Sendo tão pequenas, conseguirão
fazer mal a alguém?
As Cianocientistas,
DATA: 06/03/2009
Bárbara Oliveira
e Filipa Vaz
Professor responsável
José Luis Silva,
Colégio Nossa Senhora da Graça
Clube da Ciência
O objectivo das várias experiências
realizadas foi determinar o impacto que as
toxinas de cianobactérias têm ao nível dos
ecossistemas, realizando assim culturas e
ensaios de toxicidade em laboratório.
Basicamente criou-se um tipo de
ambiente pretendido para poder estudá-lo
e avaliar as consequências caso ocorre-se
em situação real, ou seja, caso um bloom
de cianobactérias preenchesse as águas
utilizadas por todos os outros seres vivos.
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As cianobactérias, Microcystis aeruginosa, são microrganismos autotróficos, a
fotossíntese é o seu principal meio para obtenção de energia e manutenção
metabólica. Os seus processos vitais requerem somente água, dióxido de carbono,
substâncias inorgânicas e luz.
Desenvolvem-se em águas poluídas e já tomaram conta de grande parte das fontes de
água superficiais em Portugal, alastrando-se um pouco por todo o mundo. As
cianobactérias modificam a qualidade da água produzindo toxinas, odores ou uma
espuma densa de cor verde-azulada na superfície da água, chamada floração. Estas
podem provocar graves problemas de saúde.
Estas algas são propicías em ambientes com temperaturas elevadas. O aquecimento
global é, portanto, um factor que pode levar ao aparecimento de blooms de
cianobactérias.
A chlorella é uma alga unicelular, microscópica, de água doce, muito rica em
minerais, aminoácidos e compostos químicos orgânicos desintoxicantes. Constituí a
base dos ecossistemas. Sob favoráveis condições de crescimento (forte luz solar, água
pura e ar limpo) Chlorella p. multiplica-se a uma inacreditável taxa.
As artémias são pequenos crustáceos da ordem Anostraca, de tamanho e coloração
variadas, dependendo do tipo de alimento que elas consumirem.
Vivem em regiões de água salgada concentrada (Salinas) - ambiente extremo no qual
poucas espécies desenvolvem-se, de forma que há poucos predadores - por serem
ricas em proteínas, vitaminas e sais minerais, é um dos melhores alimentos vivos que
pode se fornecer aos peixes. Acelera a recuperação de doenças e os seus náuplios
são indispensável à alimentação de alguns seres marinhos.
Foram realizados todos os protocolos fornecidos e o material indicado nos
mesmos. A única alteração feita foi, ao lado da curva de crescimento da Microsystis
aeruginosa, fez-se também uma curva de crescimento para a Chlorella vulgaris.
Essa última curva de crescimento foi feita porque inicialmente o protocolo era
um que continha um passo falacioso e, devido a uma má preparação e falta de leitura
prévia, não se apercebemos que iria ser necessário meio Z8 no teste de toxicidade,
ficando portanto sem meio. Utilizado no teste de toxicidade foi um filtrado do
inoculo das algas verdes, devido à falta de material (meio Z8). Para tal esperou-se que
as algas verdes assentassem na base do balão de fundo plano e retirou-se amostras da
superfície da cultura. Essas amostras foram filtradas entre quatro a cinco vezes,
tentando obter o conteúdo mais semelhante possível ao meio fornecido inicialmente.
É claro que não continha os nutrientes na sua totalidade, podendo pois afectar os
resultados do teste.
O gráfico obtido da curva de crescimento da Microcystis aeruginosa é:
Curva de crescimento das cianobactérias (microcystis aeuroginosa)
até 37º dia
60
50
concentração de40
células × 10+6/mL
30
20
10
0
0
5
10
15
20
nº dia
25
30
35
40
Segundo a informação complementar fornecida, temos que a curva de
crescimento contempla cinco fases: a fase de latência (fase Lag), uma fase
relativamente curta, caracterizada por não ocorrer crescimento; a fase exponencial
(fase Exp), uma fase em que ocorre aumento constante do número de organismos na
cultura; a fase de desaceleração, uma fase em que ocorre um declínio no crescimento
da cultura; a fase estacionária, caracterizada pela ausência de crescimento; e, por fim, a
fase de morte, que ocorre quando o metabolismo celular já não pode ser mantido.
Analisando a nossa curva de crescimento, temos que…
Inicialmente, até ao quinto dia a concentração de cianobactérias manteve-se
praticamente constante, não ocorrendo crescimento significativo (fase Lag). Do quinto
ao vigésimo sexto dia, no geral, houve aumento constante da concentração celular
[(fase Exp), com algumas excepções em que a concentração aumenta brutalmente. Tal
facto pode dever-se à variação da temperatura que às vezes era mais elevada]. Do dia
vinte e sete ao dia vinte e nove houve um declínio significativo na concentração de
células da cultura (fase de desaceleração). De seguida observou-se uma fase mais
estável em que o crescimento foi muito pouco acentuado, e que, comparado com o
constante aumento visto anteriormente ,não é minimamente significativo (fase
estacionária). A partir do trigésimo sexto dia há uma quebra na concentração celular,
que, apesar de a experiência ter acabo antes de acontecer, continuaria a diminuir (fase
de morte).
Curva de crescimento das algas verdes( chorella vulgaris)
10
Concentração
células
×10+6/ mL
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
0
10
20
nº dia
30
40
50
Devido ao facto de ter havido um erro na entrega do protocolo, ao
distribuir o meio Z8, não foi deixado nenhum de parte para os ensaios de
toxicidade, portanto, realizou-se uma curva de crescimento para a Chlorella vulgaris,
tal como realizámos para as cianobactérias.
Durante os primeiros sete dias a concentração das algas verdes manteve-se
mais ou menos constante, não ocorrendo crescimento minimamente significativo (fase
Lag). De dia sete a dia vinte e nove houve aumento significativo [(fase Exp), há muitas
variações, altos e baixos, muito possivelmente devido a diferenças de temperatura]. De
dia vinte e nove a dia trinta a concentração sofreu uma quebra acentuada (fase de
desaceleração). Por fim, desde esse momento até ao dia trinta e sete(final das
contagens) a concentração volta a aumentar. As restantes fases não foram observáveis
durante a realização da cultura.
Algas verdes
O ensaio de toxicidade das algas verdes foi realizado, mas, os resultados obtidos não foram os
esperados. Ora vejamos
• Após a contagem obtivemos as seguintes concentrações
• Poço:
• A1 – 5,44 x106 cél/mL
• A2 – 2,335 x106 cél/mL
• A3 – 2,235 x106 cél/mL
• A4 – 2,155 x106 cél/mL
• Onde há maior concentração de cianobactérias é onde há mais células e, onde era suposto
haver mais células, que era no controlo, é onde existem menos. E isso verifica-se para as
restantes réplicas.
• B1 – 3,82 x106 cél/mL
• B2 – 2,285 x106 cél/mL
• B3 – 2,55 x106 cél/mL
• B4 – 2,03 x106 cél/mL
• No B3 notasse um ligeiro aumento, mas não é significativo, e no B4 volta a diminuir.
• C1 – 2,91 x106 cél/mL
• C2 – 2,26 x106 cél/mL
• C3 – 2,225 x106 cél/mL
• C4 – 2,045 x106 cél/mL
• Para a 3ª réplica, as mesmas conclusões…
• É-nos pedido para calcular a % de inibição de
crescimento da Chlorella fazendo
• O problema é que o valor médio do controlo é
sempre o mais pequeno, e era suposto ser o maior…
O que nos vai dar erro nos cálculos todos.
• Também temos que, no dia em que se iniciou o ensaio de toxicidade da
Chlorella, a concentração era de 9,21 × 106 cél/mL.
Como isto também não foi feito totalmente como devia, temos que:
• O protocolo diz que devíamos ter feito uma diluição com meio Z8, para que
a concentração inicial fosse de 1 × 106 cél/mL. Nós não o conseguimos fazer
porque não tínhamos o meio Z8 (mandaram-nos o protocolo errado e nós
gastámos o meio todo logo para as culturas de cianobactérias e de chlorella
e, quando mandaram o protocolo certo, nós ficámos com o problema de já
não termos o meio). Assim em vez de 1 × 106 cél/mL, ficámos com uma
concentração inicial de 9,21 × 106 cél/mL (o que é uma concentração muito
elevada para o pouco de cianobactérias que os poços tinham).
•
O protocolo também dizia que, durante o teste de toxicidade, as células deveriam
estar em constante agitação ou, pelo menos, serem agitadas três vezes ao dia, o que
não aconteceu por falta de disponibilidade de ir ao laboratório. Foram só agitadas 2
vezes por dia. Mas também não há-de ter sido esse o problema.
•
Outra coisa, e essa deve ter sido a principal razão para o teste não ter dado bem, foi
altura em que o realizámos. Este teste era para ter sido realizado logo após ter
recebido o material, o que não aconteceu. O teste foi realizado 41 dias depois, o que
é uma GRANDE diferença. A culpa disto foi a falta de preparação prévia da
experiência, a falta de tempo e disponibilidade para realizar o teste de toxicidade e o
facto de nos terem enviado o protocolo errado. Uma das coisas que salientavam logo
no inicio era que este material se poderia estragar, por isso, pode ter-se dado o caso
do extracto congelado das cianobactérias já não ter sido viável para utilização no
teste, alterando os resultados (o mesmo para as artemias, pesar de eles terem dito
que o ensaio de toxicidade das artemias podia ser feito em qualquer altura).
•
Tendo em conta também a baixa temperatura em que a experiência decorreu,
rondou em média os 17/18°C, enquanto deveria estar a uma temperatura de 25°C.
Gráfico da percentagem de mortalidade em função da concentração de solução
tóxica de Microcystis
120
100
80
B
A
60
C
40
20
0
0
2
4
6
8
10
12
• Supostamente, o ensaio onde houvesse menos concentração de
cianobactérias, seria aquele onde haveria menos percentagem de náuplios
mortos, mas como podemos verificar tal não acontece.
• Na amostra A, para níveis mais baixos de concentração de cianobactérias
temos maior percentagem de mortos. E, há medida que a concentração vai
aumentando, a percentagem de mortos vai diminuindo. Isso leva a que
todos os valores calculados de inibição sejam superiores a 100%.
Teoricamente seria de esperar precisamente o contrário. O mesmo acontece
nas restantes réplicas.
Este resultados podem ter-se devido ao facto de:
• O obtenção dos náuplios ter sido iniciada a uma terça e ter sido esperado
um período de 48h para eclodirem (pois a temperatura estava muito baixa
por volta dos 17ºC), e por falta de disponibilidade o ensaio ter sido deixado
para fazer na segunda-feira da semana a seguir. O problema é que, durante
esse tempo todo, os náuplios foram deixados sem alimento, e isso e
influenciou, sem dúvida, os resultados obtidos.
“E se um bloom de cianobactérias te batesse à porta?”
É esta a grande questão, que através dos resultados obtidos durante este
tempo de realização de testes, vamos tentar dar resposta.
Através das experiências realizadas, e apesar dos erros obtidos, podemos concluir
que, as cianobactérias vivem dependentes de dois factores, a luz e a temperatura, e
que estas “bactérias fotossintéticas” são beneficiados onde as temperaturas são mais
elevadas e crescem de maneira rápida em condicões favoráveis. O consequente
aumento da temperatura global, pode vir a ter graves problemas a nível dos
ecossistemas marinhos, pois estas algas, devido a um crescimento mais acalerado,
podem passar a ser muito mais frequentes em zonas de temperaturas mais
elevadas. Um bloom de cianobactérias, traria a “morte” aos oceanos, isto porque,
estas algas concentram-se em grande número, cobrindo toda a superficie de uma
determinada zona, impossibilitando a passagem de luz solar para todos os seres
vivos que vivem lá.
Logo aí, trazem problemas para os outros seres vivos e, mais
ainda, através dos ensaios de toxicidade, e com a base teórica,
sabemos que, elas afectariam seres, como a Chlorella e os náuplios de
Artémia, pelo qual estes são seres vivos que se encontram na base das
cadeias alimentares. Visto que as cianobactérias libertam toxinas, irão
prejudicar o crescimento destas espécies e até conduzir à sua morte.
Provocando assim um decréscimo na diversidade das espécies. Para
além disso, as toxinas libertadas afectam a saúde humana, sendo que
a água contaminada se torna imprópria para utilização, uma vez que
quando em contacto com os seres humanos podem provocar morte
imediata.
Independentemente dos resultados obtidos a actividade foi
muito enriquecedora para nós e agora é que nos sentíamos
preparadas para a fazer de raiz.