Como a Filogenia pode
nos ajudar!!!!
Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho
[email protected]
Considerações importantes
 Regiões amplificadas sãs as regiões adequadas á pergunda em questão?
 O PCR esta adequado para a realização de uma reação de sequenciamento?
 Qualidade da sequência genômica
- Ambiguidades (polimorfismos)
- “N” nas sequências
 Qualidade do alinhamento
- “gaps”no alinhamento
 Melhor trabalhar com nucleotideos ou aminoácidos (a região é codificante?)?
 Análise filogenética
- Método
- modelo
 Que sequencias controle usar nas análises !!!!!
Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho
Sempre teremos uma árvore filogenética
Mas o resultado é consistente?????
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objetivos
Verificar a transmissão do HIV por transfusão de
sangue utilizando análise filogenética de
sequencias de DNA do HIV do doador e receptor
de sangue de um banco de sangue brasileiro
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Material & Métodos
O que levou a estes estudo!!!
 Em 2009 surgiu a suspeita que uma paciente que havia recebido
componentes de sangue numa cirurgia de retirada de cisto de ovário,
tivesse recebido algum desses componentes contaminados com HIV
 A suspeita surgiu quando a paciente reportou, aproximadamente uma
semana após a cirurgia, febre, linfoadenopatias e alterações hematológicas
 Nesta ocasião iniciou-se então a investigação retrospectiva do doador e do
seu parceiro... 
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Material & Métodos
Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho
Material & Métodos
 Testes realizados
- EIA = enzima imunoensaio
- WB = wetern Blot
- CHHia =Quimioluminescência (prisma)
- RT PCR = Real time PCR
 Nested PCR
- envelope = ED5/ED12 e ED31/ED33
- polimerase = DP10/MMRT6 e DP16/MMRT5
 Reação de sequenciamento
 Análises filogenéticas
- Distância (Mega4)/ tamura Nei / 1000 réplicas de bootstrap
- ML(PHY ML)/ Kimura / 1000 réplicas de bootstrap
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Resultados
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Resultados
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conclusão
Foi observada alta similaridade entre as sequencias
genomicas do doador e receptor
(Menos de 1% de divergência entre as sequencia
nucleotideas)
Foi observada maior similaridade entre as sequencias do
região pol quando comparado com as sequencias do
envelope.
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objetivos
Avaliar a transmissão do HIV entre casais numa:
coorte de casais HIV positivos (concordantes),
residentes em Dakar no Senegal
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Material & Métodos
De maio de 2005 até fevereiro de 2009, pacientes
das consultas do ambulatório de HIV do Centro
Hospitalar Universitário Fann, em Dakar no
Senegal foram convidados a participar do estudo
com o seu Parceiro
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Material & Métodos
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Resultados
Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho
Resultados
 34 casais – as sequencias agruparam com bootstrap acima de
80% e distância abaixo do cut off (0,04)
Estas sequências foram consideradas geneticamente
relacionadas
 6 casais – as sequencias agruparam mas com bootstrap abaixo
de 80% e distância abaixo ou acima do cut off
Estas sequências foram consideradas geneticamente
indeterminadas
 6 casais – as sequências não agruparam e a distância acima do
cut off
Estas sequências foram consideradas geneticamente
indeterminadas
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Resultados
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Resultados
Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho
conclusão
 A maioria dos casais (concordantes) HIV positivos em Dakar
no Senegal mostrou sequencias geneticamente relacionadas
 Dados epidemiológicos indicam o marido como o provável
caso indice, estes dados enfatizam o risco de mulheres
casadas em contrair HIV como resultado de relações sexuais
ocasionais de seus maridos
 Compreender as origens e dinâmicas da infecção HIV-1 em
casais na África será crucial para o planejamento futuro e
sucesso de programas de prevenção do HIV
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Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho
objetivos
 Acompanhar o padrão de evolução de HIV-1 na Ásia durante o
período de 17 anos
A actividade biológica e patogenicidade de um dos mais
prevalentes subtipos do HIV (subtipo B) na Ásia foi determinada
com base nas sequências de HIV-1 do período de 1990 -2007
disponíveis no banco de dados de Los Alamos
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Material & Métodos
 Os data sets foram divididos em 4 grupos
Grupo I: 1990 – 1994
Grupo II: 1995 – 1999
Gupo III: 2000 – 2004
Grupo IV: 2005 – 2007
 Foram realizados dois tipos de análises da proteina
do envelope e da alça V3 das sequencias retiradas do
banco de Los Alamos
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Material & Métodos
 Análises filogenéticas baseadas na proteína do envelope
 Predição de sitios de glicosilação na proteína do
envelope
 Alinhamento do dominio V3
 Análise do “Motif” GPGX
 Determinação de regiões conservadas da região V3
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Resultados
Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho
Resultados
 Os clusters B, C, D e E apresentaram divergência e taxas de
mutação altas
 Os clusters A e F exibem forte seleção e permanecem menos
divergentes durante estes período
 Foi observado um aumento de heterogeneidade nas
sequencias de envelope na população infectada durante este
periodo
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Resultados
Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho
Resultados
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Resultados
Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho
Resultados
60% dos sitios da
V3 permanecem
conservados
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conclusão
 A patogenicidade e infectividade do subtipo B do HIV-1
está aumentada e mostrou uma rápida evolução e um
mecanismo de modulação
 Os dados analisados também fornecem informações úteis
sobre a vigilância da infecção do HIV-1 na Ásia e destaca o
padrão evolutivo de populações de vírus que possam estar
sob pressões variadas de seleção durante os diferentes
períodos de tempo
Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho
Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho
objetivos
 Analisar as relações filogenéticas de diferentes regiões do
genoma do VHC de amostras de casais portadores crônicos
 Comparar as sequências genômicas dos casais portadores
de VHC com sequências de portadores crônicos, não
relacionados, atendidos no mesmo ambulatório

Avaliar o grau de similaridade entre as sequências
genômicas do VHC dos casais e dos portadores não
relacionados
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Material & Métodos
Amostra
(Soro)
Extração RNA-VHC
(QIAamp)
Síntese de cDNA
com Random Primers
1º e 2º PCR
NS5B
NS3 1ª estratégia
Neg
Pos
NS3 2ª estratégia
Pos
Reação de sequenciamento
Neg
Excluído das
análises
Excluídos
desta
análise de
NS3
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Material & Métodos
Reação de sequenciamento
Alinhamento das seqüências da região NS5B
com seqüências do GenBank e seqüências controle
Alinhamento das seqüências da região NS3
com seqüências do GenBank e seqüências controle
Purificação após reação de sequenciamento
Gel de sequenciamento
Alinhamento das seqüências da região NS3/NS5B
com seqüências do GenBank e seqüências controle
Seqüências da região NS5B e NS3
Validação das seqüências
Montagem da seqüência consenso
(Phred-Phrap- Consed)
Alinhamento das seqüências de cada região
com seqüências do GenBank e seqüências controle
(Clustal X)
Genotipagem e Subtipagem
Análise do Sinal Filogenético
Construção das topologias das árvores filogenéticas
das diferentes regiões com os diferentes métodos e modelos
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Material & Métodos
Tabela 1 - Características dos pacientes (casais) selecionados (dados obtidos de prontuário)
Casal
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Sexo
Genótipo
Nascimento
Uso Dogas Inj.
Tranfusão /ano
Promiscuidade**
Risco Prof.
Tatoo
Acupuntura
F
3
28/8/1963
Sim
Não
Não
Não
Não
Não
M
3
4/1/1960
Não
Não
Não
Não
Não
Sim
F
3
30/7/1971
Não
Não
Não
Não
Não
Não
M
3
22/11/1952
Sim
Não
Não
Não
Sim
Não
F
1
6/7/1942
Não
Sim/1975
Não
Não
Não
Sim
M
1
S/Inf*
Não
Não
Não
Não
Não
Sim
F
1
15/8/1958
Não
Não
Não
Não
Não
Não
M
1
4/6/1955
Sim
Não
Sim
Não
Não
Não
F
1
16/6/1954
Não
Não
Não
Não
Não
Não
M
1
29/5/1945
Não
Não
Não
Sim
Não
Não
F
1
19/6/1957
Não
Sim/1984
Não
Não
Não
Sim
M
1
13/2/1949
Não
Não
Não
Não
Não
Sim
F
3
5/8/1962
Não
Não
Não
Sim
Sim
Não
M
3
29/12/1963
Não
Não
Não
Sim
Não
Não
F
1
S/Inf*
Não
Não
Não
Não
Sim
Não
M
1
S/Inf*
Sim
Não
Não
Não
Sim
Não
F
1
S/Inf*
S/Inf*
S/Inf*
S/Inf*
S/Inf*
S/Inf*
S/Inf*
M
1
S/Inf*
S/Inf*
S/Inf*
S/Inf*
S/Inf*
S/Inf*
S/Inf*
S/Inf* = Sem informação
** = mais de 2 parceiros no período de 6 meses
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Material & Métodos
Tabela 2 – Características pacientes controle (dados obtidos de prontuário)
Controle Nº
Sexo
Genótipo
Nascimento
Uso Dogas Inj.
Tranfusão /ano
Promiscuidade
Risco Prof.
Tatoo
Acupuntura
6947
M
1
1981
Não
Sim/1981
Não
6681
F
1
1962
Não
Não
Não
Não
Sim
Não
Não
Não
8090
F
1
1944
Não
Não
Não
Não
Não
Não
6625
M
1
1957
Não
Não
Não
Não
Não
Não
7152
M
1
1951
Sim
Não
Não
Sim
Sim
Sim
Não
10248
F
1
1963
8217
M
1
1966
Não
Sim/1986
Não
Não
Não
Sim
Não
Sim/várias
Não
Sim
Não
Não
7954
M
1
1961
7017
M
1
1954
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Sim/1978
Não
Não
Não
9089
M
1
Não
1967
Sim
Não
Sim
Não
Sim
8399
F
Sim
1
1963
Não
Sim/1988
Não
Não
Não
Não
10402
8432
F
1
1941
Não
Sim/1975
Sim
Não
Não
Não
F
1
1968
Não
Não
Não
Não
Não
Não
10355
M
1
1956
Não
Não
Sim
Não
Sim
Não
7322
F
1
1952
Não
Não
Não
Não
Não
Não
7879
F
1
1936
Não
Sim/1971
Não
Não
Não
Não
7918
F
1
1940
Não
Não
Não
Sim
Não
Não
7910
M
1
1972
Não
Não
Não
Sim
Não
Não
6887
7733
F
M
1
1
1931
1952
Não
Não
Sim/1983
Sim/1974
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
10187
M
1
1955
Não
Sim/1976
Sim
Não
Não
Não
6611
M
1
1934
Não
Não
Não
Não
Não
Não
10323
M
1
S/Inf*
Sim
Não
Não
Não
Não
Não
6874
M
1
1956
Não
Sim/1975
Não
Não
Não
Não
5772
M
1
1949
Não
Não
Sim
Não
Não
Não
6602
F
1
1977
Não
Não
Não
Não
Não
Não
10371
M
1
1943
Não
Sim/1966
Não
Sim
Não
Não
7692
M
1
1975
S/Inf*
S/Inf*
S/Inf*
S/Inf*
S/Inf*
S/Inf*
S/Inf* = Sem informação
** = mais de 2 parceiros no período de 6 meses
Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho
Material & Métodos
Tabela 2 - Características dos pacientes controle (dados obtidos de prontuário) (continuação)
Controle Nº
Sexo
Genótipo
Nascimento
Uso Dogas Inj.
Tranfusão /ano
Promiscuidade
Risco Prof.
Tatoo
Acupuntura
10180
M
1943
Sim
Sim/1980
Não
Não
Não
Não
7647
M
1939
Não
Sim/1978
Sim
Não
Não
Não
7826
F
1938
Não
Sim/1992
Não
Não
Não
Não
10654
F
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
1952
Não
Não
Não
Não
Não
Não
1930
Não
Não
Não
Não
Não
Não
1958
Não
Sim/1978
Não
Não
Não
Não
1954
Não
Sim/1963
Não
Não
Não
Não
1961
Não
Sim/1981
Não
Não
Não
Não
1964
Não
Sim/1990
Não
Não
Sim
Não
1968
Não
Não
Não
Não
Não
Não
1951
Não
Sim/1975
Não
Não
Não
Não
10831
F
7185
M
8319
M
8487
M
7244
M
7748
M
10709
F
10749
F
10698
M
10173
F
1939
S/Inf*
S/Inf*
S/Inf*
S/Inf*
S/Inf*
S/Inf*
S/Inf*
S/Inf*
S/Inf*
S/Inf*
S/Inf*
S/Inf*
S/Inf*
1960
Não
Não
Não
Não
Sim
Não
S/Inf* = Sem informação
** = mais de 2 parceiros no período de 6 meses
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Resultados
Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho
Resultados
Análise do sinál filogenético
A
B
NS5B 199nt
(77 seq)
NS5B 344nt
(77 seq)
C
NS3 619nt
(72 seq)
D
NS3/NS5B
960nt
(72 seq)
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Resultados
Variabilidade nucleotidica
 Similaridade entre as sequências de nucleotídeos dos casais
Região NS5B  entre 78,2% e 99,1% (média de 95,45%)
Região NS3  entre 94,7% e 99,2% (média de 97,24%)
 Similaridade entre as sequências de nucleotídeos dos
controles locais e sequências do Genbank
Região NS5B  entre 53,9% e 98% (média de 72,9%)
Região NS3  entre 61% e 98,2% (média de 74,8%)
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Resultados
Análise filigenética das regiões NS3/NS5B
A
NS3/NS5B
MV TBR
TrN+I+G
(Bootstrap=1000 réplicas)
A
B
B
C
C
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Resultados
Análise filigenética das regiões NS3/NS5B
(Com controles)
A
NS3/NS5B
MV TBR
A
B
TrN+I+G
(Bootstrap = réplicas)
C
B
C
Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho
Resultados
Análise filigenética da regiãoNS5B
(Com controles)
A
B
A
C
B
NS5B
MV TBR
TrNef+I+G
C
(Bootstrap = 1000 réplicas)
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Resultados
Resumo das análises das árvores filogenéticas
(sem controle)
Análises sem controles
Familiares
NS5b
Similaridade
NS3
Bootstrap*** Distância
MV
NS3/NS5b
Similaridade Bootstrap*** Distância
MV
Bootstrap*** Distância
MV
CF01
97,4%
**
MO
MO
96,4%
**
?
?
**
MO
MO
CF02
97,4%
**
?
MO
99,2%
**
?
?
**
MO
MO
CF03
97,1%
**
?
?
94,7%
**
?
?
99
MO
MO
CF04
97,7%
98
MO
MO
NR
NR
NR
NR
NR
NR
NR
CF05
96,8%
**
?
?
96,6%
**
?
?
**
?
MO
CF06
97,7%
72
?
MO
97,0%
100
MO
MO
100
MO
MO
CF07
97,7%
73
MO
MO
97,4%
**
MO
MO
81
MO
MO
CF08
99,1%
92
MO
MO
99,0%
94
MO
MO
100
MO
MO
CF09
78,2%
**
?
?
NR
NR
NR
NR
NR
NR
NR
MO = Mesma origem (ramo monofilético) (vermelho com Bootstrap acima de 70)
MV = Máxima Verossimilhança
? = Não apresentam ramo monofilético
NR = Não Realizado
** = Sem bootstrap significativo (<70)
*** = Valores acima de 70
Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho
Resultados
Resumo das análises das árvores filogenéticas
(com controle)
Análises com controles
Familiares
NS5b
NS3
NS3/NS5b
Similaridade Bootstrap*** Distância MV Similaridade Bootstrap*** Distância MV
Bootstrap*** Distância MV
CF01
97,4%
**
MO
MO
96,4%
**
?
MO
**
?
MO
CF02
97,4%
**
?
MO
99,2%
79
?
MO
**
?
MO
CF03
97,1%
**
?
?
94,7%
88
MO
MO
94
MO
MO
CF04
97,7%
89
MO
MO
NR
NR
NR
NR
NR
NR
NR
CF05
96,8%
**
?
?
96,6%
**
?
?
**
?
MO
CF06
97,7%
**
?
MO
97,0%
99
MO
MO
99
MO
MO
CF07
97,7%
**
MO
MO
97,4%
**
MO
MO
73
MO
MO
CF08
99,1%
92
MO
MO
99,0%
91
MO
MO
98
MO
MO
CF09
78,2%
**
?
?
NR
NR
NR
NR
NR
NR
NR
MO = Mesma origem (ramo monofilético) (vermelho com Bootstrap acima de 70)
MV = Máxima Verossimilhança
? = Não apresentam ramo monofilético
NR = Não Realizado
** = Sem bootstrap significativo (<70)
*** = Valores acima de 70
Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho
conclusão

A escolha da região genômica e do método de análise
filogenética a ser utilizado são importantes para a precisão
dos resultados
 Os dados de prontuário juntamente com as análises
moleculares indicam que a origem dos vírus dos casais 8, 7,
6, 3 e 4 seja a mesma, dando suporte à hipótese de
transmissão intrafamiliar
Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho
conclusão
 A inclusão dos controles nas análises mostrou-se relevante
para a confirmação dos resultados
 Dados como similaridade de sequências não são suficientes
para inferir mesma fonte de transmissão
Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho
Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho