0,50
0,60
0,59
65ºC
controlo
1
2
3
1,00
0,99
0,99
-0,13
-0,12
-0,13
-2,22
-2,33
-2,25
0,43
0,45
0,44
65ºC
0,05% óleo de alho
1
2
3
1,00
1,00
0,95
-0,13
-0,02
-0,09
-2,25
-3,46
-2,37
0,44
0,59
0,43
65ºC
0,5% óleo de alho
1
2
3
1,00
1,00
1,00
-0,10
-0,18
-0,14
-2,33
-1,83
-2,04
0,43
0,38
0,40
65ºC
0,05% óleo de orégão
1
2
3
0,99
1,00
0,95
-0,06
-0,02
-0,03
-3,44
-4,41
-3,67
0,58
0,73
0,59
65ºC
0,5% óleo de orégão
1
2
3
1,00
1,00
0,87
-0,02
0,00
-0,48
-3,88
-7,71
-0,73
0,63
1,15
0,19
43
Ao nível do consumidor, o conceito de validação do processamento térmico não
faz grande sentido, tanto mais que a esmagadora maioria dos consumidores não usa
qualquer dispositivo para monitorizar a temperatura dos alimentos que cozinha.
Considerando que a salsicha fresca é atualmente fabricada de acordo com elevados
padrões de higiene e de acordo com os princípios de análise de perigos e de pontos
críticos de controlo, tal como exigido pelo regulamento UE 852 de 2004, será de esperar
que, se eventualmente houver uma contaminação com Salmonella spp., seja
quantitativamente reduzida. Tratando-se de um alimento que tem que ser armazenado
obrigatoriamente em refrigeração e com um prazo de validade curto devido à sua
elevada perecibilidade, admitiu-se teoricamente, no contexto do presente trabalho, que
uma redução de 3D associada ao tratamento culinário doméstico seria suficiente para
eliminar uma contaminação eventual com Salmonella spp..
No quadro 4.6 são apresentados os valores médios do tempo necessário para
produzir reduções de 7D, 5D e 3D em Salmonella spp,. Em consequência da não
linearidade da curva de morte térmica, observam-se discrepâncias enormes no tempo
necessário para produzir as reduções pré-definidas. Ao contrário do que acontece com a
utilização convencional do valor D. A título de exemplo, se considerarmos
academicamente3 o valor D de 7,7 estimado com a reta a da figura 4.5 (amostras
controlo aquecidas a 55ºC), para produzir as três reduções pré-definidas de 7D, 5D e
3D, seria necessário expor as amostras durante 53,9, 38,5 e 23,1 minutos,
respetivamente, o que é, em termos de proporcionalidade completamente diferente das
determinadas pelo modelo preditivo (quadro 4.6) para as mesmas condições 68,5, 8,89 e
0,5 minutos.
O efeitos dos óleos essenciais de alho e de orégão mostraram-se muito
interessantes na redução do tempo necessário para produzir as reduções pré-definidas
em Salmonella spp.. A 55ºC, para atingir uma redução de 7D na população de
Salmonella spp. inoculada, as amostras sem óleos essenciais destacaram-se
significativamente das amostras com óleos tratadas com 0,5% de óleo de alho e com
ambos os níveis de adição de óleo de orégão, com tempos necessários claramente
3
Como discutido nessa secção, os parâmetros da reta de regressão não permitem usá-la com confiança na
determinação do valor D
44
maiores. Com a utilização de 0,05% de óleo de orégão pode poupar-se cerca de 30
minutos no processamento térmico, e com o nível mais elevado cerca de 40 minutos.
Para uma redução menor (5D) não se observou esse efeito, e para reduções ainda
menores, ainda que os tempos de exposição sejam muito curtos, as diferenças
observadas não correspondem a um padrão esperado, tal como observado com a
redução de 7D. Esta aparente incoerência observada para reduções menos extensas
deve-se provavelmente ao facto de se enquadrarem na zona inicial da curva de morte
térmica, que tem um grande declive, entre a contagem do tempo zero e do primeiro
tempo de exposição ao calor. Como essa parte da curva representa uma elevada redução
na microflora, mas é composta por poucas observações, poderá estar na base do
aparente viés observado.
45
Quadro 4.6, Comparação do tempo necessário (minutos) estimado para produzir uma
redução de 7D, 5D e 3D na população de Salmonella spp., em massa de
salsicha fresca para cada temperatura testada (55ºC, 60ºC e 65ºC) nas
diferentes condições de ensaio,
Temperatura
Formulação
7D
5D
3D
55ºC
controlo
68,48 ± 19,64 b
8,89 ± 0,72
0,05% óleo de alho
45,94 ± 1,64
ab
6,34 ± 2,02
0,5% óleo de alho
40,99 ± 2,82
a
9,95 ± 2,16
0,05% óleo de orégão
37,52 ± 1,69
a
6,81 ± 0,60
0,5% óleo de orégão
27,06 ± 2,31
a
7,90 ± 0,55
0,003
p
0,057
0,49 ± 0,31 a
0,45 ± 0,68 a
2,00 ± 0,88 b
0,13 ± 0,19 a
1,47 ± 0,42 ab
0,009
60ºC
controlo
51,87 ± 1,09
c
0,05% óleo de alho
35,43 ± 6,40
a
0,5% óleo de alho
32,21 ± 4,98
a
5,81 ± 1,12 ab
0,05% óleo de orégão
32,55 ± 5,33
a
6,28 ± 0,50 ab
0,5% óleo de orégão
17,80 ± 0,74
b
5,21 ± 0,40 a
p
<0,001
11,77 ± 0,99 c
7,97 ± 1,48 b
<0,001
2,16 ± 0,46 b
1,37 ± 0,35 ab
0,72 ± 0,38 a
0,86 ± 0,38 a
1,11 ± 0,16 a
0,005
65ºC
controlo
2,11 ± 0,03
a
0,80 ± 0,02
0,26 ± 0,01
0,05% óleo de alho
2,00 ± 0,19
a
0,72 ± 0,12
0,23 ± 0,05
0,5% óleo de alho
1,96 ± 0,08
a
0,81 ± 0,06
0,29 ± 0,03
0,05% óleo de orégão
1,75 ± 0,19
ab
0,47 ± 0,04
0,11 ± 0,02
0,5% óleo de orégão
1,51 ± 0,18
b
0,47 ± 0,33
0,17 ± 0,19
p
0,004
0,051
0,199
a, b, c – médias seguintes de letras diferentes na mesma coluna e para cada temperatura
testada, apresentam diferenças significativas (p<0,05)
Genericamente, o padrão de diferenças observado no aquecimento a 55ºC
mantém-se quando as amostras foram aquecidas a 60ºC. Destaca-se o facto das
amostras sem adição de óleo essencial (controlo) serem sempre as que necessitam de
períodos de aquecimento mais longos para produzir as reduções pré-definidas, e aquelas
com 0,5% de óleo essencial de orégão serem as que têm uma redução mais rápida.
Quando o aquecimento foi efetuado a 65ºC, a maioria dos efeitos detetados
deixa de ser estatisticamente significativa, mantendo-se somente o efeito da adição do
nível mais elevado de óleo de orégão na redução de 7D.
46
O mecanismo de ação antimicrobiana dos óleos essenciais não está
completamente esclarecido, acreditando-se que pela sua enorme diversidade de
componentes químicos, possa ser um mecanismo complexo envolvendo danos celulares
a vários níveis. O dano que é provocado na célula alvo que é mais consensual é aquele
que se acredita que ocorra ao nível da membrana plasmática, pois o carácter lipofílico
dos óleos essenciais permite que essa interação ocorra com facilidade. Os danos ao nível
da membrana celular implicam alterações nos processos fisiológicos de transporte de
eletrões e outros mecanismos de transporte ativo (Dorman e Deans, 2000; Burt, 2004;
Benchaar, 2008). Por outro lado, é geralmente aceite que o calor húmido provoca a
morte dos microrganismos por desnaturação de enzimas vitais para as funções básicas
da célula, por danos na membrana celular e por danos ao nível do material genético,
impedindo a síntese de proteínas e replicação. A associação entre os dois mecanismos
de controlo dos microrganismos – óleos essenciais e calor – poderá exercer um efeito
aditivo, ou mesmo sinérgico, pois a redução de viabilidade da célula pelas modificações
operadas pelos óleos essenciais pode torna-las mais sensíveis ao calor. Este efeito
aditivo, do ponto de vista teórico pode ter exceções, pois existem evidências
experimentais de que quando um microrganismo é submetido a condições de stresse
(osmótico, ácido ou outro) pode ficar mais resistente a outros parâmetros,
nomeadamente ao calor (Leyer e Johnson, 1992), vulgarmente conhecida por resistência
cruzada. Ainda que os resultados do presente trabalho não indiquem que essa situação
possa ter acontecido, é importante que se demonstre experimentalmente qual o resultado
da associação entre tratamentos com efeito antimicrobiano, pois a ocorrência de
resistência cruzada pode comprometer a segurança do alimento. Ainda que haja
atualmente profícua investigação sobre o efeito de óleos essenciais no controlo de
microrganismos, a questão da potencial ocorrência de resistência cruzada não tem sido
abordada. Admite-se que, se o mecanismo de ação do óleo essencial for o dano na
membrana celular, não há teoricamente motivos para considerar a ocorrência de
resistência cruzada. Porém, dada a diversidade de compostos químicos dos óleos
essenciais envolvidos no mecanismo de inibição, se houver mecanismos que levem à
acumulação intracelular de compostos sintetizados pelo microrganismo para contrariar o
efeito nocivo do óleo, o microrganismo poderá tornar-se mais resistente ao calor.
Um outro aspeto que poderá ter contribuído para a elevada mortalidade
observada é a presença de sulfito de sódio na massa da salsicha. Os sulfitos, permitidos
no fabrico de salsicha fresca com o objetivo de prolongar a sua vida útil, têm um efeito
47
antimicrobiano que se situa fundamentalmente ao nível da membrana plasmática da
célula alvo e inibição de enzimas envolvidas na produção de ATP (Ough e Were, 2005).
Sendo basicamente estes os mecanismos de inibição dos compostos ativos do
alho e do orégão, o primeiro sobre enzimas associadas à produção de energia e o
segundo sobre a membrana celular, é expectável que possa ter existido um efeito aditivo
ou sinérgico entre a atuação do sulfito e dos óleos essenciais.
4.4. Avaliação sensorial de massa de salsicha fresca
As cinco formulações utilizadas para avaliar a resistência térmica de Salmonella
spp, foram analisadas (aspeto e cheiro) por um grupo provadores que pontuaram numa
escala de 7 pontos as características: cor vermelha, cor anormal (verde ou castanha),
intensidade do cheiro a alho ou orégão e apreciação global. Observou-se (figura 4.9)
que o óleo de alho degradou muito a cor da massa de salsichas, conferindo-lhe uma cor
esverdeada muito intensa. Ainda que as quantidades de óleo de alho fossem múltiplo de
10, observou-se que a intensidade da cor esverdeada foi muito intensa mesmo com o
nível mais reduzido. A abundância de compostos sulfurados do óleo de alho coloca um
sério problema à sua utilização em produtos frescos, pois ficam reunidas as condições
para que se forme sulfomioglobina, de cor caracteristicamente esverdeada, e, se forem
reunidas condições, a colemioglobina, cuja formação é irreversível (Correia e Correia,
1985). Este problema não é tão grave nos produtos curados com nitrito, pois a reação do
óxido nítrico com a mioglobina é bastante instável, e utiliza a posição reativa do núcleo
hémico da mioglobina (Cassens et al., 1979), minimizando assim a possibilidade de
reação com os compostos sulfurados do alho.
O cheiro a alho também se mostrou muito intenso em ambos os casos. Com
qualquer uma das concentrações de alho utilizadas, a pontuação média da apreciação
global foi inferior ao meio da escala, A apreciação global das amostras com 0,5% de
alho foi muito baixa (1 valor numa escala de 7).
A utilização do óleo de orégão mostrou-se mais interessante do ponto de vista
sensorial, pois não afetou negativamente a cor da massa de salsicha, e o cheiro a orégão,
ainda que intenso, não afetou negativamente a apreciação global. Quando foi utilizada a
dose mais reduzida de óleo de orégão, a apreciação global foi até ligeiramente superior
ao controlo.
48
8,0
7,0
6,0
5,0
Cor vermelha
4,0
Cor anormal (verde/castanho)
Cheiro alho/oregão
3,0
Apreciação global
2,0
1,0
0,0
Control
alho 0,05%
alho 0,5%
oregão 0,05% oregão 0,5%
Figura 4.9. Características sensoriais de massa de salsicha grelhada preparada de com
dois níveis de óleo de alho ou de orégão e controlo, A pontuação foi
efetuada numa escala de intensidade de 7 pontos,
Os resultados da avaliação sensorial das salsichas apresentados, particularmente no
que se refere ao parâmetro hedónico – apreciação global - devem ser interpretados com
reservas, devido ao reduzido número de provadores envolvidos. No sentido de obter
resultados mais consistentes seria importante fazer uma abordagem hedónica com
algumas dezenas de provadores, que por motivos logísticos não foi possível concretizar
no presente trabalho. A utilização de uma estratégia de avaliação sensorial de “produto
ideal”, ou como é conhecida pelo seu designativo inglês – “just about right” (Trijp et al,
2007) seria a mais adequada para saber em que sentido seria necessário ajustar os níveis
dos óleos essenciais utilizados.
49
5. CONCLUSÃO
As salsichas frescas de origem comercial apresentaram uma composição média
aproximada de 68% de humidade, 14% de proteína e de gordura e 2% de sal. Em
nenhuma das 15 amostras testadas foi detetada Salmonella spp.
A introdução de óleo de alho e de orégão em massa de salsicha fresca nos níveis
estudados no presente trabalho teve um efeito importante na redução da microflora
quando a massa da salsicha foi aquecida. Nas três temperaturas testadas, e em todos os
tempos de exposição, essa diferença estatisticamente significativa foi observada, sendo
as amostras controlo, sem adição de óleo essencial aquelas que permaneciam com mais
microrganismos viáveis. O óleo de orégão mostrou-se mais eficaz na redução do
número de sobreviventes em massa de salsicha aquecida, particularmente quando foi
adicionado 0,5%.
Os cálculos dos parâmetros de morte térmica (valores D e z) não puderam ser
calculados pois a cinética de morte microbiana apresentou-se não linear, com uma forte
redução logo no primeiro intervalo de tempo testado. As condições básicas para cálculo
do valor D – regressão com pelo menos cinco pontos, coeficientes de correlação
superiores a 90% e abranger uma redução da microflora da ordem das cinco unidades
logarítmicas – não eram cumpridas.
Aplicou-se um modelo preditivo baseado na função exponencial que se mostrou
bem adequado aos dados. Com esse modelo é possível estimar o tempo necessário para
produzir uma redução na microflora pré-determinada. Na estimativa de tempo para
produzir uma redução de 7D o efeito da adição dos óleos essenciais mostrou-se
significativo. A utilização de óleos essenciais, particularmente o de orégão permite
reduzir para cerca de metade a duração de alguns tratamentos térmicos. Para reduções
pré-definidas mais reduzidas (5D e 3D) o efeito dos óleos essenciais manteve-se, mas
não foi tão evidente.
O óleo essencial de orégão não apresentou consequências negativas nas
características sensoriais, sendo que o nível de adição de 0,05% foi muito apreciado. O
óleo essencial de alho conferiu um aroma demasiado forte, e ligeiramente químico, que
depreciou essas amostras. Adicionalmente, esse óleo foi responsável pela ocorrência de
colorações esverdeadas nas massas de salsicha fresca, o que contribuiu para a sua fraca
aceitação.
50
6. BIBLIOGRAFIA
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